本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及血漿或血清中的低豐度蛋白的富集方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)組學(xué)能高通量地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，可用于發(fā)現(xiàn)多種疾病診斷標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)。國(guó)際人類(lèi)蛋白質(zhì)組研究組織(humanproteomicorganization,hupo)早在2002年即啟動(dòng)了人類(lèi)血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃(humanplasmaproteomeproject,hppp)，其科學(xué)目標(biāo)包括全面分析人類(lèi)血漿和血清蛋白成分，確定不同人種血漿蛋白質(zhì)的差異程度，以及確定不同生理和病理狀態(tài)下的個(gè)體差異。然而，血漿蛋白質(zhì)豐度差異巨大，血漿中21種主要高豐度及中等豐度的蛋白，如白蛋白、igg、ɑ1抗胰蛋白酶、ɑ2巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等占血漿總蛋白含量的99％以上，而其余的1％則由數(shù)千種低豐度甚至極低豐度的蛋白質(zhì)組成。如白細(xì)胞介素6通常濃度范圍在0～5ng/l，而白蛋白豐度為(35～50)×109ng/l，高低豐度蛋白含量可差1012之巨，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了二維電泳(two-dimensionalelectrophoresis,2de)及其他蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)所能測(cè)定的范圍。人體組織器官發(fā)生病變時(shí)，來(lái)自病變組織或細(xì)胞的蛋白會(huì)進(jìn)入到血液系統(tǒng)，這些蛋白質(zhì)與機(jī)體的病理、生理狀況密切相關(guān)，因此，對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和分析是發(fā)現(xiàn)與各種疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的最有價(jià)值樣本之一，這些蛋白質(zhì)包括不少低豐度蛋白，其蛋白濃度在ng/ml量級(jí)或更低。本發(fā)明中我們關(guān)注以下5種低豐度蛋白，這五種蛋白在血漿中的濃度都低于1μg/ml：1.血管生成素(angiogenin,ang)：是一個(gè)由123個(gè)氨基酸組成的核酸酶，可刺激血管生成，在腫瘤發(fā)展中起著非常重要的作用，與神經(jīng)退行性疾病也密切相關(guān)。2.髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,mpo)：是血紅素過(guò)氧化物酶超家族成員之一，主要存在于髓系細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)的嗜苯胺藍(lán)顆粒中。髓過(guò)氧化物酶的基因多態(tài)性與多種疾病的易感性有關(guān)，其表達(dá)水平的升高與患冠狀動(dòng)脈疾病易感性相關(guān)，還可以預(yù)測(cè)早期患心肌梗死的危險(xiǎn)性。髓過(guò)氧化物酶與肺癌也存在相關(guān)性。3.乳鐵蛋白(lactotranferrin,ltf)：是鐵傳遞蛋白家族中的一種多功能糖蛋白，主要存在于各種分泌液中。乳鐵蛋白具有抗菌和抗病毒的功能，是先天免疫系統(tǒng)的重要成員，還能與dna、rna和多糖分子相互作用，參與許多重要生理過(guò)程。有研究認(rèn)為乳鐵蛋白是潛在的卵巢癌早期診斷的生物標(biāo)志物。4.脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(lipocalin2,lcn2)：是一個(gè)在先天免疫中起重要作用的蛋白，中性粒細(xì)胞中有表達(dá)，在腎臟、前列腺、呼吸道和胃腸道中也有低水平的表達(dá)。在急性腎損傷發(fā)生時(shí)，血液和尿液中的lcn2濃度會(huì)迅速升高，因而lcn2可作為急性腎損傷的生物標(biāo)志物。此外，在慢性腎病、腎移植等過(guò)程中也可以作為診斷標(biāo)志物。5.乙酰肝素酶(heparanase,hpse)：可在細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)中將硫酸乙酰肝素降解為短鏈多糖。此蛋白在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成中起著重要的作用，因而有研究認(rèn)為乙酰肝素酶是潛在的腫瘤藥物標(biāo)靶。在乳腺癌、卵巢癌等很多種腫瘤中，hpse表達(dá)上調(diào)，且與預(yù)后存在一定關(guān)聯(lián)，是可能的腫瘤標(biāo)志物。