專利名稱：通過瘤內(nèi)施用乳鐵蛋白治療惡性腫瘤和其他高度增生性疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單獨應(yīng)用乳鐵蛋白組合物或與標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療手段相結(jié)合治療高度增生性疾病的方法。乳鐵蛋白組合物可以通過口服、靜脈、瘤內(nèi)或局部等多種途徑施用。
背景技術(shù)：
目前對許多癌癥類型缺乏有效的治療方法。某一特定病人的治療療程需要根據(jù)診斷結(jié)果、疾病進(jìn)展的階段、以及病人的年齡、性別和一般健康狀況等來確定。癌癥治療最傳統(tǒng)的方法是手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療。手術(shù)在癌癥的診斷和治療中起到中心的作用。一般需要通過手術(shù)進(jìn)行活檢和切除癌癥生長。但如果癌癥已經(jīng)轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散，手術(shù)不太可能有療效，必需使用其他方法。手術(shù)的副作用包括組織器官功能減退、感染危險增加、出血或與凝血相關(guān)的并發(fā)癥。手術(shù)之外的治療方法包括放射治療、化學(xué)治療、生物治療和免疫治療。這些眾多療法的缺點是有副作用，可能包括骨髓功能抑制、刺激皮膚、吞咽困難、口干、惡心、腹瀉、脫發(fā)、體重減輕以及能量損失等(Curran，1998；Brizel，1998)。
乳鐵蛋白是一種單鏈金屬結(jié)合糖蛋白。已知許多細(xì)胞類型，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及小腸刷狀邊緣細(xì)胞都具有乳鐵蛋白的受體。除了作為B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的必須生長因子外，乳鐵蛋白還具有與機(jī)體初級防御機(jī)制相關(guān)的眾多功能。例如，有報道表明乳鐵蛋白可以激活自然殺傷(NK)細(xì)胞、誘導(dǎo)集落刺激活性、激活多形核中性粒細(xì)胞(PMN)、調(diào)節(jié)顆粒形成、增強(qiáng)抗體依賴的細(xì)胞毒性、刺激淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)活性以及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞毒性。
最近，牛乳鐵蛋白(bLF)已被用于預(yù)防腫瘤形成和/或已建立的腫瘤。本發(fā)明是第一次應(yīng)用乳鐵蛋白治療，而不是預(yù)防，已建立的腫瘤。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及治療高度增生性疾病的方法。治療方法包括瘤內(nèi)使用乳鐵蛋白。
本發(fā)明的一個實施方案是治療高度增生性疾病的方法，包括給受試者瘤內(nèi)施用乳鐵蛋白組合物，其用量足以使高度增生性疾病好轉(zhuǎn)。所使用的乳鐵蛋白組合物的用量為每天約0.1μg到約10g。
乳鐵蛋白組合物分布在可藥用的載體中。更優(yōu)選，乳鐵蛋白是哺乳動物乳鐵蛋白，例如人的或牛的。在具體的實施方案中，乳鐵蛋白是重組的乳鐵蛋白。
高度增生性疾病進(jìn)一步定義為癌癥，包括腫瘤。腫瘤選自黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、星狀細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、鱗狀細(xì)胞癌、頭癌、頸癌、齒齦癌、舌癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、肉瘤、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌和膀胱癌。
更進(jìn)一步，高度增生性疾病可以選自風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道病、骨關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管閉塞、再狹窄、動脈硬化、整形損傷、原位癌、口腔絨毛黏膜白斑病以及牛皮癬。
本發(fā)明的另一個實施方案是治療高度增生性疾病的方法，包括提高受試者病灶附近乳鐵蛋白的含量而加強(qiáng)全身和/或局部免疫系統(tǒng)。乳鐵蛋白通過瘤內(nèi)施用。乳鐵蛋白增強(qiáng)、刺激和/或上調(diào)白介素-18和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)?？稍O(shè)想白介素-18可以刺激免疫細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞)的產(chǎn)生或活性；而GM-CSF可以促進(jìn)包括樹突狀細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的遷移和成熟。
本發(fā)明的另一個實施方案是在受試者瘤內(nèi)施用乳鐵蛋白后提高腫瘤附近局部免疫應(yīng)答的方法?？稍O(shè)想乳鐵蛋白組合物可以刺激注射部位白介素-18和/或GM-CSF的產(chǎn)生，而它們將刺激免疫細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞)的產(chǎn)生或活性。T淋巴細(xì)胞可以從由CD4+，CD8+和CD3+組成的一組細(xì)胞中選擇。
本發(fā)明具體的實施方案是治療高度增生性疾病的方法，其包括對受試者瘤內(nèi)施用乳鐵蛋白組合物，并與化學(xué)治療、生物治療、免疫治療、手術(shù)或放射治療相結(jié)合。
前文泛泛地略述了本發(fā)明的特點和技術(shù)優(yōu)勢，以使下文對本發(fā)明的詳細(xì)描述更容易理解。本發(fā)明的其他特點和優(yōu)勢將在下文描述，并組成本發(fā)明權(quán)利要求的主題。熟悉本領(lǐng)域的人員將了解到，本發(fā)明所公開的概念和具體實施方案可以很容易地用做修改或設(shè)計其他體系的基礎(chǔ)，以實現(xiàn)與本發(fā)明相同的目的。他們也將認(rèn)識到那些與本發(fā)明等價的構(gòu)想不會離開本發(fā)明的精髓和范圍，正如從屬權(quán)利要求中所提出的那樣。若與附圖一起考慮，我們將會從下述描述中更好地理解本發(fā)明包括其組織手段和操作方法在內(nèi)的新穎獨特之處，以及進(jìn)一步的目標(biāo)和優(yōu)點。但我們必需明確地了解提供這些附圖的目的僅僅是為了說明和描述，而不是限定本發(fā)明的范圍。
附圖簡述為了更完全地理解本發(fā)明，此處與附圖相配合進(jìn)行說明。


圖1顯示通過口服、靜脈和瘤內(nèi)施用重組人乳鐵蛋白或不使用乳鐵蛋白，鱗狀細(xì)胞腫瘤的生長情況圖2顯示接受乳鐵蛋白、順鉑以及乳鐵蛋白和順鉑配伍治療的動物的腫瘤生長抑制百分比圖3顯示乳鐵蛋白和不同劑量的順鉑配伍使用后腫瘤生長抑制的百分比圖4顯示乳鐵蛋白處理后NK細(xì)胞的活性圖5顯示每天瘤內(nèi)施用乳鐵蛋白1次或2次，或不使用乳鐵蛋白，鱗狀細(xì)胞腫瘤的生長情況發(fā)明詳述很顯然，熟悉本領(lǐng)域人員不用背離本發(fā)明的范圍和精髓就可以對在本實際應(yīng)用中公開的發(fā)明進(jìn)行多種實施和修改。
權(quán)利要求和/或說明書中“個”就如此處與術(shù)語“包含”或“包括”聯(lián)用時一樣，可能意味著“一個”，但也可以意味著“一個或更多”、“至少一個”或“一個或不止一個”等。
此處使用的術(shù)語“高度增生性疾病”指任何細(xì)胞增殖地比正常組織生長快的疾病或異常。因而，一個高度增生的細(xì)胞是指比正常細(xì)胞增殖地快的細(xì)胞。
此處使用的術(shù)語“腸胃外施用”包括使化合物不經(jīng)過小腸而被機(jī)體吸收的任何施用方式。本發(fā)明中使用的“腸胃外施用”包括(但不限于)肌肉、靜脈、腹膜內(nèi)、瘤內(nèi)、眼內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)等施用方式。
此處使用的術(shù)語“靜脈施用”包括通過靜脈注射或輸注而使乳鐵蛋白組合物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的所有技術(shù)。
此處使用的術(shù)語“瘤內(nèi)施用”包括通過注射、電穿孔、膏劑、洗液等使乳鐵蛋白組合物進(jìn)入腫瘤處的所有技術(shù)。
