專利名稱：用于處理傷口的含血漿或血清的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將血漿或血清作為用于處理傷口的試劑的用途。更具體的說，本發(fā)明涉及用于處理傷口的含血漿或血清的藥物組合物，以及通過將所述組合物應(yīng)用于傷口處使受傷部位周圍的組織環(huán)境正常化而有效處理傷口的方法。
背景技術(shù)：
早期對傷口處理的研究 將重點放在密切檢查細胞階段的功能上，即炎性細胞和血小板的作用[Allgower M.和Hulliger L.，Surgery，47603，1960；Dicoreto P.E.和Browen-Pope D.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，801919，(1983)；和Houck J.C.等人，Biochem.Pharmacol.，172081，(1968)]。
近年來，促進組織生長的生長因子已經(jīng)用于處理諸如慢性潰瘍等傷口。這些生長因子刺激有絲分裂，即諸如成纖維細胞等細胞的增殖。生長因子還刺激血管發(fā)生，導致新血管的向內(nèi)生長。此外，生長因子還刺激膠原蛋白和胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的合成(L.Greenhalgh，J.Trauma，41159，1996)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細胞因子是與傷口愈合有關(guān)的生長因子。這些細胞因子的代表性實例包括由角質(zhì)細胞和成纖維細胞產(chǎn)生且促進上皮細胞生長的堿性纖維生長因子；由血小板和內(nèi)皮細胞及其它細胞類型產(chǎn)生且促進表皮生長因子(EGF)相關(guān)性上皮細胞異常增殖的血小板衍生生長因子(PDGF)；由成纖維細胞和血小板產(chǎn)生并促進結(jié)締組織生長的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)；在唾液腺刺激性腺體中產(chǎn)生且促進上皮細胞增殖的上皮細胞生長因子、成纖維細胞生長因子(FGF)；以及由巨噬細胞和上皮細胞產(chǎn)生并促進上皮細胞生長和移動的白介素-1。Becaplermin是經(jīng)過遺傳改造的重組PDGF，作為Johnson & Johnson公司的局部制劑，是用于處理傷口的商品化試劑，商標是Regranex。EP 0 575 484 B1公開了包含PDGF和地塞米松且用于哺乳動物組織再生和修復的藥物組合物。美國專利號5,981,606公開了包含TGF-β且用于處理傷口的藥物組合物。WO 96/30038公開了包含TGF-β和纖維酸以及抗氧化劑且用于傷口愈合的藥物組合物。美國專利號5,183,805公開了包含EGF且具有組織再生效果的藥物組合物。日本專利號05070365和美國專利號6,165,978公開了包含F(xiàn)GF的傷口愈合制劑。
還有報導說利用透明質(zhì)酸作為活性試劑的制劑有效治療皮膚潰瘍(參閱美國專利號5,897,880)。包含透明質(zhì)酸鈉的制劑由LAM制藥公司銷售，商品名是IPN Wound Gel。
還有報導說局部應(yīng)用的纖連蛋白(在血漿中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白)用于提高角膜損傷(Nishida，Larch Opthalmology，1011046，1983)和腿部潰瘍(Wysocki等，Arch.Dermatol.，124175，1988)的傷口愈合速度。
盡管這些處理使某些患者的局部傷口緩減，但是它們需要較長的愈合時間，而且未能展示出對這些治療的最適應(yīng)答。當傷口，尤其是慢性皮膚潰瘍，轉(zhuǎn)變成嚴重的臨床癥狀時，已做了很多努力去尋找有效治療傷口的方法。造成傷口愈合不良的根本原因是復雜的，而且至今對此知之甚少。
因此，需要開發(fā)新的和改進的處理傷口的方法。本發(fā)明制劑的單獨使用或與多種已知治療劑的聯(lián)合使用克服了現(xiàn)階段的限制。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人已令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，血漿或血清在傷口的處理中非常有效。我們發(fā)現(xiàn)，局部損傷的傷口在施用本發(fā)明含血漿或血清的制劑后幾天內(nèi)愈合。我們更驚奇的發(fā)現(xiàn)，損傷嚴重的大面積傷口在施用本發(fā)明含血漿或血清的制劑后幾周內(nèi)(大約2-6周)可以愈合。這些發(fā)現(xiàn)展示了在治療應(yīng)答和愈合時間上都比目前所用或至今所報道的常規(guī)療法或其它療法有非常顯著的改善。
