一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法，包括：（1）樣品采集和DNA制備；（2）微衛(wèi)星引物的合成；（3）PCR擴(kuò)增；（4）產(chǎn)物檢測(cè)。本發(fā)明建立了進(jìn)行大竹蟶家系和親子鑒定的4重PCR反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，因此與原有的PCR方法相比效率提高了4倍；本發(fā)明具有高效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)，可以在大竹蟶種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系比較、種質(zhì)鑒定、家系培育與管理以及良種選育中進(jìn)行推廣應(yīng)用。
【專利說明】—種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大竹蟶，貝殼長(zhǎng)達(dá)14厘米，一般殼長(zhǎng)為殼高的4~5倍，亮口緣與腹緣平行，只在腹緣中部稍向內(nèi)凹，殼頂位于殼的最前端，殼前緣截形，后端圓，兩殼合抱呈竹筒狀，前后兩端開口，殼質(zhì)薄脆，殼表光滑，被黃褐色殼皮，有時(shí)有淡紅色彩帶，生長(zhǎng)線明顯，沿后緣及腹緣方向排列，殼內(nèi)面白色或稍帶紫色，可見淡紅色彩帶，鉸合部小，兩殼各具主齒一枚。大竹蟶個(gè)體肥大，足部肌肉特別發(fā)達(dá)，味極鮮美，入藥有滋補(bǔ)、通乳功效，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類。
[0003]微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)由于其分布廣泛、符合孟德爾共顯性遺傳、多態(tài)性高、突變快、引物具有通用性強(qiáng)、便于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、家系分析與遺傳育種等多個(gè)領(lǐng)域。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法，該方法實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，因此與原有的PCR方法相比效率提高了 4倍。
[0005]本發(fā)明的一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法，包括:
[0006](I)樣品米集和DNA制備:
[0007]剪取大竹蟶的腹足，采用傳統(tǒng)的酚氯仿法提取基因組DNA ；
[0008](2)微衛(wèi)星引物的合成:
[0009]通過磁珠富集法構(gòu)建大竹蟶微衛(wèi)星富集文庫(kù)，克隆測(cè)序其中的微衛(wèi)星序列，用Primer5軟件設(shè)計(jì)大竹経不同位點(diǎn)的微衛(wèi)星正反向引物并合成；
[0010]所述的正反向引物如下:
[0011 ] SgSSR1017-F:ATAAAATGGTGAGGGTTG ；
[0012]SgSSR1017-R:AACTTCACACAAAATAACTGCTA ；
[0013]SgSSR0804-F:TCATCTACCATCCCACCC ；
[0014]SgSSR0804-R: CTTTATTCAGTTTTCCTACGCT ；
[0015]SgSSRl123-F:TCAACCTATGTTACCCTTATAC ；
[0016]SgSSRl123-R:CTTCAGTTAGATTAGGAGCA ；
[0017]SgSSRl103-F:TTTCAGTAATAAAGCGACC ；
[0018]SgSSRl103-R:AACTCTGGTAAGAAGGATTG ；
[0019](3) PCR 擴(kuò)增:
[0020]運(yùn)用優(yōu)化好的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序?qū)Σ煌笾裣|個(gè)體進(jìn)行4重PCR擴(kuò)增；[0021](4)產(chǎn)物檢測(cè):
[0022]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中依據(jù)條帶的亮度判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無或擴(kuò)增量的多少，然后用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行不同個(gè)體的基因分型，明確判斷不同個(gè)體在每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增等位基因的大小。
[0023]步驟(3)中所述的PCR 擴(kuò)增體系為 10XBuffer5 μ L, MgCl23 μ L25mM, dNTPl.0yL各含10mM，模板lyLlOOng，SgSSR1017正反向引物各2 μ L，SgSSR0804正反向引物各1.5yL, SgSSRl 123正反向引物各I μ L，SgSSRl 103正反向引物各I μ L，Taq DNA聚合酶
0.4 μ L5U/ μ L, ddH203.6 μ L。
[0024]所述的10XBuffer5yL 中含有 200mM Tris-HCl ρΗ8.8、25 °C, IOOmM KCl,IOOmM(NH4)2SO4,1.0%Triton X-1OO0
[0025]步驟(3)中所述的擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性5min后進(jìn)行下面程序:94°C變性40S，45°〇退火4(^，651:延伸lmin20S，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后65°C延伸7min。
[0026]本發(fā)明中所涉及的4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(SgSSR1017、SgSSR0804、SgSSRl 123、SgSSRl 103)的序列如 SEQ ID NO:1_4 所示。
[0027]組合這四對(duì)引物，通過調(diào)整PCR反應(yīng)體系，獲得了這四對(duì)引物可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增的參數(shù)，這些參數(shù)是:10XBuffer5y L(200mMTris - HCl (pH8.8at25 °C ) , IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 1.0%Triton X-100),MgCl23yL(25mM), dNTPl.0yL(各含 IOmM)，模板 I μ L(IOOng)，SgSSR1017 正反向引物各2 μ L，SgSSR0804正反向引物各1.5 μ L，SgSSRl 123正反向引物各I μ L，SgSSRl 103正反向弓丨物各I μ L，Taq DNA聚合酶0.4 μ L (5U/μ L)，ddH203.6 μ L。反應(yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)?94°C變性5min后進(jìn)行下面程序:94°C變性40S，45°C退火40S，65°C延伸lmin20S，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后65°C延伸7min。
[0028]有益.效果
[0029](I)本發(fā)明建立了進(jìn)行大竹蟶家系和親子鑒定的4重PCR反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，因此與原有的PCR方法相比效率提高了 4倍。
[0030](2)本發(fā)明具有高效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)，可以在大竹蟶種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系比較、種質(zhì)鑒定、家系培育與管理以及良種選育中進(jìn)行推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031 ] 圖1為大竹蟶4重PCR擴(kuò)增聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0033]實(shí)施例1
