本發(fā)明屬于手性對映體的分離技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法，以及一種羥丙基-β-環(huán)糊精的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

手性分子又稱手性對映體，是化學(xué)中結(jié)構(gòu)上鏡像對稱而又不能完全重合的分子，具有兩種分子結(jié)構(gòu)。具有不同分子結(jié)構(gòu)的兩種手性分子除旋光性存在差異外，物理性質(zhì)相同，化學(xué)性質(zhì)可能相似，因此使用常規(guī)的高效液相色譜法無法實現(xiàn)兩種手性分子的分離。但是由于具有不同分子結(jié)構(gòu)的兩種手性分子在生物活性及藥理作用等方面往往存在較大差別，甚至作用相反，因此有必要對手性分子進(jìn)行分離，分別考察其相關(guān)活性并加以合理使用。

β-環(huán)糊精是由7個吡喃型葡萄糖組成的低聚糖，具有上寬下窄、兩端開口的中空筒狀結(jié)構(gòu)，其空腔內(nèi)部相對疏水，外部由極性羥基包圍而相對親水，這種特殊結(jié)構(gòu)使得β-環(huán)糊精具有極性和非極性的獨特性質(zhì)?；讦?環(huán)糊精分子內(nèi)具有多個手性中心、其絡(luò)合作用具有高度立體選擇性且價格便宜，因此現(xiàn)有技術(shù)使用β環(huán)糊精作為流動相添加劑，采用高效液相色譜法對手性分子進(jìn)行拆分。

但是，由于β-環(huán)糊精在水中溶解度小，將其用作流動相添加劑易造成色譜柱堵塞，因此β-環(huán)糊精的上述性質(zhì)很大程度上限制了其在采用高效液相色譜法分離手性分子中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法，以全部或部分解決上述技術(shù)問題。

為了解決上述問題，本發(fā)明公開了一種采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法，包括：

將羥丙基-β-環(huán)糊精作為添加劑添加至原始流動相中，得到所需的反相色譜流動相；

使用所述反相色譜流動相和反相色譜固定相，對手性對映體16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮進(jìn)行反相高效液相色譜分離。

可選地，所述將羥丙基-β-環(huán)糊精

作為添加劑添加至原始流動相中包括：

將羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液添加至所述原始流動相中。

可選地，所述原始流動相與所述羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的體積比為40:60～30:70；

所述羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的濃度為0.02～0.04g/ml。

可選地，在對所述16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和所述16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮進(jìn)行反相高效液相色譜分離時，所述反相色譜流動相的流速為1～1.2ml/min。

可選地，所述原始流動相為乙腈或甲醇。

可選地，所述反相色譜固定相為eclipseplus-c8色譜柱或zorbaxsb-c18色譜柱。

可選地，所述eclipseplus-c8色譜柱或所述zorbaxsb-c18色譜柱的柱溫為35～40℃。

可選地，所述eclipseplus-c8色譜柱或所述zorbaxsb-c18色譜柱的尺寸為250mm×4.6mm。

本發(fā)明實施例還提供了一種羥丙基-β-環(huán)糊精的應(yīng)用，采用反相高效液相色譜法分離手性對映體16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮時，將羥丙基-β-環(huán)糊精作為添加劑添加至原始流動相中，所述羥丙基-β-環(huán)糊精和所述原始流動相組合成反相色譜流動相。

可選地，所述原始流動相為乙腈或甲醇。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明包括以下優(yōu)點：

本發(fā)明提供了一種采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法，選擇羥丙基-β-環(huán)糊精作為流動相添加劑，由于羥丙基-β-環(huán)糊精在水中溶解度較大，因此將其作為流動相添加劑不會造成色譜柱堵塞，可以有效避免傳統(tǒng)β-環(huán)糊精易造成色譜柱堵塞的缺陷。

依據(jù)本發(fā)明實施例所述方法對手性對映體進(jìn)行分離時，使用常規(guī)色譜柱即可實現(xiàn)手性對映體的高效分離，操作簡單。與傳統(tǒng)的手性固定相高效液相色譜法相比，本發(fā)明實施例所述方法成本低廉，更加經(jīng)濟(jì)適用，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例所述的一種采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法的流程圖；

