本發(fā)明屬于食品殘留物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種超低檢測(cè)限的萊克多巴胺的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

萊克多巴胺是苯乙醇胺類 β 2- 腎上腺素興奮劑,如果給動(dòng)物飼用含萊克多巴胺的飼料, 會(huì)造成肌肉及組織中不同程度的殘留, 通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體, 使消費(fèi)者出現(xiàn)不同程度的中毒現(xiàn)象。 目前，我國(guó)已經(jīng)明確將其列為禁用藥品目錄。

目前，檢測(cè)萊克多巴胺的實(shí)驗(yàn)室確證技術(shù)是高效液相色譜( HPLC) 或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢出限為2 μg /L左右， 但是樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，分析過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。而酶聯(lián)免疫法具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。為此，開發(fā)一種方便快捷、檢測(cè)限低的萊克多巴胺檢測(cè)方法是十分緊迫的。

經(jīng)過(guò)本領(lǐng)域研究人員的不懈研究，近兩年開發(fā)出了一種利用血糖儀檢測(cè)萊克多巴胺含量的技術(shù)，然而，其探針的制備需要用到特殊的Envision試劑，成本較為高昂。另外，是否還可以獲得更好的檢測(cè)限，也是本領(lǐng)域人員非常感興趣的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決本領(lǐng)域中的技術(shù)缺點(diǎn)和填補(bǔ)技術(shù)空白，本發(fā)明的目的在于提供一種一種超低檢測(cè)限的萊克多巴胺的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）將羧基化多壁碳納米管溶于DMF溶液中并加入殼聚糖乙酸溶液中，超聲處理后，得到渾濁液，再加入羧甲基化的β-環(huán)糊精、1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N- 羥基琥珀酰亞胺的PBS溶液，充分混合后，分散在含有牛血清蛋白的PBS溶液中；所述羧基化多壁碳納米管的長(zhǎng)度為0.5~1.5μm；

（2）將萊克多巴胺抗體Ab加入到膠體金溶液中，再加入蔗糖酶溶液，充分?jǐn)嚢韬?，離心取沉淀并置于含有牛血清蛋白的PBS溶液中；

（3）將步驟（1）所得物加入到待測(cè)樣品中，室溫下充分混合，清洗后，加入步驟（2）所得物，室溫下充分混合，再加入蔗糖溶液，室溫下充分混合反應(yīng)，待反應(yīng)完畢，去除沉淀取上清液，測(cè)量葡萄糖含量；通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)樣品中萊克多巴胺的含量。

步驟（1）中，羧基化多壁碳納米管在DMF溶液的濃度為0.0020~0.0025g/ml；殼聚糖乙酸溶液中乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%，殼聚糖的濃度為0.005~0.008g/ml，所述羧基化多壁碳納米管DMF溶液與所述殼聚糖乙酸溶液的體積比為1：10~15。

步驟（1）中，羧甲基化的β-環(huán)糊精、1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N- 羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為2:1:1。

步驟（1）或步驟（2）中，牛血清蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

步驟（2）中，所述萊克多巴胺抗體Ab的濃度為0.1mg/ml，其與膠體金溶液的體積比為1:10。

步驟（3）中，將步驟（1）所得物加入到待測(cè)樣品中，室溫下充分混合，震蕩2h。

步驟（3）中，檢測(cè)葡萄糖含量時(shí)可以采用血糖儀。

所述PBS溶液的pH為7.2。

近些年來(lái)，在萊克多巴胺的快捷檢測(cè)領(lǐng)域一直未有十分明顯的突破，直到中國(guó)專利201410015040.3提供了一種快速檢測(cè)方法，其不但解決了常規(guī)檢測(cè)方法復(fù)雜且耗時(shí)的缺點(diǎn)，更具有十分優(yōu)秀的可重復(fù)性和檢測(cè)限。一般而言，HPLC對(duì)于萊克多巴胺的檢測(cè)限僅有2 μg/L左右，而該專利的檢測(cè)限可低至0.02 μg/L。

然而，在萊克多巴胺的檢測(cè)領(lǐng)域，已經(jīng)出現(xiàn)了檢測(cè)限可低至0.08μg/L的電化學(xué)檢測(cè)芯片。從這個(gè)角度而言，該專利并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)檢測(cè)限方面的突破。

通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)摸索，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)如上所述制備探針后，可以不進(jìn)行信號(hào)的放大，而直接獲得低至0.001 μg/L的檢測(cè)限，不但實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)，還實(shí)現(xiàn)了更為精確的檢測(cè)，使得利用葡萄糖濃度測(cè)量萊克多巴胺含量的技術(shù)具有更強(qiáng)的實(shí)用性。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，值得一提的時(shí)，下述實(shí)施例僅僅起到示例作用，并非旨在對(duì)本發(fā)明有所限定，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，凡是符合本發(fā)明精神的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

待測(cè)樣品（豬肉）的制備方法同中國(guó)專利201410015040.3中實(shí)施例1所述。

按下述方法進(jìn)行檢測(cè)：

（1）將羧基化多壁碳納米管溶于DMF溶液中并加入殼聚糖乙酸溶液中，超聲處理后，得到渾濁液，再加入羧甲基化的β-環(huán)糊精、1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N- 羥基琥珀酰亞胺的PBS溶液，充分混合后，分散在含有牛血清蛋白的PBS溶液中；所述羧基化多壁碳納米管的長(zhǎng)度為0.5~1.5μm；

（2）將萊克多巴胺抗體Ab加入到膠體金溶液中，再加入蔗糖酶溶液，充分?jǐn)嚢韬?，離心取沉淀并置于含有牛血清蛋白的PBS溶液中；

（3）將步驟（1）所得物加入到待測(cè)樣品中，室溫下充分混合，清洗后，加入步驟（2）所得物，室溫下充分混合，再加入蔗糖溶液，室溫下充分混合反應(yīng)，待反應(yīng)完畢，去除沉淀取上清液，測(cè)量葡萄糖含量；通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)樣品中萊克多巴胺的含量。

步驟（1）中，羧基化多壁碳納米管在DMF溶液的濃度為0.0025g/ml；殼聚糖乙酸溶液中乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%，殼聚糖的濃度為0.005g/ml，所述羧基化多壁碳納米管DMF溶液與所述殼聚糖乙酸溶液的體積比為1：10。

步驟（1）中，羧甲基化的β-環(huán)糊精、1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N- 羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為2:1:1；其中β-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度為10g/L。

步驟（1）或步驟（2）中，牛血清蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

步驟（2）中，所述萊克多巴胺抗體Ab的濃度為0.1mg/ml，其與膠體金溶液的體積比為1:10。

步驟（3）中，將步驟（1）所得物加入到待測(cè)樣品中，室溫下充分混合，震蕩2h。

步驟（3）中，檢測(cè)葡萄糖含量時(shí)可以采用血糖儀。

上述步驟中，所用到的PBS的pH=7.2。

檢測(cè)結(jié)果為如表1所示。

表1

本發(fā)明的檢測(cè)限為0.001μg/L。