一方面，本發(fā)明提供了用于傷口愈合的藥物組合物，它包含與藥用載體相聯(lián)合的藥物有效量的血漿或血清。
另一方面，本發(fā)明提供了處理受試者傷口的方法，包括將含有藥物有效量的血漿或血清的藥物組合物施用于需要這種治療的受試者傷口處。
附圖簡述

圖1A是對照組大鼠受傷組織在用蒸餾水處理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖1B是試驗組大鼠受傷組織在用依照本發(fā)明的液態(tài)人血漿處理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖2A是對照組大鼠受傷組織在受傷后未經(jīng)任何處理的第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖2B是試驗組大鼠受傷組織在用依照本發(fā)明的粉狀人血漿處理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖3A是對照組大鼠受傷組織在單獨使用水溶性軟膏基質(zhì)處理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖3B是試驗組大鼠受傷組織在用依照本發(fā)明的含人血漿的軟膏處理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖4A是對照組大鼠受傷組織在受傷后未經(jīng)任何處理的第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖4B是試驗組大鼠受傷組織在用依照本發(fā)明的粉狀胎牛血清(FBS)處理后第7天的照片(三色染色，用200X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖5A是對照組大鼠受傷組織在單獨使用水溶性軟膏基質(zhì)處理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖5B是試驗組大鼠受傷組織在用依照本發(fā)明的含F(xiàn)BS的軟膏處理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖6A是對照組大鼠受傷組織在用PDGF軟膏(Regranex0.01％)處理后第7天的照片(三色染色，用200X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖6B是試驗組大鼠受傷組織在用依照本發(fā)明的含F(xiàn)BS的軟膏處理后第7天的照片(三色染色，用200X放大倍數(shù)進行觀察)。
圖7是具有足夠深度的傷口的大鼠腹部在用PDGF軟膏和依照本發(fā)明的含人血漿的軟膏處理后第4天和第7天的照片。
圖8是二級燒傷在用依照本發(fā)明的含F(xiàn)BS的軟膏處理后的第1天、第2天、和第4天的照片。
圖9顯示了依照本發(fā)明的一個或多個實施方案處理慢性傷口的流程。
發(fā)明詳述本發(fā)明通常涉及對處理傷口有用的血漿或血清的使用。在依照本發(fā)明的藥物組合物中用作活性試劑的血漿或血清對于處理傷口是高度有效的。
傷口即活體受傷狀態(tài)，包括構(gòu)成活體內(nèi)外表面的組織切割或破損的病理狀態(tài)，例如皮膚、肌肉、神經(jīng)組織、骨、軟組織、內(nèi)部器官、和脈管組織。代表性的傷口包括但不限于挫傷或擦傷、未愈合的外傷傷口、輻射造成的組織損傷、擦破、壞疽、撕裂傷、撕脫、刺傷、槍擊傷口、切割、燒傷、凍傷、皮膚潰瘍、皮膚干燥病、皮膚角化病、破損、破裂、皮炎、腳癬病、手術(shù)傷口、血管病引起的傷口、角膜損傷、瘡諸如褥瘡性潰瘍(pressure sore)和褥瘡(bed sore)、糖尿病和循環(huán)不暢相關(guān)疾病的糖尿病性皮膚糜爛、慢性潰瘍、整形手術(shù)后的縫合處、脊柱創(chuàng)傷、婦科傷口、化學損傷、和痤瘡?；铙w的任何受損或受傷部分都屬于傷口的定義之內(nèi)。在這方面，依照本發(fā)明的含血漿或血清的組合物可用于修補、替換、減輕、加速、促進、治愈、和/或治療任何受損或受傷組織。