[0034](I)樣品采集和DNA制備剪取大竹蟶腹足0.lg，用濾紙吸干、剪刀剪碎后放入
1.5mL 的離心管，加入 450 μ L STE (150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris, lmmol/L EDTA)緩沖液，25 μ L的10%SDS，10 μ L蛋白酶K (20mg/mL)混勻，55°C消化過夜，用苯酚、氯仿及酚/氯仿各抽提一次，等體積的異丙醇沉淀，12，000r/min離心30min，沉淀用70%的乙醇洗2次，再用50 μ L雙蒸水溶解，在0.8%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。
[0035](2)微衛(wèi)星引物的合成根據(jù)生物素(biotin)與鏈親和素(streptavidin)的強(qiáng)親和性原理，用平端限制性內(nèi)切酶MboI消化大竹蟶基因組DNA，回收純化300-1000bp的片段，連接上接頭，與生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星寡核苷酸探針(CA)16退火結(jié)合，用鏈親和素磁珠(streptavidin magnetic beads)親和捕捉,獲得含有微衛(wèi)星序列的單鏈目的片段,經(jīng)PCR擴(kuò)增形成雙鏈，然后克隆到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5 α中，構(gòu)建大竹蟶微衛(wèi)星富集文庫(kù)，克隆測(cè)序其中的微衛(wèi)星序列，用Primer5軟件設(shè)計(jì)大竹蟶不同位點(diǎn)的微衛(wèi)星正反向引物，將序列送生物公司合成。
[0036](3) PCR擴(kuò)增運(yùn)用以上優(yōu)化好的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序?qū)Σ煌笾裣|個(gè)體進(jìn)行4重PCR擴(kuò)增。
[0037](4)產(chǎn)物檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中依據(jù)條帶的亮度判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無或擴(kuò)增量的多少，然后用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行不同個(gè)體的基因分型，明確判斷不同個(gè)體在每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增等位基因的大小。
[0038]圖1為大竹蟶4重PCR擴(kuò)增聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中第一泳道為分子內(nèi)標(biāo)Marker,記為M,第二到十泳道為9個(gè)不同大竹経個(gè)體4重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別記為:1，2，3，4，5，6，7，8，9 ;圖中同時(shí)標(biāo)示出了 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同個(gè)體擴(kuò)增的區(qū)間。雖然體系中SgSSR1017引物濃度最高，但其擴(kuò)增效率卻最低，在電泳圖譜中隱約可見;其次為SgSSR0804,電泳圖譜相對(duì)較清晰；SgSSR1123和SgSSR1103擴(kuò)增效率最高，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因均清晰可見。同時(shí)，我們也可以看出SgSSR1103僅檢測(cè)到2個(gè)等位基因，不同個(gè)體間沒表現(xiàn)出多態(tài)性，而其他 3個(gè)位點(diǎn)在不同個(gè)體中都檢測(cè)到了數(shù)量不等的等位基因。
【權(quán)利要求】
1.一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法，包括: (1)樣品米集和DNA制備: 剪取大竹蟶的腹足，采用傳統(tǒng)的酚氯仿法提取基因組DNA ； (2)微衛(wèi)星引物的合成: 通過磁珠富集法構(gòu)建大竹蟶微衛(wèi)星富集文庫(kù)，克隆測(cè)序其中的微衛(wèi)星序列，用Primer5軟件設(shè)計(jì)大竹蟶不同位點(diǎn)的微衛(wèi)星正反向引物并合成； 所述的正反向引物如下:
SgSSR1017-F:ATAAAATGGTGAGGGTTG ；
SgSSR1017-R:AACTTCACACAAAATAACTGCTA ；
SgSSR0804-F:TCATCTACCATCCCACCC ；
SgSSR0804-R:CTTTATTCAGTTTTCCTACGCT ；
SgSSRl123-F:TCAACCTATGTTACCCTTATAC ；
SgSSRl123-R:CTTCAGTTAGATTAGGAGCA ；
SgSSRl103-F:TTTCAGTAATAAAGCGACC ；
SgSSRl103-R:AACTCTGGTAAGAAGGATTG ； (3)PCR 擴(kuò)增: 運(yùn)用優(yōu)化好的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序?qū)Σ煌笾裣|個(gè)體進(jìn)行4重PCR擴(kuò)增； (4)產(chǎn)物檢測(cè): PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中依據(jù)條帶的亮度判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無或擴(kuò)增量的多少，然后用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行不同個(gè)體的基因分型，明確判斷不同個(gè)體在每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增等位基因的大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(3)中所述的 PCR 擴(kuò)增體系為 10XBuffer5y L，MgCl23 μ L25mM, dNTPl.Ομ L 各含10mM，模板lyLlOOng，SgSSR1017正反向引物各2 μ L，SgSSR0804正反向引物各1.5yL,SgSSRl 123正反向引物各I μ L，SgSSRl 103正反向引物各I μ L，Taq DNA聚合酶0.4 μ L5U/μ L, ddH203.6 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述的 10XBuffer5y L 中含有 200mM Tris-HCl pH8.8,25°C, IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,1.0%Triton X-100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大竹蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的4重PCR檢測(cè)方法，其特征在于:步驟(3)中所述的擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性5min后進(jìn)行下面程序:94°C變性40S，45°C退火40S，65°C延伸lmin20S，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后65°C延伸7min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103898214SQ201410103315
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】張志偉, 陳愛華, 張朝暉, 張志勇, 姚國(guó)興, 蔡永祥, 吳楊平, 張雨, 曹奕, 高波 申請(qǐng)人:江蘇省海洋水產(chǎn)研究所