此處使用的術(shù)語“口服”包括口腔、面頰、腸、胃內(nèi)等施用方式。
此處使用的術(shù)語“局部施用”包括對皮膚、表皮、皮下和粘膜表層施用。
此處使用的術(shù)語“可藥用載體”包括任何的和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌抗真菌藥劑、等滲劑和吸收延緩劑等等。這些介質(zhì)和藥劑在藥用活性成分中的使用已為大家所熟知。所有傳統(tǒng)的介質(zhì)或藥劑只要與本發(fā)明的栽體或細(xì)胞相容，都會在治療用組合物中考慮使用。組合物中也可能整合進(jìn)補(bǔ)充的活性成分。
此處使用的術(shù)語“乳鐵蛋白”或“LF”指天然的或重組的乳鐵蛋白。天然的乳鐵蛋白可以從哺乳動物的乳汁或初乳或其他的天然來源中提取。重組乳鐵蛋白(rLF)可以在基因修飾的動物、植物、真菌、細(xì)菌、或其他的原核或真核物種中重組表達(dá)或直接產(chǎn)生、或通過化學(xué)合成等方法獲得。
此處使用的術(shù)語“受試者”是指根據(jù)此處描述的方法施以乳鐵蛋白組合物的任何哺乳動物受試對象。一個實施方案是用本發(fā)明的方法治療人類。另一個實施方案是治療患了高度增生性疾病的人。
此處使用的術(shù)語“治療有效劑量”是指能使疾病或狀況有改善或有好轉(zhuǎn)的劑量。
此處使用的術(shù)語“治療”是指給受試者使用治療有效劑量的一種乳鐵蛋白組合物，以使其有所好轉(zhuǎn)。好轉(zhuǎn)是指癥狀的任何改善或好轉(zhuǎn)。這種改善是觀察到的或是測量到的。因而，熟悉本領(lǐng)域的人員會意識到治療可能會改善疾病狀況，但不一定完全治好疾病。具體地說，病人癌癥的改善可能包括腫瘤穩(wěn)定、腫瘤收縮、腫瘤進(jìn)展減緩、病人生存時間延長或生活質(zhì)量提高。測量CD4+、CD8+、NK以及CD40+等免疫細(xì)胞的數(shù)量和活性可能會反映出治療對免疫系統(tǒng)的有益影響。
此處使用的術(shù)語“附近”表示腫瘤和/或高度增生性疾病的區(qū)域或位點的內(nèi)部或周圍。例如，“一個腫瘤的附近”可能指腫瘤的內(nèi)部或周圍，或腫瘤的邊緣?！案浇卑[瘤鄰近的區(qū)域、腫瘤上部的區(qū)域、腫瘤下部的區(qū)域、腫瘤周圍的邊緣區(qū)域、或腫瘤邊緣區(qū)域的鄰近區(qū)域。
A.藥物組合物本發(fā)明的乳鐵蛋白可以從天然來源中通過分離和純化獲得，例如(但不限于)哺乳動物的乳汁。乳鐵蛋白最好是哺乳動物來源的，例如?；蛉说娜殍F蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，乳鐵蛋白應(yīng)是應(yīng)用眾所周知的和廣為使用的基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組人乳鐵蛋白，例如通過重組表達(dá)或通過基因修飾的動物、植物或真核生物或化學(xué)合成等方式產(chǎn)生。參閱美國專利5581896、5571697和5571691，此處以參考文獻(xiàn)的方式引入。
根據(jù)本發(fā)明，乳鐵蛋白組合物將通過任何常規(guī)的途徑口腔、胃腸道外或局部等方式施用。可用的途徑包括，但不限于，口腔、鼻腔、頰部、直腸、陰道、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈、動脈、瘤內(nèi)或皮內(nèi)。這些組合物一般是此處描述的可藥用的組合物。
本發(fā)明的組合物可配方為中性或鹽的形式。可藥用的鹽包括酸加成鹽(通過蛋白質(zhì)的游離氨基基團(tuán)形成)，可通過無機(jī)酸(如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等)形成。無機(jī)堿(如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機(jī)堿(如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)也可以與游離羧基基團(tuán)形成鹽。
用合適的溶劑溶解所需用量的乳鐵蛋白，并與上文所列的各成分混合，并按照要求進(jìn)行無菌過濾，制備出無菌的注射液。一般情況下，各種無菌的活性成分加入到含有基本分散介質(zhì)和所需的如上列舉的其他成分的無菌容器中，并進(jìn)行分散。若制備無菌粉末，最好使用真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，所產(chǎn)生的粉末含有上述無菌過濾溶液中所含有的活性成分和任何所需的其他成分。
進(jìn)一步依照此發(fā)明，適于口服的組合物的提供方式是含在有或無惰性稀釋劑的可藥用載體中。載體應(yīng)該是可吸收的或可食用的，包括液體的、半固體的(如膏狀)或固體的。如果任何傳統(tǒng)的介質(zhì)、藥劑、稀釋劑或載體對受試者或?qū)ζ渌械娜殍F蛋白組合物的療效無害，那么用它們實現(xiàn)本發(fā)明口服乳鐵蛋白的用法就是合適的。載體或稀釋劑的例子包括脂肪、油、水、鹽水、脂類、脂質(zhì)體、樹脂、結(jié)合物、填充物等等，或者它們的組合。
依照此發(fā)明，可以使用任何方便實際的方法把組合物與載體組合起來。如通過溶解、懸浮、乳化、混合、膠囊、微膠囊、吸附等。這些對于熟悉本領(lǐng)域的人員來說都是常規(guī)程序。
本發(fā)明的一個具體實施方案中，粉末形式的組合物與半固體或固體的載體組合或充分混合?；旌峡梢酝ㄟ^任何一種方便的方式實現(xiàn)，例如研磨。混合過程中也可以加入穩(wěn)定劑，以保護(hù)組合物由于例如胃內(nèi)變性等因素而失去治療活性?？诜姆€(wěn)定劑的例子包括緩沖液、胃酸分泌拮抗劑、甘氨酸和賴氨酸等氨基酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇等糖類、蛋白酶抑組合物等等。對于口服的組合物，穩(wěn)定劑中最好含有胃酸分泌的拮抗物。
進(jìn)一步，與半固體或固體結(jié)合的口服施用組合物可進(jìn)一步制成硬的或軟的膠囊、片劑或丸劑。膠囊、片劑或丸劑最好附上腸溶膜，以免組合物在胃內(nèi)或小腸上部的酸性環(huán)境中變性。請參閱美國專利5629001。藥物進(jìn)入小腸后，小腸內(nèi)的堿性pH將溶解腸溶膜，釋放出組合物，而被特定的細(xì)胞即腸上皮細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)M細(xì)胞所吸收。
另外一個實施方案是粉末型的組合物與液體載體如水或鹽水結(jié)合，可以加入，也可以不加入穩(wěn)定劑。
本發(fā)明可能用到的一個具體的配方是一種配于無鉀等滲磷酸鹽緩沖液中的乳鐵蛋白溶液。緩沖液的組成是6mM一水磷酸二氫鈉、9mM七水磷酸氫二鈉，50mM氯化鈉，pH7.0±0.1。這一配方可以用于任何施用途徑，例如(但不限于)瘤內(nèi)施用。
進(jìn)一步，與半固體結(jié)合用于局部施用的組合物可以進(jìn)一步制成膠狀藥膏劑型。最好用凝膠聚合物制作膠狀藥膏。本發(fā)明制作膠狀組合物所優(yōu)選的聚合物包括(但不限于)carbopol、羧甲基纖維素和Pluronic聚合物。具體地，乳鐵蛋白粉末組合物與含有聚合作用的藥劑(如重量/體積含量為0.5％-5％的Carbopol 980)的液體凝膠混合，用于皮上或皮下治療高度增生性疾病。
配制后，通過與配方劑量一致的方式使用溶液。其用量應(yīng)達(dá)到治療有效，使癥狀好轉(zhuǎn)或改善。劑型應(yīng)該包括易于使用不同劑量形式，如可吸收溶液、藥物釋放膠囊等等。根據(jù)受試者的不同情況，可能會選用不同的劑量。負(fù)責(zé)施用者在任何情況下可以決定對某一特定受試者的施用劑量。此外，給人類施用要滿足FDA生物組合物標(biāo)準(zhǔn)辦公室所要求的無菌度、安全性和純度等標(biāo)準(zhǔn)。
B.治療高度增生性疾病依照本發(fā)明，對患有或可能患有高度增生性疾病的受試者，使用復(fù)合于上述任何一種藥用載體中的乳鐵蛋白組合物予以治療。根據(jù)各種考慮，如藥物的吸收、代謝、施用途徑、受試者的年齡、疾病的嚴(yán)重程度以及對治療的反應(yīng)等，對本領(lǐng)域熟悉的人員可以決定使用人乳鐵蛋白的用量以達(dá)到治療有效。
施用途徑將根據(jù)損傷的位置和性質(zhì)的不同而不同。例如皮內(nèi)、透皮、腸胃外、靜脈、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、氣管內(nèi)、腹內(nèi)、瘤內(nèi)、灌注、灌洗、直接注射以及口服等。
乳鐵蛋白組合物的口服施用包括口腔、頰部、小腸或胃內(nèi)等施用方式。設(shè)想組合物可以作為食品添加劑使用。例如，在吸收前，可以把組合物噴到食物表面或加入液體中。