在本發(fā)明組合物中用作活性成分的血漿通常指將諸如血細胞和細胞碎片的物質(zhì)由血液中分離后殘留的淡黃色液體部分。血漿的成分在本領(lǐng)域是眾所周知的(Philip Westerman，Plasma Proteins，第VII-1至VIII-13，2002年9月17日；和Wendy Y.Craig等人，Plasma Proteins Pocket Guide，F(xiàn)oundation for Blood Research-每一篇完整收入本文作為參考)。血清也有詳細的定義，通常稱為不含纖維蛋白原和其它凝結(jié)因子的血漿。
本發(fā)明組合物中所用血漿或血清的來源包括人和哺乳動物物種，例如靈長類動物、嚙齒類動物、和諸如綿羊、山羊、豬、馬、狗和牛等牲畜。
本發(fā)明中所用的血漿或血清可以使用如離心、沉淀、和過濾的常規(guī)方法很容易的由血液中獲取。在適于血細胞和細胞碎片沉淀的任何條件下進行離心，如以大約3000rpm離心大約10分鐘。此條件足以基本清除所有的細胞碎片(血小板)以及紅血球和白血球。
上清液血漿可以通過標準技術(shù)很容易的與離心后的細胞分離開來。這種分離可以使用過濾使上清液血漿通過合適的濾器來實現(xiàn)。濾器包括蛋白質(zhì)可以完全穿透的微孔膜。
血漿或血清可以是新鮮的液態(tài)血漿，或者是通過全血離心或沉淀獲得的液態(tài)制劑。此外，已知血漿或血清在使用前以多種形式保存，包括新鮮冷凍制品、冷凝制品、凍干制品、或濃縮制品。所有這些形式的血漿或血清都可用于本發(fā)明。新鮮冷凍血漿是通過將血液以約2800rpm離心15分鐘分離清除血細胞和細胞碎片并將剩余液體部分于約-18℃至-40℃的溫度冷凍而獲得的。離心是在采集血液后6小時內(nèi)進行。使用時，在大約30℃至37℃的溫水中融化新鮮冷凍血漿。
冷凝血漿是通過將一個單位的新鮮冷凍血漿于4℃解凍形成白色沉淀物(冷的沉淀蛋白質(zhì))(包括大量的因子，諸如VIIIC、纖維蛋白原、XIII、和纖連蛋白)、分離形成的沉淀物、并將其于大約-18℃至-40℃的溫度重新冷凍而獲得。使用時，將冷凝制品在1℃至6℃溫度的冰箱中放置過夜使其融化?？梢詫⑺糜诖蠹s4℃的水浴中使其融化得更快。濃縮血漿是通過由全血分離血漿、將分離得到的血漿與諸如dextranomer、交聯(lián)葡聚糖、dextramine、聚丙烯酰胺、BIO-GEL P、硅膠、沸石、DEBRISAN、交聯(lián)瓊脂糖、淀粉、和海藻酸膠等增稠劑混合以使其濃縮、并清除剩余的增稠劑而獲得的。
在本發(fā)明的某一實施方案中，用于本發(fā)明的血漿或血清可以是商品化的，例如購自血庫的粉劑制品。這些制品衍生自經(jīng)過測試不會引發(fā)抗原-抗體反應(yīng)的個人血漿單位，例如對乙肝表面抗原(HBsAg)的抗體和丙肝(HCV)抗體無反應(yīng)性且對HIV-1和HIV-2病毒的抗體呈陰性。用于制備這些制品的所有血漿或血清單位都證明不含病原體。
為了降低傳播傳染物的潛在風險，可以用有機溶劑/去污劑混合物處理制品，例如三(正-丁基)/磷酸鹽/聚山梨醇酯80設(shè)計用于滅活諸如HIV、乙肝、和HCV等包膜病毒?？梢酝ㄟ^另外進行納米過濾步驟來增強病毒的滅活和清除效果。
在另一個實施方案中，可以通過純化來制備血漿或血清制品，即，使用溶劑去污劑和納米過濾，或者將液態(tài)血漿部分進行巴氏滅菌?；蛘?，可以純化全血。由此得到的血漿或血清部分可以通過加熱、凍干、或其它合適的干燥技術(shù)而制成粉劑。只是舉例而言，將血漿在低-40℃的溫度冷凍干燥數(shù)天(如大約7天)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何常規(guī)技術(shù)和參數(shù)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，血漿或血清可以是除了粉劑之外的片劑。片劑是通過將血漿或血清置于合適的模板中并使其脫水而產(chǎn)生的。在又一個實施方案中，可以通過將增稠劑或載體摻入血漿或血清部分來提供具有機械強度和/或物理完整性的片劑。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將血漿或血清調(diào)至酸性pH。我們發(fā)現(xiàn)酸化的血液或血清具有比弱堿性血漿或血清優(yōu)越的傷口愈合功效。優(yōu)選的是，血漿或血清具有大約3.5-6.5的酸性pH值?？梢允褂盟幱脽o機或有機酸來酸化血漿或血清。藥用無機酸的例子包括但不限于鹽酸、硝酸、硫酸、和磷酸。藥用有機酸的例子包括但不限于甲酸、乙酸、三氟乙酸、鄰苯二甲酸、富馬酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、苯磺酸、和對-甲苯磺酸。
