本申請?zhí)峁┝耸褂靡合嗌V-質(zhì)譜(LC-MS)法的用于高通量篩查和分析代謝障礙的方法、試劑、內(nèi)部標準溶液和試劑盒。所述代謝障礙可以是氨基酸、有機酸或脂肪酸氧化障礙，特別是尿素循環(huán)障礙或缺陷、高血氨癥、精氨琥珀酸尿癥和/或高鳥氨酸血癥-高氨血癥-高瓜氨酸尿癥(HHH)。所述方法、試劑、內(nèi)部標準溶液和試劑盒特別適用于在新生兒中進行多個外篩查測試并且以高速檢測一組代謝障礙，以確認和/或追蹤相同的疾病。

背景技術(shù)：

目前，根據(jù)所篩查的特定的障礙，使用多種方法來進行生物學(xué)障礙的篩查，特別是這些障礙的新生兒篩查(NBS)。目前，許多團體(party)使用與串聯(lián)質(zhì)譜法偶聯(lián)的電噴射離子化作用(ESI-MS/MS)來進行NBS的氨基酸和?；鈮A分析。與質(zhì)譜法(MS)偶聯(lián)的液相色譜法(LC)也已用于NBS。

待在新生兒中檢測的特定的新生兒代謝缺陷是尿素循環(huán)缺陷。尿素循環(huán)是在哺乳動物中將有毒的代謝物氨和多余的氮處理為尿素的代謝途徑。尿素循環(huán)在防止有毒的含氮化合物的積累中發(fā)揮重要作用，并且還包含精氨酸的從頭生物合成和降解所需的幾種生物化學(xué)反應(yīng)。如圖1所示，尿素循環(huán)由五種酶催化：氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)、精氨琥珀酸合成酶(ASS)、精氨琥珀酸裂解酶(ALS)和精氨酸酶(ARG1)。尿素循環(huán)的前兩種酶位于線粒體基質(zhì)中，其余三種酶在細胞質(zhì)中。CPS1在第一步中促使從銨離子和二氧化碳形成氨甲酰磷酸。接下來的反應(yīng)由OTC催化，其將氨甲酰基從氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移到鳥氨酸以形成瓜氨酸。ASS在第三步中參與從瓜氨酸和天冬氨酸形成精氨琥珀酸，并且ASL在第四步中促使從精氨琥珀酸形成精氨酸和延胡索酸。ARG1在第五步中催化從精氨酸形成鳥氨酸和尿素。此外，N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)催化N-乙酰谷氨酸的形成，N-乙酰谷氨酸激活CPS1。因此，尿素合成代謝途徑的中斷可由所述級聯(lián)中具體步驟中涉及的幾種酶的任一種的缺乏或失活而引起。生成尿素的途徑中的缺陷具有兩個結(jié)果：精氨酸成為必需氨基酸(除了在精氨酸酶缺乏癥中，在這種情況下所述酶的缺乏引起精氨酸降解障礙)，以及氮原子在多種分子中累積，累積方式隨具體的酶的缺乏而，但是在所有未處于代謝控制下的尿素循環(huán)障礙中氨和谷氨酰胺的血漿水平增加。

尿素循環(huán)障礙(UCD)包括：(a)氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶缺乏癥(CPSD或CPS1)，(b)N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥(NAGS)，(c)鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥(OTCD)，(d)精氨琥珀酸合成酶缺乏癥(ASD)，(e)精氨琥珀酸裂解酶缺乏癥或1型瓜氨酸血癥(ALD或ASS1)，以及(f)精氨酸酶缺乏癥(ARG1)。除了作為伴X染色體的一般障礙的OTCD，尿素循環(huán)障礙以常染色體陰性方式遺傳。這些疾病中的每一種均代表尿素循環(huán)中通常表達的酶之一的生物合成的缺陷，其特征在于由尿素前體(主要是氨，其次為谷氨酰胺)的累積誘導(dǎo)的體征和癥狀。

這些臨床障礙的常見病理后遺癥是血漿氨水平的極度升高(高氨血癥)。嚴重尿素循環(huán)障礙的特征為，血漿氨水平約為2000至2500mg/dL。高氨血癥的檢測對于早期診斷和有效治療最為重要。高氨血癥通常與氨累積增加有關(guān)，嘔吐的急性發(fā)作、異常肝酶水平、嗜睡、抽搐和昏迷。即使經(jīng)過治療，長期的嚴重高氨血癥也會導(dǎo)致智力和身體遲緩。但是，存在質(zhì)疑引入通用的UCD新生兒篩查的已有臨床狀況。在所述疾病范圍的輕度階段(at the mild end of the spectrum)，有患者被描述為疾病遲發(fā)，僅有單一或很少的癥狀，甚至沒有癥狀，以及僅有生物化學(xué)表型。這些患者(例如在ASS缺乏癥的情況下)被描述為患有1型輕度瓜氨酸血癥，這是一種與典型的1型瓜氨酸血癥等位的病癥，然而程度輕得多并且需要更少(如果需要的話)的醫(yī)學(xué)干預(yù)。這樣的患者通常在新生兒篩查程序中被識別出，并已經(jīng)討論了所述輕度病況是否是由早期檢測和啟動治療引起，或由相關(guān)的殘余的酶或轉(zhuǎn)運蛋白功能引起。已經(jīng)認為代謝物和/或突變分析可有助于識別癥狀較輕的患者，以試圖避免無疾病的錯誤描述(stigmatisation)、對患者的可能的不必要的治療和患者的不必要的焦慮，但是迄今為止尚未提供確定的解決方案。

在ASS缺乏癥(瓜氨酸血癥)和ARG1缺乏癥(高精氨酸血癥)的情況下，在血液和尿中都有各自底物(瓜氨酸和精氨酸)的顯著累積。在ASL缺乏癥中，由于低腎臟閾值，底物精氨琥珀酸不以任何顯著的量在血液中累積。但是，一些瓜氨酸確實在血液中累積，并且大量精氨琥珀酸被排到尿中。在這方面，最近的UCD指南總結(jié)，目前不推薦近端(proximal)障礙的NBS，但是可考慮將其用于遠端(distal)UCD。實際上，開發(fā)基于對血液或尿中酶或累積的底物的直接測量的UCD篩查測試的嘗試限于循環(huán)中的最終步驟，因為對于前面的步驟，酶(例如，NAGS、CPS1和OTC)被限制在線粒體中，因此沒有底物累積(圖1)。但是，從技術(shù)上講，直接測量干血斑點中的氨幾乎是不可能的。

從2001年起，通過使用精氨酸和瓜氨酸作為標記物，在美國的一些州(加利福尼亞州、馬薩諸塞州、密歇根州、紐約州、紐瓦克州、威斯康星州)中在擴展的新生兒篩查程序中已包含ASSD和ASLD。從2006年起，通過使用瓜氨酸作為標記物，在整個美國已篩查ASSD和ASLD，其作為“推薦統(tǒng)一篩查組”的一部分。來自6077736名新生兒的公開數(shù)據(jù)(覆蓋從2001年至2012年不同的州)得到所述兩種障礙的1/117000新生兒的累積發(fā)病率。

尿素循環(huán)的一種最常見和嚴重的缺陷——OTC缺乏癥——被考慮包含于所述組中，但是由于缺少已在一般的新生兒群體中被驗證的篩查測試，它不符合指定的評估標準。作為伴X染色體的障礙，OTC缺乏癥具有較大的臨床變異性并且可表現(xiàn)為在出生后前幾天中危及生命的嚴重的新生兒發(fā)病形式，或通常更輕度的疾病的遲發(fā)形式。女性攜帶者也可經(jīng)歷與血氨水平增加相關(guān)的癥狀。OTC缺乏癥的實驗室指征為谷氨酰胺和氨濃度升高、低瓜氨酸，以及尿中乳清酸的排泄升高。因此，NBS實驗室已經(jīng)試圖使用低瓜氨酸和若干比值來鑒定處于OTC缺乏癥風(fēng)險的嬰兒，但是迄今為止取得的成功有限。

為了強調(diào)使用低瓜氨酸作為標記物以檢測近端UCD的困難，在2001年至2008年期間，在Tuscany應(yīng)用LC-MS/MS進行了一項研究。作者得出結(jié)論，低瓜氨酸血癥并不是OTCD新生兒篩查的可靠標記物，特別是對于可表現(xiàn)出正常瓜氨酸水平的遲發(fā)形式而言。在其他代謝障礙中也可發(fā)現(xiàn)低瓜氨酸濃度，這進一步質(zhì)疑了它作為篩查標記物的用途。因此，最近的UCD指南得出結(jié)論：目前不能推薦用于近端障礙的NBS，但是可考慮將其用于遠端UCD。

盡管在患有OTC缺乏癥的患者的尿中乳清酸通常升高，仍無法可靠地將它用作血液中的標記物。盡管所有UCD均影響尿素循環(huán)功能并因此導(dǎo)致高氨血癥，但它們的生物化學(xué)特征(profile)是非常不同的。

關(guān)于新生兒尿素循環(huán)缺陷篩查的若干其他限制是，目前無法可靠地檢測CPS1缺乏癥、OTC缺乏癥和NAGS缺乏癥。此外，盡管已通過這些方法檢測高精氨酸血癥或ARG1缺乏癥，仍無法預(yù)期新生兒篩查能夠可靠地檢測所有的情況。即使在可通過新生兒篩查檢測的UCD中，新生兒通常在獲得篩查結(jié)果之前就表現(xiàn)出癥狀；因此，醫(yī)療保健提供者的高水平的臨床懷疑(clinical suspicion)是必要的。使用目前可用的檢測UCD的技術(shù)時，這類篩查的靈敏性和特異性不是絕對的。

在該途徑中全部五種酶缺乏癥的共同因子為血漿氨水平的極度升高(高氨血癥)。因此高氨血癥的檢測對于早期診斷和有效治療是最重要的。因為在NBS中直接測量氨是不可行的，谷氨酰胺是通常在UCD中升高的另一種代謝物。但是，也報告了使用谷氨酰胺作為UCD的標記物的許多困難。實際上，谷氨酰胺在血漿和血清中是高度不穩(wěn)定的，并自發(fā)地轉(zhuǎn)化為谷氨酸鹽和焦谷氨酸鹽，其形成會導(dǎo)致假的低谷氨酰胺水平，使得谷氨酰胺目前不是使用LC-MS進行的NBS的適合篩查參數(shù)。

