羰基還原酶ChKRED20在催化羰基底物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種羰基還原酶ChKRED20作為生物催化劑在不對(duì)稱催化多種前手性羰基底物生成相應(yīng)手性醇中的用途。該羰基還原酶ChKRED20來(lái)源于金黃桿菌（Chryseobacterium?sp.CA49），具有高活力高對(duì)映選擇性。
【專利說(shuō)明】羰基還原酶在催化羰基底物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物催化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種羰基還原酶011(1^020在不對(duì)稱催化羰基底物合成手性醇中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]羰基還原酶是一類廣泛應(yīng)用于手性醇合成的重要酶類，利用羰基還原酶作為催化劑還原前手性的羰基化合物，可以直接構(gòu)建光學(xué)活性醇的手性中心，從而一步法獲得化學(xué)反應(yīng)可能需要多步反應(yīng)才能得到的手性化合物砌塊。當(dāng)前越來(lái)越多的羰基還原酶已用于工業(yè)生產(chǎn)手性醇(^^1^6,2012,485:185-194^盡管如此，許多羰基還原酶催化的底物譜較窄，往往是為特定反應(yīng)篩選的最合適生物催化劑，因此在催化一些結(jié)構(gòu)相似度很高的底物時(shí)才能獲得較高的對(duì)映體過(guò)量值和活性。雖然通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)可以擴(kuò)展羰基還原酶的底物譜，但擴(kuò)展范圍有限，這就使酶的應(yīng)用范圍相對(duì)較窄。
[0003]目前報(bào)道的羰基還原酶僅有少數(shù)催化前手性酮符合^^1-？1~6108規(guī)則(81080161106, 0101:601111010^7 冊(cè)己8廿7，2011，75:2155-2161 )，其中只有少量的文獻(xiàn)研究這些羰基還原酶的底物譜(了6廿沾6辦011:八87臟6廿7，2005,16:2539-2549)0從自然界中篩選的符合規(guī)則的高效羰基還原酶，研究其可以高效高選擇性催化的天然底物，可以拓展應(yīng)用范圍，豐富生物催化工具箱，提升該酶在多種化合物合成中的應(yīng)用潛力，為這些化合物生物合成提供更多高效催化劑的選擇。
[0004]氟取代的光學(xué)醇廣泛應(yīng)用在制藥、放射指示劑等材料中，近來(lái)年研究者們積極探索以生物催化技術(shù)生產(chǎn)這類化合物(11160？01611118廿7，2013，78:7312-7317〉。研究手性氟取代芳基醇生物催化工藝具有重要意義，可為這些化合物的生產(chǎn)提供新的環(huán)保路線。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供羰基還原酶011(1^020在催化多種羰基底物中的用途。該酶來(lái)源于金黃桿菌(6^49 ( 0111-786013801:61-111111鄧.0149 )，具有高活力高對(duì)映選擇性，該酶核苷酸序列和氨基酸序列及其在催化3，5-雙三氟甲基苯乙酮中的應(yīng)用已申請(qǐng)中國(guó)專利:一株金黃桿菌及其羰基還原酶用于阿瑞匹坦手性中間體生產(chǎn)，申請(qǐng)?zhí)?01310399109.2，申請(qǐng)日2013年9月5日。該酶在從:81數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為％342020。
[0006]金黃桿菌0149鄧.0149)可以在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，其保藏號(hào)為⑶了⑶12012484 ；分類命名為金黃桿菌0149(011*78601^(^61*111111鄧.0149)0在已公開(kāi)的專利申請(qǐng)201310399109.2中已經(jīng)保藏。
[0007]羰基還原酶011(1^020的基因是通過(guò)？⑶技術(shù)從金黃桿菌(^49(0^78601^(^61^1111181).(^49)基因組中克隆獲得。通過(guò)構(gòu)建大腸桿菌異源表達(dá)體系使該酶過(guò)量表達(dá)。重組菌構(gòu)建方法，誘導(dǎo)表達(dá)條件和純化方法已經(jīng)在 申請(qǐng)人:在前提交的專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?01310399109.2，申請(qǐng)日2013年9月5日)的說(shuō)明書(shū)以及實(shí)施例中有詳細(xì)描述。即步驟為:將羰基還原酶ChKRED20的基因以常規(guī)PCR方法克隆，并連入pET28a ( + )載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中構(gòu)建重組菌。挑取單克隆至LB (含卡那霉素50 μ g/ml)培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，以1%的接種量轉(zhuǎn)接至TB (含卡那霉素50μ g/ml)培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3h，加入
0.5mM IPTG誘導(dǎo)后，30°C繼續(xù)培養(yǎng)至20~36h。
[0008]羰基還原酶ChKRED20的純化采用鎳柱親和層析(Bio-Rad)。將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體以13，OOOrpm, 4°C離心收集，重懸于Buffer A (50mM磷酸鹽緩沖液，pH8.0, 300mMNaCl, IOmM咪唑)，超聲破碎(超聲IOs,間隔30s，30次)，之后以13，OOOrpm，4°C離心20min,將上清液加入已用Buffer A平衡的柱料中，輕微混勻30min，用含有20mM咪唑的Buffer A漂洗雜蛋白，再用含250mM咪唑的Buffer A的緩沖液洗脫目的蛋白，最后電泳鑒定純度，并用BCA Protein Assay kit測(cè)定蛋白濃度。
[0009]本發(fā)明提供了羰基還原酶ChKRED20作為生物催化劑在不對(duì)稱催化多種前手性羰基底物生成相應(yīng)手性醇中的應(yīng)用，具體地說(shuō)，這些底物包括如下化學(xué)式1、2或3所示的前手性羰基化合物。
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種羰基還原酶011(1^020作為生物催化劑在不對(duì)稱催化多種前手性羰基底物生成相應(yīng)手性醇中的應(yīng)用，其特征在于，所述底物包括如下化學(xué)式1、2或3所示的前手性羰基化合物，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述化學(xué)式1中，札為??！，民為洱，切5，0^01,切抑，⑶哪，0？3 ；或者I為，位置為間位或者對(duì)位，尺2為(? ；化學(xué)式2中，尺3和尺4為？，且分別在苯環(huán)上第三、第五位，且％為〇成。
【文檔編號(hào)】C12P7/22GK103834694SQ201410103481
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】吳中柳, 湯脫險(xiǎn), 劉艷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所