在臨床檢驗(yàn)實(shí)踐中，這些低豐度蛋白較難檢測(cè)，如何有效地檢測(cè)和分析低豐度蛋白一直是分析科學(xué)領(lǐng)域具有挑戰(zhàn)性的難題。目前，對(duì)于這些低豐度蛋白的定量分析主要通過(guò)依賴(lài)于抗體的技術(shù)如elisa等來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些方法的準(zhǔn)確性主要由抗體的質(zhì)量決定，而抗體質(zhì)量容易受到多種因素的影響，這會(huì)造成測(cè)量結(jié)果的不穩(wěn)定。此外這些基于抗體的方法價(jià)格都比較昂貴，當(dāng)需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)抗體時(shí)成本會(huì)進(jìn)一步上升。質(zhì)譜技術(shù)近年來(lái)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，可以同時(shí)定量很多種蛋白，但用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)血漿或血清這類(lèi)復(fù)雜生物樣品進(jìn)行直接分析也存在一些缺點(diǎn)，影響這一技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用。難點(diǎn)主要在兩個(gè)方面：一方面，血漿或血清蛋白中的高、低豐度蛋白含量的差異巨大，如果不對(duì)血漿或血清樣品做進(jìn)一步的處理而直接進(jìn)行常規(guī)質(zhì)譜分析，低豐度蛋白的信號(hào)易被高豐度蛋白所掩蓋，造成低豐度的目標(biāo)蛋白無(wú)法被檢測(cè)到，低豐度蛋白漏檢率高；另一方面，用多維液相色譜、電泳預(yù)分離等方法以及通過(guò)免疫親和技術(shù)剔除高豐度蛋白的預(yù)處理方法與質(zhì)譜聯(lián)用，雖然可以改善低豐度蛋白的檢出幾率，但是這些方法對(duì)儀器設(shè)備、操作技術(shù)有嚴(yán)格要求，費(fèi)時(shí)費(fèi)力或者需要用到昂貴的耗材，不易在實(shí)際應(yīng)用中進(jìn)行推廣。因此，如何簡(jiǎn)便有效、成本低廉地去除血漿或血清中的高豐度蛋白和富集血漿或血清中的低豐度蛋白，是蛋白質(zhì)組學(xué)的一項(xiàng)重要研究課題，更是實(shí)現(xiàn)低豐度蛋白的有效檢測(cè)和分析的關(guān)鍵。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供富集血漿或血清中5種低豐度蛋白的方法，無(wú)需依賴(lài)于抗體，即可簡(jiǎn)便有效、成本低廉地去除血漿或血清中的高豐度蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于血漿或血清中5種低豐度蛋白的同時(shí)富集。富集后，能夠采用高效液相色譜聯(lián)合高分辨質(zhì)譜對(duì)這5種低豐度蛋白進(jìn)行鑒定和定量分析。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：富集血漿或血清中5種低豐度蛋白的方法，所述5種低豐度蛋白為血管生成素、髓過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2、乙酰肝素酶，包括以下步驟：(1)將柱料裝至離心管中，并向所述離心管中加入氫氧化鈉和氯化鈉的溶液對(duì)所述柱料進(jìn)行堿處理，再向所述離心管中加入鹽酸溶液對(duì)所述柱料進(jìn)行酸處理；然后，向所述離心管中加入色譜柱運(yùn)行緩沖液，懸浮所述柱料并靜置后離心棄上清，重復(fù)多次；最后，向所述離心管中加入所述色譜柱運(yùn)行緩沖液，懸浮所述柱料后裝到空柱中，得到色譜柱并封閉其出口；(2)按照每100微升血漿或血清對(duì)應(yīng)5毫升色譜柱運(yùn)行緩沖液的比例，用所述色譜柱運(yùn)行緩沖液稀釋血漿或血清，然后上樣至所述色譜柱，孵育后，打開(kāi)所述色譜柱出口使液面下降，待液面降至所述柱料時(shí)，加入所述色譜柱運(yùn)行緩沖液清洗，重復(fù)清洗多次；(3)向所述色譜柱中加入洗脫液，孵育后，打開(kāi)所述色譜柱出口，收集洗脫組分；其中，所述柱料為磷酸纖維素；所述色譜柱運(yùn)行緩沖液包含20毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷、300毫摩爾/升氯化鈉和1毫摩爾/升乙二胺四乙酸，溶劑是超純水，ph值為8.0；所述洗脫液包含20毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷、1摩爾/升氯化鈉和1毫摩爾/升乙二胺四乙酸，溶劑是超純水，ph值為8.0。