臨床實驗室中質(zhì)譜(MS)的使用隨時間大大增加。該發(fā)展顯然是由于過去十五年中質(zhì)譜應(yīng)用的巨大進步。質(zhì)譜允許使用濾紙斑點(spot)在不同的生物樣品中或直接在不同的生物液體中非?？焖俚販y量不同的代謝物。由于它的高靈敏性，這項技術(shù)可用于使用適合的內(nèi)部標準品來定性和定量分析許多分析物或代謝物，例如，氨基酸和酰基肉堿、高半胱氨酸、乳清酸、琥珀酰丙酮等。特別地，MS廣泛用于分析來自出生時取的干血斑點(Guthrie卡片)的代謝物，但是因為以上段落中所討論的缺點，在檢測的代謝物中那些由于UCD導(dǎo)致的代謝物未被有效地檢測。

盡管將UCD篩查包含在新生兒篩查中是非常合乎需要的，但是其受到以下事實的阻礙：沒有針對每一種UCD的特異性標記物；迄今為止，UCD的共同特征(例如高氨血癥)不可直接在干血斑點(DBS)中檢測；由于所提出的谷氨酰胺在DBS中的不穩(wěn)定性，檢測谷氨酰胺的繼發(fā)升高(secondary elevation)似乎是不可行的。

因此，本發(fā)明的目的是提供分析方法、試劑和內(nèi)部標準溶液，其允許確定可正確地指示UCD的代謝物(特別是谷氨酰胺)，以及確定通常在代謝物篩查(特別是對出生時取的干血斑點進行的那些篩查)中確定的其他代謝物。本發(fā)明因此涉及新生兒篩查試劑盒、方法、試劑和內(nèi)部標準溶液，其允許使用串聯(lián)質(zhì)譜來快速并可靠地確定和檢測多種UCD以及其他代謝缺陷(串聯(lián)-MS NBS)。

本發(fā)明因此提供了可靠的方法、試劑盒、試劑和內(nèi)部標準溶液，用于在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)中同時檢測來自樣品的賴氨酸和谷氨酰胺，以及用于分離和特異性定量谷氨酰胺的二級(second-tier)UPLC方法。因此，本發(fā)明使得使用新的標記物或新的標記物的組合來檢測UCD可行，這不能通過現(xiàn)有技術(shù)中報告的方法來實現(xiàn)。

這樣的方法、試劑盒、試劑和內(nèi)部標準溶液可有利地與全部特異性氨基酸(精氨酸、精氨琥珀酸、瓜氨酸、鳥氨酸和脯氨酸)、n-乙酰谷氨酸和乳清酸的測量相結(jié)合。該新的組合、方法、試劑盒(kit)、試劑盒(reagent kit)和內(nèi)部標準溶液允許使用串聯(lián)質(zhì)譜來非常快速和可靠地確定和檢測新生兒中的多種UCD(串聯(lián)-MS NBS)。

本發(fā)明特別適用于檢測近端標記物如谷氨酰胺，其作為近端尿素循環(huán)障礙缺陷的診斷標記物。檢測標記物(如谷氨酰胺)允許區(qū)分近端和遠端尿素循環(huán)缺陷，因為這樣的標記物可以是近端酶的產(chǎn)物和遠端酶的底物。一旦確定所述缺陷是在近端或遠端尿素循環(huán)障礙中，則可以快速替換谷氨酰胺和其他氨基酸。然后可進行在近端尿素循環(huán)障礙中的靜脈谷氨酰胺給藥，以使受試者快速恢復(fù)。

本發(fā)明因此提供了可靠和靈敏的方法和試劑盒以通過確定和定量生物樣品中多種指示代謝物的組合，在與現(xiàn)在通常實施的方法相比更高的檢測和/或精確度水平上評估更多種UCD的易感性、存在和嚴重性，所述UCD包括OTC缺乏癥、精氨琥珀酸合成酶缺乏癥(瓜氨酸血癥)、精氨琥珀酸裂解酶缺乏癥(精氨琥珀酸尿癥)、精氨酸酶缺乏癥和高氨血癥-高鳥氨酸血癥-高瓜氨酸尿癥綜合征(HHH)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明因此涉及篩查方法、試劑盒、試劑和內(nèi)部標準溶液，用于檢測和評估從受試者獲得的樣品(例如從新生兒獲得的干血斑點)中谷氨酰胺代謝物谷氨酰胺的水平。所述試劑盒、內(nèi)部標準溶液和方法適用于新生兒篩查(NBS)，特別適用于檢測新生兒中的尿素循環(huán)障礙或缺陷(UCD)、OTC缺乏癥和/或高氨血癥和/或精氨琥珀酸尿。這樣的新生兒篩查方法、試劑盒、試劑和內(nèi)部標準溶液也適用于檢測和/或定量所述樣品中的其他代謝物，包括氨基酸、有機酸、多種肉堿和/或琥珀酰丙酮。

本發(fā)明也涉及用于診斷新生兒中代謝障礙(例如，UCD、高氨血癥、HHH和/或精氨琥珀酸尿癥)的新生兒篩查方法、試劑盒、試劑和內(nèi)部標準溶液，包括檢測和/或測量樣品(例如，從新生兒獲得的干血斑點)中代謝物，特別是谷氨酰胺的水平。

本發(fā)明還提供了新生兒篩查試劑盒，包括其本身包含多個細胞的測試盤；以及單獨貯存的內(nèi)部標準品，至少包括賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，其被放置在所述測試盤的多個細胞中；以及任選的溶劑分配器(dispenser)，例如微量移液器，或任何其他分配溶劑的方式。所述單獨貯存的標準品可以優(yōu)選地為干燥的。

本發(fā)明最后提供了可用于本發(fā)明的新生兒篩選方法試劑盒的新的穩(wěn)定同位素標記的標準品或內(nèi)部標準溶液的組，至少包括賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，還包括對應(yīng)于待在所述新生兒篩查試劑盒中測試的額外代謝物的一種或多種額外的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品。所述新的穩(wěn)定同位素標記的標準品或內(nèi)部標準溶液的組可以以干燥形式存在。

附圖說明

圖1：示出了尿素循環(huán)的示意圖。

圖2：為示出了尿素循環(huán)中主要酶缺乏癥的病理值的表格。

圖3：為提供了內(nèi)源氨基酸的一些對照水平的表格。

圖4：為示出了使用串聯(lián)質(zhì)譜進行的對各分析物的谷氨酰胺、賴氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸以及標準溶液的測量的線性度的圖表。

圖5：為示出了使用串聯(lián)質(zhì)譜進行的對各分析物的谷氨酰胺、賴氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸以及標準溶液的測量的線性度的圖表。

圖6：為示出了使用串聯(lián)質(zhì)譜進行的對各分析物的谷氨酰胺、賴氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸以及標準溶液的測量的線性度的圖表。

圖7：為示出了使用離子交換色譜進行的對干血斑點(DBS)中賴氨酸和谷氨酰胺總和的測量的線性度的圖表。

圖8：示出了對甘氨酸和賴氨酸總和的預(yù)期測量結(jié)果，以及來自健康新生兒的180DBS的測量值，來自被證明患有OTC缺乏癥的患者的2個樣品的測量值，以及患有尿素循環(huán)缺陷(UCD)的患者的預(yù)期范圍。在圖8中，圖注如下：賴氨酸＝來自文獻的參考范圍，谷氨酰胺＝來自文獻的參考范圍，Sum(Gln+Lys)＝結(jié)合的參考范圍，正常＝180個正常的NBS樣品，OTC＝來自被證明患有OTC缺乏癥的患者的2個DBS，UCD＝患有UCD的新生兒的預(yù)期范圍。

圖9：為示出了男性、女性、青少年和兒童的血漿中氨基酸的生理水平(μmol/L)的表格。

圖10：為示出了決策樹流程圖，其從檢測作為早期標記物的谷氨酰胺和賴氨酸的升高的總和開始，到隨后更精確地檢測受試者中UCD的類型的診斷步驟。

圖11：為本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒的照片再現(xiàn)。

具體實施方式

盡管結(jié)合了多個實施方案來描述本發(fā)明，本發(fā)明并不意欲受限于這樣的實施方案。相反，本發(fā)明包含多種替代方案、修改和等價物，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。

本發(fā)明涉及新生兒篩查試劑盒、方法以及新的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，用于通過串聯(lián)質(zhì)譜法檢測從受試者獲得的樣品中代謝物的存在和/或測量代謝物的水平，所述代謝物包括具有類似質(zhì)量結(jié)構(gòu)的代謝物，其中一種代謝物是不穩(wěn)定的，包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定所述具有類似質(zhì)量結(jié)構(gòu)的代謝物的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于一種穩(wěn)定代謝物的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品來檢測和定量所述代謝物的量，以及推導(dǎo)出其他穩(wěn)定代謝物的量。

本發(fā)明的體外方法、新生兒篩查試劑盒以及新的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，允許對具有相同等重特性的靶代謝物進行定量，并且可通過使用總和或比值來確定樣品中一種或多種等重物(isobar)的定量濃度。

在本發(fā)明的第一實施方案中，所述新生兒篩查方法、試劑、試劑盒和內(nèi)部標準品允許定量谷氨酰胺和賴氨酸，更特別為谷氨酰胺。

根據(jù)該實施方案，本發(fā)明也涉及新生兒篩查試劑盒、方法和新的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，用于通過串聯(lián)質(zhì)譜法在從受試者獲得的樣品中檢測代謝物的存在和/或測量代謝物的水平，所述代謝物至少包括谷氨酰胺并且/或者賴氨酸和谷氨酰胺的總和，包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定谷氨酰胺和賴氨酸的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測和定量谷氨酰胺的量并且/或者谷氨酰胺和賴氨酸的量。

所述方法因此提供了在復(fù)雜混合物中對未分辨的色譜峰和/或不穩(wěn)定的代謝物進行高通量代謝物分析。這樣的方法允許從質(zhì)譜儀信號(優(yōu)選從串聯(lián)質(zhì)譜儀信號)去卷積(deconvolute)樣品中多個代謝物的貢獻。可獲得代謝物(例如，等重物或結(jié)構(gòu)異構(gòu)體)的定量濃度。由于谷氨酰胺和賴氨酸的等重性質(zhì)，可從色譜信號評估所述等重物的總和和/或比值，隨后可通過與對應(yīng)于賴氨酸或以上提及的賴氨酸替代物的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品進行比較來推導(dǎo)谷氨酰胺的水平。

