一種產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。其中所述工程菌是通過將編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因引入枯草芽孢桿菌中表達，同時加強枯草芽孢桿菌自身的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶表達，在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建成從葡萄糖或甘油到N-乙酰神經(jīng)氨酸的完整代謝通路，從而能利用葡萄糖或甘油為底物進行發(fā)酵培養(yǎng)生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。本發(fā)明所采用的枯草芽孢桿菌在食品工業(yè)上已得到廣泛的應(yīng)用，已被證明安全無害，適合于生產(chǎn)食品和保健品所需的N-乙酰神經(jīng)氨酸。
【專利說明】一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]唾液酸，又稱燕窩酸，廣泛存在于自然界的各種生物體內(nèi)，唾液酸是一系列含有9個碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖的統(tǒng)稱，其中最主要的組分是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)。
[0003]N-乙酰神經(jīng)氨酸目前的應(yīng)用主要有兩個領(lǐng)域，一個是作為醫(yī)藥中間體，用于合成抗流感藥物扎那米韋；另一個是作為食品添加劑，用于嬰幼兒奶粉中，以使其接近母乳，促進嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。
[0004]作為醫(yī)藥中間體的N-乙酰神經(jīng)氨酸，可以用生物催化法和發(fā)酵法生產(chǎn)，其中生物催化法是以N-乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸鈉為原料，以高表達神經(jīng)氨酸醛縮酶和N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶的大腸桿菌菌體或細菌破碎液為催化劑，轉(zhuǎn)化生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸是對大腸桿菌進行代謝工程改造，使其能從葡萄糖或甘油直接合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。
[0005]用作食品添加劑的N-乙酰神經(jīng)氨酸目前主要還是從含有N-乙酰神經(jīng)氨酸的天然原料(如雞蛋、乳清、燕窩等)中直接提取，該方法生產(chǎn)的產(chǎn)品為天然來源，安全可靠，但由于含量太低和成分復(fù)雜導(dǎo)致提取工藝復(fù)雜，成本高昂。而目前生物轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法都是以大腸桿菌進行生產(chǎn)，大腸桿菌由于發(fā)酵過程中會有內(nèi)毒素產(chǎn)生，對于其生產(chǎn)出的終產(chǎn)品可能會有不利的影響，因此，大腸桿菌生產(chǎn)出的N-乙酰神經(jīng)氨酸在食品添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用尚未得到權(quán)威認(rèn)可。
[0006]枯草芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)品已在人類食品和保健品中得到廣泛的應(yīng)用，目前尚未發(fā)現(xiàn)毒副作用，被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)認(rèn)證為一般認(rèn)為安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)類微生物,具有安全無害的優(yōu)點,可用于人類食品保健品領(lǐng)域的生產(chǎn)。但相比大腸桿菌，枯草芽孢桿菌的遺傳改造比較復(fù)雜，代謝背景不清晰，尚未見改造后用于N-乙酰神經(jīng)氨酸合成生產(chǎn)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明選擇枯草芽孢桿菌作為生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的出發(fā)菌株，但分析枯草芽孢桿菌的代謝途徑可知，其從葡萄糖開始可以合成到UDP-N-乙酰氨基葡萄糖，但缺乏從UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成到N-乙酰神經(jīng)氨酸的途徑，無法達到以葡萄糖為底物，發(fā)酵法直接合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的目的。[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明在枯草芽孢桿菌中外源表達編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶編碼基因neuC和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶編碼基因neuB，補足從UDP-N-乙酰氨基葡萄糖到N-乙酰神經(jīng)氨酸合成所需的酶，架構(gòu)起從葡萄糖到N-乙酰神經(jīng)氨酸的完整代謝途徑，從而實現(xiàn)利用葡萄糖直接發(fā)酵合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的目的。
[0010]為進一步提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量，本發(fā)明高表達枯草芽孢桿菌自身編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因，打通從葡萄糖或甘油到N-乙酰神經(jīng)氨酸合成的瓶頸，增加代謝流量，從而增加N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。
[0011]為此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是通過將m)P-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)肟莶菅挎邨U菌中進行外源表達而構(gòu)建得到的。
