本發(fā)明涉及醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)試劑領(lǐng)域，尤其涉及一種辣根過氧化物酶穩(wěn)定底物AB混合液。
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA）方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，這種結(jié)合既不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。這種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈比例。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測儀進(jìn)行定量測定，通過結(jié)合酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。如今應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用最廣。
辣根過氧化物酶HRP具有分子量小，標(biāo)記方法簡單，性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是臨床檢驗(yàn)試劑中的常用酶。HRP廣泛用于生化檢測項目和免疫類ELISA試劑盒，作為試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分，對試劑盒的質(zhì)量有重要影響。一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl，RZ）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右（最高可達(dá)3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。
辣根過氧化物酶發(fā)色底物為過氧化物和供氫體（DH2），其真正底物是H2O2，但人們習(xí)慣把供氫體稱為底物或統(tǒng)稱供氫體底物。在ELISA中常用的供氫體有以下幾種：1.鄰苯二胺（o-Phenylenediamine,OPD）是ELISA技術(shù)中應(yīng)用較多的供氫體，酶作用后顯黃色（最大吸收波長為492 nm），其靈敏度高，測定方便?？捎萌庋塾^察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時內(nèi)不改變，是目前國內(nèi)ELISA中最常用的一種； 2.TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB，3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）是近年來常用的一種供氫底物，經(jīng)酶作用后顯天藍(lán)色，目測對比度鮮明，加酸終止酶反應(yīng)后變黃色（最大吸收波長為450 nm），易比色定量測定。3.DBA (3,3'-Diaminobenzidine, DAB,3,3'-二氨基聯(lián)苯胺)供氫底物，其反應(yīng)產(chǎn)物為不能溶解的棕色吩嗪衍生物，可用不同光鏡觀察。此種多聚物能被還原和螯合四氯化碳，形成具有電子密度的產(chǎn)物，便于用電鏡觀察。
辣根過氧化物酶是酶聯(lián)試劑最常用的工具酶之一，當(dāng)催化反應(yīng)時的供氫體為鄰苯二胺OPD時，HRP能催化底物H2O2（過氧化氫）反應(yīng)，生成物能供還原劑聯(lián)苯二胺發(fā)生氧化，而產(chǎn)生較為穩(wěn)定的顯色反應(yīng)。
過氧化氫有一定的腐蝕性且較不穩(wěn)定，使用中常采用過氧化氫和尿素的結(jié)合物過氧化脲來替代，但過氧化脲亦不是十分穩(wěn)定的化合物，在放置過程中可分解成脲素和過氧化氫，生成的過氧化氫可使顯色劑變色，造成試劑中底物的變質(zhì)、失效。
聯(lián)苯二胺是一種強(qiáng)還原劑，可被氧化劑（包括過氧化氫）氧化而變色，因此在使用中常將底物A液（過氧化脲）和B液（聯(lián)苯二胺）分別配制，在顯色時先后加入，以完成顯色反應(yīng)。
由于A、B液的分別加入操作過程繁瑣，有一定的時間限制，增加了操作誤差所造成的風(fēng)險，使用時亟待有一種穩(wěn)定的混合試劑替代目前常用的A、B液。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種辣根過氧化物酶穩(wěn)定底物AB混合液,具有性能穩(wěn)定的特點(diǎn)，在顯色反應(yīng)中能夠避免誤差，使得檢測結(jié)果更精準(zhǔn)。
一種辣根過氧化物酶穩(wěn)定底物AB混合液，高壓滅菌水定容至1000ml，包括：0.1mol/L檸檬酸243ml、0.2mol/L磷酸氫二鈉257ml、聯(lián)苯二胺(OPD) 40mg、甘油50ml、焦磷酸鈉 500mg、五水合硫代硫酸鈉 （Na2S2O3.5H2O）50mg、30%過氧化脲150ul。
本發(fā)明的有益效果是：混合液性能穩(wěn)定，避免了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中A、B液的分操作誤差所造成的風(fēng)險，使得試驗(yàn)效果大大提高。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明?？梢岳斫獾氖?，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。
一種辣根過氧化物酶穩(wěn)定底物AB混合液，包括：高壓滅菌水定容至1000ml， 0.1mol/L檸檬酸243ml、0.2mol/L磷酸氫二鈉257ml、聯(lián)苯二胺(OPD) 40mg、甘油50ml、焦磷酸鈉 500mg、五水合硫代硫酸鈉 （Na2S2O3.5H2O）50mg、30%過氧化脲150ul。
本發(fā)明方法的具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。