因此，根據(jù)本發(fā)明，賴氨酸可用于定量谷氨酰胺的量。但是應(yīng)理解，本發(fā)明的方法、試劑盒和內(nèi)部標準品并不限于賴氨酸。任何與賴氨酸具有類似質(zhì)量結(jié)構(gòu)并且與谷氨酰胺等重的代謝物也可在本發(fā)明的方法和試劑盒中被用作賴氨酸替代物。可通過使用總和或比值來確定樣品中一種或多種等重物的定量濃度，以及定量受試者樣品中谷氨酰胺的量。以賴氨酸替代物為例，我們能夠引用谷氨酸、甲硫氨酸、甲基賴氨酸、二甲基賴氨酸、三甲基賴氨酸、羥基賴氨酸、乙?；嚢彼?、sumoyl-賴氨酸、糖基化-賴氨酸(glocosilated-lysine)，以及賴氨酸合成的前體，例如天冬氨酸等。

本發(fā)明的方法因此涉及新生兒篩查試劑盒、體外診斷方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或新的內(nèi)部標準溶液的組，用于診斷和/或檢測代謝障礙，例如UCD、高氨血癥、精氨琥珀酸尿和/或高鳥氨酸血癥-高氨血癥-高瓜氨酸尿癥(HHH)綜合征，包括通過串聯(lián)質(zhì)譜法在從新生兒獲得的樣品中檢測代謝物的存在和/或測量代謝物水平，所述代謝物至少包括谷氨酰胺，包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定谷氨酰胺和賴氨酸的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品來檢測和定量谷氨酰胺的量，以及任選地

(vii)確定與谷氨酰胺的生理水平相比，步驟(vi)中獲得的谷氨酰胺的水平是否升高。

具有所述缺乏癥的患者的谷氨酰胺的預(yù)期血漿生理水平是本領(lǐng)域中公知的(參見，例如，Physician’s Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases,Editors:NenadBlau,Marinus Duran,Milan E.Blaskovics,K.Michael Gibson,Springer-Verlag Berlin Heidelberg，第二版，2003，其以引用的形式納入本文)。圖2和3中提供了健康受試者的血漿中谷氨酰胺的水平。例如，兒童中谷氨酰胺的生理水平可以為200或900μmol/L，或250至850μmol/L，或330至809μmol/L。

如圖1所示，尿素循環(huán)障礙(UCD)包括多種遺傳缺陷，其導(dǎo)致無效的尿素合成。UCD可包括尿素循環(huán)中的一種或多種酶缺乏癥：(a)氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶缺乏癥(CPSD或CPS1)，(b)N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥(NAGS)，(c)鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥(OTCD)，(d)精氨琥珀酸合成酶缺乏癥(ASD)，(e)精氨琥珀酸裂解酶缺乏癥或1型瓜氨酸血癥(ALD或ASS1)，以及(f)精氨酸酶缺乏癥(ARG1)。除了作為伴X染色體遺傳障礙的OTCD，尿素循環(huán)障礙以常染色體陰性方式遺傳。這些疾病中的每一種均代表尿素循環(huán)通常表達的酶之一的生物合成缺陷，其特征在于由尿素前體(主要是氨和谷氨酰胺)的累積誘導(dǎo)的體征和癥狀。

本發(fā)明因此特別適用于檢測近端標記物如谷氨酰胺，其作為近端尿素循環(huán)障礙缺陷的診斷標記物。本發(fā)明允許檢測額外的標記物如谷氨酰胺，從而區(qū)分近端和遠端尿素循環(huán)缺陷，因為這樣的標記物可以是近端酶的產(chǎn)物和遠端酶的底物。一旦確定所述缺陷是在近端或遠端尿素循環(huán)障礙中，則可以快速替換谷氨酰胺和其他氨基酸。

確定谷氨酰胺的存在和定量谷氨酰胺的量，與尿素循環(huán)障礙和/或高氨血癥和/或精氨琥珀酸尿癥和/或高鳥氨酸血癥-高氨血癥-高瓜氨酸尿癥(HHH)綜合征的存在或不存在有關(guān)。

高氨血癥指與氨水平升高相關(guān)的臨床病癥，其表現(xiàn)為多種癥狀和體征，包括明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)異常。

高鳥氨酸血癥-高氨血癥-高瓜氨酸尿癥(HHH)綜合征的特征在于，谷氨酰胺和氨的血漿濃度高。

包括診斷方法是至關(guān)重要的，所述診斷方法用于在生理癥狀和行為癥狀變得明顯之前，在人類新生兒患者中早期評估對UCD、高氨血癥和/或精氨琥珀酸尿癥的新生兒易感性(predisposition)。

實際上，這些情況中的典型臨床生物化學(xué)異常是血漿谷氨酰胺和氨濃度的顯著升高。但是，隨著血漿氨濃度恢復(fù)正常，血漿谷氨酰胺濃度仍保持適度升高(對照值上限的1.5倍至2倍)。通常，所形成的氨被谷氨酸捕獲以通過谷氨酰胺合成酶形成谷氨酰胺。因此，谷氨酰胺的任何升高均將導(dǎo)致更高的氨捕獲。因此，通過給予(具體而言)可捕獲谷氨酰胺并且(一般而言)可捕獲氨基酸的藥劑，谷氨酰胺作為適用于HHH檢測和計劃進一步的HHH治療的標記物，因此將來自尿素合成的氮轉(zhuǎn)移到替代的排泄途徑。

根據(jù)第二實施方案，新生兒篩查試劑盒、體外診斷方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或新的內(nèi)部標準溶液的組適用于通過串聯(lián)質(zhì)譜法來進一步檢測從新生兒獲得的血液樣品中與谷氨酰胺一起的額外代謝物的存在和/或測量其水平，因此特別適用于檢測所有的UCD，包括近端異常以及典型的遠端缺陷。

所述額外代謝物可包括精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、鳥氨酸、賴氨酸和/或乳清酸。實際上，如圖10的診斷決策樹中所示，一旦已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明檢測到升高的谷氨酰胺水平，可進一步診斷對UCD類型的精確確定，例如特別是新的近端尿素循環(huán)缺陷，包括N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)缺乏癥、氨甲酰磷酸合成酶(CPS)缺乏癥、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)缺乏癥，和/或鳥氨酸移位酶缺乏癥(HHH)。

根據(jù)該實施方案，新生兒篩查試劑盒、體外診斷方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的標準品或新的內(nèi)部標準溶液的組，適用于通過串聯(lián)質(zhì)譜法在從新生兒獲得的血液樣品中進一步檢測與谷氨酰胺一起的額外代謝物(其選自精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、鳥氨酸、賴氨酸和/或乳清酸)的存在和/或測量其水平，因此特別適用于進行多個體外測試以測定所述血液樣品中的其他代謝物，包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定谷氨酰胺和賴氨酸的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測和定量谷氨酰胺的量，以及

(vii)通過分析步驟(iv)中所獲得的MRM質(zhì)譜圖確定所述一種或多種代謝物的存在和/或水平。

本發(fā)明因此提供了可靠且靈敏的新生兒篩查試劑盒和方法以通過確定和定量生物樣品中多種指示代謝物的組合，在與現(xiàn)在通常實施的方法相比更高的檢測和/或精確度水平上評估更多種UCD的易感性、存在和嚴重性，所述UCD包括OTC缺乏癥、精氨琥珀酸合成酶缺乏癥(瓜氨酸血癥)、精氨琥珀酸裂解酶缺乏癥(精氨琥珀酸尿癥)、精氨酸酶缺乏癥和高氨血癥-高鳥氨酸血癥-高瓜氨酸尿綜合征(HHH)。

根據(jù)該實施方案的第一方面，本發(fā)明涉及新生兒篩查試劑盒、新生兒篩查體外方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，用于在新生兒中檢測或診斷對精氨酸酶缺乏癥(ARG1)的懷疑，包括通過串聯(lián)質(zhì)譜法在從新生兒獲得的樣品中檢測代謝物的存在和/或測量代謝物的水平，所述代謝物至少包括谷氨酰胺和精氨酸，并且所述試劑盒和方法包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定谷氨酰胺和賴氨酸的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測和定量谷氨酰胺的量，

(vii)確定與谷氨酰胺的生理水平相比，步驟(vi)中獲得的谷氨酰胺的量是否升高，以及

(viii)如果步驟(vii)中獲得的谷氨酰胺的水平升高，則進一步確定精氨酸的水平以及所述精氨酸水平與精氨酸的生理水平相比是否升高，從而允許診斷對精氨酸酶缺乏癥的懷疑。

根據(jù)該實施方案的第二方面，本發(fā)明涉及新生兒篩查試劑盒、新生兒篩查體外方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，用于在新生兒中檢測或診斷對N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)缺乏癥的懷疑，包括通過串聯(lián)質(zhì)譜法在從新生兒獲得的樣品中檢測代謝物的存在和/或測量代謝物的水平，所述代謝物至少包括谷氨酰胺、精氨酸、瓜氨酸，所述試劑盒和方法包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定谷氨酰胺和賴氨酸的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測和定量升高的谷氨酰胺水平；

(vii)分別使用對應(yīng)于精氨酸和瓜氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測精氨酸和瓜氨酸的水平，以及

(viii)如果步驟(vi)中獲得的谷氨酰胺的水平升高，并且精氨酸水平與精氨酸的生理水平相比降低，則進一步確定與瓜氨酸的生理水平相比瓜氨酸水平是否降低，從而推測N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)缺乏癥。

根據(jù)該實施方案的第三方面，本發(fā)明涉及新生兒篩查試劑盒、新生兒篩查體外方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，用于在新生兒中檢測或診斷精氨琥珀酸合成酶(ASS)缺乏癥、精氨琥珀酸尿癥(ASA)和/或瓜氨酸血癥，包括通過串聯(lián)質(zhì)譜法在從新生兒獲得的樣品中檢測代謝物的存在和/或測量代謝物的水平，所述代謝物至少包括谷氨酰胺、精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸，所述試劑盒和方法包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定谷氨酰胺和賴氨酸的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測和定量升高的谷氨酰胺水平；

(vii)分別使用對應(yīng)于精氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測精氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸的水平，以及

(viii)如果步驟(vi)中獲得的谷氨酰胺的水平升高，并且精氨酸水平與精氨酸的生理水平相比降低，則進一步確定與瓜氨酸的生理水平相比瓜氨酸水平是否增加，從而診斷對瓜氨酸血癥的懷疑，以及進一步確定與精氨琥珀酸的生理水平相比精氨琥珀酸水平是否升高，從而推測精氨琥珀酸尿癥(ASA)。