乳鐵蛋白組合物的瘤內(nèi)施用包括瘤內(nèi)注射、電穿孔或通過外科手術(shù)或內(nèi)窺器植入。對于可接近的離散的固體瘤特別考慮瘤內(nèi)注射，或注入瘤內(nèi)脈管系統(tǒng)。局部、區(qū)域、或全身施用也可能是適合的。
高度增生性疾病包括(但不限于)腫瘤。腫瘤是指異常的組織生長，一般形成一個獨特的腫塊，通常細(xì)胞增殖比正常組織生長得快。腫瘤部分地或全部缺乏組織結(jié)構(gòu)以及與正常組織的功能協(xié)作。可粗略分為三種類型。來源于上皮結(jié)構(gòu)的惡性腫瘤稱為癌癥；來源于如肌肉、軟骨、脂肪、骨等結(jié)締組織的惡性腫瘤稱為肉瘤；而影響造血結(jié)構(gòu)包括免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤稱為白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。此處“腫瘤”包括造血系統(tǒng)腫瘤和實體瘤。
腫瘤的例子包括(但不限于)黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星狀細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、齒齦癌、舌癌、白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、肉瘤、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、骨髓癌，或其他惡性或良性腫瘤。
其他高度增生性疾病包括(但不限于)神經(jīng)纖維瘤病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Waginer氏肉芽腫、Kawasaki氏病、紅斑狼瘡、中線肉芽腫、炎性腸病、骨關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管阻塞、再狹窄、動脈硬化、腫瘤前損傷、原位癌、口腔絨毛粘膜白斑癥、牛皮癬、前白血病、原始細(xì)胞增多性貧血以及脊髓發(fā)育不良綜合癥。
本發(fā)明特別感興趣的腫瘤包括(但不限于)造血系統(tǒng)腫瘤。例如，一個造血系統(tǒng)腫瘤可能包括急性骨髓性白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病或其他造血源性惡化。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是，使用有效量的乳鐵蛋白組合物減少、減輕、抑制或去除腫瘤的生長。乳鐵蛋白組合物的使用量可在每天約0.1μg到約100g之間變化。優(yōu)選每天約1mg到約100g之間，更優(yōu)選每天約20mg到約10g，最優(yōu)選每天4.5g。靜脈內(nèi)施用的乳鐵蛋白可在每天約0.1μg到約10g范圍內(nèi)變化，優(yōu)選每天約0.1μg到約1mg，最優(yōu)選每天250mg。局部施用的乳鐵蛋白可在每天約1μg到約100g范圍內(nèi)變化，優(yōu)選地，局部用的凝膠、溶液、膠囊或藥片含有的乳鐵蛋白濃度在約0.01％到約20％之間，最優(yōu)選約1％到約8.5％。
治療方案也可能各不相同，而常常依賴于腫瘤的類型、腫瘤的位置、疾病進(jìn)展情況以及病人的健康狀況和年齡。顯然，某些腫瘤類型需要積極的治療，而同時，某些病人難以承受繁重的治療程序。根據(jù)治療配方的已知效果和毒性(如果有)，醫(yī)生最適于作出此類決定。
在某些實施方案中，所治療的腫瘤可能至少在開始的階段是可切除的。用乳鐵蛋白組合物治療會使腫瘤的邊緣收縮或去除腫瘤的某些侵襲性部位，因而使切除腫瘤的可能性大增。經(jīng)過乳鐵蛋白治療，腫瘤的切除也許是可能的。切除后繼續(xù)以乳鐵蛋白治療會去除腫瘤位點的微觀殘留病灶。
另一個選擇是，本發(fā)明可能會用在手術(shù)時和/或手術(shù)后治療殘留的或轉(zhuǎn)移的疾病。例如，切除后的瘤床可以注射或灌注含有乳鐵蛋白的組合物。灌注可以在術(shù)后繼續(xù)進(jìn)行，例如在手術(shù)部位留一導(dǎo)管。也設(shè)想在術(shù)后進(jìn)行定期的治療。
如果合適，也可進(jìn)行連續(xù)的施用。例如腫瘤被切除，對瘤床進(jìn)行處理以去除殘留的、微觀的疾病。最好選用注射器或?qū)Ч苁┯?。這種連續(xù)灌注可持續(xù)到處理后約1-2小時、約6-12小時、約12-24小時、約1-2天、約1-2周或更長的時間。一般情況下，在連續(xù)灌注期間經(jīng)過調(diào)整，所用的治療組合物的用量應(yīng)與通過一次或多次注射所用的用量相等。也可考慮通過四肢灌注方式施用本發(fā)明的治療組合物，尤其在用于治療黑素瘤和肉瘤時。
在具體實施方案中，乳鐵蛋白組合物提供單劑量形式或多劑量形式。單劑量可以每日使用一次、或每日多次，或每周多次、或每月一次、或每月多次。在進(jìn)一步的實施方案中，乳鐵蛋白以系列劑量形式提供。系列劑量可以每日施用一次、或每日多次，或每周一次，或每周多次、或每月一次、或每月多次。
本發(fā)明的另一個實施方案是治療高度增生性疾病的方法，其包括通過提高胃腸道乳鐵蛋白含量以補(bǔ)充粘膜免疫系統(tǒng)的步驟。優(yōu)選，乳鐵蛋白通過口服。
而一個進(jìn)一步的實施方案是提高受試者胃腸道內(nèi)粘膜免疫應(yīng)答的方法，其包括給受試者口服施用乳鐵蛋白組合物，優(yōu)選人乳鐵蛋白的步驟。乳鐵蛋白刺激胃腸道內(nèi)白介素-18和GM-CSF的表達(dá)，它們進(jìn)一步增強(qiáng)免疫細(xì)胞。例如，白介素-18可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞活性而GM-CSF可以增強(qiáng)包括樹突狀細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的活性。具體的實施方案是白介素-18(IL-18)可以增強(qiáng)CD4+，CD8+和CD3+細(xì)胞的活性。熟悉本領(lǐng)域的人員都了解IL-18是一種TH1細(xì)胞因子，與白介素-12和白介素-2協(xié)同作用，刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。也可能刺激其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如(但不限于)IL-1b或IL-12或IFN-γ。也可設(shè)想乳鐵蛋白在口服后刺激白介素-18的產(chǎn)生，從而抑制血管形成。由于腫瘤細(xì)胞生長依賴新血管的生成，故而乳鐵蛋白具有抗腫瘤細(xì)胞的活性。
本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案是治療高度增生性疾病的方法，其包括通過增加循環(huán)系統(tǒng)中乳鐵蛋白的含量而加強(qiáng)全身免疫系統(tǒng)的步驟。優(yōu)選，乳鐵蛋白組合物經(jīng)靜脈施用?？梢栽O(shè)想乳鐵蛋白刺激組織內(nèi)IL-18和GM-CSF的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性。例如，IL-18可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞而GM-CSF促進(jìn)包括樹突狀細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的成熟和遷移。在具體的實施方案中，IL-18增強(qiáng)CD4+，CD8+和CD3+細(xì)胞。熟悉本領(lǐng)域的人員都了解IL-18是一種TH1細(xì)胞因子，與白介素-12和白介素-2協(xié)同作用，刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。IL-18也可能刺激其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如(但不限于)IL-1b或IL-12或IFN-γ。也可設(shè)想乳鐵蛋白在靜脈施用后刺激白介素-18的產(chǎn)生，從而抑制血管形成。由于腫瘤細(xì)胞生長依賴新血管的生成，故而乳鐵蛋白具有抗腫瘤細(xì)胞的活性。
