本發(fā)明涉及膽汁酸的檢測領(lǐng)域，尤其涉及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測五種甘氨結(jié)合型膽汁酸的方法。
背景技術(shù)：
：甘氨結(jié)合型膽汁酸是指膽汁酸以酰胺鍵(簡稱肽鍵)與甘氨酸結(jié)合，成為甘氨結(jié)合型膽汁酸，包括甘氨膽酸(glycocholicacid，gca)、甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholicacid，gcdca)、甘氨石膽酸(glycolithocholicacid，glca)、甘氨脫氧膽酸(glycodeoxycholicacid，gdca)、甘氨熊去氧膽酸(glycoursodeoxycholicacid，gudca)。甘氨結(jié)合型膽汁酸易溶于水，這是由于其分子中既含有親水的羥基和羧基，又含有疏水的甲基，且這兩種性質(zhì)不同的基團(tuán)又完全排列在環(huán)戊烷多氫菲核的兩側(cè)，使分子分為“親水”和“疏水”兩個側(cè)面。故甘氨結(jié)合型膽汁酸具有強(qiáng)乳化劑功能，使腸腔內(nèi)油脂乳化成微粒，以增加油脂與消化液中脂肪酶(lipase)接觸面積而便于脂類消化吸收。甘氨結(jié)合型膽汁酸在人體中除了作為乳糜微粒的主要成分外，它還是體內(nèi)膽固醇消除的一個重要途徑，肝臟中新陳代謝的產(chǎn)物可隨膽汁排出。甘氨結(jié)合型膽汁酸參與脂肪循環(huán)，和磷脂形成微粒，并形成乳化液幫助脂肪酸和脂溶性維生素的腸道吸收。盡管甘氨結(jié)合型膽汁酸在于肝腸循環(huán)，體循環(huán)和尿液中含量很低，然而當(dāng)出現(xiàn)肝膽疾病而致使膽汁酸排泄障礙時(shí)，肝內(nèi)、血液以及尿液中含量顯著升高。甘氨結(jié)合型膽汁酸能明顯誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡，引起肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，激活磷脂酶a2(spla2)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加。有研究表明在肝癌中甘氨結(jié)合型膽汁酸明顯高于正常組織，因此檢測檢測每一種甘氨結(jié)合型膽汁酸的體內(nèi)水平對于肝膽和腸道疾病的篩查、診斷和鑒別診斷具有重要價(jià)值。分離和定量甘氨結(jié)合型膽汁酸及其結(jié)合物是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@類化合物的生化特征各異，有的還存在同分異構(gòu)體，且它們在人體中的含量較低。目前常規(guī)檢測方法是循環(huán)酶法測定生理溶液中的膽汁酸，雖然操作較為簡單，然而該方法只能檢測總膽汁酸含量，無法做到測定不同甘氨結(jié)合型膽汁酸的差異；氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用在檢測膽汁酸時(shí)需要復(fù)雜的樣品制備，衍生化，需將甘氨結(jié)合型膽汁酸水解成非結(jié)合型才能進(jìn)行分析；高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測器在檢測復(fù)雜生物基質(zhì)中的甘氨結(jié)合型膽汁酸會導(dǎo)致靈敏度和特異性不足；熒光檢測法則需要復(fù)雜的衍生化技術(shù)而不能推廣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中五種甘氨結(jié)合型膽汁酸的方法，甘氨結(jié)合型膽汁酸檢測操作復(fù)雜，靈敏度和特異性不足的問題。本發(fā)明的目的采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中五種甘氨結(jié)合型膽汁酸的方法，包括如下步驟：(1)標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將甘氨結(jié)合型膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋到若干個不同濃度備用，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品中加入等量的含有已知濃度內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，所述甘氨結(jié)合型膽汁酸乙腈溶液的濃度范圍為2nmol/l～6μmol/l，所述內(nèi)標(biāo)為氘代膽酸，氘代脫氧膽酸，氘代熊脫氧膽酸，高速離心后取上清液，上清液利用離心濃縮冷凍系統(tǒng)凍干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后離心，取上清液于96孔板用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析；(2)高效液相色譜分離：利用超高壓液相色譜以及相應(yīng)的流動相，在反向c18分析柱上對五種甘氨結(jié)合型膽汁酸進(jìn)行分離；(3)串聯(lián)質(zhì)譜檢測：色譜上分離后的五種甘氨結(jié)合型膽汁酸進(jìn)入到質(zhì)譜進(jìn)行檢測，利用三重四級桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)控模式特異性地檢測五種甘氨結(jié)合型膽汁酸，根據(jù)信號噪音比計(jì)算得到定量檢測限與鑒定檢測限，根據(jù)比值以及已知標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并得到定量校正方程；(4)血清中甘氨結(jié)合型膽汁酸的檢測：取血清樣本，加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液進(jìn)行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次離心，移取血清上清液利用離心濃縮冷凍系統(tǒng)凍干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后離心，取上清液于96孔板上備用，用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析步驟同步驟(2)、步驟(3)，液相色譜質(zhì)譜檢測得到甘氨結(jié)合型膽汁酸與內(nèi)標(biāo)的比值，將比值代入到定量校正方程，計(jì)算得到血清中甘氨結(jié)合型膽汁酸的含量。