依照本發(fā)明，液態(tài)或粉劑形式的血漿或血清可以直接施用于傷口，即噴撒在傷口處。片劑形式的血漿可以敷在傷口處，然后適當包扎以保護傷口并防止活性成分的愈合作用減少。任何商品化或常規(guī)的傷口敷料都可用于本發(fā)明。商品化傷口敷料的例子包括但不限于Compeel、Duoderm、Tagaderm、和Opsite。
聯(lián)合藥用載體且包含藥物有效量的血漿或血清的組合物可以通過制藥學領(lǐng)域的已知方法配制成多種形式。施用形式包括但不限于常規(guī)劑量形式的外用制劑，如液態(tài)涂劑、噴霧劑、洗液、乳膏、凝膠、糊劑、擦劑、軟膏、氣霧劑、粉劑、和經(jīng)皮吸收劑。用于制備可施用組合物的現(xiàn)行方法對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是已知的或顯然的，而且在出版物中有更詳細的描述，諸如Remington’s Pharmaceutical Science，第15版，1975年，Mack出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞18042(第87章Blaug，Seymour)，將其內(nèi)容收入本文作為參考。
在本發(fā)明的外用制劑中，可以根據(jù)劑量形式選擇合適的載體，包括但不限于碳氫化合物，諸如凡士林、液體石蠟、和塑化碳氫化合物凝膠(plastibase)；動物和植物油，諸如中等鏈長脂肪酸甘油三酯、豬油、固體脂肪、和可可油；高級脂肪酸及其醇和酯，諸如硬脂酸、十六醇、十八烷醇、和棕櫚酸異丙基；水溶性基質(zhì)，諸如Macrogol(聚乙二醇)、1，3-丁二醇、甘油、明膠、白糖、和糖醇；乳化劑，諸如甘油脂肪酸酯、硬脂酸聚烴氧基、和聚氧乙烯/或固化蓖麻油；增稠劑，諸如丙烯酸酯和海藻酸鈉；推進劑，諸如液化石油氣和二氧化碳；以及防腐劑，諸如對羥苯甲酸酯。本發(fā)明的外用制劑可以通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的方法用上述載體制備。除了所述載體以外，如果需要，還可以使用諸如穩(wěn)定劑、色素、著色劑、pH調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、表面活性劑、和抗氧化劑等添加劑。本發(fā)明的外用制劑還可以通過常規(guī)方法施用于局部傷口處。
依照本發(fā)明的外用制劑還可用于附著在固體支持物上，諸如傷口覆蓋釋放層。附著是通過用血漿或血清組分飽和固體支持物并隨后將組分脫水而實現(xiàn)的。在本發(fā)明的一個實施方案中，首先用附著層包被固體支持物以改進血漿或血清對固體支持物的附著。例示性附著材料包括聚丙烯酸酯和氰基丙烯酸酯。這種制劑有許多商品化產(chǎn)品，包括Smith & Nephew有限公司的在穿孔塑料膜上具有非附著性傷口覆蓋釋放層的繃帶；Johnson &Johnson公司的薄條、小塊、斑點、和熱塑料帶形式的BAND-AID；Kendall公司(Colgate-Palmolive公司的分部)的CURITY和CURAD(“無痛”型繃帶)；和American White Cross Labs公司的STIK-TITE(彈性帶)。
在一個實施方案中，依照本發(fā)明的藥物組合物可以配制成液體涂劑制劑，即將粉劑血漿或血清與生理鹽水以固定的體積比混合，并將由此產(chǎn)生的混合物的pH值調(diào)至3.5-6.5的范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，依照本發(fā)明的藥物組合物可以配制成軟膏制劑，即將粉劑血漿或血清與水溶性軟膏基質(zhì)混合，并向由此產(chǎn)生的混合物中添加生理鹽水。優(yōu)選的是，將軟膏的pH值調(diào)節(jié)至3.5-6.5的范圍內(nèi)。
依照本發(fā)明，可以使用諸如凝膠或微球體等藥用載體來促進傷口的愈合。用作一種或多種藥用或化妝用活性物質(zhì)的載體的多種微球體聚合物描述于美國專利號5,264,207、WO 2000/24378、WO 96/13164、和WO 94/13333，將其內(nèi)容完整收入本文作為參考。
本發(fā)明的藥物組合物可用于處理哺乳動物的多種傷口。尤其是，本發(fā)明的組合物對于處理非愈合性潰瘍是有效的，包括由于感染、惡性腫瘤、大動脈血管功能不全、小動脈血管功能不全、深部靜脈堵塞或功能不全、表面靜脈功能不全(靜脈曲張)、淋巴管阻塞、內(nèi)循環(huán)功能不全、血液異常、膠原血管病、輻射性皮炎、營養(yǎng)原因等等造成的那些潰瘍。
