本發(fā)明屬于化學檢測領(lǐng)域，尤其是一種ase-hplc法測定山楂中金絲桃苷含量的方法。

背景技術(shù)：

山楂葉為薔薇科植物山里紅(crataeguspinnatifidabge.varmajorn.e.br.)，具有活血化瘀，理氣通脈，用于氣滯血瘀，胸悶憋氣，心悸見忘，眩暈耳鳴。

研究結(jié)果表明山楂中金絲桃苷是已經(jīng)被證實治療心血管疾病，并有解痙鎮(zhèn)痛，保護胃黏膜、肝組織及調(diào)節(jié)血脂，增強免疫力，抗抑郁及對心腦缺血的保護作用。

2015年版藥典記載的提取及測定山楂中金絲桃苷的方法為：本品細粉約1g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流提取至提取液無色，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇繼續(xù)提取至無色(約4小時)，提取液蒸干，殘渣加稀乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為供試品貯備液。在15000r/min下離心3min，取上清液，進入lc測定。

本發(fā)明曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，《中國藥典》使用三氯甲烷除雜后，采用甲醇索提至無色，雜質(zhì)較少。而三氯甲烷毒性較大；另外，按照藥典方法進行，耗時至少需4小時。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述不足，本發(fā)明旨在提供一種毒性小、耗時短的ase-hplc法測定山楂中金絲桃苷含量的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc法測定山楂中金絲桃苷含量的方法，依次包括下述步驟：

步驟1：采用ase法萃取山楂粉末，所述的ase萃取法包括先用正己烷萃取，再用乙醇萃取，并收集乙醇萃取液；

步驟2：采用hplc法檢測山楂中的金絲桃苷含量。

其中，所述的步驟1包括下述子步驟：

步驟s1：將山楂樣品粉碎，取1g與1g石英砂混合；

步驟s2：在放有濾膜的ase萃取池中添加1g硅藻土，加入步驟s1所得的混合物，加石英砂至與池口下2mm處；

步驟s3：先用正己烷除雜，再用乙醇萃取，得提取液；

步驟s4：用乙醇將提取液定容至50ml，離心，取上清液，得乙醇萃取液。

其中，步驟s3所述的除雜步驟的參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為80℃，時間為5min，次數(shù)為2次，沖洗體積為100％，吹掃時間為100s。

其中，步驟s3所述的萃取步驟的參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為110℃，時間為5min，次數(shù)為1次，沖洗體積為100％，吹掃時間為100s。

其中，步驟s4所述的離心步驟的參數(shù)為離心速度為15000r/min、離心時間為3min。

其中，步驟2所述的hplc法的檢測參數(shù)為：色譜柱為thermosyncronisc18；柱溫為40℃，流速為0.5ml/min；流動相為乙腈-0.2％磷酸；檢測波長為363nm。

其中，所述的色譜柱的規(guī)格為3*100mm，3μm。

其中，所述的流動相的乙腈-0.2％磷酸的體積比為24:76。

本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有下述優(yōu)點：

1.本發(fā)明曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，《中國藥典》使用三氯甲烷除雜后，采用甲醇索提至無色，雜質(zhì)較少。而三氯甲烷毒性較大，故采用極性相對較接近的正己烷作為除雜溶劑，甲醇、作為提取溶劑進行了溶劑考察，結(jié)果顯示正己烷除雜，甲醇提取后金絲桃苷含量與2015年版《中國藥典》含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑；

2.在除雜過程中，藥典方法加入三氯甲烷索提取液無色，時間相對較長，且三氯甲烷毒性較大，我們采用了多次萃取除雜的方式，發(fā)現(xiàn)80℃，提取5min，2次即可達到除去大部分雜質(zhì)，再多的提取時間和次數(shù)已經(jīng)無明顯影響，而相對高的溫度對提取效果影響不大，故最終確定最佳除雜工藝組合為提取溫度80℃，提取時間5min，提取次數(shù)2次；提取過程中采用110℃，提取5min，提取1次即可達到與藥典含量接近，更多的提取時間、溫度、次數(shù)對結(jié)果已經(jīng)無明顯影響；最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度110℃，提取時間5min，提取次數(shù)1次。

附圖說明

圖1為金絲桃苷對照品的色譜圖；

圖2為藥典方法提取山楂葉中金絲桃苷的色譜圖；

圖3為ase法萃取山楂葉中金絲桃苷的色譜圖；

圖4為金絲桃苷對照品以濃度(mg/ml)-峰面積進行線性回歸圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)。

實施例1

1、儀器設(shè)備及試劑

1.1儀器：

電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國dionex公司)、thermou3000uhplc液相色譜儀。

1.2試劑：試劑與溶液(除特別注明外，本實驗所用試劑均為分析純)

水：符合gb/t6682規(guī)定的一級水；

正己烷(c6h14)：分析純；

乙醇(c2h6o)：分析純；

乙腈(c2h3n)：色譜純(液相色譜用)；

磷酸(h3p04)：分析純；

石英砂：粒徑約2mm。

2、方法

2.1對照品溶液的制備

取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含34.20ug的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備