由上述富集方法得到的洗脫組分，采用高效液相色譜聯(lián)合高分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析可鑒定所述5種低豐度蛋白，進(jìn)一步，通過(guò)與未經(jīng)富集的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，可以明顯看出：富集后的樣品中所述5種低豐度蛋白的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰干擾，峰面積明顯增強(qiáng)，可直接進(jìn)行相對(duì)定量分析，說(shuō)明上述方法對(duì)于所述5種低豐度蛋白的富集效果明顯。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，步驟(1)中，所述堿處理具體如下：①向裝有1克磷酸纖維素柱料的50毫升離心管中加入50毫升含有0.05摩/升氫氧化鈉和0.5摩爾/升氯化鈉的溶液，晃動(dòng)進(jìn)行混合，浸泡5分鐘；②將所述離心管放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘，倒掉上清液；③向所述離心管加入50毫升超純水，懸浮所述柱料，放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘后測(cè)量上清液ph值，倒掉上清液，如果ph值小于10，結(jié)束堿處理進(jìn)行下一步處理，否則，重復(fù)步驟③。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，步驟(1)中，所述酸處理具體如下：④向經(jīng)所述堿處理后的裝有柱料的離心管加入50毫升0.5摩爾/升鹽酸，晃動(dòng)進(jìn)行混合，浸泡5分鐘；⑤將所述離心管放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘，倒掉上清液；⑥向所述離心管加入50毫升超純水，懸浮柱料，放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘后測(cè)量上清液ph值，倒掉上清液；如果ph值大于4，結(jié)束酸處理進(jìn)行下一步處理，否則重復(fù)步驟⑥。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，步驟(1)中，所述靜置的時(shí)間為30分鐘。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，步驟(2)中，所述孵育的時(shí)間為30分鐘。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，步驟(3)中，所述孵育的時(shí)間為20分鐘。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述柱料為磷酸纖維素粉末。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：本發(fā)明利用磷酸纖維素，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于血漿或血清中多個(gè)低豐度蛋白的同時(shí)富集。采用液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜對(duì)富集后樣品進(jìn)行檢測(cè)，可鑒定這5種低豐度蛋白并進(jìn)行相對(duì)定量分析。本發(fā)明富集效果顯著，方法簡(jiǎn)便，不需要使用昂貴的設(shè)備或耗材，成本低廉，便于推廣和應(yīng)用。本發(fā)明的富集方法以及后續(xù)的檢測(cè)過(guò)程中，均不需要使用抗體，可以大大降低檢測(cè)的費(fèi)用，也可去除由于抗體質(zhì)量穩(wěn)定性問(wèn)題帶來(lái)的不確定性。附圖說(shuō)明圖1a為對(duì)比例1和實(shí)施例1中富集前后的血漿樣品中血管生成素的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖1b為對(duì)比例1和實(shí)施例1中富集前后的血漿樣品中乳鐵蛋白的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖1c為對(duì)比例1和實(shí)施例1中富集前后的血漿樣品中髓過(guò)氧化物酶的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖1d為對(duì)比例1和實(shí)施例1中富集前后的血漿樣品中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖1e為對(duì)比例1和實(shí)施例1中富集前后的血漿樣品中乙酰肝素酶的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖2a為對(duì)比例2和實(shí)施例2中富集前后的血清樣品中血管生成素的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖2b為對(duì)比例2和實(shí)施例2中富集前后的血清樣品中乳鐵蛋白的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖2c為對(duì)比例2和實(shí)施例2中富集前后的血清樣品中髓過(guò)氧化物酶的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖2d為對(duì)比例2和實(shí)施例2中富集前后的血清樣品中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的質(zhì)譜圖對(duì)比。