可以用本發(fā)明的藥物組合物處理的具體病癥包括輻射性潰瘍。放療(例如在癌癥治療中)常常導致非愈合性皮膚潰瘍。這些潰瘍因受輻射組織中的循環(huán)不良而對常規(guī)療法反應(yīng)較差，因此常常用低強度激光照射進行處理。輻射性潰瘍對于依照本發(fā)明的含血漿或血清的組合物的處理反應(yīng)良好。在本發(fā)明的一個實施方案中，將1g劑量的含5％(以重量計)血漿或血清的組合物施用于5cm2表面區(qū)域，厚度為大約1.5-2密耳。
本發(fā)明的組合物中所包含的血漿或血清的藥物有效量指使傷口部位周圍的多種細胞激活物質(zhì)和異常細胞正?；⒋龠M傷口愈合的量。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，根據(jù)所處理傷口的類型、所處理傷口的部位、施用的頻率和時間、施用的途徑和形式、所處理傷口的嚴重程度、賦形劑的類型、和其它因素，量可能發(fā)生變化。
通常，每份劑量施用2-5％(以重量計)的粉劑血漿或血清。施用頻率的范圍可以是每天兩次至每周一次。在一個具體實施方案中，每天用0.01-0.1g/cm2本發(fā)明藥物組合物處理全面深度缺陷傷口(fullthickness defect wounds)，優(yōu)選0.02-0.09g/cm2，更優(yōu)選0.02-0.07g/cm2。
圖9顯示了用于治療慢性非愈合性傷口的例示性流程100。如圖9步驟110所示，評估缺陷傷口以確定用本發(fā)明活性成分進行處理的適合性。這種處理適于全面深度缺陷傷口，諸如糖尿病性潰瘍、輻射性潰瘍、褥瘡、三度燒傷、和其它組織壞疽。這種處理還適于部分深度缺陷傷口(partialthickness defect wounds)，諸如二級燒傷、輻射性皮炎、和擦皮術(shù)中受損的組織。
一旦缺陷傷口經(jīng)鑒定適于依照本發(fā)明進行處理，培養(yǎng)傷口(步驟120)以確定是否存在感染。如果需要，清除傷口組織。第4期潰瘍需要清創(chuàng)；某些潰瘍還需要更深入的手術(shù)。當潰瘍充滿膿液和壞死碎片時，應(yīng)用dextranomer珠或其它親水聚合物可能促進組織清除而無需手術(shù)。應(yīng)當開始用鑷子和剪刀進行壞死組織的保守性清除。某些清除術(shù)可以通過用1.5％過氧化氫清洗傷口來完成。用水進行濕敷(尤其是旋渦水浴)將有助于清除。清除壞死組織后的肉芽形成可能滿足覆蓋小面積的皮膚移植的要求。
當培養(yǎng)結(jié)果是陽性時，因感染而處理傷口(步驟140)。在血漿或血清處理前可以施用含抗生素的濕敷(步驟145)，或者聯(lián)合抗生素施用含粉劑血漿或血清的制劑(步驟148)。例示性抗生素包括但不限于青霉素酶抗性青霉素或頭孢菌素。
當培養(yǎng)結(jié)果是陰性時(步驟150)，無需施加抗生素，用本發(fā)明的粉劑血漿或血清處理傷口(步驟155)。
在本文所公開的多種制劑之任一種中，將粉劑血漿或血清施用于傷口，并用常規(guī)傷口敷料包扎傷口，諸如Compeel、Duoderm、Tagaderm、或Opsite傷口敷料。根據(jù)待施用的血漿或血清的量以及由藥用載體釋放血漿或血清的期望特性，間隔1-5天更換敷料，也可以間隔3-4天進行更換。根據(jù)下方組織的受損程度，在短至4天的時間內(nèi)可觀察到部分深度缺陷傷口的愈合，而在短至2-4周的時間內(nèi)可觀察到全面深度缺陷傷口的愈合。
本發(fā)明通過下面的實施例得到了更具體的例示。提供下面的實施例是為了例示而非限制本發(fā)明。
實施例實施例1液態(tài)血漿的制備將證實不含病原體，包括HIV、HCV和乙肝的人新鮮冷凍血漿制品(韓國國家紅十字會中央血液中心，漢城，韓國)于30℃解凍，然后以10∶1的體積比與生理鹽水混合。邊攪動邊添加1N HCl或1N NaOH，將由此產(chǎn)生的混合物的pH值調(diào)至5.5以提供期望的液態(tài)血漿。pH值是使用Orion pH計測量的。
將剩余的血漿制品在凍干瓶、管形瓶、容器或托盤、或其它貯存瓶中冷藏。
實施例2粉劑形式凍干血漿的制備將證實不含病原體，包括HIV、HCV、和乙肝的人新鮮冷凍血漿制品(韓國國家紅十字會中央血液中心，漢城，韓國)于30℃解凍。將500ml由此產(chǎn)生的液體血漿置于凍干瓶中，然后于-80℃(低溫冰箱，F(xiàn)orma Science公司，俄亥俄州，美國)冷凍8小時。將冷凍瓶安置到冷凍干燥/凍干系統(tǒng)(Labconco Corporation，堪薩斯城，密蘇里州，美國)上，并于-48℃凍干7天。所有處理都是在無菌條件下進行的。由500ml液態(tài)血漿得到大約30g凍干的血漿粉劑。
實施例3軟膏制劑的制備將5g如實施例2中所述制備的血漿粉劑與95g水溶性軟膏基質(zhì)(SAM-A基質(zhì)，SAM-A Pharmaceutical Ind.有限公司，漢城，韓國)混合。