本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案是治療高度增生性疾病的一種方法，其包括通過增加腫瘤附近乳鐵蛋白的含量而增強(qiáng)局部或全身免疫系統(tǒng)的步驟?！澳[瘤附近”指腫瘤的一般區(qū)域，例如乳鐵蛋白可以直接用于腫瘤內(nèi)部或上部，也可用于腫瘤的一般區(qū)域而不直接用在腫瘤的內(nèi)部。一般區(qū)域可以包括腫瘤區(qū)域的邊緣或邊緣的附近或鄰近。優(yōu)選，乳鐵蛋白組合物直接用于腫瘤內(nèi)部。可以設(shè)想乳鐵蛋白刺激局部組織中白介素-18和GM-CSF的表達(dá)而增強(qiáng)免疫細(xì)胞。例如，白介素-18可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞活性而GM-CSF可以增強(qiáng)包括樹突狀細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的活性。在一個具體實施方案中，IL-18增強(qiáng)CD4+，CD8+和CD3+細(xì)胞。熟悉本領(lǐng)域的人員都了解IL-18是一種TH1細(xì)胞因子，與白介素-12和白介素-2協(xié)同作用，刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。IL-18也可能刺激其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如(但不限于)IL-1b或IL-12或IFN-γ。也可設(shè)想乳鐵蛋白在瘤內(nèi)施用后刺激白介素-18的產(chǎn)生，從而抑制血管形成。由于腫瘤細(xì)胞依賴新血管的生成，故而乳鐵蛋白具有抗腫瘤細(xì)胞的活性。
本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案是治療高度增生性疾病的一種方法，其包括通過提高腫瘤附近皮膚內(nèi)乳鐵蛋白的含量而加強(qiáng)局部或全身免疫系統(tǒng)的步驟。優(yōu)選，乳鐵蛋白組合物通過局部施用。如上所述，腫瘤附近施用包括在腫瘤邊緣的附近或鄰近施用，或直接在腫瘤的邊緣施用。設(shè)想乳鐵蛋白可以刺激局部組織(如角質(zhì)細(xì)胞)中IL-18和GM-CSF的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。例如，白介素-18可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞活性而GM-CSF可以增強(qiáng)包括樹突狀細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的活性。
在一個實施方案中，IL-18增強(qiáng)CD4+，CD8+和CD3+細(xì)胞。熟悉本領(lǐng)域的人員都了解IL-18是一種TH1細(xì)胞因子，與白介素-12和白介素-2協(xié)同作用，刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。IL-18也可能刺激其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如(但不限于)IL-1b或IL-12或IFN-γ。也可設(shè)想乳鐵蛋白在局部施用后刺激白介素-18的產(chǎn)生，從而抑制血管形成。由于腫瘤細(xì)胞依賴新血管的生成，故而乳鐵蛋白具有抗腫瘤細(xì)胞的活性。
C.聯(lián)合治療為了提高本發(fā)明的人乳鐵蛋白組合物的效果，把本發(fā)明的組合物與其他治療高度增生性疾病有效的藥劑(例如抗癌藥劑)或手術(shù)結(jié)合起來可能是理想的?！翱拱彼巹┛梢苑疵娴赜绊懯茉囌叩陌┌Y，例如，可以殺死癌細(xì)胞、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、降低癌細(xì)胞的增長率、減少轉(zhuǎn)移的發(fā)生或數(shù)量、減小腫瘤體積、抑制腫瘤生長、降低對腫瘤或癌細(xì)胞的輸血量、防止或抑制癌的進(jìn)展、或提高癌癥患者的壽命?？拱┧巹┌ㄉ锼巹?生物治療)、化學(xué)治療藥劑和放射治療藥劑。更一般地，這些其他組合物將使用能聯(lián)合有效殺死或抑制細(xì)胞增殖的劑量。這一過程可能包括同時使用本發(fā)明的人乳鐵蛋白組合物和其他藥劑或各種因素。為達(dá)到上述目的，可以使用一種同時包括兩種藥劑的組合物或劑型；或同時使用兩個完全分開的組合物或劑型、或在協(xié)同作用的有效期內(nèi)分別使用。其中，一種組合物含有乳鐵蛋白，而另一個含有第二藥劑。
另一個選擇是本發(fā)明的乳鐵蛋白組合物可在其他抗癌藥劑治療之前或之后施用，間隔可以從幾分鐘到幾周。在實施中，對癌細(xì)胞分別使用其他抗癌藥劑和乳鐵蛋白組合物時，應(yīng)該保證它們的間隔不要超過一定期限，以使抗癌藥劑和乳鐵蛋白組合物仍可對癌細(xì)胞發(fā)揮有益的協(xié)同作用。在這種情況下，可以考慮在互相間隔1-14天內(nèi)使用兩種療法，優(yōu)選在12-24小時之間。在一些情況下，也可延長治療間隔，如幾天(2、3、4、5、6或7)或幾個星期(2、3、4、5、6、7或8)。
1.化學(xué)治療癌癥治療也包括很多基于化學(xué)藥劑的療法。一些化學(xué)治療藥劑包括(而不限于)抗生素化學(xué)治療藥劑，如阿霉素(Doxorubicin)、柔紅霉素、阿霉素(adriamycin)、絲裂霉素(也成為突變霉素和/或絲裂霉素-C)、放線菌素D、博來霉素(爭光霉素)、Plicomycin等；植物堿，如紫杉醇(Taxol)，長春新堿，長春堿等；其他藥劑如基于鉑的藥劑(如順鉑(CDDP))、依托泊苷(VP16)、腫瘤壞死因子、烷化劑如卡莫斯汀、美法侖(左旋溶肉瘤素，苯丙氨酸氮芥)、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安(馬勒蘭，甲磺酸丁二醇二酯)等、基于taxane的藥劑(如多西他賽)以及羅氮芥等。
一些其他藥劑的例子包括(但不限于)卡鉑、甲基芐肼(甲芐肼)、二氯甲基二乙胺、伊立替康、拓?fù)涮婵?、異環(huán)磷酰胺、Nitrosurea、依托泊苷(VP16)、它莫西芬(三苯氧胺)、雷洛昔芬、托瑞米芬、艾多西芬、著洛西芬、TAT-59、Zindoxifene、曲奧昔芬、ICI 182780、EM-800、雌激素受體結(jié)合劑、吉西他濱、異長春花堿、法尼基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉑、5-氟尿嘧啶、過氧化氫、氨甲蝶呤、Temazolomide(DTIC的液態(tài))、Mylotarg、Dolastatin-10、薯司他丁或上述任何藥劑的類似物或衍生物。
2.放射治療劑放射治療劑和因素包括可以誘導(dǎo)DNA損傷的放射線和波，例如γ輻射、X射線、紫外輻射、微波、電子放射、放射性同位素等等。可以利用上述放射形式對腫瘤所在的位點進(jìn)行照射而完成治療。上述各因素很可能對DNA、DNA前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)以及染色體的組裝和維持產(chǎn)生大面積的損傷。
X射線的劑量可在每日50-200倫琴并延續(xù)一段時間(3-4周)，到一次性單劑量2000-6000倫琴之間變動。放射性同位素的劑量范圍很廣，并依賴于同位素的半衰期、放射線的強(qiáng)度和類型、以及腫瘤細(xì)胞的攝取度。
3.手術(shù)大約60％的癌癥患者要接受某種形式的手術(shù)，包括預(yù)防性的、用于癌癥診斷或分期的、治療性的以及緩解性的手術(shù)。治療性手術(shù)可與其他治療結(jié)合起來，例如本發(fā)明的治療、化學(xué)治療、放射治療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或其他的治療。
治療性手術(shù)包括腫瘤切除，即對癌癥組織全部或部分地物理去除、切離和/或破壞。腫瘤切除是指通過物理方法至少去除腫瘤的一部分。除了腫瘤切除，手術(shù)治療還包括激光外科、冷凍外科、電外科以及顯微外科(莫氏外科)。也可進(jìn)一步考慮將本發(fā)明與去除表層癌、癌前病變或附帶的正常組織相結(jié)合。
切除癌細(xì)胞、癌組織或腫瘤后體內(nèi)可能會形成一個腔?？赏ㄟ^灌注、直接注射或局部施用等方式在該區(qū)域使用另外一種抗癌治療。這種治療可以重復(fù)，例如每1、2、3、4、5、6、7天或每1、2、3、4、5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月治療一次。這些治療的劑量也可能不同。
4.其他生物治療藥劑本發(fā)明可考慮與其他生物藥劑相結(jié)合，以加強(qiáng)治療的效果。這些另外的藥劑包括(不限于)影響細(xì)胞表面受體上調(diào)和縫隙連接的藥劑、細(xì)胞生長抑組合物和細(xì)胞分化劑、細(xì)胞粘附抑組合物、增強(qiáng)高度增生性細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感度的藥劑、或其他生物藥劑或生物療法，如熱療。