圖2是本發(fā)明實施例的16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同手性流動相添加劑條件下的高效液相色譜圖；

圖3是本發(fā)明實施例中16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同流動相比例條件下的高效液相色譜圖；

圖4是本發(fā)明實施例的16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同色譜柱下的高效液相色譜圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

下面通過實施例對本發(fā)明所述方法的實現(xiàn)流程進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明實施例提供了一種采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法。

參照圖1，其示出了本發(fā)明實施例所述的一種采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法的流程圖，所述方法包括以下步驟：

步驟101，將羥丙基-β-環(huán)糊精作為添加劑添加至原始流動相中，得到所需的反相色譜流動相。

16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮是手性對映體，其中16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮是一種重要的甾體藥物中間體，對甾體類藥物合成具有重要意義，因此對16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮進(jìn)行分離提純是非常必要的。二者結(jié)構(gòu)分別如下所示：

基于羥丙基-β-環(huán)糊精分子內(nèi)具有多個手性中心、其絡(luò)合作用具有高度立體選擇性、在水中具有較大溶解度等性能，本發(fā)明實施例采用反相高效液相色譜法對手性分子16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮進(jìn)行分離時，在原始流動相中加入羥丙基-β-環(huán)糊精，原始流動相和羥丙基-β-環(huán)糊精組合成所需的反相色譜流動相。

本發(fā)明實施例中，原始流動相可以為乙腈或甲醇。

在向原始流動相中添加羥丙基-β-環(huán)糊精時，添加的羥丙基-β-環(huán)糊精可以水溶液的形式添加，即將羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液添加至原始流動相中。其中，原始流動相與羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的體積比可以為40:60～30:70，羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的濃度控制在0.02～0.04g/ml。

步驟102，使用反相色譜流動相和反相色譜固定相，對手性對映體16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮進(jìn)行反相高效液相色譜分離。

得到由原始流動相羥丙基-β-環(huán)糊精組成的反相色譜流動相后，利用高效液相色譜儀，使用反相色譜流動相和反相色譜固定相，對手性對映體16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮進(jìn)行分離?；诹鲃酉嘀辛u丙基-β-環(huán)糊精的加入，使得16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮在得到有效分離的同時，不會堵塞色譜柱，保證了色譜實驗的正常進(jìn)行。

本發(fā)明實施例中，反相色譜固定相可以為eclipseplus-c8色譜柱或zorbaxsb-c18色譜柱，eclipseplus-c8色譜柱或zorbaxsb-c18色譜柱的柱溫可以控制在35～40℃，eclipseplus-c8色譜柱或zorbaxsb-c18色譜柱的尺寸可以為250mm×4.6mm。

本發(fā)明實施例還提供了一種羥丙基-β-環(huán)糊精的應(yīng)用，采用反相高效液相色譜法分離手性對映體16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮時，將羥丙基-β-環(huán)糊精作為添加劑添加至原始流動相中，羥丙基-β-環(huán)糊精和原始流動相組合成反相色譜流動相。具體分離過程可參照本發(fā)明實施例提供的采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法。所述原始流動相可以為乙腈或甲醇。

本發(fā)明實施例選擇羥丙基-β-環(huán)糊精作為流動相添加劑，由于羥丙基-β-環(huán)糊精在水中溶解度較大，因此將其作為流動相添加劑不會造成色譜柱堵塞，可以有效避免傳統(tǒng)β-環(huán)糊精易造成色譜柱堵塞的缺陷。

相對于傳統(tǒng)的手性對映體拆分方法，如手性固定相高效液相色譜法，該方法采用的色譜柱是手性色譜柱，由于手性色譜柱是由具有光學(xué)活性的單體固定于聚合物等一類特殊制作的色譜柱，價格昂貴且選擇性較強(qiáng)，只適用于某一類物質(zhì)的分離，因此使用該方法對手性對映體進(jìn)行分離所耗費的成本較高，且操作復(fù)雜。相比于上述傳統(tǒng)的手性固定相高效液相色譜法，依據(jù)本發(fā)明實施例所述方法對手性對映體進(jìn)行分離時，使用常規(guī)色譜柱即可實現(xiàn)手性對映體的高效分離，操作簡單，成本低廉，更加經(jīng)濟(jì)適用，具有廣泛的應(yīng)用前景。