根據(jù)該實施方案的第四方面，本發(fā)明涉及新生兒篩查試劑盒、新生兒篩查體外方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，用于在新生兒中檢測或診斷鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥(OTCD)和/或氨甲酰磷酸合成酶(CPS)缺乏癥，包括通過串聯(lián)質(zhì)譜法在從新生兒獲得的樣品中檢測代謝物的存在和/或測量代謝物的水平，所述代謝物至少包括谷氨酰胺、精氨酸、瓜氨酸和乳清酸，所述試劑盒和方法包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定谷氨酰胺和賴氨酸的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測和定量升高的谷氨酰胺水平；

(vii)使用包含對應(yīng)于精氨酸、瓜氨酸和乳清酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的內(nèi)部標準溶液，檢測精氨酸、瓜氨酸和乳清酸的水平，以及

(viii)如果步驟(vi)中獲得的谷氨酰胺水平升高，并且與精氨酸和瓜氨酸的生理水平相比精氨酸和瓜氨酸水平降低，則進一步確定與乳清酸的生理水平相比乳清酸水平是否升高，從而診斷對鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥(OTCD)的懷疑，或進一步確定乳清酸水平是否正常，從而診斷對氨甲酰磷酸合成酶(CPS)缺乏癥的懷疑。

根據(jù)該實施方案的第五方面，本發(fā)明涉及新生兒篩查試劑盒、新生兒篩查體外方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，用于在新生兒中篩查或診斷對賴氨酸尿性蛋白耐受不良(LPI)或高鳥氨酸血癥-高氨血癥-高瓜氨酸尿癥(HHH)的懷疑，包括通過串聯(lián)質(zhì)譜法在從新生兒獲得的樣品中檢測代謝物的存在和/或測量代謝物的水平，所述代謝物至少包括谷氨酰胺、賴氨酸和鳥氨酸，所述試劑盒和方法包括以下步驟：

(i)使用提取液從所述樣品中提取所述代謝物；

(ii)在步驟(i)之前或之后，提供包含已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的溶液，所述內(nèi)部標準品對應(yīng)于樣品中待檢測的所述代謝物；

(iii)使所述代謝物和所述一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品離子化以產(chǎn)生離子；

(iv)在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下在質(zhì)譜圖中獲得所述一種或多種離子的質(zhì)荷比(m/z)；

(v)在MRM模式下確定谷氨酰胺和賴氨酸的總和，以及

(vi)使用對應(yīng)于賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，檢測和定量谷氨酰胺和賴氨酸的量；

(vii)確定與谷氨酰胺和賴氨酸的生理水平相比，步驟(vi)中獲得的谷氨酰胺的量是否升高，以及賴氨酸水平是否降低；

(viii)如果與生理水平相比，步驟(vii)中獲得的谷氨酰胺水平升高并且賴氨酸水平降低，則進一步確定與鳥氨酸的生理水平相比鳥氨酸水平是否升高，從而允許診斷對高鳥氨酸血癥-高氨血癥-高瓜氨酸尿癥(HHH)的懷疑，或進一步確定鳥氨酸水平是否正常，從而允許診斷對賴氨酸尿性蛋白耐受不良(LPI)的懷疑。

精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、乳清酸和鳥氨酸的生理水平是本領(lǐng)域中公知的。那些尤其記載于Physician’s Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases,Editors:NenadBlau,Marinus Duran,Milan E.Blaskovics,K.Michael Gibson,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,第二版，2003,ISBN978-3-642-62709-5，其以引用的方式納入本文。圖9提供了健康受試者的血漿中的氨基酸水平。

可使用本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒、方法和內(nèi)部標準溶液來檢測的額外代謝物包括，例如，N-乙酰谷氨酸、脯氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和/或高瓜氨酸，從而允許更精確地診斷UCD。實際上，迄今為止已經(jīng)報告了，低的N-乙酰谷氨酸水平與NAGS酶缺乏癥相關(guān)，或低的脯氨酸水平與吡咯啉-5-羧化酶合酶(P5CS)缺乏癥相關(guān)，又或者血液中的高瓜氨酸檢測與高鳥氨酸血癥-高氨血癥-高瓜氨酸尿癥(HHH)綜合征相關(guān)。

因此，根據(jù)該第二實施方案，新生兒篩查試劑盒和方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，有利地提供了更完備的代謝特征(profile)，允許更可靠和高效地體外診斷或預(yù)測受試者中的UCD、高氨血癥、HHH和/或精氨琥珀酸尿癥，因為現(xiàn)在在新生兒受試者的生物樣品中檢測尿素循環(huán)的早期標記物谷氨酰胺的累積，以及指示UCD、高氨血癥、HHH和/或精氨琥珀酸尿癥的其他代謝物。如圖2的表格中所示，谷氨酰胺是最重要的標記物之一，因為它指示了多種UCD。因此，檢測并測量谷氨酰胺以及其他標記代謝物對篩查和檢測UCD是至關(guān)重要的。

本文所述的代謝特征可適用于監(jiān)測受試者(例如，哺乳動物，如人類)如新生兒的代謝。作為非限制性實例，所述方法可用于確定特定治療的治療效果?；谶@種確定，可提供受試者額外的或替代性的治療選擇。所述代謝特征也適用于評估特定治療方式(例如飲食限制)的患者依從性。因此，本文所述的技術(shù)適用于篩查、診斷、預(yù)后、監(jiān)測療法和依從性，以及其中確定兩種或多種生物分子組的存在和量所適用的任何其他應(yīng)用。

根據(jù)第三實施方案，新生兒篩查試劑盒和體外方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，特別是在新生兒中用于確定通常用作代謝疾病的標記物的其他額外代謝物的存在和/或水平，從而通過單一篩查確保對新生兒中疾病病癥的更廣泛的檢測。

所述其他額外的代謝物可包括但不限于氨基酸、有機酸、肉堿或多種肉堿，以及琥珀酰丙酮(SUAC)。升高的氨基酸、游離肉堿和?；鈮A的水平是可指示若干代謝障礙中的一種或多種的代謝物的實例。游離肉堿和?；鈮A是被歸類為脂肪酸氧化(FAO)障礙和有機酸尿癥(OA)的障礙的標記物。同樣地，氨基酸可用作被共同地稱為氨基酸代謝病的若干代謝障礙的標記物。

因此，根據(jù)該第三實施方案，新生兒篩查試劑盒、體外方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組可用于在新生兒中鑒定、檢測和/或定量通常被用作代謝疾病標記物的臨床上相關(guān)的氨基酸。

由于許多原因，患者體液中氨基酸的種類(identity)和數(shù)量對患者的健康是重要的。異常的氨基酸水平可用于診斷疾病或病癥。在評估受試者的代謝狀態(tài)中，內(nèi)源氨基酸的存在、缺失、種類、數(shù)量或修飾，以及其與其他氨基酸相比的存在和數(shù)量(即游離氨基酸的全部特征)是重要的參數(shù)。圖3提供了內(nèi)源氨基酸的一些對照水平。異常的氨基酸水平或者與其他氨基酸相比某些氨基酸水平的升高/降低可表明代謝障礙。血液中游離氨基酸的定性和定量分析對于診斷和管理多種代謝紊亂(包括主要氨基酸酶病(例如，苯丙酮尿癥、楓糖尿病)和氨基酸轉(zhuǎn)運障礙(例如，胱氨酸尿癥))是重要的。

例如，這些代謝物可選自組成蛋白質(zhì)(proteinogenic)的氨基酸和非組成蛋白質(zhì)的氨基酸。更精確而言，它們可選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、左旋多巴(L-Dopa)、羥脯氨酸、硒代甲硫氨酸、磷酸絲氨酸、α-氨基己二酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、β-丙氨酸、?；撬帷ⅵ?氨基異丁酸、肌肽、甲基組氨酸、α-氨基丁酸、鵝肌肽、乙醇胺、胱硫醚、羥賴氨酸、鳥氨酸、精氨琥珀酸、s-磺酸半胱氨酸(s-sulfocysteine)、高瓜氨酸、霍金素(hawkinsin)。氨基酸代謝物優(yōu)選地選自纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、高瓜氨酸、天冬酰胺和/或5-氧代脯氨酸(焦谷氨酸)。

其他額外的代謝物也可包括肉堿，例如游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、癸酰肉堿、十二酰肉堿、十四酰肉堿、十六酰肉堿和/或硬脂酰肉堿。

進行?；鈮A特征(ACP)分析，以對脂肪酸氧化(FAO)障礙和有機酸代謝障礙進行生物化學(xué)篩查。遺傳的FAO障礙是最近發(fā)現(xiàn)的先天性代謝缺陷(IEM)。它們可在從出生到成年的任何年齡出現(xiàn)，通常導(dǎo)致危及生命的代謝失代償發(fā)作期。典型的表現(xiàn)為低酮低血糖癥(hypoketotic hypoglycemia)、肝病、骨骼和心肌病，以及意外猝死。有機酸血癥是IEM的更異源的組。它們通常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的危及生命的急性疾病、張力過低或張力過高、發(fā)育停滯和發(fā)育遲滯。通常的急性表現(xiàn)包括嘔吐、嗜睡、昏迷和癲癇。

在有機酸尿癥(OA)中，有機酸的代謝途徑被破壞，因此血液和尿中酸的積累改變了身體的酸堿平衡。所獲得的對中間代謝途徑的改變或適應(yīng)可導(dǎo)致多種臨床癥狀，包括代謝性酸中毒、酮病、高氨血癥、發(fā)育停滯、敗血癥或昏迷。特別地，確定樣品的琥珀酰丙酮(SUAC)也是特別有用的。I型酪氨酸血癥(Tyr-I)的新生兒篩查是強制性的，以在危及生命的癥狀出現(xiàn)之前識別出處于風(fēng)險中的嬰兒。單獨的酪氨酸分析是受限的，并可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，需要進行SUAC分析。根據(jù)本發(fā)明，不需要用于SUAC的單獨的衍生化步驟。

因此，優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明的第三實施方案檢測并定量的其他額外的代謝物選自精氨琥珀酸、琥珀酰丙酮、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、癸酰肉堿、十二酰肉堿、十四酰肉堿、十六酰肉堿和/或硬脂酰肉堿。

因此，本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒、體外方法以及新的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組，適用于診斷所有的UCD，以及在新生兒早期生命中通常在實驗室中進行的代謝障礙的新生兒常規(guī)代謝篩查，從而提供擴展但單一的新生兒篩查。代謝障礙通常為新生兒中的先天性代謝缺陷。