熱療是一種使病人的組織暴露于高溫(高達(dá)106°F)的方法?？墒褂猛庥玫幕騼?nèi)用的加熱器進(jìn)行局部、區(qū)域或全身的熱療。局部熱療用于小面積加熱，如腫瘤?？捎皿w外設(shè)備對準(zhǔn)腫瘤產(chǎn)生高頻波而加熱。內(nèi)源加熱可能會用到各種無菌探針，包括熱的金屬細(xì)絲、或裝有熱水的中空管、植入的微波探頭或無線電頻率電極等。
可使用產(chǎn)生高能的裝置如磁鐵對病人的器官或四肢加熱進(jìn)行區(qū)域治療?；蛘叱槿∫恍┎∪说难翰⒓訜?，然后再輸回到某一需要內(nèi)部加熱的區(qū)域。如果癌癥已經(jīng)擴(kuò)散全身，也可通過熱水毯、熱蠟、感應(yīng)線圈以及溫室等對全血進(jìn)行加熱。
本發(fā)明也可與激素治療相結(jié)合。激素可能會被用來治療某些特定癌癥，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或?qū)m頸癌，用以降低或阻斷某些激素(如睪丸甾酮或雌激素)的效果，并且往往可以減少轉(zhuǎn)移的危險。
本發(fā)明也可與佐劑治療相結(jié)合。所用的佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑包括(但不限于)腫瘤壞死因子；干擾素α、β和γ；IL-2和其他細(xì)胞因子；F42K和其他細(xì)胞因子類似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、以及其他化學(xué)因子。
5.免疫治療免疫治療一般依賴于使用效應(yīng)細(xì)胞和分子來定位和破壞癌癥細(xì)胞。例如，免疫效應(yīng)物可以是某一腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的特異抗體。抗體本身可作為治療的效應(yīng)分子，也可結(jié)合其他細(xì)胞來發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用?？贵w也可與藥物或毒素(化學(xué)治療劑、放射性核素、蓖麻毒素A、霍亂毒素、百日咳毒素等)等結(jié)合而僅僅作為靶向試劑。此外，效應(yīng)物也可以是那些攜帶能與腫瘤靶標(biāo)直接或間接結(jié)合的表面分子的淋巴細(xì)胞。這些不同的效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞。
本發(fā)明可以考慮與用于治療癌癥的疫苗相結(jié)合而提高治療效果。這種疫苗包括多肽疫苗或樹突狀細(xì)胞疫苗。多肽疫苗可以包括任何可被細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞識別的腫瘤特異抗原。進(jìn)一步講，熟悉本領(lǐng)域的人員會了解樹突狀細(xì)胞免疫是指應(yīng)用多肽或抗原激活樹突狀細(xì)胞，并把此樹突狀細(xì)胞輸?shù)讲∪梭w中。
腫瘤特異抗原的例子包括(但不限于)gp100或MAGE-3，它們被用作黑素瘤疫苗。這些抗原被用做多肽疫苗和/或樹突狀細(xì)胞疫苗而施用。
D.實施例下列實施例用以展示本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。熟悉本領(lǐng)域的人員應(yīng)該了解到下列實施例中所公布的技術(shù)代表了發(fā)明者所發(fā)現(xiàn)的在發(fā)明實踐中應(yīng)用較好的技術(shù)，因而被認(rèn)為構(gòu)成了本發(fā)明優(yōu)選的實踐模式。然而，根據(jù)本公開，熟悉本領(lǐng)域的人員應(yīng)該而了解到此處公開的實例可以進(jìn)行多種改變而不背離本發(fā)明的精髓和范圍。
實施例1rhLF抑制腫瘤生長使用人鱗狀細(xì)胞癌(O12)。將細(xì)胞注入到無胸腺裸鼠右側(cè)。rhLF通過瘤內(nèi)(49只動物，7個劑量，劑量范圍為0.05μg到125μg)、靜脈(7只動物，每個劑量125μg)、或口服(7只動物，每個劑量20mg)施用。對照動物僅以載體處理，而不加入rhLF。接種腫瘤11天待腫瘤形成后，每天使用rhLF兩次，持續(xù)5天(靜脈組)或8天(所有其他組)。
通過實驗期間和之后測量實體瘤體積來評價治療效果；測量腫瘤的同時也測量體重。如圖1和表1所示，同對照組相比，rhLF處理使腫瘤生長降低了46％-80％。事實上，口服20mg rhLF的效果最好，與對照組相比，腫瘤的生長被抑制了80％(P＝0.0073)。
表1rhLF在小鼠O12腫瘤模型中抑制腫瘤生長的總結(jié)
*指處理后時間**具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)***統(tǒng)計學(xué)意義十分顯著(p＜0.01)本研究的結(jié)果表明通過多種途徑給藥的rhLF可以在鱗狀細(xì)胞小鼠腫瘤模型中顯著地抑制腫瘤的生長。根據(jù)這些結(jié)果，可認(rèn)為口服的乳鐵蛋白通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性而影響腫瘤。
實施例2rhLF在不同腫瘤類型中的評價多種腫瘤類型的腫瘤細(xì)胞注入到無胸腺裸鼠的右側(cè)。在大約接種腫瘤11天待腫瘤長出后，或根據(jù)常規(guī)或已發(fā)表方法確定的其他時間，對實驗動物口服使用rhLF、天然hLF或牛LF。對照動物僅以載體處理，而不含rhLF。給實驗動物使用rhLF，每天一次或兩次，持續(xù)1天、5天、7天、8天或14天。
通過實驗期間和之后測量實體瘤體積來評價治療效果；測量腫瘤的同時也測量體重。通過測量循環(huán)系統(tǒng)和小腸中細(xì)胞因子、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的量來測量免疫應(yīng)答。
實施例3口服rhLF和bLF的效果對小鼠口服施用rhLF和bLF，并測量小腸內(nèi)IL-18的產(chǎn)生。
小鼠以65mg/kg/day的rhLF、300mg/kg/day的rhLF或300mg/kg/day的bLF處理三天。對照組僅以藥用載體處理。LF處理24小時后，或?qū)φ战M3天后，對實驗動物進(jìn)行稱重，并采集血和血清。血清用于通過ELISA測量細(xì)胞因子。
并且在這些時間點上，處理掉動物，分離出小腸用于進(jìn)一步分析。小腸上皮用含有PBS、1％Nonidet P-40、0.5％脫氧膽酸鈉、含有10μg/mlPMSF的0.1％SDS裂解液勻漿。勻漿物在15000rpm下離心10分鐘，上清儲存于-80℃直到用于分析IL-18的水平。
如表2和表3所示，兩個劑量的rhLF都可以顯著提高血清和小腸提取物中IL-18的含量。bLF可以較低程度地提高小腸IL-18的含量，但沒有提高血清中IL-18的含量。
表2rhLF和bLF對小腸和血清中IL-18水平的影響
表3rhLF和bLF對小腸和血清中IL-18水平的刺激
實施例4口服rhLF對體內(nèi)NK細(xì)胞活性的影響B(tài)alb/c幼鼠每天口服1次rhLF或安慰劑，共3天(見表4)。
表4處理方案
第4天處理掉小鼠并采集脾。經(jīng)磁珠細(xì)胞分離方法(MACSanti-NK-DX5)分離NK細(xì)胞并計數(shù)。應(yīng)用乳酸脫氫酶釋放試驗測量NK細(xì)胞對YAC靶標(biāo)的體外活性。
表5表明口服rhLF使得NK細(xì)胞對于YAC靶標(biāo)細(xì)胞的離體活性顯著增加(30∶1處為10％，而對照組為2.8％)。而安慰劑處理的對照組小鼠則沒有顯著的NK活性變化。
表5口服rhLF處理的小鼠的NK細(xì)胞活性
*細(xì)胞毒百分比＝[(效應(yīng)細(xì)胞加靶標(biāo)細(xì)胞-效應(yīng)細(xì)胞對照)]-較低對照/[(較高對照-較低對照)]×100**p＜0.05(雙側(cè)p值)
實施例5口服rhLF對體內(nèi)GM-CSF的影響給小鼠口服rhLF或安慰劑，測量小腸中GM-CSF的產(chǎn)生。
每天以300mg/kg的rhLF處理小鼠(每組5只動物)，連續(xù)3天。對照組僅使施藥用載體。使用LF后24小時或使用安慰劑后3天處死動物，并分離小腸組織用于進(jìn)一步分析。小腸上皮用含有PBS、1％Nonidet P-40、0.5％脫氧膽酸鈉、含有10μg/ml PMSF的0.1％SDS裂解液勻漿。勻漿物在15000rpm下離心10分鐘，上清儲存于-80℃直到用于以ELISA試劑盒分析GM-CSF的水平。
如表6所示，相對于對照組動物，以rhLF處理動物使得小腸中一個主要的免疫刺激細(xì)胞因子即GM-CSF的產(chǎn)生增加。
