用于對流行性感冒進(jìn)行治療以及診斷的組合物以及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了新的人類抗流行性感冒抗體以及相關(guān)的組合物和方法，其中所述的抗體與一種基質(zhì)2蛋白(M2)同型四聚體的構(gòu)象抗原決定簇發(fā)生了結(jié)合。這些抗體被用在流行性感冒感染的診斷以及治療當(dāng)中。
【專利說明】用于對流行性感冒進(jìn)行治療以及診斷的組合物以及方法
[0001] 本申請是2008年11月12日遞交的申請?zhí)枮?00880123932. 8,發(fā)明名稱為"用于 對流行性感冒進(jìn)行治療以及診斷的組合物以及方法"的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 本申請要求享有申請日為2007年11月12日的臨時申請USSN60/987353、申請日 為2007年11月12日的臨時申請USSN60/987355、申請日為2008年5月16日的臨時申請 USSN61/053840、以及申請日為2008年9月8日的臨時申請USSN61/095208中的權(quán)益，上述 文獻(xiàn)中的全部內(nèi)容均作為一個整體在本發(fā)明中被引入作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明大體上涉及對流行性感冒感染的治療、診斷以及監(jiān)控。本發(fā)明更加具體的 涉及到識別流行性感冒基質(zhì)2蛋白-特異性抗體的方法以及它們的制造和使用。這樣的抗 體可以被有效的用在藥物組合物中，用于對流行性感冒進(jìn)行預(yù)防以及治療，并且用于對流 行性感冒的感染進(jìn)行診斷以及監(jiān)控。

【背景技術(shù)】
[0005] 在美國，流行性感冒病毒每年感染了 5-20 %的人群并且導(dǎo)致30000-50000例的死 亡。盡管流行性感冒疫苗是預(yù)防感染的首要方法，在美國同樣可以利用四種抗病毒藥物： 金剛燒胺（amantadine),金剛乙胺（rimantadine),奧司他韋（oseltamivir)以及扎那米韋 (zanamivir)。到2005年12月為止，僅僅奧司他韋（TAMIFLU?)被推薦用來進(jìn)行A型流行 性感冒的治療，這是因?yàn)樗霾《緦饎偼榘芬约敖饎傄野返目剐栽鰪?qiáng)，這種抗性的增強(qiáng) 是由于存在于所述病毒的M2蛋白中的氨基酸取代而產(chǎn)生的。
[0006] 由A型流行性感冒的病毒感染而引發(fā)的疾病以其周期性的性質(zhì)為代表?？乖钠?變以及漂移使得每年有不同的A型菌株出現(xiàn)。不僅如此，所述的高度致病性的菌株侵入普 遍人群中的威脅加強(qiáng)了對于流行性感冒感染的新的治療方法的需求。所述的中和抗體的主 要片段指向所述的紅血球凝集素以及神經(jīng)氨糖酸苷酶蛋白的多態(tài)性區(qū)域。因此，這樣的一 種中和性的單克隆抗體大概應(yīng)當(dāng)僅僅能夠命中一個或者幾個菌株。近來的焦點(diǎn)專注于相對 而言不變的基質(zhì)2 (M2)蛋白。一種作用于基質(zhì)2蛋白（M2)的中和性單克隆抗體可能應(yīng)當(dāng) 適合于對所有的A型流行性感冒菌株進(jìn)行治療。
[0007] 在一種形成離子通道的同型四聚體中發(fā)現(xiàn)了所述的基質(zhì)2蛋白（M2)，并且其被認(rèn) 為能夠幫助所述的病毒在進(jìn)入所述細(xì)胞中時脫除外殼。在發(fā)生感染之后，可以在所述的細(xì) 胞表面上找到豐富的基質(zhì)2蛋白。隨后其被導(dǎo)入到所述的病毒粒子外殼中，在所述的病毒 粒子外殼中僅僅包括全部外殼蛋白的大約2%。所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e) 很短，所述的氨基末端上的2-24個氨基酸陳列在所述的細(xì)胞之外。抗基質(zhì)2蛋白單克隆抗 體（Anti-M2MAb)迄今為止已經(jīng)作用于這種線性序列。因此，它們對于細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)2蛋 白不會表現(xiàn)出期望的結(jié)合性質(zhì)，包括在天然的基質(zhì)2蛋白的構(gòu)象抗原決定簇上的結(jié)合。
[0008] 因此，在本領(lǐng)域存在一種對于新的抗體的長期需求，其中所述的抗體能夠與所述 的細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)2蛋白以及所述的天然基質(zhì)2蛋白的構(gòu)象抗原決定簇進(jìn)行結(jié)合。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了完全人類單克隆抗體，其中所述的單克隆抗體能夠特異性的作用于 基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)。任選的，所述的抗體是從人類供體的B細(xì)胞中分離得 到的。范例性的單克隆抗體包括本發(fā)明中所描述的8ilO,21B15以及23K12?？梢赃x擇的， 所述的單克隆抗體是一種這樣的抗體，其與8il0, 21B15以及23K12在同樣的表位上進(jìn)行結(jié) 合。所述的抗體在本發(fā)明中分別被稱為人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體。所述 的人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體具有下述性質(zhì)中的一種或者多種：a)在一種 流行性感冒病毒的基質(zhì)2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的表位上進(jìn)行結(jié)合； b)與感染了 A型流行性感冒的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合；或者c)與A型流行性感冒病毒進(jìn)行結(jié)合。 [0010] 所述的人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體結(jié)合的表位是一種基質(zhì)2蛋 白多肽的非線性表位。優(yōu)選的，所述的表位包括所述的基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)多 肽的氨基末端區(qū)域。更加優(yōu)選的，所述的表位完全的或者部分的包括所述的氨基酸序列 SLLTEV(序列識別號：42)。最為優(yōu)選的，所述的表位包括存在于所述的基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外 結(jié)構(gòu)域（M2e)多肽的位置2、5以及6上的氨基酸，其中所述的編號與序列識別號1中的編 號一致。所述的存在于位置2處的氨基酸是絲氨酸；存在于位置5處的氨基酸是蘇氨酸；并 且存在于位置6處的氨基酸是谷氨酸。
[0011] 一種人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體中含有重鏈可變區(qū)域以及輕鏈可 變區(qū)域，其中所述的重鏈可變區(qū)域中含有序列識別號44或者50中所示的氨基酸序列，并 且所述的輕鏈可變區(qū)域中含有序列識別號46或者52中所示的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述 的三個重鏈互補(bǔ)決定區(qū)域（CDR)中包括一種氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列與下述氨 基酸序列具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或者更高的同一性4￥￥13(序列識別 號：72)，F(xiàn)IYYGGNTKYNPSLKS (序列識別號：74)，ASCSGGYCILD (序列識別號：76)，SNYMS (序 列識別號：1〇3)，VIYSGGSTYYADSVK (序列識別號：105)，CLSRMRGYGLDV (序列識別號：107) (通過Kabat方法進(jìn)行測定）或者ASCSGGYCILD (序列識別號：76)，CLSRMRGYGLDV (序列識別 號：107)，GSSISN(序列識別號：109)，F(xiàn)IYYGGNTK(序列識別號：110)，GSSISN(序列識別號： 111)，GFTVSSN(序列識別號：112)，VIYSGGSTY(序列識別號：113)(通過Chothia方法進(jìn)行 測定），并且所述的三個輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)域（CDR)中包括一種氨基酸序列，其中所述的氨基 酸序列與下述氨基酸序列具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或者更高的同一性： RASQNIYKYLN(序列識別號：59)，AASGLQS (序列識別號：61)，QQSYSPPLT (序列識別號：63)， RTSQSISSYLN(序列識別號：92)，AASSLQSGVPSRF (序列識別號：94)，QQSYSMPA (序列識別號： 96)(通過Kabat方法進(jìn)行測定）或者RASQNIYKYLN (序列識別號：59)，AASGLQS (序列識別 號：61)，QQSYSPPLT (序列識別號：63)，RTSQSISSYLN(序列識別號：92)，AASSLQSGVPSRF(序 列識別號：94)，QQSYSMPA (序列識別號：96)(通過Chothia方法進(jìn)行測定）。所述的抗體與 基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)進(jìn)行了結(jié)合。
[0012] 所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體的重鏈來自于一種生殖系V(可變 的）基因，例如，所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域4(IgHV4)生殖系基因或者免疫球蛋白重 鏈可變區(qū)域3生殖系基因。
[0013] 本發(fā)明所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體包括可變的重鏈（VH)區(qū)域， 其中所述的重鏈區(qū)域是由人類免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域4(IgHV4)生殖系基因序列或者免 疫球蛋白重鏈可變區(qū)域3生殖系基因序列進(jìn)行編碼的。免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域4生殖系 基因序列在例如 Accession numbers (登錄號）L10088、M29812、M95114、X56360 #&M95117 中有所表示。免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域3生殖系基因序列在例如Accession numbers (登錄 號）X92218、X70208、Z27504、M99679以及AB019437中有所表示。