圖2e為對(duì)比例2和實(shí)施例2中富集前后的血清樣品中乙酰肝素酶的質(zhì)譜圖對(duì)比。具體實(shí)施方式為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，下述的實(shí)施實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。以下實(shí)施例中所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1血漿中5種低豐度蛋白的富集(一)制備色譜柱稱(chēng)量所需的磷酸纖維素粉末作為柱料(0.5克柱料/1個(gè)樣品×樣品數(shù))，將其分裝至多個(gè)50毫升離心管(每個(gè)離心管中裝有1克柱料)，并對(duì)每個(gè)離心管分別進(jìn)行以下處理：①向離心管中加入50毫升含有0.05摩爾/升氫氧化鈉和0.5摩爾/升氯化鈉的溶液，晃動(dòng)進(jìn)行混合，浸泡5分鐘；②將步驟①得到的離心管放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘，倒掉上清液；③向步驟②得到的離心管加入50毫升超純水，懸浮柱料，放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘后測(cè)量上清液ph值，倒掉上清液，如果ph值小于10，可進(jìn)行步驟④，否則，重復(fù)步驟③；④向步驟③得到的離心管加入50毫升0.5摩爾/升鹽酸，晃動(dòng)進(jìn)行混合，浸泡5分鐘；⑤將步驟④得到的離心管放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘，倒掉上清液；⑥向步驟⑤得到的離心管加入50毫升超純水，懸浮柱料，放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘后測(cè)量上清液ph值，倒掉上清液；如果ph值大于4，可進(jìn)行步驟⑦，否則重復(fù)步驟⑥；⑦向步驟⑥得到的離心管中加入50毫升色譜柱運(yùn)行緩沖液，重新懸浮柱料，靜置30分鐘后，放入離心機(jī)在1000g離心1分鐘，倒掉上清液；重復(fù)步驟⑦兩次；色譜柱運(yùn)行緩沖液包含20毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷、300毫摩爾/升氯化鈉和1毫摩爾/升乙二胺四乙酸，溶劑是超純水，ph值為8.0；⑧向步驟⑦得到的離心管中加入4毫升色譜柱運(yùn)行緩沖液，懸浮柱料后分裝到準(zhǔn)備好的空柱子中，每管柱料分裝至兩個(gè)空柱(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，規(guī)格為6ml)中，完成色譜柱的裝柱。(二)富集低豐度的目標(biāo)蛋白按照5毫升色譜柱運(yùn)行緩沖液/100微升血漿的比例，用10毫升色譜柱運(yùn)行緩沖液稀釋200微升血漿，上樣至步驟(一)得到的一個(gè)裝有柱料的色譜柱(出口已封閉)，孵育30分鐘后，打開(kāi)色譜柱出口使液面下降，液面降至柱料時(shí)，加入5毫升色譜柱運(yùn)行緩沖液清洗，共清洗6～8次(共30～40毫升)；加入4毫升洗脫液，孵育20分鐘后，打開(kāi)色譜柱出口，收集洗脫組分，進(jìn)行下一步分析或冷凍保存；洗脫液包含20毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷、1摩爾/升氯化鈉和1毫摩爾/升乙二胺四乙酸，溶劑是超純水，ph值為8.0。采用高效液相色譜聯(lián)合高分辨質(zhì)譜對(duì)富集后樣品(即洗脫組分)進(jìn)行檢測(cè)(1)吸取500μl洗脫組分樣品到10k超濾離心管，13000rpm/min離心10分鐘，去除濾過(guò)液，保留截留部分；再吸取500μl洗脫組分樣品到10k超濾離心管，離心10分鐘，去除濾過(guò)液，保留截留部分；一共重復(fù)4次，從而完成對(duì)共計(jì)2ml洗脫組分樣品的濃縮，在10k超濾離心管中得到濃縮的洗脫組分樣品；(2)吸取200μl的濃度為50mmol/l的碳酸氫銨溶液到步驟(1)得到的10k超濾離心管，13000rpm/min離心10分鐘，去除濾過(guò)液，保留截留部分；(3)向步驟(2)得到的10k超濾離心管中加入二硫蘇糖醇，使得終濃度為20mmol/l，60℃孵育20分鐘；(4)向步驟(3)得到的10k超濾離心管中加入碘乙酰氨，使得終濃度為50mmol/l，室溫避光放置30分鐘；(5)吸取200μl濃度為50mmol/l的碳酸氫銨溶液到步驟(4)得到的10k超濾離心管，13000rpm/min離心10分鐘，去除濾過(guò)液，保留截留部分；重復(fù)一次；(6)向步驟(5)得到的10k超濾離心管中加入質(zhì)譜級(jí)胰酶(例如promega出品的trypsingold)，使得終濃度為0.01μg/ml，并含有0.4％(w/v)脫氧膽酸鈉(sodiumdeoxycholate,sdc)，37℃孵育12～16小時(shí)；(7)加入100μl濃度為50mmol/l的碳酸氫銨溶液到步驟(6)得到的10k超濾管，13000rpm/min離心10分鐘，收集超濾管截留的液體；加入0.5～1％(v/v)三氟乙酸混勻，13000rpm/min離心10分鐘，吸取截留的液體到新的1.5毫升離心管；使用c18吸頭(thermopierce貨號(hào)87784)脫鹽后，采用真空濃縮儀干燥，用0.1(v/v)％甲酸重溶，13000rpm/min離心10分鐘后，將上清部分轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜上樣管進(jìn)行檢測(cè)；質(zhì)譜檢測(cè)條件設(shè)置如下：使用q-exactive質(zhì)譜儀和easy-nlc1000uplcsystem。液相采用60分鐘梯度，流速為220nl/min，預(yù)柱用acclaimrpepmap100column(100μmid,2cmlength,c18,5μm,)，分析柱用acclaimrpepmaprslccolumn(50μmid,15cmlength,c18,2μm,)。流動(dòng)相a為0.1％fa(甲酸)水溶液，流動(dòng)相b為0.1％fa乙腈溶液。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集通過(guò)xcalibur2.2sp1軟件操作，一級(jí)母離子掃描范圍為350～2000m/z，分辨率為70000；選擇信號(hào)排名前15的多肽進(jìn)行碎裂，碎裂模式為hcd，能量為27％。用proteomediscoverersoftware(versionpd1.4,thermoscientific,usa)進(jìn)行蛋白鑒定，maxquant軟件(version1.4.0.8)進(jìn)行定量分析。對(duì)比例1不經(jīng)過(guò)富集處理(即不經(jīng)過(guò)制備色譜柱和富集低豐度蛋白的步驟)，直接采用高效液相色譜聯(lián)合高分辨質(zhì)譜對(duì)富集前樣品檢測(cè)，即：使用富集前的1微升血漿替代實(shí)施例1中的濃縮的洗脫組分樣品(即，檢測(cè)步驟中(1)所得的濃縮的洗脫組分樣品)，用高效液相色譜聯(lián)合高分辨質(zhì)譜檢測(cè)的其他條件相同。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果(1)由質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果可以明顯看出：富集后，多種高豐度蛋白濃度顯著降低，去除效果明顯，例如：serpina1(登錄號(hào)為p01009的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.0761；orm1(登錄號(hào)為p02763的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.0702；a2m(登錄號(hào)為p01023的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.0809；tf(登錄號(hào)為p02787的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.0706；hp(登錄號(hào)為p00738的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.1561；apoa2(登錄號(hào)為p02652的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.3213；apoa1(登錄號(hào)為p02647的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.7349；igha1(登錄號(hào)為p01876的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.2400；ighg2(登錄號(hào)為p01859的蛋白)，100微升血漿富集后的蛋白量與1微升未富集血漿中的蛋白量比例為0.2775。富集樣品的起始材料體積為未富集樣品的100倍，而富集后這些高豐度蛋白的量少于未富集樣品，說(shuō)明去除的比例均為99％以上。(2)由質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果可以明顯看出：富集后，5種目標(biāo)低豐度蛋白的富集效果顯著，詳見(jiàn)以下對(duì)于富集前后質(zhì)譜圖對(duì)比的分析和說(shuō)明。圖1a～1e依次分別為對(duì)比例1和實(shí)施例1中富集前后的血漿樣品中血管生成素、乳鐵蛋白、髓過(guò)氧化物酶、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2、乙酰肝素酶的質(zhì)譜圖對(duì)比，其中，y軸給出信號(hào)的相對(duì)值，x軸為液相色譜的保留時(shí)間，nl給出圖中最高峰的絕對(duì)值(對(duì)應(yīng)相對(duì)值的100％)，basepeakm/z是荷質(zhì)比的范圍，aa則給出峰面積。