在由此產(chǎn)生的混合物中邊攪動邊添加適當量的生理鹽水以提供期望的軟膏?；?g基質(zhì)，軟膏基質(zhì)由下述物質(zhì)組成38mg鯨蠟、116mg硬脂醇、38mg聚乙二醇4000、192mg濃縮甘油、23mg十六醇、適當量的純水、9mg月桂基磺酸鈉、0.87mg對羥苯甲酸乙基、和0.12mg對羥苯甲酸丁基。
實施例4pH調(diào)好的軟膏的制備將5g如實施例2中所述制備的血漿粉劑與95g水溶性軟膏基質(zhì)(SAM-A基質(zhì)，SAM-A Pharmaceutical Ind.有限公司，漢城，韓國)混合。在由此產(chǎn)生的混合物中添加適當量的生理鹽水以提供軟膏。在軟膏中邊攪動邊添加1N HCl或1N NaOH以提供pH值5.5的軟膏。pH是使用Orion pH計測量的。
實施例5粉劑形式凍干血漿的制備將500ml內(nèi)毒素容量不超過0.1ng/mg且血紅蛋白容量不超過30ng/100ml的胎牛血清(FBS，Biofluidsnc公司，羅克維爾，馬里蘭州，美國)置于凍干瓶中，然后于-80℃溫度(低溫冰箱，F(xiàn)orma Science公司，俄亥俄州，美國)冷凍6小時。將冷凍瓶安置在冷凍干燥/凍干系統(tǒng)(Labconco Corporation，堪薩斯城，密蘇里州，美國)上，并于-48℃溫度下凍干7天以提供期望的凍干血漿粉劑。所有處理都是在無菌條件下進行的。
實施例6軟膏的制備將5g如實施例5中所述制備的血漿粉劑與95g水溶性軟膏基質(zhì)(SAM-APharmaceutical Ind.有限公司，漢城，韓國)混合。在由此產(chǎn)生的混合物中添加適當量的生理鹽水以生成軟膏。在軟膏中邊攪動邊添加1N HCl或1N NaOH以提供pH5.5的期望軟膏。pH是使用Orion pH計測量的。
實施例7凝膠的制備將5份重量如實施例2中所述制備的血漿粉劑與95份重量的乳劑混合，乳劑由38mg Carbopol ETD 2020、116mg甘油、38mg丙二醇、192mg三乙醇胺、和適當量的純水組成，以提供pH5.8-6.0的透明凝膠。CarbopolETD 2020是丙烯酸酯和C10-30烷基丙烯酸酯交聯(lián)聚合物的混合物。
試驗實施例1人液態(tài)血漿的傷口愈合作用將如實施例1中所制備的依照本發(fā)明的人液態(tài)血漿施用于全面深度缺陷傷口以進行組織學研究，看它是否促進傷口處的肉芽組織形成。此試驗中使用了10只體重300-350mg的成年白色Sprague-Dawley大鼠。
將動物腹部完全去毛，并造成大小為10mm×10mm的全面深度缺陷傷口。在兩個上肢附近分別造成兩個傷口。同樣的，在兩個下肢附近分別造成兩個傷口。在左側(cè)上下肢處的兩個傷口上敷以大小為10mm×10mm且用0.3ml液態(tài)血漿pH5.5浸濕的兩層紗布。作為對照，在右側(cè)上下肢處的兩個傷口上分別敷以大小為10mm×10mm且用0.3ml蒸餾水浸濕的兩層紗布。然后在上面放置包扎薄膜(Tagaderm，3M)，將所有四個邊用5/0尼龍縫合線縫合使其不會在試驗階段分離。
在試驗后的第7天，取出傷口組織。將活檢樣品在10％中性緩沖福爾馬林中固定24小時，并用石蠟包埋。將石蠟包埋的活檢樣品切成厚度4μm的切片。將切片用蘇木精-伊紅和Masson氏三色進行染色以顯現(xiàn)結(jié)締組織。根據(jù)使用圖像分析軟件(Image專業(yè)版3.0，Microsoft)以100×放大倍數(shù)獲得的顯微鏡觀察結(jié)果，測量所產(chǎn)生肉芽組織的寬度。
還測量了只具有新形成血管的肉芽組織層的厚度。新形成血管是那些由組織基部長到上層的血管，即組織中縱向切片的血管。
在切片厚度不均一的情況中，取具有數(shù)值列表中間值厚度的那些切片。通過Student’s t檢驗法對所得到的數(shù)值進行統(tǒng)計學分析。
結(jié)果顯示，試驗組的肉芽組織顯著比對照組厚。
三色染色揭示了試驗組具有很緊密的沉積膠原纖維，而對照組則顯示薄膠原纖維的松散分布。在試驗組中，在基底部和上層之間建立了密集的肉芽組織新血管，指示肉芽組織生長活躍。相反，對照組則顯示只在肉芽組織的基底部發(fā)現(xiàn)了一些新血管，指示肉芽組織的活躍發(fā)育仍未開始。見圖1A和1B。
在顯微鏡下以40x放大倍數(shù)測量肉芽組織的厚度。使用Student’st-檢驗法對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析(p＜0.05)。試驗組顯示168.62μm±16.06，與對照組的59.44μm±14.42顯著不同(p＜0.01)。數(shù)值表述成平均值±標準偏差(SD)。