特別地，本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒、體外方法以及新的內(nèi)部標準品或內(nèi)部標準溶液的組允許早期評估新生兒對以下的易感性：UCD、高氨血癥、HHH和/或精氨琥珀酸尿癥，以及通常在人類新生兒中測試的額外的代謝缺陷，例如但不限于氨基酸障礙、脂肪酸氧化(FAO)障礙和有機酸尿癥(OA)。

氨基酸障礙可包括，例如但不限于，苯丙酮尿癥(PKU)和其他高苯丙氨酸血癥、楓糖尿病(MSUD)、高半胱氨酸血癥、瓜氨酸血癥(I型和II型)、精氨酸血癥、酪氨酸血癥(I型和II型)、甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)缺乏癥、生物蝶呤缺乏癥、高脯氨酸血癥、高甲硫氨酸血癥，以及脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜回旋形萎縮。通過MS/MS進行的氨基酸障礙篩查通常包括進行氨基酸的定量或半定量測量。

FAO障礙可包括，例如但不限于，中鏈?；?CoA脫氫酶(MCAD)缺乏癥、超長鏈?；?CoA脫氫酶(VLCAD)缺乏癥、短鏈?；?CoA脫氫酶(SCAD)缺乏癥、多?；?CoA脫氫酶(MAD)缺乏癥或II型戊二酸血癥(GA-II)、長鏈3-羥基?；?CoA脫氫酶(LCHAD)缺乏癥、中/短鏈L-3-羥基?；?CoA脫氫酶(M/SCHAD)缺乏癥、三功能性蛋白缺乏癥(TFP)、I型和II型肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥(CPT-I,CPT-II)、肉堿-?；鈮A移位酶(CACT)缺乏癥、肉堿轉(zhuǎn)運蛋白缺乏癥/肉堿吸收缺陷、短鏈3-酮酰基-CoA硫解酶(SKAT)缺乏癥、中鏈3-酮?；?CoA硫解酶(MCKAT)缺乏癥，以及2,4-二烯酰-CoA還原酶缺乏癥。通過MS/MS進行的脂肪酸障礙篩查通常包括對酰基肉堿進行定量或半定量測量。游離肉堿不是?；鈮A，但是如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，在為NBS目的而進行測量的情況下，術(shù)語“?；鈮A”的使用通常包括游離肉堿以及真正的?；鈮A。

此外，有機酸障礙可包括，例如但不限于，3-甲基巴豆酰-CoA羧化酶(3-MCC)缺乏癥、I型戊二酸血癥(GA-I)、甲基丙二酸血癥(MMA)、丙酸血癥(PA)、異戊酸血癥(IVA)、丙二酸尿癥(MA)、多羧化酶缺乏癥(MCD)、2-甲基-3-羥基丁酰-CoA脫氫酶(MHBD)缺乏癥、3-羥基-3-甲戊二酰-CoA裂解酶(HMG)缺乏癥、2-甲丁酰-CoA脫氫酶(2MBCD)缺乏癥、3-甲基戊烯二酸尿癥(MGA)、異丁酰-CoA脫氫酶(IBD)缺乏癥、β-酮硫解酶缺乏癥(BKT)和乙基丙二酸腦病(EE)。

本發(fā)明因此提供了使用串聯(lián)質(zhì)譜法的改善的體外方法，以分析生物樣品，確保更廣泛地檢測受試者(特別是受試者)的疾病病癥。疑似患有代謝障礙的受試者可以是人、兒童、新生兒(neonate)、新生兒(newborn)或兒童，但是優(yōu)選地為新生兒，并且所述被診斷的代謝障礙是先天性代謝缺陷。優(yōu)選地，所述診斷是在生命的第1至5天在新生兒中進行。

生物樣品，例如體液樣品、血液樣品，可以是新生兒的血液樣品，最優(yōu)選干血斑點(DBS)的形式。所述干血樣品可通過任何方式獲得自受試者或患者。例如，可通過刺破患者皮膚(例如足跟穿刺)并將全血滴在濾紙或濾卡(或Guthrie卡片)上，作為一個或多個斑點，從而從新生兒獲得樣品。取樣卡的設(shè)計不同，但是通常取樣卡包含2至10個斑點/卡。然后可將所述斑點穿孔(例如，直徑范圍為約3/16英寸至2/16英寸)并將其放置在容器中。例如，可將不同的斑點放置在微量滴定板的不同的孔中?；蛘?，可以以適合于所需測試和/或應(yīng)用的任何其他形式提供血液樣品，例如以血溶物(hemosylate)、貯存的液體血液或血液產(chǎn)物或凍干樣品等形式。

對優(yōu)選地含有干血的生物樣品進行質(zhì)譜分析以產(chǎn)生許多質(zhì)譜峰，對其中的至少一個峰進行分析。任選地，在進行質(zhì)譜分析之前，迅速對樣品進行預(yù)處理，例如通過色譜、超濾、電泳或透析進行預(yù)處理。色譜的實例包括離子交換色譜、親和色譜、疏水色譜、親水色譜和反相色譜。

上述實施方案的新生兒篩查試劑盒可包括至少一個板或微量滴定板、干血斑點對照、具有已知濃度的儲存的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品、提取液、洗脫液和蓋(cover)。

優(yōu)選地，新生兒篩查試劑盒包括以下元素中的一種或多種：

-提取板，例如U形底的微量滴定板、或用于提取的任何合適的微量滴定板；

-分析板，例如V形底的微量滴定板、或用于分析的任何合適的微量滴定板；

-干血斑點對照(A-B-C級)；

-具有已知濃度的儲存的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，其包含標記的氨基酸、和/或標記的?；鈮A、和/或標記的琥珀酰丙酮、和/或標記的精氨琥珀酸；

-提取液；

-洗脫液；

-粘性的塑料蓋；

-任選的鋁箔蓋。

最優(yōu)選地，新生兒篩查試劑盒包括以下元素：

(a)提取板(U形底的微量滴定板)，

(b)分析板(V形底的微量滴定板)，

(c)干血斑點對照(A-B-C級)，

(d)具有已知濃度的單獨地儲存的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品(標記的氨基酸)；

(e)具有已知濃度的單獨地儲存的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品(標記的?；鈮A)；

(f)具有已知濃度的單獨地儲存的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品(標記的琥珀酰丙酮)；

(g)具有已知濃度的單獨地儲存的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品(標記的精氨琥珀酸)；

(h)提取液；

(i)洗脫液；

(j)粘性的塑料蓋；和

(k)鋁箔蓋。

試劑盒的多種元素示于表11中。

所述內(nèi)部標準溶液包含穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，其單獨地在分隔的小瓶中儲存或在共同的小瓶中儲存。穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品為如上文的本發(fā)明的多個實施方案和方面中所述。它們優(yōu)選地以干燥形式儲存。

提取微量滴定板和分析微量滴定板可由任何合適的材料(例如塑料或金屬或組合)制成，并可含有具有多種尺寸和數(shù)目的孔。并且，測試試劑盒蓋片可以是無菌的。試劑盒中所含的提取液和洗脫液可儲存在例如硅烷化的玻璃小瓶中，或任何合適的容器、小瓶或燒瓶中。

新生兒篩查試劑盒可任選地包括溶劑或提取液以及分配器，例如微量移液器、多通道微量移液器和機器分配器，或任何其他分配提取液和洗脫液的工具。試劑盒的一種或多種組分可儲存在容器中，所述容器可避免或最大程度地減少物質(zhì)損失或溶劑蒸發(fā)。

所述診斷性的新生兒篩查試劑盒和體外方法可包括描述診斷步驟的技術(shù)信息表和/或指導(dǎo)方案，所述診斷步驟可包括：i)立即(具體地，在出生后1分鐘至6小時)獲得所述新生兒患者的血液樣品，ii)通過串聯(lián)質(zhì)譜，測量從新生兒獲得的干血樣品中內(nèi)源性代謝物的水平，以得到新生兒內(nèi)源性代謝物的代謝特征，所述代謝物至少包含谷氨酰胺，以及任選的任何其他目的內(nèi)源性代謝物，所述內(nèi)源性代謝物可用于檢測上文所述的新生兒的氨基酸、?；鈮A和/或有機酸代謝通路中的多種額外代謝缺陷，iii)將所測得的內(nèi)源性代謝物的水平與從對照獲得的生物樣品中的內(nèi)源性代謝物的相應(yīng)水平進行對比，以評估UCD、高血氨癥、HHH和/或精氨琥珀酸尿的易感性和/或存在與否，以及任選地評估通常在新生兒中測試的多種額外代謝缺陷的存在。

然后可將一定體積的提取液加入含有干血樣品的每種容器中。這可手動完成，或優(yōu)選地使用自動的樣品操作設(shè)備進行。一旦將提取液加入每個樣品孔，就對所述樣品進行洗脫，例如在振動臺上使用溫和振動操作進行洗脫。從每個容器中移出上清液并丟棄血液樣品的殘余物。最終將上清液中的溶劑去除，例如使用加熱的氮氣流通過蒸發(fā)去除。

優(yōu)選地，所述技術(shù)信息表和/或指導(dǎo)方案可詳細描述使用篩查試劑盒的步驟，其中所述步驟包括用提取液制備工作液(所述工作液包含所述一種或多種復(fù)原的(reconstituted)經(jīng)標記的內(nèi)部標準品)的步驟和樣品提取的步驟，其中所述步驟可以任意順序進行。

優(yōu)選地，本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒包括以下步驟：

-制備內(nèi)部標準品的步驟(穩(wěn)定同位素標記的氨基酸、標記的酰基肉堿標準品等)的步驟，

-用提取液制備工作液(所述工作液包含復(fù)原的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品)的步驟，和/或

-樣品提取的步驟。

新生兒篩查試劑盒還可包括根據(jù)設(shè)備制造商所述進行設(shè)備設(shè)置的步驟，和/或根據(jù)設(shè)備制造商所述進行結(jié)果計算的步驟。

最優(yōu)選地，新生兒篩查試劑盒包括以下步驟：

步驟1：制備內(nèi)部標準溶液，其包括：將穩(wěn)定同位素標記的標準品(例如穩(wěn)定同位素標記的氨基酸、穩(wěn)定同位素標記的酰基肉堿等)溶于1ml提取液中。

步驟2：制備“工作液”