圖1a～1e中各基峰(basepeak)所對(duì)應(yīng)的多肽列表如下：表1：各基峰(basepeak)所對(duì)應(yīng)的多肽列表編號(hào)多肽m/z值位置seqidno：1ycesimrm/z＝479.70971圖1aseqidno：2adavtldggfiyeaglapykm/z＝1036.02281圖1bseqidno：3igldlpalnmqrm/z＝670.87142圖1cseqidno：4sypgltsylvrm/z＝628.33771圖1dseqidno：5flillgspkm/z＝494.31553圖1e從圖1a中可以看出，對(duì)比例1未經(jīng)富集的血漿樣品中血管生成素的質(zhì)譜圖上有多個(gè)峰，包括來(lái)自高豐度蛋白的干擾峰，顯示信號(hào)較雜；而實(shí)施例1經(jīng)過(guò)富集處理后的血漿樣品中血管生成素的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰，而且nl值明顯提升。從圖1b中可以看出，對(duì)比例1未經(jīng)富集的血漿樣品中乳鐵蛋白的質(zhì)譜圖上存在高豐度蛋白的干擾峰，使得目標(biāo)蛋白信息被掩蓋，而實(shí)施例1經(jīng)過(guò)富集處理后的血漿樣品中乳鐵蛋白的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰，而且nl值高。從圖1c中可以看出，對(duì)比例1未經(jīng)富集的血漿樣品中髓過(guò)氧化物酶的質(zhì)譜圖上有多個(gè)峰，包括來(lái)自高豐度蛋白的干擾峰，顯示信號(hào)較雜；而實(shí)施例1經(jīng)過(guò)富集處理后的血漿樣品中髓過(guò)氧化物酶的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰，而且nl值明顯提升。從圖1d中可以看出，對(duì)比例1未經(jīng)富集的血漿樣品中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的質(zhì)譜圖上有多個(gè)峰，包括來(lái)自高豐度蛋白的干擾峰，顯示信號(hào)較雜；而實(shí)施例1經(jīng)過(guò)富集處理后的血漿樣品中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰，而且nl值明顯提升。從圖1e中可以看出，對(duì)比例1未經(jīng)富集的血漿樣品中未檢測(cè)到乙酰肝素酶的質(zhì)譜峰，推測(cè)為乙酰肝素酶豐度低而被高豐度蛋白信號(hào)掩蓋，而實(shí)施例1經(jīng)過(guò)富集處理后的血漿樣品中乙酰肝素酶能夠被檢測(cè)到，而且nl值高。由上述圖1a～1e的結(jié)果可見(jiàn)，未經(jīng)富集處理樣品的質(zhì)譜中的信號(hào)弱、或被掩蓋、或來(lái)自高豐度蛋白的干擾信號(hào)較雜，富集處理后樣品的質(zhì)譜中信號(hào)干凈，強(qiáng)度高，可進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，說(shuō)明上述方法對(duì)于這五種蛋白有明顯的富集效果。實(shí)施例2血清中5種低豐度蛋白的富集以血清樣品替代實(shí)施例1中的血漿樣品，其他條件與實(shí)施例1完全相同，對(duì)樣品進(jìn)行富集。再以與實(shí)施例1相同的方法，采用高效液相色譜聯(lián)合高分辨質(zhì)譜對(duì)富集后樣品(即洗脫組分)檢測(cè)。對(duì)比例2以血清樣品替代對(duì)比例1中的血漿樣品，其他條件與對(duì)比例1完全相同，對(duì)未富集的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果(1)由質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果可以明顯看出：富集后，多種高豐度蛋白濃度顯著降低，去除效果明顯。(2)由質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果可以明顯看出：富集后，5種目標(biāo)低豐度蛋白的富集效果顯著，詳見(jiàn)以下對(duì)于富集前后質(zhì)譜圖對(duì)比的分析和說(shuō)明。圖2a～2e依次分別為對(duì)比例2和實(shí)施例2中富集前后的血清樣品中血管生成素、乳鐵蛋白、髓過(guò)氧化物酶、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2、乙酰肝素酶的質(zhì)譜圖對(duì)比，其中，y軸給出信號(hào)的相對(duì)值，x軸為液相色譜的保留時(shí)間，nl給出圖中最高峰的絕對(duì)值(對(duì)應(yīng)相對(duì)值的100％)，basepeakm/z是荷質(zhì)比的范圍，aa則給出峰面積。