本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸的測定試劑及其制備方法，屬于借助于測定材料的化學(xué)或物理性質(zhì)來測試或分析材料
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：同型半胱氨酸(高半胱氨酸,Hcy)是含硫氨基酸，在細(xì)胞內(nèi)蛋氨酸脫甲基生成。同型半胱氨酸經(jīng)甲基化生成蛋氨酸，此過程需活性維生素B12及四氫葉酸作為輔助因子參與。同型半胱氨酸也可經(jīng)轉(zhuǎn)硫通路生成半胱氨酸，此過程需胱硫酶合成酶參與，磷酸吡哆醛(活性維生素B6)為其輔助因子。當(dāng)同型半胱氨酸代謝受阻，同型半胱氨酸就在細(xì)胞內(nèi)積聚，并進(jìn)入血液循環(huán)。還原型同型半胱氨酸在血中僅占1％，大部分以氧化型存在，其中80-90％與蛋白結(jié)合，5-10％與同型半胱氨酸自身結(jié)合(HCY-SS-HCY)，另外5-10％與半胱氨酸等結(jié)合形成混合型同型半胱氨酸二硫化物(CY-SS-HCY)。通常測定血中總同型半胱氨酸含量(tHCY)，臨床證明：同型半胱氨酸對預(yù)測心腦血管病、惡性腫瘤、老年性癡呆等多種疾病的發(fā)病危險具有重要意義，具體如下：(1)同型半胱氨酸與冠狀動脈疾病在動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管病癥中，其血清同型半胱氨酸的水平顯著升高，濃度越高危險性越大。所以輕微到中度同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化所致心血管疾病最廣泛、最強(qiáng)的獨(dú)立的致病因素。對慢性腎病病人，排泄HCY功能降低，血中tHCY增加，引起動脈粥樣硬化，心血管疾病死亡率增加。(2)同型半胱氨酸與血栓形成同型半胱氨酸通過產(chǎn)生超氧化物及過氧化物損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變凝血因子功能，增加血栓形成傾向。同型半胱氨酸可使小動脈血管易于栓塞及促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖參與粥樣硬化形成。同型半胱氨酸活化形式(Homocysteinthiolactone)可促使血小板聚集，并可與載脂蛋白B形成致密的復(fù)合物易于被血管壁巨噬細(xì)胞吞噬，引起血管壁脂肪堆積。同型半胱氨酸能增強(qiáng)其它心血管疾病危險因素如膽固醇、高血壓及吸煙對心血管的損害。(3)同型半胱氨酸與腎功能衰竭進(jìn)行血液透析的腎病患者，其血中同型半胱氨酸水平可達(dá)到正常人的2～4倍，且發(fā)生血管栓塞性癥狀的幾率顯著增加。(4)同型半胱氨酸與妊娠同型半胱氨酸與與妊娠高血壓綜合癥相關(guān)，妊娠中期同型半胱氨酸水平可作為早期妊娠高血壓綜合癥的指標(biāo)；在體外研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的同型半胱氨酸具有胚泡毒性，從而導(dǎo)致畸胎發(fā)病率增加；高濃度同型半胱氨酸還可引起絨毛膜絨毛細(xì)胞血管病因而導(dǎo)致復(fù)發(fā)性早期流產(chǎn)。(5)遺傳和營養(yǎng)因素所致高同型半胱氨酸血癥同型半胱氨酸在體內(nèi)的分解代謝，受兩方面因素影響最大。一是與先天遺傳有關(guān)的某些生物酶的缺乏，另一個就是體內(nèi)葉酸、維生素B6、維生素B12等營養(yǎng)元素的缺乏。這兩種缺乏都會影響同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥。目前國內(nèi)測定同型半胱氨酸的方法主要有：(1)質(zhì)譜法，該方法操作復(fù)雜，價格昂貴，不易開展。(2)膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，該方法靈敏度較低，易產(chǎn)生帶現(xiàn)象。(3)酶循環(huán)法，該方法雖然準(zhǔn)確性高，但有干擾物的影響。例如：膽紅素加入濃度在4.0mg/dl、8.0mg/dl、12.0mg/dl、16.0mg/dl、和20.0mg/dl時，產(chǎn)生的干擾偏差分別為-0.85％、0.51％、0.17％、-1.24％和-1.41％；血紅蛋白加入濃度在3.3g/L、6.7g/L、10.0g/L、11.7g/L和13.3g/L時，產(chǎn)生的干擾偏差分別為4.49％、5.09％、6.55％、4.71％和6.71％；而熒光法中，膽紅素、血紅蛋白對該試劑盒的測定結(jié)果無明顯干擾基于此，做出本申請。