可在任何合適的容器中制備工作液，例如在10ml的容量瓶中制備。

通過以下方式制備工作液：

a.加入100μl復(fù)原的經(jīng)標記的氨基酸、100μl復(fù)原的經(jīng)標記的酰基肉堿等，

b.用提取液補足至10ml，以及

c.充分混合。

步驟3：樣品提取

獲得新生兒的血液樣品并將其置于干血斑點(Dried Blood Spot，例如Guthrie卡片等)上。對血斑點打孔(punch)，每個血斑點負載新生兒干血樣品的等分試樣。

可按以下方式進行樣品提?。?/p>

i.將干血對照(A-B-C級)的3mm圓片打孔到U形底的微量滴定板(a)中，

ii.對患者樣品的3mm圓片打孔到U形底的微量滴定板(a)中，

iii.加入100μl如步驟2所制備的“工作液”，

iv.確保將圓片適當?shù)亟瘢?/p>

v.用粘性的塑料蓋(j)蓋板，

vi.在室溫(RT)下以650rpm振動20min(+/-4min)

vii.移除塑料蓋(j)，

viii.將每孔的70μl內(nèi)容物轉(zhuǎn)入V形底的微量滴定板(b)中，

ix.用鋁箔蓋(k)蓋板，

x.將帶蓋的微量滴定板置于串聯(lián)質(zhì)譜儀的自動進樣器中并注射所述樣品。

篩查試劑盒還可包含關(guān)于以下的指導(dǎo)：

-根據(jù)設(shè)備制造商所述進行設(shè)備設(shè)置，以及任選地

-根據(jù)設(shè)備制造商所述進行結(jié)果計算。

然后，在提取步驟之前或之后，將單獨標準品的組(其包含與待檢測代謝物相對應(yīng)的已知量的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品)加入樣品中，使得最終通過質(zhì)譜分析的測試樣品包含穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品。因此，在加入穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品之前或之后，可以用提取液和洗脫液處理干血樣品。

因此，本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒可包括用于加入孔(所述孔已經(jīng)含有干燥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品)中的溶劑。因此，可用同樣含有具有已知濃度的穩(wěn)定同位素標記的標準品的溶劑或提取液從經(jīng)打孔而來的血斑點中提取新生兒的血液樣品。如上文所述，這樣的溶劑包括賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，以及任何合適的額外穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品(其也可加入試劑盒中以進行想要的和/或需要的其他額外的多種對新生兒血液樣品的測試)。

可對血斑點提取物(其含有同位素標記的標準品)進行化學(xué)修飾或直接進行分析。對樣品所暴露的所有條件也被應(yīng)用于內(nèi)部標準品。試劑盒和方法可需要或不需要對代謝物進行衍生化。通過對樣品的一種或多種代謝物的共價修飾(即甲基化或酯形成)而進行衍生化步驟，以檢測和測量所述代謝物。通常，衍生化試劑例如鹽酸-正丁醇被用于此目的，或使用其他合適的衍生化試劑。隨后必須再次干燥樣品，以去除過量的衍生化試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法和試劑盒不需要進行任何衍生化。

或者，帶有孔的測試盤可已經(jīng)提供一種或多種干燥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品。在兩種情況中，所述穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品都包括至少一種賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，并還可包括一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品(其適于確定任何其他也可用本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒測試的目標代謝物的量)。通過觀察已知標準品與被分析的未知物的設(shè)備響應(yīng)的比率，推知串聯(lián)質(zhì)譜測量的血斑提取物中物質(zhì)的量。

優(yōu)選的本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒和方法利用用于新生兒篩查的干燥的穩(wěn)定同位素標記的標準品，其被溶解并根據(jù)不同的樣品(sample-by-sample)來加以使用。可通過已知的方法(包括加熱干燥和冷凍干燥(凍干法))將標準品干燥。

根據(jù)第四個實施方案，本發(fā)明包括內(nèi)部標準溶液，其含有新的一組用于檢測UCD、高血氨癥、HHH、和/或精氨琥珀酸尿癥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，其包含至少一種賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，本發(fā)明還可包括與受試者生物樣品中的一種或多種待進一步檢測的代謝物相對應(yīng)的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品。

優(yōu)選地，所述穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品的組允許檢測所有UCD以及上述的額外常規(guī)新生兒篩查，并因此包括賴氨酸的干燥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，以及額外的與新生兒篩查試劑盒中待進一步檢測的一種或多種代謝物相對應(yīng)的干燥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品。

根據(jù)該實施方案的一個方面，所述與一種或多種代謝物相對應(yīng)的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品選自精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、乳清酸和/或鳥氨酸。

根據(jù)該實施方案的第二個方面，所述內(nèi)部標準溶液可因此至少包含賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，任選地包含谷氨酰胺的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，以及與一種或多種選自以下的代謝物相對應(yīng)的一種或多種穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品：精氨琥珀酸、琥珀酰丙酮、乳清酸、鳥氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、癸酰肉堿、十二酰肉堿、十四酰肉堿、十六酰肉堿和/或硬脂酰肉堿。

所述穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品優(yōu)選地以干燥的形式存在。

優(yōu)選地，內(nèi)部標準溶液可包含賴氨酸的干燥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，以及與對應(yīng)于瓜氨酸、精氨琥珀酸、乳清酸和鳥氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品，從而允許檢測所有UCD以及NAGS缺乏癥、CPS缺乏癥、OTC缺乏癥、HHH、瓜氨酸血癥，如上文所述。

所述賴氨酸的干燥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品可與對應(yīng)于亮氨酸和/或纈氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品結(jié)合使用，用于檢測所有UCD并同時檢測MSUD障礙，和/或與對應(yīng)于苯丙氨酸的內(nèi)部標準品結(jié)合使用，用于檢測PKU和高苯丙氨酸血癥。

本發(fā)明第四個實施方案的其他組合是，賴氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品與對應(yīng)于酪氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品用于檢測所有UCD和酪氨酸血癥，和/或加上對應(yīng)于精氨琥珀酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品用于進一步檢測精氨琥珀酰-CoA-裂解酶(ASAL)缺乏癥。

所述內(nèi)部標準溶液還可包含賴氨酸的干燥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品與對應(yīng)于瓜氨酸、精氨琥珀酸、乳清酸、鳥氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和/或丙氨酸的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品。

可向任何上述組合中加入與以下物質(zhì)對應(yīng)的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品以用于進一步檢測脂肪酸氧化病癥：游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、癸酰肉堿、十二酰肉堿、十四酰肉堿、十六酰肉堿和/或硬脂酰肉堿。

基于獨特的物理性質(zhì)(例如獨特的質(zhì)量或質(zhì)荷比)，可從分子中單獨地檢測出穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品。目標代謝物的穩(wěn)定同位素標記形式代表常用的內(nèi)部標準品。例如，如果分析物是MPP，內(nèi)部標準品可以是同位素標記的MPP。穩(wěn)定同位素標記的類似物可用于通過使用稱為同位素稀釋質(zhì)譜法的技術(shù)來定量相應(yīng)的目標代謝物，其中將代謝物和內(nèi)部標準品在相同的樣品中處理。

如本文所使用，同位素標記的、同位素-標記的及其他類似術(shù)語以本領(lǐng)域中理解的方式使用。特別地，同位素標記的化合物是這樣的化合物：其已知位置的至少一個原子所富集的同位素與該元素天然存在的最豐富的同位素不同。例如，甲烷可以是¹³C同位素標記的并具有結(jié)構(gòu)¹³CH₄，或是氘標記的。氘標記的甲烷可以指化合物中與甲烷相關(guān)的四個氫原子位置中的一個或多個富集²H(D)。常見的氘標記的甲烷結(jié)構(gòu)包括CDH₃和CD₄。同位素標記是指超過天然豐度的同位素富集。優(yōu)選地，所述富集位置的同位素純度大于50％、或大于80％、大于90％、大于95％、大于97％、大于98％、或大于99％。

可設(shè)計內(nèi)部標準品以使得(1)所述標記引起至少1個質(zhì)量單位的質(zhì)量轉(zhuǎn)移，以及(2)穩(wěn)定同位素標記均不位于不穩(wěn)定位點以避免交換。在滿足上述先決條件(2)的前提下，可以改變分子上標記的實際位置。此外，標記的位置和碎片離子質(zhì)量可能的改變也可用于確認內(nèi)部標準品和代謝物的分離。

根據(jù)本發(fā)明，對于內(nèi)部標準品，可使用一種或多種同位素標記，當使用多于一種的同位素標記時，可存在多個相同標記(例如氘)或不同標記(例如氘和¹³C)。示例性的同位素標記的內(nèi)部標準品是可明顯地與目標代謝物的同位素峰區(qū)分開的那些衍生物。

可使用任何合適的同位素標記，例如²H、¹³C、¹⁵N、和¹⁸O或其組合。不受任何理論的束縛，預(yù)期所述穩(wěn)定同位素標記的衍生物在樣品制備和信號產(chǎn)生方面的物理化學(xué)行為與未標記的分析物相同，但在質(zhì)譜上可明顯地區(qū)分。

標記有一種或多種穩(wěn)定同位素的氨基酸標準品優(yōu)選地相對于未標記的氨基酸具有三個或更大的質(zhì)量差。通過用穩(wěn)定同位素來標記未標記的氨基酸以帶來3個或更大的質(zhì)量差，可降低未標記物體中天然存在的同位素比率造成的影響，并可進行高精度分析。例如，丙氨酸(分子式；C₃H₇NO₂，分子量88)中天然同位素的分布是分子量88(95.8％)、89(3.74％)、90(0.34％)和91(0.02％)，通過制造3個或更大的質(zhì)量差，可避免天然同位素的影響。

因此，根據(jù)所述第四個實施方案，可用于新生兒篩查試劑盒和方法的內(nèi)部標準溶液可至少包含賴氨酸-¹³C₆-¹⁵N₂，以及一種或多種選自²H₄-丙氨酸、²H₄-¹³C-精氨酸、²H₂-瓜氨酸、¹⁵N-¹³C-甘氨酸、²H₃-亮氨酸、²H₃-甲硫氨酸、²H₆-鳥氨酸、¹³C₆-苯丙氨酸、²H₈-纈氨酸、²H₃-天冬氨酸、²H₃-谷氨酸、¹³C₃-絲氨酸、¹³C₆-酪氨酸、²H₅-脯氨酸、¹³C₅-琥珀酰丙酮和/或¹⁵N₄-¹³C₆-精氨琥珀酸的穩(wěn)定同位素標記的氨基酸標準品，和/或一種或多種選自²H₉-肉堿、²H₃-乙酰肉堿、²H₃-丙酰肉堿、²H₃-丁酰肉堿、²H₉-異戊酰肉堿、²H₃-戊二酰肉堿、²H₃-己酰肉堿、²H₃-辛酰肉堿、²H₃-癸酰肉堿、²H₃-十二酰肉堿、²H₉-十四酰肉堿、²H₃-十六酰肉堿、²H₃-硬脂酰肉堿的經(jīng)標記的肉堿標準品。優(yōu)選的氨基酸濃度范圍是0.2至50μmol/L。本發(fā)明試劑盒試劑中(?；?肉堿的優(yōu)選濃度是0.001至1μmol/L。所述內(nèi)部標準品優(yōu)選地以干燥的形式存在。