2.2.12015年版藥典方法

本品細粉約1g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流提取至提取液無色，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇繼續(xù)提取至無色(約4小時)，提取液蒸干，殘渣加稀乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為供試品貯備液。在15000r/min下離心3min，取上清液，進入lc測定。

2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法

樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過三號篩，約1.0g，精密稱定，與1g石英砂混合均勻，待用，在預先放好過濾膜的10ml萃取池中先加入1g硅藻土，后加入混合均勻的樣品，再加入適量石英砂，輕輕振搖使之與池口在同一水平線下2mm處，擰緊萃取池上蓋。萃取(包括除雜和提取2步，見ase條件方法)結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移于50ml容量瓶中，用烯乙醇稀釋至刻度，在15000r/min下離心3min，取上清液，進入lc測定。

2.3ase萃取條件

所述的除雜步驟的參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為80℃，時間為5min，次數(shù)為2次，沖洗體積為100％，吹掃時間為100s。

所述的萃取步驟的參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為110℃，時間為5min，次數(shù)為1次，沖洗體積為100％，吹掃時間為100s。

2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

所述的hplc法的檢測參數(shù)為：色譜柱為thermosyncronisc18，3*100mm，3μm；柱溫為40℃，流速為0.5ml/min；流動相為乙腈-0.2％磷酸；檢測波長為363nm。

其中，所述的流動相的乙腈-0.2％磷酸的體積比為24:76以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；理論板數(shù)按金絲桃苷峰計算應(yīng)不低于3000。

2.5測定法

照高效液相色譜法(通則0512)測定；

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

圖1為金絲桃苷對照品的色譜圖；圖2為藥典方法提取山楂葉中金絲桃苷的色譜圖；圖3為ase法萃取山楂葉中金絲桃苷的色譜圖，其中，金絲桃苷的保留時間為13.647min。

2.6標準限值要求

本品按干燥品計算，含金絲桃苷(c21h20o12)不得少于0.050％。

2.7、計算(外標法)

式中cr——對照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；

ax——供試品的峰面積；

ar——對照品峰面積。

注意：

使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；

萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；

萃取池裝樣時松緊適中，太松容易導致提取液過多；

開機前檢查氣瓶氣壓是否達到1mpa；

使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時晾干(容易生銹)。

3結(jié)果

3.1線性關(guān)系

取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含金絲桃苷34.20ug的溶液，然后分別精密吸取該溶液0.5μl、1μl、2μl、5μl、8μl進入lc測定，并依照上述方法測定，結(jié)果詳見表1。

以濃度(mg/ml)-峰面積進行線性回歸，求得回歸方程：y＝2,092.56039x-0.08287,r²＝0.99997。金絲桃苷在0.0171～0.2736μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，詳見圖4--金絲桃苷對照品以濃度(mg/ml)-峰面積進行線性回歸圖。

表1線性試驗結(jié)果

3.2重現(xiàn)性試驗

取相同批號的樣品1.0g，共4份，精密稱定，按ase提取方法提取供試品溶液，進樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗，測得樣品中金絲桃苷的含量見表2，rsd為3.9％，試驗表明ase提取方法重復性良好。

表2重現(xiàn)性試驗結(jié)果

3.3樣品采用藥典方法與ase方法測定含量的結(jié)果(1批)

表3可以看出采用ase儀器1、ase儀器2和藥典方法提取后的結(jié)果以及ase儀器之間的重復性均良好。

表3樣品采用藥典方法與ase方法測定含量的結(jié)果對比

4討論：

4.1ase提取溶劑的選擇：

本發(fā)明曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，《中國藥典》使用三氯甲烷除雜后，采用甲醇索提至無色，雜質(zhì)較少。而三氯甲烷毒性較大，故采用極性相對較接近的正己烷作為除雜溶劑，甲醇、作為提取溶劑進行了溶劑考察，結(jié)果顯示正己烷除雜，甲醇提取后金絲桃苷含量與2015年版《中國藥典》含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。

4.2ase提取條件的優(yōu)化

在除雜過程中，藥典方法加入三氯甲烷索提取液無色，時間相對較長，且三氯甲烷毒性較大，我們采用了多次萃取除雜的方式，發(fā)現(xiàn)80℃，提取5min，2次即可達到除去大部分雜質(zhì)，再多的提取時間和次數(shù)已經(jīng)無明顯影響，而相對高的溫度對提取效果影響不大，故最終確定最佳除雜工藝組合為提取溫度80℃，提取時間5min，提取次數(shù)2次。提取過程中采用110℃。提取5min，提取1次即可達到與藥典含量接近，更多的提取時間、溫度、次數(shù)對結(jié)果已經(jīng)無明顯影響。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度110℃，提取時間5min，提取次數(shù)1次。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。