本發(fā)明所述的基質(zhì)2蛋 白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體包括一個由一種核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)域，其中所述的 核酸序列與所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域4生殖系基因序列或者免疫球蛋白重鏈可變 區(qū)域3生殖系基因序列具有至少80%的同源性。優(yōu)選的，所述的核酸序列與所述的免疫球 蛋白重鏈可變區(qū)域4生殖系基因序列或者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域3生殖系基因序列具有 至少90 %、95 %、96 %、97 %的同源性，并且更加優(yōu)選的，與所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域 4生殖系基因序列或者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域3生殖系基因序列具有至少98^^99%的 同源性。所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體的重鏈可變區(qū)域與所述的由免疫球 蛋白重鏈可變區(qū)域4(IgHV4)生殖系基因序列或者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域3(IgHV3)生殖 系基因序列編碼的重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列具有至少80%的同源性。優(yōu)選的，所述的基 質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體的重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列與所述的由免疫球蛋白 重鏈可變區(qū)域4 (IgHV4)生殖系基因序列或者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域3 (IgHV3)生殖系基 因序列編碼的氨基酸序列具有至少90195196197%的同源性，并且更加優(yōu)選的，與由 所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域4 (IgHV4)生殖系基因序列或者免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域 3 (IgHV3)生殖系基因序列編碼的序列具有至少98%、99%的同源性。
[0014] 本發(fā)明所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體同樣包括可變的輕鏈（')區(qū) 域，其中所述的輕鏈區(qū)域是由人類免疫球蛋白kappa可變區(qū)域l(IgKVl)生殖系基因序列進(jìn) 行編碼的。人類免疫球蛋白kappa可變區(qū)域1輕鏈可變生殖系基因序列在例如Accession numbers X59315、X59312、X59318、J00248以及Y14865中有所表示?？梢赃x擇的，所述的基 質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體包括由一種核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)域，其中所述 的核酸序列與所述的免疫球蛋白kappa可變區(qū)域1 (IgKVl)生殖系基因序列具有至少80% 的同源性。優(yōu)選的，所述的核酸序列與所述的免疫球蛋白kappa可變區(qū)域l(IgKVl)生殖系 基因序列具有至少90%、95%、96%、97%的同源性，并且更加優(yōu)選的，與所述的免疫球蛋白 kappa可變區(qū)域1生殖系基因序列具有至少98 %、99 %的同源性。所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞 外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體的輕鏈可變區(qū)域與所述的由免疫球蛋白kappa可變區(qū)域l(IgKVl)生 殖系基因序列編碼的輕鏈可變區(qū)域的氨基酸序列具有至少80%的同源性。優(yōu)選的，所述的 基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體的輕鏈可變區(qū)域的氨基酸序列與所述的由免疫球蛋 白kappa可變區(qū)域l(IgKVl)生殖系基因序列編碼的氨基酸序列具有至少90%、95%、96%、 97%的同源性，并且更加優(yōu)選的，與由所述的免疫球蛋白kappa可變區(qū)域l(IgKVl)生殖系 基因序列編碼的序列具有至少98 %、99 %的同源性。
[0015] 在另外一個方面，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明所述的人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié) 構(gòu)域（huM2e)抗體的組合物。在各種不同的方面中，所述的組合物中進(jìn)一步的包括一種抗 病毒藥物，一種病毒侵入抑制劑或者一種病毒吸附抑制劑。所述的抗病毒藥物是例如一種 神經(jīng)氨糖酸苷酶抑制劑，一種透明質(zhì)酸（HA)抑制劑，一種唾液酸抑制劑或者一種基質(zhì)2蛋 白離子通道抑制劑。所述的基質(zhì)2蛋白離子通道抑制劑是例如金剛烷胺或者金剛乙胺。所 述的神經(jīng)氨糖酸苷酶抑制劑是例如扎那米韋，或者奧司他韋的磷酸鹽。在一個進(jìn)一步的方 面，所述的組合物中進(jìn)一步包括第二種抗A型流行性感冒的抗體。