試驗實施例2人血漿粉劑的傷口愈合作用將如實施例2中所制備的依照本發(fā)明的人血漿粉劑施用于全面深度缺陷傷口以進行組織學研究，看它是否促進傷口處的肉芽組織形成。
依照上文試驗實施例1中所述的相同方式，在10只成年白色大鼠上造成全面深度缺陷傷口。用0.05g人血漿粉劑處理左側(cè)上下肢的兩個傷口。作為對照，右側(cè)的兩個傷口不進行處理。然后在紗布區(qū)域上面放置包扎薄膜(Tagaderm，3M)，將所有四個邊用5/0尼龍縫合線縫合使其不會在試驗階段分離。
在試驗后的第7天，依照上文試驗實施例1中所述的相同方式，制備染色的肉芽組織切片，隨后對其厚度進行組織學觀察和測量。結(jié)果顯示，試驗組的肉芽組織顯著比對照組厚。
在三色染色中，雖然對照組顯示松散分布的薄膠原纖維，但是試驗組顯示緊密的沉積膠原纖維。試驗組肉芽組織中的新血管發(fā)育與上文試驗實施例1的情況相似，即在基底部和上層之間建立了密集的新血管。見圖2A和2B。
在顯微鏡下以100x放大倍數(shù)測量肉芽組織的厚度。使用Student’st-檢驗法對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析(p＜0.05)。試驗組顯示151.62μm±14.24，與對照組的44.24μm±14.32顯著不同(p＜0.01)。數(shù)值表述成平均值±標準偏差(SD)。
試驗實施例3含人血漿的軟膏的傷口愈合作用將如實施例3中所制備的依照本發(fā)明的含人血漿的軟膏施用于全面深度缺陷傷口以進行組織學研究，看它是否促進傷口處的肉芽組織形成。
依照上文試驗實施例1中所述的相同方式，在10只成年白色大鼠上造成全面深度缺陷傷口。用0.3g本發(fā)明軟膏處理左側(cè)上下肢的兩個傷口。作為對照，用0.3g SAM-A基質(zhì)(SAM-A Pharmaceutical Ind.有限公司，漢城，韓國)處理右側(cè)的兩個傷口。然后在紗布區(qū)域上面放置包扎薄膜(Tagaderm，3M)，將所有四個邊用5/0尼龍縫合線縫合使其不會在試驗階段分離。
在試驗后的第7天，依照上文試驗實施例1中所述的相同方式，制備染色的肉芽組織切片，隨后對其厚度進行組織學觀察和測量。結(jié)果顯示，試驗組的肉芽組織顯著比對照組厚。
在三色染色中，雖然對照組顯示松散分布的薄膠原纖維，但是試驗組顯示緊密的沉積膠原纖維。試驗組肉芽組織中的新血管發(fā)育與上文試驗實施例1的情況相似，即在基底部和上層之間建立了密集的新血管。見圖3A和3B。
在顯微鏡下以100x放大倍數(shù)測量肉芽組織的厚度。使用Student’st-檢驗法對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析(p＜0.05)。試驗組顯示164.50μm±17.64，與對照組的54.54μm±10.02顯著不同(p＜0.01)。數(shù)值表述成平均值±標準偏差(SD)。
試驗實施例4和5含胎牛血清的軟膏和粉劑的傷口愈合作用為了研究來自非人動物的血漿的傷口愈合作用而進行這些試驗。在20只成年白色大鼠腹部造成全面深度缺陷傷口。依照上文試驗實施例2中所述的相同方式，用上文實施例5中制備的胎牛血清粉劑處理第一組10只動物。依照上文試驗實施例3中所述的相同方式，用上文實施例6中制備的胎牛血清粉劑處理第二組10只動物。
在試驗后的第7天，依照上文試驗實施例2和3中所述的相同方式，制備染色的肉芽組織切片，隨后對其厚度進行組織學觀察和測量。結(jié)果顯示，試驗組的肉芽組織顯著比對照組厚。
在三色染色中，雖然對照組顯示松散分布的薄膠原纖維，但是試驗組顯示緊密的沉積膠原纖維。試驗組肉芽組織中的新血管發(fā)育與上文試驗實施例2和3的情況相似，即在基底部和上層之間建立了密集的新血管。見圖4A、4B、5A和5B。
在顯微鏡下以100x放大倍數(shù)測量肉芽組織的厚度。使用Student’st-檢驗法對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析(p＜0.05)。對于胎牛血清粉劑，試驗組顯示152.62μm±20.86，與對照組的41.20μm±7.44顯著不同(p＜0.01)。
對于含胎牛血清的軟膏，試驗組顯示168.62μm±19.26，與對照組的58.62μm±7.62顯著不同(p＜0.01)。
數(shù)值表述成平均值±標準偏差(SD)。
試驗實施例6含胎牛血清的軟膏與PDGF軟膏之間傷口愈合作用的比較在此試驗中，將依照本發(fā)明如上文實施例6中所制備的含胎牛血清的軟膏的傷口愈合作用與FDA最初批準作為傷口愈合劑的Regranex(PDGF軟膏，Johnson & Johnson)的傷口愈合作用進行比較。