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有同型半胱氨酸在測試過程中存在的上述缺陷，本發(fā)明首先提供一種快速靈敏、準(zhǔn)確性好、特異性高、穩(wěn)定性好、液體雙試劑操作簡便，采用國內(nèi)外先進(jìn)的熒光法，適用于臨床全自動或半自動生化分析(手工加樣品、試劑)的同型半胱氨酸測定試劑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請采取的技術(shù)方案如下：一種同型半胱氨酸的測定試劑，由R1a試劑、R1b試劑、R2試劑和標(biāo)準(zhǔn)樣構(gòu)成，所述的R1a試劑是由TritonX-100溶解于添加有緩沖液、二硫蘇糖醇(DTT)的純化水中所形成的溶液；所述的R1b試劑是由基因重組蛋氨酸裂解酶溶解于添加有緩沖液、山梨醇、蔗糖、海藻糖、4-氨基-N,N-二甲基苯胺鹽酸鹽的純化水中所形成的溶液；所述的R2試劑是添加有鹽酸、三氯化鐵的純化水中所形成的溶液；所述的標(biāo)準(zhǔn)樣是由同型半胱氨酸、牛血清蛋白、緩沖液和疊氮鈉溶解于純化水中形成的溶液。進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：所述的R1a試劑中，緩沖液為三羥甲基氨基甲烷(Tris)，更優(yōu)選的，所述的三羥甲基氨基甲烷(Tris)的濃度為100mmol/L，二硫蘇糖醇(DTT)的濃度為0.5mmol/L，TritonX-100的濃度為0.2％。所述的R1b試劑中，山梨醇的濃度3％，蔗糖的濃度為2％，海藻糖的濃度為2％，4-氨基-N,N-二甲基苯胺鹽酸鹽濃度為20mmol/L，基因重組蛋氨酸裂解酶濃度為0.75KU/L。所述的R2試劑中，鹽酸濃度為10％，三氯化鐵濃度為15mmol/L。所述的標(biāo)準(zhǔn)樣中，緩沖液為磷酸鹽緩沖液，更優(yōu)選的，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為50mmol/L，牛血清蛋白濃度為0.5％，疊氮鈉濃度為0.1％。同時，本申請還提供了一種具有上述特征同型半胱氨酸測定試劑的制備方法，包括如下步驟：(1)R1a試劑配制：向純化水中加入緩沖液，攪拌至完全溶解；加入二硫蘇糖醇(DTT)攪拌至溶解，加入TritonX-100，攪拌至溶解，繼續(xù)攪拌后定容；(2)R1b試劑配制：向純化水中加入緩沖液，攪拌至完全溶解；加入山梨醇攪拌至溶解，加入蔗糖，攪拌至溶解；加入海藻糖，攪拌至溶解；加入4-氨基-N,N-二甲基苯胺鹽酸鹽，攪拌至溶解；加入基因重組蛋氨酸裂解酶攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；(3)R2試劑配制：向純化水中加入鹽酸，攪拌至完全溶解；加入三氯化鐵，攪拌至溶解，繼續(xù)攪拌后定容；(4)同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣配制：向純化水中加入同型半胱氨酸，攪拌至完全溶解；加入緩沖液攪拌至溶解，加入牛血清蛋白攪拌至溶解；加入疊氮鈉攪拌至完全溶解；繼續(xù)攪拌后定容；(5)對上述制備的R1a試劑、R1b試劑和R2試劑及同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行靈敏度、線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行測定。進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：所述的攪拌速度為450轉(zhuǎn)/分。攪拌速度過高會導(dǎo)致剪切力過大，影響所配制溶體的表面張力和粘合力，攪拌速度過低則影響其混配效果，控制在450轉(zhuǎn)/分時，在確保攪拌剪切適中的同時，也促進(jìn)了其內(nèi)所添加物質(zhì)的融合。步驟(1)中，所述的純化水為400ml，定容體積為500ml。定容前后體積變化在20％左右，可以很好的保證其內(nèi)所添加其他物質(zhì)良好的融合性，確保所配置的R1a試劑濃度、溶液穩(wěn)定性最佳。步驟(2)中，所述的純化水為2ml，定容體積為3ml。定容前后體積變化在20％左右，可以很好的保證其內(nèi)所添加其他物質(zhì)良好的融合性，確保所配置的R1b試劑濃度、溶液穩(wěn)定性最佳。