[0016] 在一個進(jìn)一步的方面，依照本發(fā)明所述的人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e) 抗體與一種治療試劑或者一種可探測性標(biāo)記進(jìn)行了可操作的連接。
[0017] 除此之外，本發(fā)明提供了一種刺激免疫應(yīng)答、治療、預(yù)防或者緩解流行性感冒病毒 感染所帶來的癥狀的方法，其中所述的方法是通過向宿主施用一種人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外 結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體的方式來實(shí)現(xiàn)的。
[0018] 任選的，進(jìn)一步的向所述的宿主施用另外一種試劑，所述的試劑是例如，但不局限 于，一種流行性感冒病毒抗體，一種抗病毒藥物例如神經(jīng)氨糖酸苷酶抑制劑，透明質(zhì)酸（HA) 抑制劑，唾液酸抑制劑或者基質(zhì)2蛋白（M2)離子通道抑制劑，一種病毒侵入抑制劑或者一 種病毒吸附抑制劑。所述的基質(zhì)2蛋白離子通道抑制劑是例如金剛烷胺或者金剛乙胺。所 述的神經(jīng)氨糖酸苷酶抑制劑是例如扎那米韋，或者奧司他韋的磷酸鹽。所述的宿主患有或 者具有發(fā)展成為流行性感冒病毒感染的傾向，例如，一種自身免疫性疾病或者是一種炎性 障礙。
[0019] 在另外一個方面，本發(fā)明提供了一種向宿主施用本發(fā)明所述的人類基質(zhì)2蛋白細(xì) 胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體的方法，其中所述的施用發(fā)生在所述的宿主被暴露于流行性感冒 病毒中的之前和/或之后。例如，可以使用本發(fā)明中所述的人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 (huM2e)抗體來治療或者預(yù)防排斥性流行性感冒的感染。所述的人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié) 構(gòu)域（huM2e)抗體是以足以促進(jìn)病毒的清除或者消除感染了 A型流行性感冒的細(xì)胞的劑量 來進(jìn)行施用的。
[0020] 同樣被包括在本發(fā)明之內(nèi)的是一種在患者體內(nèi)測定一種流行性感冒病毒感染是 否存在的方法，所述的方法通過下述方式來實(shí)現(xiàn)：將一種來自于所述患者的生物學(xué)樣本與 一種人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體進(jìn)行接觸；對與所述的生物學(xué)樣本發(fā)生結(jié) 合的所述抗體的劑量進(jìn)行探測；并且將與所述的生物學(xué)樣本發(fā)生結(jié)合的所述抗體的所述劑 量與一個對照值進(jìn)行比較。
[0021] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種包括人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體的診斷 用試劑盒。
[0022] 本發(fā)明的其他特征以及優(yōu)點(diǎn)將通過下面的詳細(xì)描述以及權(quán)利要求而變得顯而易 見并且其被涵蓋在下述的詳細(xì)描述以及權(quán)利要求之內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 附圖1表示的是在存在有或者不存在有游離的基質(zhì)2蛋白肽的情況下，本發(fā)明中 所述的三種抗體以及對照的人類14C2抗體與293-人胚腎細(xì)胞（HEK)進(jìn)行的結(jié)合，其中所 述的293-人胚腎細(xì)胞使用一種基質(zhì)2蛋白表達(dá)構(gòu)建體或者對照載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。
[0024] 附圖2A以及B是曲線圖，表示的是與A型流行性感冒/PR/8/32發(fā)生結(jié)合的人類 單克隆抗體。
[0025] 附圖3A是一個圖表，表示的是基質(zhì)2蛋白（M2)變體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序 列。
[0026] 附圖3B以及C是柱狀圖表，表示的是人類單克隆抗流行性感冒抗體與附圖3A中 所示的基質(zhì)2蛋白變體所進(jìn)行的結(jié)合。
[0027] 附圖4A以及B是柱狀圖表，表示的是經(jīng)過丙氨酸分區(qū)突變后，人類單克隆抗流行 性感冒抗體與基質(zhì)2蛋白肽所進(jìn)行的結(jié)合。
[0028] 附圖5是一系列的柱狀圖表，表示的是單克隆抗體8il0以及23K12與基質(zhì)2蛋白 (M2)之間所進(jìn)行的結(jié)合，這代表著流行性感冒菌株A/香港/483/1997序列在所述的中國倉 鼠卵巢（CH0)細(xì)胞系DG44中進(jìn)行了穩(wěn)定的表達(dá)。
[0029] 附圖6A是一個圖表，表示的是抗基質(zhì)2蛋白抗體與變化的基質(zhì)2蛋白肽之間進(jìn)行 的交叉反應(yīng)性結(jié)合。