優(yōu)選地，可根據(jù)本發(fā)明使用的內(nèi)部標準溶液包含至少一種選自組分A至D的試劑，其中組分A包含纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和谷氨酸，組分B包含絲氨酸、脯氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸，組分C包含肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、癸酰肉堿、十二酰肉堿、十四酰肉堿、十六酰肉堿、硬脂酰肉堿，組分D包含琥珀酰丙酮、乳清酸和精氨琥珀酸，其中每種化合物的一個或多個原子標記有穩(wěn)定同位素。

另一種優(yōu)選的內(nèi)部標準溶液包含甘氨酸、纈氨酸、琥珀酰丙酮、精氨琥珀酸，以及亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和瓜氨酸中的至少一種。

本文所述的方法和試劑盒涉及檢測兩種或更多種氨基酸的比率或總和或加權(quán)總和，所述氨基酸例如是賴氨酸和谷氨酰胺以及一種或多種其他生物代謝物(例如，氨基酸、游離肉堿或?；鈮A、SUAC、有機酸)，每種生物分子的存在或量與代謝疾病的存在與否相關(guān)。本文所述的方法可用于定量，如果需要的話，可允許將測試樣品的結(jié)果與已知的或預(yù)先確定的具體代謝物的標準量作對比(例如，通過使用內(nèi)部標準品，如上文所述)。所述方法和試劑盒也可用于定性，將測試樣品與參考樣品進行對比，參考樣品可以是正常參考或代謝障礙參考。在這方面，生物分子的相對量可指示代謝疾病。例如，參考樣品可來自患有病癥、未疑似患有病癥、或沒有發(fā)生病癥的風(fēng)險的受試者，所述病癥例如是代謝障礙，例如尿素循環(huán)障礙。

一般地，對于通常測試的代謝物和酶，給定生物分子的臨界值(cut-off value)可以改變且是本領(lǐng)域中已知的。本領(lǐng)域中已知方法的常規(guī)的且明顯的改變可用于為不常測試的代謝物建立臨界值。臨界值通常為生物分子的量，或與另一生物分子的比率，大于或小于臨界值可認為指示代謝病癥或再測試的原因。因此，根據(jù)本文所述的發(fā)明，將特定樣品類型中的至少一種生物分子的參考水平視為臨界值，所述至少一種生物分子的存在(或缺失)和代謝病癥的存在(或缺失)之間有顯著關(guān)聯(lián)。應(yīng)當理解，可將生物分子組作為整體看待，作為部分看待，或者根據(jù)不同的分析物(analyte-by-analyte)來加以看待。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到，某些臨界值不是絕對的，因為在臨界值兩邊的值的范圍上仍然是顯著的。然而，可以為特定樣品類型選擇出生物分子的最佳臨界值(例如，不同的H-分數(shù)等)。通常將所確定的用于本文所述方法中的臨界值與已公開的范圍作對比，但可針對所使用的方法學(xué)和患者群體將其個體化。應(yīng)當理解，根據(jù)所使用的統(tǒng)計方法的復(fù)雜性以及根據(jù)用于為不同生物分子和樣品類型確定參考水平值的樣品的數(shù)量和來源，可決定提高最佳臨界值。因此，根據(jù)定期的再評價或方法學(xué)或群體分布的改變，可上下調(diào)整所建立的臨界值。此外，如果需要，例如當設(shè)備之間的性能相似性>10％時，可使用設(shè)備特異性的臨界值。

可通過各種方法決定參考水平，條件是所得到的參考水平精確地提供每種生物分子的量：存在大于該量的第一組受試者(例如人類)，其患有代謝障礙的概率不同于第二組受試者(其具有的代謝物或酶活性的量低于參考水平)?？赏ㄟ^對比生物分子量(例如患有相同代謝障礙的受試者群體(例如患者)中的生物分子量)來決定參考水平。這可通過例如直方圖(histogram)分析完成，其中全部患者組(cohort)均在圖中表示，其中第一軸線表示生物分子的量，第二軸線表示群體中受試者的數(shù)量，其樣品含有一種或多種給定量的生物分子。

因此，用于進行新生兒篩查的試劑盒和體外方法是通過利用串聯(lián)質(zhì)譜信號分析多種代謝物的貢獻來進行，所述方法包括：獲得包含多個峰值強度的樣品的串聯(lián)質(zhì)譜信號，其中所述樣品中多于一個的所述代謝物貢獻至少一個所述峰值強度；為每種所述代謝物提供將所述峰值強度與貢獻強度關(guān)聯(lián)的模型；其中所述模型包括將所述信號表示為參考信號(其包括測量賴氨酸和谷氨酰胺的和)的加權(quán)總和，其中每個參考信號對應(yīng)于一個所述代謝物；使用所述模型計算每種所述代謝物的所述貢獻強度；為至少一個所述代謝物提供校正曲線以將貢獻強度與濃度關(guān)聯(lián)起來；基于所述校正曲線，確定至少一種代謝物的濃度并使用該結(jié)果解釋尿素循環(huán)障礙以及上文所述的其他代謝障礙。

根據(jù)本發(fā)明的方法和試劑盒，離子化步驟(iii)是通過以下方式進行：將從DBS樣品提取的代謝物與干燥的穩(wěn)定同位素內(nèi)部標準品遞送至質(zhì)譜儀的離子源。將所提取的代謝物與用作對照的干燥的穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)部標準品在熱氮氣流的存在下通過小管噴射入強電場，以幫助去除溶劑并形成離子。離子化過程通常涉及轉(zhuǎn)移電荷至溶劑液滴、蒸發(fā)溶劑以及最終產(chǎn)生帶正電荷或帶負電荷的離子。所述離子形成過程是質(zhì)譜分析的出發(fā)點。

有多種離子化方法可供使用，離子化方法的選擇取決于待分析的樣品。例如，對于多肽的分析，可使用相對溫和的離子化過程，例如電噴射離子化(ESI)。對于ESI，使含有樣品的溶液在高電勢下(這產(chǎn)生強電場)穿過細針，獲得高度帶電的液滴的細噴霧，其被導(dǎo)入質(zhì)譜儀。其他離子化過程包括，例如，快原子轟擊(FAB)，其使用中性原子的高能量射束轟擊固體樣品，導(dǎo)致解吸并離子化?；|(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)是這樣的方法：將激光脈沖用于轟擊已經(jīng)在UV吸收的化合物基質(zhì)中結(jié)晶的樣品。本領(lǐng)域中已知的其他離子化過程包括，例如，等離子體輝光放電、等離子體解吸電離、共振電離和次級電離。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將溶劑化的測試樣品/標準品直接引入串聯(lián)質(zhì)譜儀中，串聯(lián)質(zhì)譜儀被改造為適于使用電噴射處理所述測試樣品/標準品。

串聯(lián)質(zhì)譜儀可以是任何合適的市售可得的譜儀。

電噴射離子化(ESI)具有多個對本文所述的發(fā)明有用的特性。例如，ESI可用于難于離子化或汽化的生物分子，例如多肽。而且，ESI的效率可以非常高，這為高靈敏度的測量提供了基礎(chǔ)。此外，ESI從溶液中產(chǎn)生帶電荷的分子，這便于分析溶液中的報告分子(reporter)。與之相反，離子化過程，例如MALDI，需要在離子化之前使樣品結(jié)晶。由于ESI可直接從溶液中產(chǎn)生帶電荷的分子，這適合于液相色譜系統(tǒng)的樣品。例如，質(zhì)譜儀可具有液相色譜系統(tǒng)(例如HPLC)的入口，而使級分從色譜柱流入質(zhì)譜儀。這種液相色譜系統(tǒng)與質(zhì)譜儀的聯(lián)機排列(in-line arrangement)有時稱為LC-MS。例如，LC-MS可用于在質(zhì)譜分析之前從已裂解的標簽報告分子中分離出未裂解的或部分裂解的標簽報告分子。此外，色譜可用于在質(zhì)譜分析之前從標簽報告分子樣品中去除鹽或其他緩沖液成分。例如，在聯(lián)機或脫機(off-line)下，使用反相HPLC柱進行樣品脫鹽，可用于提高離子化過程的效率，并因而提高質(zhì)譜的檢測靈敏度。優(yōu)選地，離子化步驟(iii)可按以下方式進行：將所述提取的代謝物和標準品通過液相色譜系統(tǒng)遞送至質(zhì)譜儀的離子源。

所述汽化和離子化的混合物進入第一MS，其用作分離設(shè)備且僅允許目標離子通過。通過第一MS的離子稱為前體或母離子，其進入碰撞室，在那里發(fā)生破碎。通過向碰撞室通入惰性碰撞氣體(例如氮氣或氬氣)來實現(xiàn)破碎。碰撞室中產(chǎn)生的碎片稱為產(chǎn)物或子離子。在第二MS中測量這些碎片的質(zhì)量。第二MS中的碎片與第一MS中產(chǎn)生的完整分子相關(guān)。這個過程使得能夠進行獨特的MS例如前體離子掃描和中性丟失掃描成為可能。

根據(jù)本發(fā)明，質(zhì)荷比(m/z)的獲得步驟(iv)是以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行，并且涉及串聯(lián)光譜(MS-MS)實驗，在所述實驗中監(jiān)測所選擇的前體離子(即母離子、分子離子或子離子)的一種或多種特定產(chǎn)物。

質(zhì)譜儀的多種結(jié)構(gòu)(configuration)可用于本發(fā)明的方法中。通常，質(zhì)譜儀具有以下主要組件：樣品入口、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器、真空系統(tǒng)、設(shè)備控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)系統(tǒng)。樣品入口、離子源和質(zhì)量分析器中的差異通常定義了設(shè)備的類型及其性能。例如，入口可以是毛細管柱液相色譜源或可以是直接的探針或平臺(例如用于基質(zhì)輔助激光解吸中)。常見離子源是例如電噴射，包括納噴射和微噴射或基質(zhì)輔助激光解吸。常見質(zhì)量分析器包括四極質(zhì)量過濾器、離子阱質(zhì)量分析器和飛行時間質(zhì)量分析器。優(yōu)選地，所述數(shù)據(jù)獲得步驟(iv)可以用三重四極質(zhì)譜儀或高分辨質(zhì)譜儀進行。