步驟(3)中，所述的純化水為80ml，定容體積為100ml。定容前后體積變化在20％左右，可以很好的保證其內(nèi)所添加其他物質(zhì)良好的融合性，確保所配置的R2試劑濃度、溶液穩(wěn)定性最佳。步驟(4)中，所述的純化水為80ml，定容體積為100ml。定容前后體積變化在20％左右，可以很好的保證其內(nèi)所添加其他物質(zhì)良好的融合性，確保所配置的標(biāo)準(zhǔn)樣濃度、溶液穩(wěn)定性最佳。本發(fā)明的工作原理如下：本試劑盒使用酶轉(zhuǎn)換法定量測定血清中同型半胱氨酸的總濃度。首先以還原劑將氧化態(tài)的同型半胱氨酸還原，再以基因重組酶將同型半胱氨酸分解?；蛑亟M酶分解所形成的產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)后之產(chǎn)物可于660nm波長激發(fā)下發(fā)射出710nm波長熒光，測定其反應(yīng)前后熒光度的差，即可計算出樣本中同型半胱氨酸的含量。(1)靈敏度評價試驗(yàn)根據(jù)GB/T26124-2011《臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)》中對“分析靈敏度”檢測的要求，以試劑盒在規(guī)定參數(shù)下對分析靈敏度評價用樣本進(jìn)行檢測產(chǎn)生的吸光度改變，換算為n單位的吸光度的差值(ΔA)作為分析靈敏度。分析靈敏度評價試驗(yàn)對分析靈敏度評價用樣本重復(fù)測定20次。評估結(jié)果：分析靈敏度43.5μmol/L，熒光值≥700RFU。(2)線性范圍評價試驗(yàn)根據(jù)GB/T26124-2011《臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)》和《體外診斷試劑分析性能評估指導(dǎo)原則——線性范圍(征求意見稿)》中的建議，對試劑線性范圍進(jìn)行驗(yàn)證時，在待驗(yàn)證線性范圍內(nèi)選擇5個濃度水平，每個濃度水平重復(fù)測定3次。(3)精密度評價試驗(yàn)精密度評價包括重復(fù)性和批間差，且至少評估二個濃度水平樣本的精密度，其中有一個濃度在醫(yī)學(xué)決定水平左右。因此，重復(fù)性評價采用在重復(fù)性條件下，用二個濃度水平的控制物質(zhì)(其中一個濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平)測試，每個濃度重復(fù)測試10次；批間差評價采用二個濃度水平的控制物質(zhì)(其中一個濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平)分別測試3個不同批號的試劑盒，每個批號測試3次。(4)準(zhǔn)確度評價試驗(yàn)用不少于40個在檢測濃度范圍內(nèi)的不同濃度的人源樣品，以指定的分析系統(tǒng)作為比對方法，每份樣品按待測試劑操作方法及比對方法分別檢測。用線性回歸方法計算兩組結(jié)果的相關(guān)系數(shù)(r)及每個濃度點(diǎn)的相對偏差。評估結(jié)果：三批試劑的重復(fù)性≤10％；批間差≤15％；相對偏差≤15％，試劑線性可達(dá)80μmol/L，分析靈敏度43.5μmol/L，熒光值≥700RFU。本發(fā)明利用熒光法測定同型半胱氨酸的方法，其優(yōu)點(diǎn)是快速靈敏，準(zhǔn)確性好，特異性高，穩(wěn)定性好，操作簡便，可適用于臨床全自動或半自動生化分析儀配套使用。附圖說明圖1為本申請中抗原-熒光值曲線圖；圖2為本申請中抗體-熒光值曲線圖；圖3為本申請中測定試劑的準(zhǔn)確度柱狀圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本實(shí)施例所用主要試劑：R1a試劑：T三羥甲基氨基甲烷(Tris)：100mmol/L；二硫蘇糖醇(DTT)：0.5mmol/L；TritonX-100：0.2％。R1b試劑：山梨醇：3％；蔗糖：2％；海藻糖：2％；4-氨基-N,N-二甲基苯胺鹽酸鹽：20mmol/L；基因重組蛋氨酸裂解酶：0.75KU/L。R2試劑：鹽酸：10％；三氯化鐵：15mmol/L。標(biāo)準(zhǔn)樣：磷酸鹽緩沖液：50mmol/L；牛血清蛋白：0.5％；疊氮鈉：0.1％。1)R1a試劑的配制①將400ml純化水加入到適當(dāng)容器中。