[0030] 附圖6B是一個圖表，表示的是基質(zhì)2蛋白抗體對截短型基質(zhì)2蛋白肽而言的結(jié)合 活性。
[0031] 附圖7是一個曲線圖，表示的是利用人類抗流行性感冒單克隆抗體進(jìn)行治療的感 染了流行性感冒的小鼠的存活情況。
[0032] 附圖8是一個圖解，表示的是所述的抗基質(zhì)2蛋白抗體在基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié) 構(gòu)域（M2e)的N-末端中的一個高度保守的區(qū)域內(nèi)發(fā)生的結(jié)合。
[0033] 附圖9是一個圖表，表示的是在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)中，克隆于粗上清液中 的抗基質(zhì)2蛋白大鼠抗人類單克隆抗體（rHMAb)與流行性感冒的結(jié)合，而所述的對照抗基 質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)單克隆抗體14C2并不能容易的與病毒進(jìn)行結(jié)合。
[0034] 附圖10是一系列的照片，表示的是抗基質(zhì)2蛋白大鼠抗人類單克隆抗體（rHMAb) 與感染了流行性感冒的細(xì)胞所進(jìn)行的結(jié)合。犬腎（MDCK)細(xì)胞經(jīng)過或者沒有經(jīng)過A型流行 性感冒/PR/8/32的感染并且在24小時之后對來自于粗上清液中的抗體結(jié)合進(jìn)行測試。通 過所述的熒光微量檢測技術(shù)（FMAT)平板掃描儀對數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。
[0035] 附圖11是一個圖表，表示的是克隆于粗上清液中的抗基質(zhì)2蛋白大鼠抗人類單克 隆抗體（rHMAb)與細(xì)胞所進(jìn)行的結(jié)合，其中所述的細(xì)胞利用所述的流行性感冒亞型H3N2、 HK483、以及VN1203基質(zhì)2蛋白進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。將編碼與流行性感冒菌株H3N2、HK483、以及 VN1203相應(yīng)的全長基質(zhì)2蛋白cDNA的質(zhì)粒與一種模擬的質(zhì)粒對照瞬間轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞內(nèi)。 測試所述的14C2、8il0,23K12,以及21B15單克隆抗體與所述轉(zhuǎn)染體之間的結(jié)合，并且使用 一種AF647-偶聯(lián)型抗人類免疫球蛋白G次級抗體進(jìn)行探測。圖中表示的是熒光激活的細(xì) 胞分揀器（FACS)分析后，所述的特異性的單克隆抗體結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 本發(fā)明提供了完全人類單克隆抗體，其中所述的單克隆抗體能夠特異性的作用于 所述的基質(zhì)2蛋白（M2)多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。所述的抗體在本發(fā)明中分別被稱為人類基 質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體。
[0037] 基質(zhì)2蛋白（M2)是一個有96個氨基酸的跨膜蛋白，其以一種同型四聚體的形式 存在于流行性感冒病毒以及病毒感染性細(xì)胞的表面之上?；|(zhì)2蛋白含有一個有23個氨 基酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)，所述的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域高度保守的穿過（across) A型流行性感 冒菌株。自從1918年在全國流行的菌株之后，僅有幾個氨基酸發(fā)生了改變，因此基質(zhì)2蛋 白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)τ诹餍行愿忻暗闹委煻允且粋€有吸引力的目標(biāo)。在先前的研究中，對 于所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)具有特異性的單克隆抗體是通過一種肽的免疫 作用而得到的，其中所述的肽與所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)的線性序列相對 應(yīng)。與之形成對照的是，本發(fā)明提供了一種新的方法，其中在細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)完全長度的基質(zhì) 2蛋白（M2)，這樣一來能夠?qū)εc這種細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)發(fā)生結(jié) 合的人類抗體進(jìn)行識別。已經(jīng)表明，所述的人類基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體能 夠與存在于所述的基質(zhì)2蛋白-轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及天然基質(zhì)2蛋白上的構(gòu)象抗原決定簇進(jìn)行結(jié) 合，可以與感染了流行性感冒的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，或者可以與所述的病毒自身進(jìn)行結(jié)合。