優(yōu)選的，所述步驟(1)中含已知濃度內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液濃度分別為：內(nèi)標(biāo)氘代膽酸的濃度為76nmol/l，內(nèi)標(biāo)氘代脫氧膽酸的濃度為104nmol/l，內(nèi)標(biāo)氘代熊脫氧膽酸的濃度為126nmol/l。優(yōu)選的，所述步驟(2)中高效液相色譜分離條件為：色譜柱：watersacquityuplcc18column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350ivd；色譜柱柱溫：45℃；進(jìn)樣量：10μl；流速：0.4ml/min；流動相組成：a相為0.1％甲酸水溶液，b相為0.1％甲酸-乙腈：甲醇＝3：1。優(yōu)選的，所述步驟(3)質(zhì)譜檢測條件中，每一種物質(zhì)的檢測參數(shù)均先用標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化，然后利用三重四級桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)控模式以及優(yōu)化好的特定質(zhì)譜參數(shù)特異性地檢測五種甘氨結(jié)合型膽汁酸，具體的，所述質(zhì)譜檢測參數(shù)為：電噴霧針電壓：3.0kv，去溶劑氣流速：800l/h，去溶劑氣溫度：400℃，錐孔氣流速：50l/h，檢測為負(fù)離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)控。優(yōu)選的，所述步驟(1)中兩次離心條件為：低溫離心機(jī)在18000g離心力4℃下離心5min。優(yōu)選的，所述步驟(4)中血清與含內(nèi)標(biāo)乙腈溶液的體積比為1:3。優(yōu)選的，所述步驟(4)中血清為人或動物血清。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測五種甘氨結(jié)合型膽汁酸的方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)且前處理過程較簡單，短時(shí)間內(nèi)可完成五種甘氨結(jié)合型膽汁酸的分離和檢測，檢測效率高，可用于臨床上血清中甘氨結(jié)合型膽汁酸的定量分析，對臨床上疾病的診斷和篩查具有重大意義。附圖說明圖1、本發(fā)明的檢測方法的流程示意圖；圖2、甘氨結(jié)合型膽汁酸及內(nèi)標(biāo)色譜洗脫出峰的絕對保留時(shí)間；圖3、甘氨膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4、甘氨石膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5、甘氨脫氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6、甘氨鵝脫氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖7、甘氨熊脫氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明，從而對本發(fā)明的保護(hù)范圍作出明確的限定；下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作出進(jìn)一步詳細(xì)的說明。甘氨石膽酸標(biāo)準(zhǔn)品采購于torontoresearchchemicals公司，其余4種甘氨結(jié)合型膽汁酸(甘氨膽酸，甘氨脫氧膽酸，甘氨鵝脫氧膽酸，甘氨熊脫氧膽酸)標(biāo)準(zhǔn)品以及同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)(氘代膽酸，氘代脫氧膽酸，氘代熊脫氧膽酸)均采購于sigmaaldrich公司。標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)首先用乙腈進(jìn)行溶解，然后保存在-80℃，需要進(jìn)行實(shí)際樣品檢測時(shí)，再利用乙腈將內(nèi)標(biāo)氘代膽酸稀釋濃度為76nmol/l，內(nèi)標(biāo)氘代脫氧膽酸稀釋濃度為104nmol/l，內(nèi)標(biāo)氘代熊脫氧膽酸稀釋濃度為126nmol/l，作為工作液。1.標(biāo)準(zhǔn)品制備：分別取0.1ml9個不同濃度的甘氨結(jié)合型膽汁酸乙腈溶液到1.5mlep管中，再分別加入0.3ml低溫保存的含內(nèi)標(biāo)氘代膽酸，氘代脫氧膽酸，氘代熊脫氧膽酸乙腈溶液，用旋渦混合器充分混合后，用1ml的移液槍轉(zhuǎn)移0.3ml含內(nèi)標(biāo)氘代的膽汁酸乙腈溶液到另外一個1.5mlep管，然后用離心濃縮冷凍系統(tǒng)凍干；凍干后加入一定量的含有乙腈的水溶液后，混合組分使用低溫離心機(jī)在18000g離心力4℃下離心5min，取上清液于96孔板用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析。2.液相色譜分離：利用超高壓液相色譜以及相應(yīng)的流動相，在反向c18分析柱上對樣品上清液中甘氨結(jié)合型膽汁酸進(jìn)行色譜洗脫分離，通過控制洗脫條件，分離出5種甘氨結(jié)合型膽汁酸；液相色譜條件為：色譜柱：watersacquityuplcc18column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350ivd；色譜柱柱溫：45℃；進(jìn)樣量：10μl；流速：0.4ml/min；流動相組成：a相為0.1％甲酸水溶液，即甲酸在混合液中的體積占比為0.1％，b相為0.1％甲酸-乙腈：甲醇＝3：1，即甲酸和乙腈的混合液與甲醇的體積比為3:1,其中甲酸在甲酸和乙腈的混合液中體積占比為0.1％。