②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③稱取0.5000gTris加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④量取2.5ml二硫蘇糖醇加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑤量取1.0mlTritonX-100加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑥攪拌十分鐘以上。⑦定容至500ml。2)R1b試劑的配制①將2ml純化水加入到適當(dāng)容器中。②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③稱取0.0010gTris加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④量取0.09ml山梨醇加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑤稱取0.009g蔗糖加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑥稱取0.006g海藻糖加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑦量取0.02ml4-氨基-N,N-二甲基苯胺鹽酸鹽加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑧量取0.3ml基因重組蛋氨酸裂解酶加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑨攪拌十分鐘以上。⑩定容至3ml。3)R2試劑的配制①將80ml純化水加入到適當(dāng)容器中。②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③量取10ml鹽酸加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④稱取1.500g三氯化鐵加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。⑤攪拌十分鐘以上。⑥定容至100ml。4)標(biāo)準(zhǔn)品的配制①將80ml純化水加入到適當(dāng)容器中。②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③量取0.5ml同型半胱氨酸加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④量取5.46ml磷酸氫二鉀加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。⑤量取4.53ml磷酸二氫鉀加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑥量取0.1ml牛血清蛋白加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑦稱取0.0200g疊氮鈉加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑧攪拌十分鐘以上。⑨定容至100ml。4)試劑檢驗(yàn)①儀器配置:儀器使用OP-162微量熒光檢測儀。測定參數(shù)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書在儀器中設(shè)定，基本測定參數(shù)如下：a.方法：終點(diǎn)法，反應(yīng)方向：向上；激發(fā)光：660nm，發(fā)射光：710nm；溫度37℃，反應(yīng)時間：10min。b.比色杯光徑：1cm；工作液(在R1b管中加入200μl的R1a混勻):200μl,R2試劑:30μl，同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣：20μl。c.第一反應(yīng)點(diǎn)：在工作液加入后恒溫溫育5min。d.第二反應(yīng)點(diǎn)：在R2加入后恒溫溫育5min。②試劑外觀檢查：目測檢查。③裝量檢查：用通用量具測量。④試劑空白測定:用蒸餾水或去離子水作為空白樣品測試試劑盒，在660nm波長激發(fā)下發(fā)射出710nm波長熒光，測定其反應(yīng)前后熒光度的差，差值即為工作試劑的空白吸光度。