本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種枸櫞酸托法替布疑似基因毒性雜質(zhì)的檢測分析方法。
背景技術(shù)：
：枸櫞酸托法替布(tofacitinibcitrate)由美國輝瑞公司研發(fā)，適用于對甲氨蝶呤應(yīng)答不充分或不耐受的中至重度活動性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成年患者的治療。它可用作單藥療法或與甲氨蝶呤或其它非生物性緩解病情的抗風(fēng)濕藥(dmards)聯(lián)用。枸櫞酸托法替布結(jié)構(gòu)中含有c3與c4兩個手性中心，其中文化學(xué)名稱：3-((3r，4r)-4-甲基-3-(甲基(7h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-氧代丙腈枸櫞酸鹽；分子式：c16h20n6o·c6h8o7；分子量：504.5；cas登記號：540737-29-9，結(jié)構(gòu)式如下：枸櫞酸托法替布合成過程中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)，需要進行嚴格控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量和安全。因此，實現(xiàn)枸櫞酸托法替布中疑似基因毒性雜質(zhì)的快速分離和含量分析在合成過程中的質(zhì)量控制方面有很重要的現(xiàn)實意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的在于提出了一種快速分析分離枸櫞酸托法替布中的工藝副產(chǎn)物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的高效液相色譜法，從而實現(xiàn)了枸櫞酸托法替布中疑似基因毒性雜質(zhì)在同一色譜條件下的分離及含量測定。枸櫞酸托法替布原料藥合成采用的路線：4-氯-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶是枸櫞酸托法替布常用的起始原料，因其價廉易得備受青睞，4-氯-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶在參與反應(yīng)過程中，由于吡咯環(huán)上的仲胺反應(yīng)活性強，很容易發(fā)生副反應(yīng)，通常都是先進行磺?；Ｗo，然后再脫保護。工藝中我們使用了對甲苯磺酰氯作為反應(yīng)試劑，并且在后續(xù)反應(yīng)中使用了乙醇和正丁醇作為溶劑，因此有可能產(chǎn)生對甲苯磺酸乙酯和對甲苯磺酸丁酯，雖然目前對甲苯磺酸烷基酯暫無基因毒性數(shù)據(jù)報道，但類似結(jié)構(gòu)的甲磺酸烷基酯類已有基因毒性報道，因此，我們將本品中潛在殘留的對甲苯磺酸乙酯和對甲苯磺酸丁酯作為毒性雜質(zhì)進行控制。對甲苯磺酸乙酯與對甲苯磺酸丁酯為本品潛在的合成副反應(yīng)產(chǎn)物，考慮到對甲苯磺酸烷基酯類為潛在基因毒性警示結(jié)構(gòu)類化合物，為嚴格對其殘留量進行控制，我們將其訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用hplc法進行檢查，并根據(jù)歐盟emea相關(guān)要求，結(jié)合本品最大日服用劑量，擬定限度為含對甲苯磺酸乙酯與對甲苯磺酸丁酯總和不得過0.005％(50ppm)。另外枸櫞酸托法替布原料藥容易產(chǎn)生氧化降解雜質(zhì)，該氧化降解雜質(zhì)也具有疑似基因毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。考慮到目前未見其相關(guān)毒性報道，因此，我們將其訂入標(biāo)準(zhǔn)，在有關(guān)物質(zhì)檢查中作為未知雜質(zhì)進行控制，限度參照ichq3a中雜質(zhì)鑒定限度(本品最大日劑量≤2g，并且小于1.0g)制定為不得過0.1％。這三個雜質(zhì)被ich(人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會)以及fda和歐洲藥品審評署(emea)定義為疑似基因毒性雜質(zhì)，按照ich以及fda和emea規(guī)定，根據(jù)可接受的閾值量(ttc)，每天攝入1.5微克的基因毒性雜質(zhì)，被認為對大多數(shù)藥品來說是可以接受的風(fēng)險。所以成品中三個雜質(zhì)的相應(yīng)限度分別為：甲苯磺酸乙酯與對甲苯磺酸丁酯總和不得過0.005％，氧化降解雜質(zhì)不得過0.1％。本發(fā)明提供了一種枸櫞酸托法替布疑似基因毒性雜質(zhì)的檢測方法，其特征在于：a、色譜條件：色譜柱選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；流動相梯度洗脫：流動相由a相和b相組成，流動相a相是0.05mol/l磷酸二氫鈉緩沖溶液，流動相b相是甲醇或乙腈；采用二極管陣列檢測器進行檢測或采用紫外檢測器，檢測波長：220nm-280nm；b、樣品溶液的配置：采用甲醇和水的混合液將待檢測樣品配制成一定濃度的樣品溶液；c、分離分析：將樣品溶液注入高效液相色譜儀，在適當(dāng)流速和柱溫下進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，完成枸櫞酸托法替布中疑似基因毒性雜質(zhì)的含量測定，其中，所述疑似基因毒性雜質(zhì)為對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸丁酯及氧化降解雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式如下所示：采用該方法可以將枸櫞酸托法替布中的三個疑似基因毒性雜質(zhì)進行高效快速的分離和檢測，有效控制原料藥及制劑的質(zhì)量。