所述 的人類基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體不與所述的線性基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域（M2e)肽進(jìn)行結(jié)合，但是它們的確能夠與幾種天然的基質(zhì)2蛋白變體進(jìn)行結(jié)合，也能夠經(jīng) 由cDNA的轉(zhuǎn)染作用在細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。因此，本發(fā)明能夠?qū)θ祟悊慰寺】贵w進(jìn)行識別以 及制備，其中所述的人類單克隆抗體對于非常寬范圍的A型流行性感冒病毒菌株表現(xiàn)出新 的特異性。這些抗體可以進(jìn)行診斷性的應(yīng)用，用于對A型流行性感冒的感染進(jìn)行識別，并且 可以進(jìn)行治療性的應(yīng)用，用于對A型流行性感冒的感染進(jìn)行治療。
[0038] 本發(fā)明所述的人類基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體具有下述性質(zhì)中的一 種或者多種：所述的人類基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體結(jié)合于a)存在于一種流 行性感冒病毒的基質(zhì)2蛋白（M2)多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個表位；b)結(jié)合于感染了 A型 流行性感冒的細(xì)胞；和/或c)結(jié)合于A型流行性感冒病毒（S卩，病毒粒子）。本發(fā)明所述的 人類基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體經(jīng)由免疫效應(yīng)器機(jī)制對感染了流行性感冒的 細(xì)胞進(jìn)行消除并且通過與流行性感冒病毒粒子的結(jié)合促進(jìn)了病毒的直接清除，其中所述的 免疫效應(yīng)器機(jī)制是例如抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC)。本發(fā)明所述的人類基質(zhì) 2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗體與所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)多肽的氨 基末端區(qū)域進(jìn)行結(jié)合。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的人類基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（huM2e)抗 體與所述的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)多肽的氨基末端進(jìn)行結(jié)合，其中所述的N-末 端的蛋氨酸殘基是空鍵。范例性的基質(zhì)2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)序列包括在下面的表 格I中列出的那些序列。
[0039] 表格 I
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組抗-基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體，所述的抗體包括：由包括序列識 別號：43所示核酸序列的核酸序列進(jìn)行編碼的重鏈可變區(qū)域，以及由包括序列識別號：45 所示核酸序列的核酸序列進(jìn)行編碼的輕鏈可變區(qū)域。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述包括序列識別號：43所示核酸序列的核酸序 列是一種cDNA，以及所述包括序列識別號：45所示核酸序列的核酸序列是一種cDNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述序列識別號：43所示的核酸序列是一種 cDNA，以及所述序列識別號：45所示的核酸序列是一種cDNA。
4. 一種載體，所述載體具有包括序列識別號：43所示核酸序列的核酸序列，以及包括 序列識別號：45所示核酸序列的核酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其中所述包括序列識別號：43所示核酸序列的核酸序 列是一種cDNA，或者所述包括序列識別號：45所示核酸序列的核酸序列是一種cDNA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其中所述的載體是適合進(jìn)行核酸繁殖或者復(fù)制的載 體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其中所述的載體是適合表達(dá)所述核酸的載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或者7所述的載體，其中所述的載體包括病毒、質(zhì)粒、或者柯斯載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體，其中所述的載體是重組病毒。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其中所述的病毒包括來自于哺乳動物基因中的啟動 子。