表6 rhLF對小腸和血清中GM-CSF水平的影響
實施例6hLF與化學(xué)治療的結(jié)合通過頸部皮膚將一株小鼠鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞珠(SCCVII)注入到有免疫能力的C3H小鼠的口腔底層(第0天)。接種腫瘤細(xì)胞5天后(第5天)在下頸處切開，將已建立的腫瘤切除。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的三維尺度。
將荷瘤小鼠隨機(jī)分成對照組和7組接受rhLF和/或順鉑的治療。從第5天一直到第12連續(xù)8天，每天通過管飼法給小鼠喂食rhLF(4mg；200mg/Kg)。在rhLF治療的開始(第5天)、中間(第8天)或結(jié)束(第12天)，給小鼠腹膜內(nèi)注射5mg/Kg單一劑量的順鉑。在第12天處死動物，測量殘余瘤塊，并進(jìn)行后繼試驗。
表7試驗組
與安慰劑組相比，rhLF單獨、順鉑單獨或兩者合用處理的小鼠，腫瘤生長抑制(TGI)。兩者合用的抑制作用最強(qiáng)(表7和圖2)。
在所有的樣本中，與單獨接受順鉑處理的相關(guān)動物相比，接受rhLF+順鉑處理的動物均表現(xiàn)出腫瘤生長抑制(TGI)。綜合分析，rhLF+順鉑的TGI與安慰劑比較為77％(P＜0.0001)，與僅用rhLF比較為66％(P＜0.01)，與僅用順鉑比較為63％(P＜0.01)。
在rhLF治療之前(RhLF+CP-5)立即使用順鉑或在rhLF治療期間(RhLF+CP-8)使用順鉑比在rhLF治療之后(RhLF+CP-12)使用順鉑的效果更好。然而，只有跨越治療方案(RhLF+CP-8)相對于單獨使用順鉑的TGI(77％)有顯著的改善(P＜0.01)。
表8治療組的腫瘤生長抑制(TGI)
*相對于安慰劑組的抑制及單側(cè)P值**相對于各個順鉑組的抑制及單側(cè)P值實施例7hLF與化學(xué)治療聯(lián)用的劑量依賴如實施例6所述，通過頸部皮膚將一株小鼠鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞珠(SCCVII)注入到有免疫能力的C3H小鼠的口腔底層(第0天)。接種腫瘤5天后，測量腫瘤大小作為本底，而后以順鉑單獨(第8天，腹腔注射，5mg/kg)或順鉑加上三個劑量的口服rhLF(從第5天到第11或12天通過管飼法連續(xù)喂服7到8天)處理。第11或12天處死小鼠，測量腫瘤。如圖3所示，與單獨使用順鉑相比，聯(lián)合使用rhLF和順鉑對小鼠的腫瘤生長具有劑量依賴性的抑制作用。
實施例8hLF與多西他賽聯(lián)用如實施例7所述，通過頸部皮膚將一株小鼠鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞珠(SCCVII)注入到有免疫能力的C3H小鼠的口腔底層(第0天)。接種腫瘤5天后，測量腫瘤大小作為本底，而后單獨口服安慰劑(第5-12天每天1次，6只動物)、安慰劑加多西他賽(第8天靜脈施用31.3mg/kg多西他賽丸劑，9只動物)或多西他賽加上口服rhLF(200mg/kg，從第5-9天管飼法喂食；9只動物)。與安慰劑相比，多西他賽單獨使用可以抑制腫瘤生長，而rhLF與多西他賽聯(lián)用可進(jìn)一步抑制腫瘤生長。抑制作用和P值(單側(cè))顯示在表9中。
表9治療組的腫瘤生長抑制(TGI)
實施例9hLF與放射治療聯(lián)用通過頸部皮膚將一株小鼠鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞珠(SCCVII)注入到有免疫能力的C3H小鼠的口腔底層(第0天)。接種腫瘤細(xì)胞5天后(第5天)在下頸處切開，將已建立的腫瘤切除。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的三維尺度。
將荷瘤小鼠隨機(jī)分為6組，如下接受rhLF(200mg/Kg)處理和/或放射治療。從第5天一直到第12天連續(xù)8天，每天通過管飼法給小鼠喂食rhLF(4mg；200mg/Kg)。在rhLF治療的開始(第5天)和期間(第8天)給小鼠使用2戈瑞(Gray)的單一劑量照射。在處理后第14天處死動物，測量殘余瘤塊，并進(jìn)行后繼試驗。
表10實驗分組
*從第5天到第12天每天口服RhLF/安慰劑與安慰劑組相比，單獨服用rhLF、單獨放射治療或兩者合用的小鼠腫瘤生長得到明顯抑制。兩者合用的抑制作用比任何一種獨用的抑制作用稍有增加，比獨用rhLF增加28％(P＜0.05)，比獨用發(fā)射治療增加15％(P＝0.1207)。
表11治療組的腫瘤生長抑制(TGI)
*與安慰劑組相比的抑制作用以及單側(cè)P值因而，乳鐵蛋白刺激免疫系統(tǒng)。進(jìn)一步，乳鐵蛋白與順鉑、多西他賽以及放射治療聯(lián)用致使腫瘤生長受到抑制。
實施例10人類口服hLF在四個國家(阿根廷、巴西、智利、美國)的多個中心進(jìn)行的兩個不同研究中，患有多種轉(zhuǎn)移性癌癥類型的人類患者口服了重組人乳鐵蛋白。RhLF以每日1.5到9克的兩個不同劑量使用14輪，每輪間隔14天。
以CT掃描和可用的腫瘤標(biāo)記物監(jiān)控腫瘤大小的進(jìn)展。首先進(jìn)行本底CT掃描，一旦開始治療，每隔8用掃描一次CT，并且也與進(jìn)入本研究之前的本底前CT掃描相比較。每4周測量一次腫瘤標(biāo)記。采取血樣測量循環(huán)淋巴細(xì)胞的亞型和NK細(xì)胞的活性。采取血漿、血清和血細(xì)胞提取物樣本測量循環(huán)IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，19個評測病人中(經(jīng)過1次本底CT掃描和至少1次治療后掃描)，9個病人(47％)在第1次治療后CT掃描時表現(xiàn)出疾病穩(wěn)態(tài)?；加懈鞣N腫瘤類型的病人從使用乳鐵蛋白中獲益。
表12顯示6個不同腫瘤類型的病人的腫瘤應(yīng)答。用CT掃描測量在rhLF治療前腫瘤大小增長的百分比(相應(yīng)的持續(xù)時間顯示在括號中)和隨后兩個時間段腫瘤的增長百分比，表明在所有病例中腫瘤增長率降低或顯示出腫瘤收縮。
表12接受口服rhLF治療轉(zhuǎn)移性癌癥的病人的腫瘤應(yīng)答
實施例11在人類中用口服hLF聯(lián)合治療人類病人可單獨口服重組人乳鐵蛋白或與標(biāo)準(zhǔn)抗癌方案結(jié)合以抑制腫瘤生長。
簡單地說，根據(jù)實施例10中確定的最佳治療方案和劑量使用rhLF，并且根據(jù)腫瘤類型選擇標(biāo)準(zhǔn)的抗癌方案作為聯(lián)合治療的一部分。所附加的抗癌治療的施用途徑和方法遵照FDA批準(zhǔn)的或經(jīng)同行評議發(fā)表的方法。
以CT掃描和可用的腫瘤標(biāo)記物監(jiān)控腫瘤大小的進(jìn)展。首選進(jìn)行本底CT掃描，一旦開始治療，每8周掃描一次CT，每4周測量一次腫瘤標(biāo)記。采取血樣以測量循環(huán)淋巴細(xì)胞的亞型和NK細(xì)胞的活性。采取血漿、血清和血細(xì)胞提取物樣本以測量循環(huán)IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
實施例12口服rhLF后的免疫刺激Balb/c幼鼠每天口服rhLF或安慰劑1次，連續(xù)3天。1天后(第4天)，將小鼠處死，收集脾細(xì)胞。NK細(xì)胞以磁珠細(xì)胞分離試驗(MACSanti-NK-DX5)分離并計數(shù)。而后通過乳酸脫氫酶釋放試驗體外測量NK細(xì)胞對YAC靶標(biāo)的活性。
如圖4所示，口服rhLF處理使得NK細(xì)胞對YAC靶標(biāo)細(xì)胞的離體活性顯著增加。在效應(yīng)細(xì)胞∶靶標(biāo)細(xì)胞的比例為30∶1時，使用rhLF使得相對于安慰劑處理組的活性提高了243％(從2.86％到9.81％，p＜0.05)。
實施例13靜脈施用的效應(yīng)對實驗動物(優(yōu)選大鼠)靜脈使用rLF、bLF和天然LF，測量血漿、血清和血積層細(xì)胞產(chǎn)生IL-18、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IFNγ的量。
簡單地說，以每個劑量0.05μg到100μg的量連續(xù)處理大鼠14天。對照組大鼠則使施用物載體。在使用LF或?qū)φ蘸蟮奶囟〞r間點，即0天、2天、3天、5天、9天和14天，稱重動物，并采集全血和血清。從全血中計數(shù)CD4+、CD8+和NK的水平。血漿、血清和血細(xì)胞提取物則用于ELISA試驗測量細(xì)胞因子。