該檢測方法靈敏度高、專屬性強、精密度高、準(zhǔn)確性強、操作方便，可以有效控制原料藥的質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明實施例的測定枸櫞酸托法替布中疑似基因毒性雜質(zhì)的含量方法，還可以具有以下附加技術(shù)特征：根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述流動相b為甲醇。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述磷酸二氫鈉緩沖液的ph值為3.0～4.5，優(yōu)選ph值為3.0。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述緩沖液與有機相的體積比為(0～100％)：(0～100％)，所述梯度程序如下所示：時間流動相a體積比/％流動相b體積比/％085％15％585％15％3445％55％4585％15％5085％15％根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述流動相的流速為0.8～1.2ml/min，優(yōu)選1.0ml/min。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述柱溫為25℃～35℃，優(yōu)選30℃。根據(jù)本發(fā)明的實施例，檢測波長為280nm。色譜柱規(guī)格用250mm長度*4.6mm內(nèi)徑*5μm填充劑粒徑。本發(fā)明所述的測定方法，可以依照以下方法實現(xiàn)：1、取待檢測樣品適量，用甲醇：水(體積比40:60)的混合液溶解，配置每1ml含1mg的樣品溶液。2、設(shè)置流動相流速為0.8-1.2ml/min，流動相的流速優(yōu)選為1.0ml/min，檢測波長280nm，色譜柱溫度25-35℃，優(yōu)選30℃。3、取1的混合樣品溶液20μl，注入液相色譜儀，完成枸櫞酸托法替布中疑似基因毒性雜質(zhì)的含量的測定。本發(fā)明的驗證項目包括專屬性、系統(tǒng)適用性與精密度、準(zhǔn)確度、線性、重復(fù)性、檢測限、定量限、耐用性等項目。驗證結(jié)果，在專屬性試驗中，空白溶劑對樣品檢測無干擾，雜質(zhì)對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸丁酯及氧化降解雜質(zhì)及各相鄰雜質(zhì)與枸櫞酸托法替布之間的分離度大于1.5；系統(tǒng)適用性與精密度試驗中各個雜質(zhì)量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)均小于2.0％；線性試驗中，對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸丁酯及氧化降解雜質(zhì)在相應(yīng)的測試濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999；方法重復(fù)性實驗中對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸丁酯及氧化降解雜質(zhì)、單個未知雜質(zhì)的rsd均小于10.0％，雜質(zhì)總量的rsd小于5.0％，中間精密度試驗結(jié)果良好；方法準(zhǔn)確度試驗結(jié)果表明，其相關(guān)雜質(zhì)的回收率均在90％～110％的范圍內(nèi)；同時通過耐用性試驗結(jié)果表明色譜條件的微小變化不會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果均符合中國藥典2015版相關(guān)規(guī)定，證明該方法精密、有效。本發(fā)明方法的洗脫分離效果好，能使原料藥樣品中三個疑似基因毒性雜質(zhì)有效分離。檢測時間僅需60min，可以快速、準(zhǔn)確、可靠的分離枸櫞酸托法替布及相鄰的疑似基因毒性雜質(zhì)。附圖說明：圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例1，所得三個疑似基因毒性雜質(zhì)定位的高效液相色譜圖；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例2，所得分離枸櫞酸托法替布原料藥及疑似基因毒性雜質(zhì)的高效液相色譜圖；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例4，所得分離枸櫞酸托法替布原料藥及疑似基因毒性雜質(zhì)的高效液相色譜圖。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻描述的技術(shù)或條件或按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商的，均為可以通過市購的常規(guī)產(chǎn)品。本發(fā)明實施例中所用的枸櫞酸托法替布原料藥為申請人自制。枸櫞酸托法替布原料藥的制備工藝為：以4-氯-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶進行磺化反應(yīng)后和(3r,4r)-順式-1-芐基-4-甲基-3-甲氨基-哌啶二鹽酸鹽縮合，脫保護，?；?，成鹽得到枸櫞酸托法替布。