洗脫梯度如下表1或表2所示：表1表2序號時(shí)間(min)流速(ml/min)a％b％曲線值1-0.46535-22.00.45743633.50.45446645.00.44159657.00.44159668.70.434666710.70.42981811.30.4653513.質(zhì)譜檢測并制標(biāo)準(zhǔn)曲線：液相色譜上分離出的5種甘氨結(jié)合型膽汁酸進(jìn)入到三重四級桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測，利用三重四級桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)控模式特異性地檢測5種甘氨結(jié)合型膽汁酸的含量，并畫制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；根據(jù)不同的色譜洗脫時(shí)間，設(shè)置不同的檢測窗口以及參數(shù)，每一種物質(zhì)的檢測參數(shù)均先用標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化，然后利用三重四級桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)控模式以及優(yōu)化好的特定質(zhì)譜參數(shù)特異性地檢測五種甘氨結(jié)合型膽汁酸；質(zhì)譜為watersxevotqdivd(waters,milford,ma)；質(zhì)譜檢測條件如下：電噴霧針電壓：3.0kv，去溶劑氣流速：800l/h，去溶劑氣溫度：400℃，錐孔氣流速：50l/h，檢測為負(fù)離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)控，每個待測物的特定反應(yīng)離子對、駐留時(shí)間、錐孔電壓、碰撞能量等如下表所示(不同類型儀器，碰撞能量、錐孔電壓值有所不同，需要獨(dú)立優(yōu)化)：表3多重反應(yīng)監(jiān)控通過兩次篩選，即第一個四級桿進(jìn)行特定母離子篩選，第二個四級桿進(jìn)行母離子碎裂產(chǎn)生子離子，第三個四級桿進(jìn)行特定子離子篩選，具有非常好的檢測特異性，可以通過選擇反應(yīng)監(jiān)控檢測到的離子流，以及對應(yīng)的保留時(shí)間，來確定甘氨結(jié)合型膽汁酸的檢測，再利用添加已知量的氘代膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代脫氧膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代熊脫氧膽酸內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。如圖2所示，樣品通過超高壓液相色譜分離后，不同的甘氨結(jié)合型膽汁酸在不同洗脫時(shí)間出峰，并且被質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)控模式檢測到，從先到后檢測到的物質(zhì)分別為：甘氨熊脫氧膽酸，甘氨膽酸，氘代熊脫氧膽酸，氘代膽酸，甘氨鵝脫氧膽酸，甘氨脫氧膽酸，氘代脫氧膽酸，甘氨石膽酸，氘代膽酸保留時(shí)間為3.87min，氘代脫氧膽酸保留時(shí)間為5.76min，氘代熊脫氧膽酸保留時(shí)間為3.58min，甘氨膽酸保留時(shí)間為2.47min，甘氨石膽酸保留時(shí)間為5.86min，甘氨脫氧膽酸保留時(shí)間為4.51min，甘氨鵝脫氧膽酸保留時(shí)間為4.13min，甘氨熊脫氧膽酸保留時(shí)間為2.15min。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖3至圖7；檢測限定義為信噪比>3，定量限定義為信噪比>10，保留時(shí)間為色譜洗脫出峰的絕對保留時(shí)間，所有檢測物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)r2均>0.99，每種甘氨結(jié)合型膽汁酸的保留時(shí)間，檢出限，定量限，線性范圍以及定量校正方程分別如圖中所示；通過三日的精密度測試，包括低、中、高三個濃度，日內(nèi)日間精密度rsd均小于15％，如表5所示，表明檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)。五種甘氨結(jié)合型膽汁酸的保留時(shí)間、檢測限、定量限、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)如下：表4五種甘氨結(jié)合型膽汁酸的日內(nèi)和日間精密度數(shù)據(jù)如下：表54.血清中甘氨結(jié)合型膽汁酸的檢測：取0.1ml血清樣品到1.5mlep管中，再加入0.3ml低溫保存的含內(nèi)標(biāo)氘代膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代脫氧膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代熊脫氧膽酸乙腈溶液，用旋渦混合器充分混合后，用1ml的移液槍轉(zhuǎn)移0.3ml含內(nèi)標(biāo)氘代膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代脫氧膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代熊脫氧膽酸的膽汁酸乙腈溶液到另外一個1.5mlep管，然后用真空冷凍干燥器凍干；凍干后加入一定量的含有乙腈的水溶液后，混合組分使用低溫離心機(jī)在18000g離心力4℃下離心5min，取上清液于96孔板用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析同步驟(2)和(3)，質(zhì)譜檢測得到甘氨結(jié)合型膽汁酸與內(nèi)標(biāo)的比值，將比值代入到定量校正方程，計(jì)算得到血清中甘氨結(jié)合型膽汁酸的含量。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12