另外，在24天時間點，處死動物，分離出組織用于進(jìn)一步分析。組織用含有PBS、1％乙基苯基聚乙二醇P-40、0.5％脫氧膽酸鈉、含10μg/ml PMSF的0.1％ SDS裂解液勻漿。勻漿物在15000rpm下離心10分鐘，上清儲存于-80℃直到用于分析IL-18、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IFNγ等。
實施例14靜脈施用rhLF與其他藥劑的聯(lián)合化學(xué)治療將待測腫瘤細(xì)胞注入無胸腺裸鼠的右側(cè)。如實施例13所述，單獨靜脈使用rhLF以及與其他抗癌方法結(jié)合。對照動物僅使用載體，而不含rhLF。根據(jù)實施例13中實驗得出的最佳方法使用rhLF?？拱┲委熓褂脴?biāo)準(zhǔn)的或已發(fā)表的方法。治療從接種后11天開始，以使腫瘤建立和形成?；蚋鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)或已發(fā)表方法在其他時間點上進(jìn)行。
通過在實驗之間或?qū)嶒炛鬁y量實體瘤體積來評估治療效果。測量腫瘤時也同時測量動物的體重。
實施例15人體靜脈施用hLF病人可靜脈施用重組乳鐵蛋白以抑制腫瘤生長。
簡單地說，患有不可切除癌癥或癌癥已轉(zhuǎn)移的病人每天使用500mgrhLF，連續(xù)8天?；蛘?，癌癥已轉(zhuǎn)移的病人使用rhLF 1-8天，每天的劑量是0.1、1、10、100和1000mg。均通過靜脈施用。
以CT掃描和可用的腫瘤標(biāo)記物監(jiān)控腫瘤大小的進(jìn)展。首先進(jìn)行本底CT掃描，一旦開始治療，每隔8周掃描一次CT，每4周測量一次腫瘤標(biāo)記。采取血樣以測量循環(huán)淋巴細(xì)胞的亞型和NK細(xì)胞的活性。采取血漿、血清和血細(xì)胞提取物樣本以測量循環(huán)IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
實施例16用靜脈施用的hLF聯(lián)合治療通過靜脈施用給病人單獨使用重組乳鐵蛋白，或與標(biāo)準(zhǔn)抗癌方法聯(lián)用，以抑制腫瘤生長。
簡單地說，根據(jù)實施例15中確定的最佳治療方法和劑量使用rhLF，并且根據(jù)腫瘤類型選擇標(biāo)準(zhǔn)的抗癌方法作為聯(lián)合治療的一部分。所附加的抗癌治療的施用途徑和方法遵照FDA批準(zhǔn)的或經(jīng)同行評議發(fā)表的方法。
以CT掃描和可用的腫瘤標(biāo)記物監(jiān)控腫瘤大小的進(jìn)展。首先進(jìn)行本底CT掃描，一旦開始治療，每8周掃描一次CT，每4周測量一次腫瘤標(biāo)記。采取血樣以測量循環(huán)淋巴細(xì)胞的亞型和NK細(xì)胞的活性。采取血漿、血清和血細(xì)胞提取物樣本以測量循環(huán)IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
實施例17瘤內(nèi)rhLF的活性將人口咽鱗狀細(xì)胞癌的O12腫瘤細(xì)胞注入無胸腺裸鼠的右側(cè)。通過瘤內(nèi)施用途徑給動物使用重組人乳鐵蛋白和載體對照。每個動物使用50μl劑量不同濃度的rhLF，每個50μl劑量由4個約12.5μl的分劑量組成，以不同的方向和角度注射(大約相當(dāng)于東、南、西、北)，以使整個劑量均勻分布在整個腫瘤中(即鋪展開)。
表13通過瘤內(nèi)注射重組人乳鐵蛋白治療裸鼠中人鱗狀細(xì)胞癌的方案
表13顯示了每個實驗組的方案和每組每只動物每針使用rhLF的劑量。本研究中，將rhLF直接注入腫瘤。通過外部卡尺測量突出腫瘤，每日跟蹤每只動物的腫瘤生長。
本模型中，與對照組相比，兩個rhLF處理組腫瘤生長都十分明顯地減小。從A組和C組中合并出安慰劑組，其腫瘤大小中等。與之相比，使用了單劑量rhLF組(A組)的動物的腫瘤在施用11天后其生長減少了50％(p＜0.05)；而每日2次施用組(C組)則減少了56％(見圖5)。
實施例18瘤內(nèi)施用rhLF后的免疫刺激根據(jù)實施例17中的方法，正常C3H/HeJ小鼠接種SCCVII和RIF小鼠腫瘤細(xì)胞系中的一個。小鼠內(nèi)腫瘤建立起來后，每天瘤內(nèi)注射每個劑量為250μg或500μg的rhLF或載體對照，連續(xù)4天。最后一次注射24小時后處死小鼠并觀察血中淋巴細(xì)胞數(shù)量。與安慰劑處理的對照動物相比，循環(huán)淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加了34％到56％(表14)。
表14瘤內(nèi)注射rhLF后循環(huán)淋巴細(xì)胞的增加
實施例19hLF與其他藥劑聯(lián)合化學(xué)治療將待測腫瘤細(xì)胞注入無胸腺裸鼠的右側(cè)。如實施例1或?qū)嵤├?7中所述，單獨瘤內(nèi)施用rhLF以及與其他抗癌方法聯(lián)用。對照動物僅使用載體，而不含rhLF?？拱┲委熓褂脴?biāo)準(zhǔn)的或已發(fā)表的方法。治療從腫瘤細(xì)胞接種后約11天開始，以使腫瘤建立和形成；或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)或已發(fā)表方法在其他時間點上進(jìn)行。
通過在實驗之間或?qū)嶒炛鬁y量實體瘤體積來評估治療效果。測量腫瘤時也同時測量動物的體重。
實施例20瘤內(nèi)施用hLF病人可以通過瘤內(nèi)施用重組乳鐵蛋白抑制腫瘤生長。
簡單地說，患有無法切除或已轉(zhuǎn)移癌癥的病人每天使用1000μgrhLF，連續(xù)8天。或者，已轉(zhuǎn)移癌癥病人使用rhLF 1到8天，每天使用劑量為10、50、100、500以及1000μg。采用瘤內(nèi)施用方式。
以CT掃描和可用的腫瘤標(biāo)記物監(jiān)控腫瘤大小的進(jìn)展。首先進(jìn)行本底CT掃描，一旦開始治療，每隔8周掃描一次CT，每4周測量一次腫瘤標(biāo)記。采取血樣以測量循環(huán)淋巴細(xì)胞的亞型和NK細(xì)胞的活性。采取血漿、血清和血細(xì)胞提取物樣本以測量循環(huán)IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
實施例21用瘤內(nèi)hLF聯(lián)合治療通過瘤內(nèi)施用給病人單獨使用重組乳鐵蛋白，或與標(biāo)準(zhǔn)抗癌方法聯(lián)用，以抑制腫瘤生長。
簡單的說，根據(jù)實施例20中確定的最佳治療方法和劑量使用rhLF，并且根據(jù)腫瘤類型選擇標(biāo)準(zhǔn)的抗癌方法作為聯(lián)合治療的一部分。所附加的抗癌治療的施用途徑和方法采用FDA批準(zhǔn)的或經(jīng)同行評議發(fā)表的方法。
以CT掃描和可用的腫瘤標(biāo)記物監(jiān)控腫瘤大小的進(jìn)展。首先進(jìn)行本底CT掃描，一旦開始治療，每隔8周掃描一次CT，每隔4周測量一次腫瘤標(biāo)記。采取血樣以測量循環(huán)淋巴細(xì)胞的亞型和NK細(xì)胞的活性。采取血漿、血清和血細(xì)胞提取物樣本以測量循環(huán)IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
實施例22在人類中局部使用hLF給病人使用凝膠劑型的重組乳鐵蛋白以抑制腫瘤生長。
簡單地說，在患有轉(zhuǎn)移性疾病的病人的皮膚或皮下癌癥損傷部位每日使用2次的rhLF凝膠組合物，其強(qiáng)度為1％、2.5％或8.5％。
以CT掃描和可用的腫瘤標(biāo)記物監(jiān)控轉(zhuǎn)移性疾病大小的進(jìn)展。首先進(jìn)行本底CT掃描，一旦開始治療，每隔8周掃描一次CT。腫瘤標(biāo)記每4周測量一次。采取血樣以測量循環(huán)淋巴細(xì)胞的亞型和NK細(xì)胞的活性。采取血漿、血清和血細(xì)胞提取物樣本以測量循環(huán)IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
實施例23與局部使用hLF聯(lián)合治療通過給病人單獨使用凝膠劑型的重組乳鐵蛋白，或與標(biāo)準(zhǔn)抗癌方法聯(lián)用，以抑制腫瘤生長。
簡單地說，根據(jù)實施例22中確定的最佳治療方法和劑量使用rhLF，并且根據(jù)腫瘤類型選擇標(biāo)準(zhǔn)的抗癌方法作為聯(lián)合治療的一部分。所附加的抗癌治療的施用途徑和方法采用FDA批準(zhǔn)的或經(jīng)同行評議發(fā)表的方法。
以CT掃描和可用的腫瘤標(biāo)記物監(jiān)控腫瘤大小的進(jìn)展。首先進(jìn)行本底CT掃描，一旦開始治療，每隔8周掃描一次CT，每隔4周測量一次腫瘤標(biāo)記。采取血樣以測量循環(huán)淋巴細(xì)胞的亞型和NK細(xì)胞的活性。采取血漿、血清和血細(xì)胞提取物樣本以測量循環(huán)IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