依照上文試驗實施例3中所述的相同方式，在10只成年白色大鼠上造成全面深度缺陷傷口，只是沿著腹部中線額外造成兩個全面深度缺陷傷口。用0.3g本發(fā)明軟膏處理左側(cè)上下肢的兩個傷口，用0.3g Regranex處理右側(cè)上下肢的兩個傷口。作為對照，用SAM-A基質(zhì)(SAM-APharmaceutical Ind.有限公司，漢城，韓國)處理腹部中線的兩個傷口。
在試驗后的第7天，依照上文試驗實施例2中所述的相同方式，制備染色的肉芽組織切片，隨后對其厚度進行組織學觀察和檢測。結(jié)果顯示，Regranex處理組的肉芽組織比對照組厚，但比試驗組薄。此外，Regranex處理組的肉芽組織不緊密。
三色染色揭示了Regranex處理組只產(chǎn)生較少的膠原纖維，與對照組沒有差別。相反，試驗組則顯示與正常真皮一樣厚的緊密沉積的膠原纖維，而且分布均勻。對于肉芽組織的新血管而言，Regranex處理組只顯示較少的縱向生長血管。相反，試驗組顯示在基底部和上層之間建立了密集的肉芽組織新血管。見圖6A和6B。
在顯微鏡下以200x放大倍數(shù)測量肉芽組織的厚度。使用Student’st-檢驗法對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析(p＜0.05)。試驗組顯示168.62μm±13.41，與Regranex處理組的81.82μm±18.01顯著不同(p＜0.01)。數(shù)值表述成平均值±標準偏差(SD)。
試驗實施例7含人血漿的軟膏與PDGF軟膏之間傷口愈合作用的比較在此試驗中，將依照本發(fā)明如上文實施例3中所制備的含人血漿的軟膏的傷口愈合作用與Regranex(PDGF軟膏，Johnson & Johnson)的傷口愈合作用進行比較。在成年白色大鼠的腹部造成4個全面深度缺陷傷口。作為對照，第一個上部傷口不用任何制劑進行處理，但是進行很好的保護。用0.3g Regranex處理第二個傷口。分別用0.3g含人血漿的軟膏分別處理第三個和第四個傷口。
與第一個未處理的傷口和第二個用Regranex處理的傷口相比，用含人血漿的軟膏處理的第三個和第四個傷口愈合得更快。圖7顯示了在開始治療后第4天和第11天傷口部位的照片?？梢钥闯鲇醚獫{處理的傷口(標記為Healadex)在第4天顯示愈合開始，而且在第11天傷口幾乎愈合。
試驗實施例8此試驗證實了依照本發(fā)明如上文實施例6中所制備的含F(xiàn)BS的軟膏對大傷口的愈合作用。用本發(fā)明的含F(xiàn)BS的軟膏處理二級燒傷(部分深度缺陷傷口)。圖8顯示了治療后第1天、第2天、和第4天的愈合程度。在治療后第4天觀察到傷口完全愈合。
權(quán)利要求
1.一種用于處理傷口的藥物組合物，其包含藥物有效量的血漿或血清作為活性劑。
2.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中pH在3.5-6.6的范圍內(nèi)。
3.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述活性劑衍生自牲畜。
4.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中它被局部給藥。
5.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其為乳膏，軟膏，凝膠，液體，或貼劑形式。
6.依照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述傷口包括挫傷或擦傷、未愈合的外傷傷口、輻射造成的損傷、擦破、骨壞疽、裂口、撕裂、刺傷、槍擊傷口、切割、燒傷、凍瘡、皮膚潰瘍、皮膚干燥病、皮膚角化病、破損、破裂、皮炎、皮膚真菌引起的疼痛、外科手術(shù)或血管病引起的傷口、角膜損傷、褥瘡性潰瘍、褥瘡、與糖尿病有關(guān)的某些病癥諸如糖尿病型皮膚病和與循環(huán)不暢有關(guān)的某些病癥、慢性潰瘍、整形手術(shù)后的縫合處、脊柱創(chuàng)傷、婦科傷口、化學損傷、和痤瘡。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于處理傷口的含血漿或血清的藥物組合物，以及通過將所述組合物應(yīng)用于傷口處使該部位周圍的組織環(huán)境正?；行幚韨诘姆椒?。
文檔編號A61K35/16GK1668317SQ03816396
公開日2005年9月14日 申請日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月9日
發(fā)明者李相燁, 張京喜, 琴其昌, 柳來春, 劉元敏, 李津 申請人:醫(yī)學基因公司