[0012]本發(fā)明所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因neuC和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因neuB來源于空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或能表達相同功能酶的微生物，基因的獲得可根據(jù)GenBank N0.AF400048中neuB和neuC基因序列全基因合成，或利用空腸彎曲菌(如菌株ATCC43438)的基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。由于來源于空腸彎曲菌的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因neuC和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因neuB連鎖在一起，因此外源表達是可以將兩個基因一起表達,也可以將兩個基因分開表達。[0013]所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因來源于枯草芽孢桿菌或能表達相同功能酶的微生物，基因的獲得可根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組序列GenBank N0.AL009126.3中的glmS基因及其上游的SD序列全基因合成，或利用枯草桿菌168菌株的基因組DNA為模板PCR擴增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。
[0014]在一個實施方案中，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因在同一個載體中一起克隆表達。作為本領(lǐng)域的科研人員，利用常規(guī)的分子克隆技術(shù)，也可以將三個基因在不同載體中分開克隆表達或以類似方式完成外源表達，從而達到同樣目的。
[0015]在一個實施方案中,所述枯草芽孢桿菌宿主為枯草芽孢桿菌164或枯草芽孢桿菌168，并且所得到的基因工程菌已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在中國武漢大學(xué)，保藏號分別為 CCTCC NO:M2013731 和 CCTCC N0:M2014038，保藏號為 CCTCC N0:M2013731 的分類號為:枯草芽孢桿菌CASOV — 3Bacillus subtilis CASOV — 3，CCTCC N0:M2014038 的分類號為:枯草芽孢桿菌CASOV — 4Bacillus subtilis CASOV — 4。本實施方案也可以選擇其他枯草芽孢桿菌菌株，達到類似的實驗?zāi)康摹?br> [0016]本發(fā)明還公開了一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，即利用上述工程菌以葡萄糖或甘油進行發(fā)酵，生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，所述應(yīng)用包括以下步驟:
[0017]I)活化培養(yǎng)工程菌種子；
[0018]2)將培養(yǎng)好的種子逐級放大，并在相應(yīng)的發(fā)酵罐中進行好氣培養(yǎng)；以及補充合適的碳氮源；
[0019]3)加入異丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)對枯草芽孢桿菌進行改造，使其可以以葡萄糖或甘油直接合成N-乙酰神經(jīng)氨酸，具有生產(chǎn)工藝簡單，環(huán)境友好的優(yōu)點。同時本發(fā)明采用的枯草芽孢桿菌作為生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的宿主，所生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸沒有內(nèi)毒素污染的威脅，安全可靠，可用于食品保健品領(lǐng)域，具有工業(yè)化生產(chǎn)的價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]下面結(jié)合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明:
[0021]圖1是枯草芽孢桿菌中葡萄糖或甘油到N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成改造途徑。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例中使用的質(zhì)粒、PCR試劑等采用商業(yè)產(chǎn)品，具體操作按照說明書進行。其他未注明的實驗操作按照常規(guī)分子操作方法進行。
[0023]實施例1:neuBC和glmS基因串聯(lián)表達載體的構(gòu)建
[0024]一、neuBC基因表達載體pHTOl-neuBC的構(gòu)建
[0025]I)根據(jù)neuBC的基因序列(GenBank N0.AF400048)全基因合成neuBC基因，兩端加BamHI和XbaI位點，具體序列如下所示(SEQ ID N0.1)。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是通過將UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)肟莶菅挎邨U菌中進行外源表達而構(gòu)建得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因來源于空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或能表達相同功能酶的微生物。
3.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因來源于枯草芽孢桿菌或能表達相同功能酶的微生物。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因在同一個載體中一起克隆表達，或克隆在不同的載體后轉(zhuǎn)入同一菌株后中分開表達。
5.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌宿主為枯草芽孢桿菌164或枯草芽孢桿菌168或其他類似菌株。
6.如權(quán)利要求5所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是保藏號為CCTCC N0:M2013731或CCTCC N0:M2014038的菌株。
7.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌工程菌的用途，其特征在于利用所述工程菌生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，其步驟包括: 1)活化培養(yǎng)工程菌種子； 2)將培養(yǎng)好的種子逐級放大，并在相應(yīng)的發(fā)酵罐中進行好氣培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中補充合適的碳氮源；以及 3)加入異丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達。
8.權(quán)利要求7的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌工程菌的用途，其特征在于利用葡萄糖或甘油作為碳源進行發(fā)酵。
【文檔編號】C12R1/125GK103923869SQ201410102633
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】柳鵬福, 孫立潔, 王紀(jì), 袁麗霞, 劉洋, 吳金勇, 陳祥松, 史吉平, 姚建銘 申請人:武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司