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，以下通過多個具體的實施例來說明本發(fā)明實施例的采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法。

實施例1

(1)稱取約5mg16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮樣品，以乙腈為溶劑進(jìn)行樣品溶解。

(2)將步驟(1)所述樣品溶液經(jīng)0.2μm濾膜過濾后，分別以乙腈/水、乙腈/0.02g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液、乙腈/0.03g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液、乙腈/0.04g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液及乙腈/0.06g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液為流動相，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。

儀器與試劑

安捷倫agilent1260高效液相色譜儀

色譜柱：eclipseplus-c8250mm*4.6mm，5μm

試劑：乙腈(色譜純)，蒸餾水(up)，羥丙基-β-環(huán)糊精

流動相比例：乙腈:羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝40:60

流動相的流速：1.0ml/min

手性對映體的進(jìn)樣量：20μl

本發(fā)明實施例對在不同濃度羥丙基-β-環(huán)糊精下16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮(α化合物)和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮(β化合物)手性對映體的高效液相色譜圖，即得到圖1。

圖2中，曲線1為α化合物的高效液相色譜圖，曲線2為β化合物的高效液相色譜圖，曲線3、曲線4、曲線5、曲線6和曲線7為α化合物和β化合物混合物的高效液相色譜圖，曲線1、曲線2和曲線3的流動相為乙腈和水，曲線4的流動相為乙腈和0.02mg/ml羥丙基-β-環(huán)糊精，曲線5的流動相為乙腈和0.03mg/ml羥丙基-β-環(huán)糊精，曲線6的流動相為乙腈和0.04mg/ml羥丙基-β-環(huán)糊精，曲線7的流動相為乙腈和0.06mg/ml羥丙基-β-環(huán)糊精。

本發(fā)明實施例還測得了16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同手性流動相添加劑條件下的分離參數(shù)，分離參數(shù)如表1所示。

表1、本發(fā)明實施例中16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同手性流動相添加劑條件下的分離參數(shù)

基于圖2與表1數(shù)據(jù)可知，在以eclipseplus-c8色譜柱為反相色譜固定相條件下，以乙腈和水的混合物為流動相時，α化合物的保留時間為25.9min，β化合物的保留時間為25.2min，當(dāng)兩者混合時，分離度為0.9，不能較好拆分該手性對映體。

以乙腈和0.02g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的混合物為流動相對上述手性對映體進(jìn)行拆分時，兩種手性對映體的分離度為1.2。以乙腈和0.03g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的混合物為流動相對上述手性對映體進(jìn)行拆分時，兩種手性對映體的分離度為1.3。以乙腈和0.04g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的混合物為流動相對上述手性對映體進(jìn)行拆分時，兩種手性對映體的分離度為1.5，兩種手性對映體可以達(dá)到較好的分離效果。將羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的濃度提高到0.06g/ml時，上述手性對映體的分離度沒有得到明顯提升。

實施例2

(1)稱取約5mg16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮的混合樣品，以乙腈為溶劑對上述混合樣品進(jìn)行溶解。

(2)將步驟(1)所得的混合樣品溶液經(jīng)0.2μm濾膜過濾后，分別以乙腈和0.04g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的混合物、甲醇和0.04g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的混合物為流動相，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。

儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫agilent1260高效液相色譜儀。

色譜柱：eclipseplus-c8(250mm*4.6mm，5μm)。

試劑：甲醇(色譜純)，蒸餾水(up)，羥丙基-β-環(huán)糊精。

流動相比例：v甲醇:羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝40:60。

流動相的流速：1.0ml/min。

手性對映體的進(jìn)樣量：20μl。

其他色譜條件相同時，以乙腈/0.04g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液為流動相該手性對映體保留時間分別為18.9和20.2min，分離度為1.5；以甲醇/0.04g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液為流動相該手性對映體在60min內(nèi)仍保留在色譜柱內(nèi)，所需時間較長。