⑤線性范圍測定:取接近線性范圍上限的高值樣本用生理鹽水倍比稀釋配制成不同濃度梯度的樣本系列。以H值與稀釋比例計算出預(yù)期值。稀釋方法參照表1所示(根據(jù)高值的大小可相應(yīng)調(diào)整稀釋梯度)。表1樣本稀釋表實(shí)施例12345生理鹽水(ml)00.50.50.50.5高值標(biāo)本H(ml)10.50.50.50.5稀釋比例原倍1/21/41/81/16實(shí)施例1樣本的濃度為已知定值CH，實(shí)施例2-5樣本濃度按公式：樣本濃度＝CH×稀釋比例，計算作為預(yù)期值，將稀釋好的樣本系列充分混勻，在校正后的測定系統(tǒng)上按從低值到高值順序平行測定2次，均值作為對應(yīng)實(shí)施例樣本實(shí)測值(如2次測定結(jié)果有明顯偏差應(yīng)剔除重測)。統(tǒng)計學(xué)分析：以預(yù)期值為橫坐標(biāo)，樣本實(shí)測值為縱坐標(biāo)作圖及直線回歸分析，確定線性區(qū)間計算出直線方程y＝a+bx及相關(guān)系數(shù)，當(dāng)相關(guān)系數(shù)r≥0.990時為線性良好。數(shù)據(jù)分析處理采用MicrosoftExcel軟件。相關(guān)公式如下：b=nΣXiYi-ΣXi·ΣYinΣXi2-(ΣXi)2...(1)]]>|a|=|ΣYi-bΣXi|n...(2)]]>r-nΣXiYi-ΣXiΣYi[n·ΣXi-(ΣXi)][nΣYi-(ΣYi)]...(3)]]>式中，C：濃度；V：容積；b：回歸線的斜率；∣a∣：回歸線截距的絕對值；r：相關(guān)系數(shù)；Xi：各管預(yù)期值；Yi：各管測定值；i：1、2、3.……、n；n：測定樣本數(shù)。⑥精密度測定:a.重復(fù)性測定:用臨床標(biāo)本或質(zhì)控血清測試試劑盒，重復(fù)測試10次，計算測量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。按如下公式計算變異系數(shù)(CV)。與變異系數(shù)CV(％)：X‾=ΣX1/n...(4)]]>CV=Σ(X‾-Xi)(X‾)2(n-1)...(5)]]>式中：——待測血清樣本的均值；Xi——測定血清樣本的測定結(jié)果；n——測定次數(shù)；CV——變異系數(shù)。b.批間差測定取三個批號送檢試劑，每個批號取3瓶，分別測定1份臨床樣本或質(zhì)控血清，可選用羅氏質(zhì)控品，分別計算9份試劑測定均值和每個批號3份試劑的測定均值并用MicrosoftExcel軟件統(tǒng)計三個批號試劑測定的變異系數(shù)。相關(guān)公式如下:式中：——中的最大值；——中的最小值；——總均值。⑦準(zhǔn)確性測定:相關(guān)系數(shù)r≥0.990。相對偏差≤15％；⑧分析靈敏度:用已知濃度或活性的樣品測試試劑盒，記錄在試劑盒規(guī)定參數(shù)下產(chǎn)生的吸光度改變，換算為n單位的吸光度差值(ΔA)。根據(jù)表1計算得到的預(yù)期值、實(shí)測值、變異系數(shù)CV、批間極差、相對偏差B以及吸光度差值ΔA匯總?cè)氡?。表2測試結(jié)果匯總表表3分析靈敏度對照表(1-20為平行實(shí)驗(yàn)序號)1234567891077676876081679276082481678477611121314151617181920776824792808784848776792816752表4批內(nèi)重復(fù)性對照表表5批間精密度對照表評估結(jié)果及表2-5結(jié)果表明：本申請?jiān)噭┑闹貜?fù)性變異系數(shù)CV≤10％；批間差≤15％；相對偏差≤15％，試劑線性可達(dá)80μmol/L，分析靈敏度43.5μmol/L，熒光值≥700RFU。本申請利用熒光法測定同型半胱氨酸的方法，測試過程快速靈敏，準(zhǔn)確性好，特異性高，穩(wěn)定性好，操作簡便，可適用于臨床全自動或半自動生化分析儀配套使用。以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實(shí)施方式對所提供技術(shù)方案所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明創(chuàng)造具體實(shí)施只局限于上述這些說明，對于本發(fā)明創(chuàng)造所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3