圖2a～2e中各基峰(basepeak)所對(duì)應(yīng)的多肽列表如下：表2：各基峰(basepeak)所對(duì)應(yīng)的多肽列表編號(hào)多肽m/z值位置seqidno：1ycesimrm/z＝479.70971圖2aseqidno：2adavtldggfiyeaglapykm/z＝1036.02281圖2bseqidno：3igldlpalnmqrm/z＝670.87142圖2cseqidno：4sypgltsylvrm/z＝628.33771圖2dseqidno：5flillgspkm/z＝494.31553圖2e從圖2a中可以看出，對(duì)比例2未經(jīng)富集的血清樣品中血管生成素的質(zhì)譜圖上存在干擾峰，顯示信號(hào)較雜；而實(shí)施例2經(jīng)過(guò)富集處理后的血清樣品中血管生成素的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰，而且nl值明顯提升。從圖2b中可以看出，對(duì)比例2未經(jīng)富集的血清樣品中乳鐵蛋白的質(zhì)譜圖上存在高豐度蛋白的干擾峰，使得目標(biāo)蛋白信息被掩蓋，而實(shí)施例2經(jīng)過(guò)富集處理后的血清樣品中乳鐵蛋白的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰，而且nl值高。從圖2c中可以看出，對(duì)比例2未經(jīng)富集的血清樣品中髓過(guò)氧化物酶的質(zhì)譜圖上存在高豐度蛋白的干擾峰，使得目標(biāo)蛋白信息被掩蓋，而實(shí)施例2經(jīng)過(guò)富集處理后的血清樣品中髓過(guò)氧化物酶的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰，而且nl值高。從圖2d中可以看出，對(duì)比例2未經(jīng)富集的血清樣品中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的質(zhì)譜圖上存在高豐度蛋白的干擾峰，使得目標(biāo)蛋白信息被掩蓋，而實(shí)施例2經(jīng)過(guò)富集處理后的血清樣品中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的質(zhì)譜圖信號(hào)干凈，無(wú)雜峰，而且nl值高。從圖2e中可以看出，對(duì)比例2未經(jīng)富集的血清樣品中未檢測(cè)到乙酰肝素酶的質(zhì)譜峰，推測(cè)為乙酰肝素酶豐度低而被高豐度蛋白信號(hào)掩蓋，而實(shí)施例2經(jīng)過(guò)富集處理后的血清樣品中乙酰肝素酶能夠被檢測(cè)到。由上述圖2a～2e的結(jié)果可見(jiàn)，未經(jīng)富集處理樣品的質(zhì)譜中的信號(hào)弱、被掩蓋或來(lái)自高豐度蛋白的干擾信號(hào)較雜，富集處理后樣品的質(zhì)譜中信號(hào)干凈，強(qiáng)度高，可進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，說(shuō)明上述方法對(duì)于這五種蛋白有明顯的富集效果。上述實(shí)施例中磷酸纖維素粉末作為陽(yáng)離子交換柱柱料，其可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)，如美國(guó)sigma-aldrich公司、美國(guó)spectrumchemical公司等。由此可見(jiàn)，本發(fā)明的目的已經(jīng)完整并有效的予以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的方法以及原理已在實(shí)施例中予以展示和說(shuō)明，在不背離所述原理的情況下，實(shí)施方式可作任意修改。所以，本發(fā)明包括了基于權(quán)利要求精神及權(quán)利要求范圍的所有變形實(shí)施方式。sequencelisting<110>浙江省腫瘤醫(yī)院<120>富集血漿或血清中5種低豐度蛋白的方法<130>2017<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>7<212>prt<213>人(homosapiens)<400>1tyrcysgluserilemetarg15<210>2<211>20<212>prt<213>人(homosapiens)<400>2alaaspalavalthrleuaspglyglypheiletyrglualaglyleu151015alaprotyrlys20<210>3<211>12<212>prt<213>人(homosapiens)<400>3ileglyleuaspleuproalaleuasnmetglnarg1510<210>4<211>11<212>prt<213>人(homosapiens)<400>4sertyrproglyleuthrsertyrleuvalarg1510<210>5<211>9<212>prt<213>人(homosapiens)<400>5pheleuileleuleuglyserprolys15當(dāng)前第1頁(yè)12