實施例1儀器：島津lc-20a、pda檢測器(儀器編號yq-分析020)色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(c18，5μm，4.6*150mm)流動相a：0.05mol/l磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值為3.0)流動相b：甲醇梯度洗脫：時間流動相a％流動相b％085％15％585％15％3445％55％4585％15％5085％15％流速：1.0ml/min檢測波長：220-280nm進樣體積：50μl柱溫：30℃運行時間：60min實驗步驟：雜質(zhì)定位溶液配制：精密稱取對甲苯磺酸乙酯對照品、對甲苯磺酸丁酯與氧化降解雜質(zhì)對照品各25mg，置于同一個100ml容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置10ml容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1ml置100ml容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，即得250ppm濃度的溶液。結(jié)論：此色譜條件下，三個疑似基因毒性雜質(zhì)可以在同一色譜條件下達到良好的分離，圖1(檢測波長280nm)中保留時間20.735min，30.412min，36.368min的色譜峰分別為氧化降解雜質(zhì)、對甲苯磺酸乙酯與對甲苯磺酸丁酯。色譜圖表明三個雜質(zhì)在含量為250ppm時，進行高效液相色譜分析是可以作定性分析的，定量限為250ppm。實施例2儀器：島津2010cht、紫外檢測器(儀器編號yq-分析021)色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(c18，5μm，4.6*150mm)流動相a：0.05mol/l磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值為3.0)流動相b：甲醇時間流動相a％流動相b％085％15％585％15％3445％55％4585％15％5085％15％流速：1.0ml/min檢測波長：280nm進樣體積：50μl柱溫：30℃運行時間：60min實驗步驟：精密稱取枸櫞酸托法替布原料藥100mg，置同一個10ml容量瓶中，加實施例1配制的雜質(zhì)定位溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得10mg/ml的溶液。結(jié)論：此色譜條件下，圖2中保留時間20.797min，30.462min，36.413min的色譜峰分別為氧化降解雜質(zhì)、對甲苯磺酸乙酯與對甲苯磺酸丁酯。色譜圖表明原料藥中三個疑似基因毒性雜質(zhì)對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸丁酯與氧化降解雜質(zhì)可在同一色譜條件下達到良好的分離。結(jié)果也表明該方法可用于枸櫞酸托法替布原料藥的質(zhì)量檢測。實施例3儀器：島津lc-20a、pda檢測器(儀器編號yq-分析020)色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(c18，5μm，4.6*150mm)流動相a：0.05mol/l磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值為3.5)流動相b：甲醇時間流動相a％流動相b％085％15％585％15％3445％55％4585％15％5085％15％流速：1.0ml/min檢測波長：220nm進樣體積：50μl柱溫：30℃運行時間：60min實驗步驟：精密稱取枸櫞酸托法替布原料藥100mg，置同一個10ml容量瓶中，加實施例1配制的雜質(zhì)定位溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。結(jié)論：此色譜條件下，色譜圖中保留時間20.678min，30.356min，36.375min的色譜峰分別為氧化降解雜質(zhì)、對甲苯磺酸乙酯與對甲苯磺酸丁酯。色譜圖表明原料藥中三個疑似基因毒性雜質(zhì)對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸丁酯、氧化降解雜質(zhì)可在同一色譜條件下達到良好的分離。結(jié)果也表明該方法可用于枸櫞酸托法替步原料藥的質(zhì)量檢測。實施例4儀器：島津lc-20a、pda檢測器(儀器編號yq-分析020)島津2010cht、紫外檢測器(儀器編號yq-分析021)色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(c18，5μm，4.6*150mm)流動相a：0.05mol/l磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值為3.0)流動相b：甲醇流動相a：流動相b＝85：15(體積比％)，等度洗脫流速：1.0ml/min檢測波長：280nm進樣體積：50μl柱溫：30℃運行時間：60min實驗步驟：雜質(zhì)定位溶液配制：精密稱取對甲苯磺酸乙酯對照品、對甲苯磺酸丁酯與氧化降解雜質(zhì)對照品各25mg，置于同一個100ml容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置10ml容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1ml置100ml容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，即得250ppm濃度的溶液。結(jié)論：三個疑似基因毒性雜質(zhì)對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸丁酯、氧化降解雜質(zhì)在該色譜條件分離效果不好，氧化降解雜質(zhì)和主成分分不開。當(dāng)前第1頁12