引用的參考文獻(xiàn)本說明書所提及的所有專利和出版物展示了熟悉本發(fā)明相關(guān)技術(shù)的人員的水平。本處引用所有專利和出版物作為參考文獻(xiàn)，就如同單獨地和特定地指出每一出版物被作為參考文獻(xiàn)而引用一樣。
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盡管已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明及其優(yōu)點，應(yīng)該了解到此處可以進(jìn)行多種變化、替換和改變，而不會偏離附加描述所定義的內(nèi)涵和范圍。而且，本發(fā)明的范圍并不限于說明書中所描述的具體實施方案，包括過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、途徑、方法以及步驟等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將很容易從本發(fā)明的公開中了解到，根據(jù)本發(fā)明，這些當(dāng)前的或以后將開發(fā)的與此處描述的相應(yīng)實施方案表現(xiàn)出相同的功能或獲得相同的結(jié)果的發(fā)明、過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、途徑、方法或步驟等，很可能會被用到。因此，說明書旨在將這些過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、途徑、方法或步驟等包括進(jìn)其范圍。
權(quán)利要求
1.一種治療高度增生性疾病的方法，其包括給受試者瘤內(nèi)施用乳鐵蛋白組合物的步驟，其中乳鐵蛋白的用量足以改善所述受試者的高度增生性疾病。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的乳鐵蛋白組合物分散于藥物可接受的載體中。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的乳鐵蛋白是指哺乳動物乳鐵蛋白。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的乳鐵蛋白是人乳鐵蛋白。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述的乳鐵蛋白是牛乳鐵蛋白。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述的乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的乳鐵蛋白組合物的施用量是每天約0.1μg到約10g。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的高度增生性疾病進(jìn)一步定義為癌癥。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的癌癥包括腫瘤。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的腫瘤選自黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺肝癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、星狀細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、鱗狀細(xì)胞癌、頭癌、頸癌、齒齦癌、舌癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、肉瘤、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌以及膀胱癌。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的高度增生性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、骨關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管閉塞、再狹窄、動脈硬化、腫瘤前損傷、原位癌、口腔絨毛粘膜白斑病以及牛皮癬。
12.一種治療高度增生性疾病的方法，其包括通過提高高度增生性疾病部位的乳鐵蛋白含量而加強(qiáng)受試者全身免疫系統(tǒng)的步驟。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述的乳鐵蛋白經(jīng)瘤內(nèi)施用。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述的乳鐵蛋白刺激白介素-18的產(chǎn)生。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述的乳鐵蛋白刺激GM-CSF的產(chǎn)生。
17.一種治療高度增生性疾病的方法，其包括通過提高高度增生性疾病部位的乳鐵蛋白含量而加強(qiáng)受試者局部免疫系統(tǒng)的步驟。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述的乳鐵蛋白經(jīng)瘤內(nèi)施用。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述的乳鐵蛋白刺激白介素-18的產(chǎn)生。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的白介素-18刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、成熟或活化。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述的乳鐵蛋白刺激GM-CSF的產(chǎn)生。
23.一種通過為所述受試者瘤內(nèi)施用乳鐵蛋白組合物而增強(qiáng)腫瘤附近局部免疫應(yīng)答的方法。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述的乳鐵蛋白組合物刺激注射部位的白介素-18。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述的乳鐵蛋白組合物刺激注射部位的GM-CSF。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述的白介素-18刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、成熟或活化。
28.權(quán)利要求27的方法，其中免疫細(xì)胞是指T淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞。
29.權(quán)利要求28的方法，其中T淋巴細(xì)胞選自CD4+、CD8+和CD3+細(xì)胞。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述的GM-CSF刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、成熟或活化。
31.權(quán)利要求30的方法，其中免疫細(xì)胞是指樹突狀細(xì)胞或其他抗原呈遞細(xì)胞。
32.權(quán)利要求23的方法，其中所述的受試者患有高度增生性疾病。
33.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括附加地施用化學(xué)治療、免疫治療、手術(shù)、生物治療、放射治療或其組合。
34.一種治療高度增生性疾病的方法，其包括為受試者瘤內(nèi)施用乳鐵蛋白組合物，并與化學(xué)治療、生物治療、免疫治療或放射治療相聯(lián)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及單獨應(yīng)用乳鐵蛋白組合物或與標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療手段相結(jié)合治療高度增生性疾病的方法。
文檔編號A61P1/02GK1668326SQ03816391
公開日2005年9月14日 申請日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月10日
發(fā)明者A·瓦拉哈查里, K·佩特拉克, R·巴斯基, B·奧馬利 申請人:阿根尼克斯有限公司