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其中所述的哺乳動物基因是人類基因。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其中所述的病毒包括來自于病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒基 因組中的啟動子。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的載體，其中所述的病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒是多瘤病毒，禽痘 病毒，腺病毒，牛乳突淋瘤病毒，鳥類肉瘤病毒，細(xì)胞巨化病毒（CMV)，B型肝炎病毒或者猿 猴病毒40 (SV40)。
14. 一種重組抗-基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體，所述的抗體包括編碼具有序列 識別號：44所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)域的核酸序列，以及編碼具有序列識別號：46所 示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)域的核酸序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述編碼具有序列識別號：44所示氨基酸序列 的重鏈可變區(qū)域的核酸序列是一種cDNA，以及所述編碼具有序列識別號：46所示氨基酸序 列的輕鏈可變區(qū)域的核酸序列是一種cDNA。
16. -種載體，所述載體包括編碼具有序列識別號：44所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū) 域的核酸序列，以及編碼具有序列識別號：46所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)域的核酸序 列。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的載體，其中所述編碼具有序列識別號：44所示氨基酸序列 的重鏈可變區(qū)域的核酸序列是一種cDNA，以及所述編碼具有序列識別號：46所示氨基酸序 列的輕鏈可變區(qū)域的核酸序列是一種cDNA。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的載體，其中所述的載體是適合進(jìn)行核酸繁殖或者復(fù)制的載 體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的載體，其中所述的載體是適合表達(dá)所述核酸的載體。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或者19所述的載體，其中所述的載體包括病毒、質(zhì)粒、或者柯斯載 體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的載體，其中所述的載體是重組病毒。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的載體，其中所述的病毒包括來自于哺乳動物基因中的啟動 子。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體，其中所述的哺乳動物基因是人類基因。
24. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的載體，其中所述的病毒包括來自于病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒基 因組中的啟動子。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的載體，其中所述的病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒是多瘤病毒，禽痘 病毒，腺病毒，牛乳突淋瘤病毒，鳥類肉瘤病毒，細(xì)胞巨化病毒（CMV)，B型肝炎病毒或者猿 猴病毒40 (SV40)。
26. -種重組抗-基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體，所述的抗體包括：由包括序列 識別號：49所示核酸序列的核酸序列進(jìn)行編碼的重鏈可變區(qū)域，以及由包括序列識別號： 51所示核酸序列的核酸序列進(jìn)行編碼的輕鏈可變區(qū)域。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體，其中所述包括序列識別號：49所示核酸序列的核酸 序列是一種cDNA，以及所述包括序列識別號：51所示核酸序列的核酸序列是一種cDNA。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體，其中所述序列識別號：49所示的核酸序列是一種 cDNA，以及所述序列識別號：51所示核酸序列是一種cDNA。
29. -種載體，所述載體具有包括序列識別號：49所示的核酸序列的核酸序列，以及包 括序列識別號：51所示的核酸序列的核酸序列。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體，其中所述包括序列識別號：49所示核酸序列的核酸 序列是一種cDNA，以及所述包括序列識別號：51所示核酸序列的核酸序列是一種cDNA。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體，其中所述的載體是適合進(jìn)行核酸繁殖或者復(fù)制的載 體。
32. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體，其中所述的載體是適合表達(dá)所述核酸的載體。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31或者32所述的載體，其中所述的載體包括病毒、質(zhì)粒、或者柯斯載 體。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的載體，其中所述的載體是重組病毒。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的載體，其中所述的病毒包括來自于哺乳動物基因中的啟動 子。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的載體，其中所述的哺乳動物基因是人類基因。
37. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的載體，其中所述的病毒包括來自于病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒基 因組中的啟動子。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的載體，其中所述的病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒是多瘤病毒，禽痘 病毒，腺病毒，牛乳突淋瘤病毒，鳥類肉瘤病毒，細(xì)胞巨化病毒（CMV)，B型肝炎病毒或者猿 猴病毒40 (SV40)。
39. -種重組抗-基質(zhì)2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（M2e)抗體，所述的抗體包括編碼具有序列 識別號：50所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)域的核酸序列，以及編碼具有序列識別號：52所 示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)域的核酸序列。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的抗體，其中所述編碼具有序列識別號：50所示氨基酸序列 的重鏈可變區(qū)域的核酸序列是一種cDNA，以及所述編碼具有序列識別號：52所示氨基酸序 列的輕鏈可變區(qū)域的核酸序列是一種cDNA。
41. 一種載體，所述載體包括編碼具有序列識別號：50所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū) 域的核酸序列，以及編碼具有序列識別號：52所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)域的核酸序 列。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的載體，其中所述編碼具有序列識別號：50所示氨基酸序列 的重鏈可變區(qū)域的核酸序列是一種cDNA，以及所述編碼具有序列識別號：52所示氨基酸序 列的輕鏈可變區(qū)域的核酸序列是一種cDNA。
43. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的載體，其中所述的載體是適合進(jìn)行核酸繁殖或者復(fù)制的載 體。
44. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的載體，其中所述的載體是適合表達(dá)所述核酸的載體。
45. 根據(jù)權(quán)利要求43或者44所述的載體，其中所述的載體包括病毒、質(zhì)粒、或者柯斯載 體。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的載體，其中所述的載體是重組病毒。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的載體，其中所述的病毒包括來自于哺乳動物基因中的啟動 子。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的載體，其中所述的哺乳動物基因是人類基因。
49. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的載體，其中所述的病毒包括來自于病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒基 因組中的啟動子。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的載體，其中所述的病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒是多瘤病毒，禽痘 病毒，腺病毒，牛乳突淋瘤病毒，鳥類肉瘤病毒，細(xì)胞巨化病毒（CMV)，B型肝炎病毒或者猿 猴病毒40 (SV40)。
【文檔編號】C12N15/63GK104059143SQ201410103093
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2008年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2007年11月12日
【發(fā)明者】A·G·格蘭德, G·金, T·考克斯, O·奧爾森, J·米特查姆, M·默勒 申請人:特羅科隆科學(xué)有限公司