實施例3

(1)稱取約5mg16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮的混合樣品，以乙腈為溶劑對上述混合樣品進(jìn)行溶解。

(2)將步驟(1)所得的混合樣品溶液經(jīng)0.2μm濾膜過濾，之后以乙腈和0.04g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的混合物為流動相，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定,流動相比例分別為：v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝45:55、v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝40:60、v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝35:65、v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝30:70。

儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫agilent1260高效液相色譜儀。

色譜柱：eclipseplus-c8(250mm*4.6mm，5μm)。

試劑：乙腈(色譜純)，蒸餾水(up)，羥基-β-環(huán)糊精。

流動相的流速：1.0ml/min。

手性對映體的進(jìn)樣量：20μl。

本發(fā)明實施例對16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同流動相條件下的色譜圖進(jìn)行了測試，測試結(jié)果如圖3所示。圖3中，曲線1為流動相比例v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝30:90的高效液相色譜圖，曲線2為流動相比例v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝30:70的高效液相色譜圖，曲線3為流動相比例v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝35:65的高效液相色譜圖，曲線4為流動相比例v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝40:60的高效液相色譜圖，曲線5為流動相比例v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝45:55的高效液相色譜圖。

本發(fā)明實施例還測得了16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同流動相條件下的分離參數(shù)，分離參數(shù)如表2所示。

表2、本發(fā)明實施例中16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同流動相條件下的分離參數(shù)

由圖3及表2可知，當(dāng)流動相比例v乙腈:v-羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液為30:70、35:65及40:60時，該手性對映體可得到良好拆分，且當(dāng)v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝40:60時具有較合適的保留時間,而當(dāng)流動相比例v乙腈:v-羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液為45:55時，該手性對映體分離度僅為0.9，不能滿足其良好分離，當(dāng)流動相比例v乙腈:v羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液為30:90時，保留時間較長，導(dǎo)致操作耗時較長。因此，原始流動相與羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的體積比優(yōu)選為40:60～30:70。

實施例4

(1)稱取約5mg16α-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮和16β-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮的混合樣品，以乙腈為溶劑對上述混合樣品進(jìn)行溶解。

(2)將步驟(1)所得的混合樣品溶液經(jīng)0.2μm濾膜過濾，之后以乙腈和0.04g/ml羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的混合物為流動相，分別以zorbaxsb-c18和eclipseplus-c8為色譜固定相，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。

儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫agilent1260高效液相色譜儀。

色譜柱：250mm*4.6mm，5μm。

試劑：乙腈(色譜純)，蒸餾水(up)，羥丙基-β-環(huán)糊精。

流動相比例：乙腈:羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液＝40:60

流動相的流速：1.0ml/min。

手性對映體的進(jìn)樣量：20μl。

本發(fā)明實施例對16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同色譜柱下的色譜圖進(jìn)行了測試，測試結(jié)果如圖4所示，圖4中，曲線a為zorbaxsb-c18對應(yīng)的高效液相色譜圖，曲線b為eclipseplus-c8對應(yīng)的高效液相色譜圖，

并且測得了16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同色譜柱下的分離參數(shù)，分離參數(shù)如表3所示。

表3、本發(fā)明實施例中16α(β)-甲基雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮手性對映體在不同色譜柱下的分離參數(shù)

由圖4及表3數(shù)據(jù)可見，在其他色譜條件相同條件下，利用eclipseplus-c8色譜柱進(jìn)行該手性對映體拆分時，其保留時間分別為18.9和20.2min，分離度為1.5，時間較合適且可實現(xiàn)手性對映體的良好拆分，而利用zorbaxsb-c18色譜柱拆分時其保留時間為32.0和33.9min，時間較長。

以上對本發(fā)明所提供的一種采用反相高效液相色譜法分離手性對映體的方法以及一種羥丙基-β-環(huán)糊精的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進(jìn)行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實施方式及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。