使用質(zhì)譜儀掃描測試樣品以產(chǎn)生一個或多個質(zhì)譜。任何可檢測所提取的代謝物和標準品中信號的質(zhì)譜儀均可用于本發(fā)明方法。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地使用串聯(lián)質(zhì)譜儀，因為它能鑒定不同的分子實體，所述分子實體在經(jīng)受碰撞誘導(dǎo)解離(CID)時產(chǎn)生常見碎片。在串聯(lián)質(zhì)譜中，兩臺質(zhì)量分析器由碰撞室串聯(lián)連接。第一質(zhì)量分析器(第一四極)用于選擇目標離子(例如，具有特定質(zhì)荷比(m/z)的離子)。然后，所選擇的離子被轉(zhuǎn)入碰撞室，在那里通過惰性氣體(例如氮氣或氦氣或氬氣)碰撞將它們破碎。這個過程稱為碰撞活化解離(CAD)，在質(zhì)譜儀的碰撞室中進行。一旦前體離子已被破碎，第二質(zhì)量分析器(第三四極)就被用于掃描或檢測所有產(chǎn)生的產(chǎn)物離子、或選擇和檢測特定碎片離子。

串聯(lián)質(zhì)譜被用于離子化賴氨酸和/或谷氨酰胺以及本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒和方法中待檢測的任何額外代謝物。所述串聯(lián)質(zhì)譜允許離子破碎并檢測特定峰，所述特定峰指示樣品中這些分子的存在。

可以許多方式完成串聯(lián)質(zhì)譜檢測。在一種類型(通常在三重四極串聯(lián)質(zhì)譜上進行)的串聯(lián)質(zhì)譜中，破碎以產(chǎn)生常見產(chǎn)物(碎片)離子的離子可作為一類通過進行“前體離子掃描”來檢測，通過在碰撞室中為常見破碎選擇合適的質(zhì)量來進行，檢測所有產(chǎn)生常見碎片離子的離子。在一種不同形式的串聯(lián)質(zhì)譜中，破碎以產(chǎn)生常見中性丟失的離子可作為一類通過進行所謂的中性丟失掃描來檢測，其中通過在第一和第三四極之間設(shè)置等于常見中性丟失的合適的質(zhì)量補償來進行，檢測所有破碎以產(chǎn)生特定中性丟失的離子。在稱為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的另一種類型的串聯(lián)質(zhì)譜中，在第一四極中選擇目標前體離子、在碰撞室中破碎并在第三四極中選擇從碰撞活化中得到的特定碎片離子并最終檢測。

將第一和第三四極固定以在預(yù)先確定的時間(幾毫秒)內(nèi)分別選擇相應(yīng)的前體和目標碎片離子對。如果需要檢測額外的分析物或代謝物，可在實驗中引入額外的檢測轉(zhuǎn)換?？蛇B續(xù)獲得所有選擇的質(zhì)量轉(zhuǎn)換中的數(shù)據(jù)，以獲得想要的信息。

可對四極質(zhì)量分析器以及本文所述的其他質(zhì)量分析器進行編程以分析所定義的m/z或質(zhì)量范圍。由于在測定前會知道裂解的標簽報告分子的質(zhì)量范圍，可對質(zhì)譜儀進行編程以傳送具有設(shè)計的正確質(zhì)量范圍的離子，而排除具有更高或更低質(zhì)量范圍的離子。選擇質(zhì)量范圍的能力能夠降低測定中的背景噪聲，并因此提高信噪比。此外，所定義的質(zhì)量范圍可用于排除對分子的分析。因此，質(zhì)譜儀能夠完成內(nèi)在的分離步驟并完成代謝物的檢測和鑒定。

離子阱質(zhì)譜利用離子阱質(zhì)量分析器。在這些質(zhì)量分析器中，應(yīng)用場以使所有m/z的離子都在最初被捕獲并在質(zhì)量分析器中振蕩。離子通過聚焦裝置(例如八極透鏡系統(tǒng))從離子源進入離子阱。在激發(fā)和從電極噴射至檢測器之前，在捕獲區(qū)域中進行離子捕獲。通過連續(xù)施加電壓完成質(zhì)量分析，所述電壓會增加振蕩的振幅，使m/z增加的離子從阱中噴射出并進入檢測器。與四極質(zhì)譜相比，除具有所選擇的m/z的離子外，所有離子都保留在質(zhì)量分析器的場中。離子阱的一個優(yōu)勢在于，只要小心地限制在一次被捕獲的離子數(shù)目，其就具有非常高的靈敏度。對離子數(shù)目的控制可通過改變離子注入阱中所用的時間來實現(xiàn)。離子阱的質(zhì)量分辨率與四極質(zhì)量過濾器的分辨率接近，但是離子阱的確具有低的m/z限制。

飛行時間質(zhì)譜利用飛行時間質(zhì)量分析器。對于這種m/z分析的方法，通過在電場中加速(通過高電壓產(chǎn)生)首先給予離子固定量的動能。加速后，離子進入無場或“漂流”區(qū)域，在那里離子在與其m/z成反比的速度下穿行。因此，具有低m/z的離子比具有高m/z的離子穿行得更快。測量離子穿行無場區(qū)域的長度所需的時間，并將其用于計算離子的m/z。

這種類型的質(zhì)量分析的一個考慮因素是將所研究的離子組在同一時間引入分析器。例如，這種類型的質(zhì)量分析非常適于離子化技術(shù)例如MALDI，其以短的明確的脈沖來產(chǎn)生離子。另一個考慮因素是控制動能量變化的離子所產(chǎn)生的速度零散(velocity spread)。使用更長的飛行管、離子反射體、或更高的加速電壓可幫助將速度零散的影響減至最小。飛行時間質(zhì)量分析器比四極或離子阱質(zhì)量分析器具有更高水平的靈敏度和更寬的m/z范圍。同樣地，用這類質(zhì)量分析器可快速獲得數(shù)據(jù)，因為不必進行質(zhì)量分析器的掃描。

串聯(lián)質(zhì)譜可利用上述質(zhì)量分析器的組合。串聯(lián)質(zhì)譜儀可使用第一質(zhì)量分析器以根據(jù)離子的m/z分離離子，以分離出目標離子用于進一步分析。然后使分離出的目標離子破碎成碎片離子(稱為碰撞活化解離或碰撞誘導(dǎo)解離)并通過第二質(zhì)量分析器分析碎片離子。這些類型的串聯(lián)質(zhì)譜儀系統(tǒng)稱為空間系統(tǒng)上串聯(lián)，因為兩臺質(zhì)量分析器在空間上是分開的，通常通過碰撞室隔開。串聯(lián)質(zhì)譜儀系統(tǒng)還包括時間系統(tǒng)上串聯(lián)，其使用一臺質(zhì)量分析器，但質(zhì)量分析器被連續(xù)用于分離離子、誘導(dǎo)破碎、然后進行質(zhì)量分析。

在空間范疇上串聯(lián)的質(zhì)譜儀具有一臺質(zhì)量分析器。例如，串聯(lián)四極質(zhì)譜儀系統(tǒng)可具有第一四極質(zhì)量過濾器、然后是碰撞室、然后是第二四極質(zhì)量過濾器、然后是檢測器。另一種排列是使用四極質(zhì)量過濾器用于第一質(zhì)量分析器、飛行時間質(zhì)量分析器用于第二質(zhì)量分析器，用碰撞室將兩臺質(zhì)量分析器間隔開。其他串聯(lián)系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的，包括反射式飛行時間、串聯(lián)扇形和扇形-四極質(zhì)譜。

在時間范疇串聯(lián)的質(zhì)譜儀具有一臺質(zhì)量分析器，其在不同時間發(fā)揮不同功能。例如，離子阱質(zhì)譜儀可用于捕獲所有m/z的離子。應(yīng)用一系列的rf掃描功能，將除目標m/z離子外的所有m/z的離子從阱中噴射出。在已經(jīng)分離出目標m/z后，應(yīng)用rf脈沖以在阱中用氣體分子產(chǎn)生碰撞，以誘導(dǎo)離子的破碎。然后通過質(zhì)量分析器測量破碎離子的m/z值。離子回旋加速共振設(shè)備(也稱為傅里葉變換質(zhì)譜儀)是時間系統(tǒng)上串聯(lián)的實例。

多種類型的串聯(lián)質(zhì)譜實驗可通過控制在實驗的每個階段中選擇出的離子來進行。不同類型的實驗利用質(zhì)譜分析器的不同操作模式，有時稱為“掃描”。在第一實例中，稱為質(zhì)譜掃描，第一質(zhì)量分析器和碰撞室將所有用于質(zhì)量分析的離子傳送至第二質(zhì)量分析器。在第二實例中，稱為產(chǎn)物離子掃描，在第一質(zhì)量分析器中對目標離子進行質(zhì)量選擇，然后在碰撞室中破碎。然后，通過掃描第二質(zhì)量分析器對所形成的離子進行質(zhì)量分析。在第三實例中，稱為前體離子掃描，掃描第一質(zhì)量分析器以將經(jīng)過質(zhì)量分析的離子連續(xù)傳送至碰撞室用于破碎。第二質(zhì)量分析器對目標產(chǎn)物離子進行質(zhì)量選擇以用于傳送至檢測器。因此，檢測信號是能被破碎為常見產(chǎn)物離子的所有前體離子的結(jié)果。其他實驗?zāi)Ｊ桨ㄖ行詠G失掃描，其中在質(zhì)量掃描中獲得恒定的質(zhì)量差異。當在單次實驗中測量大的代謝物組時(如進行多通道實驗時)，使用這些不同的串聯(lián)質(zhì)譜掃描過程是有利的。

這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，他們?nèi)菀渍J識到，不同質(zhì)譜法(例如四極質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、飛行時間質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜)可使用離子源和質(zhì)量分析器的各種組合，其允許在設(shè)計自定義的檢測方案中具有靈活性。而且，可對質(zhì)譜儀進行編程以連續(xù)或同時從離子源將所有離子傳送至質(zhì)譜儀。此外，可對質(zhì)譜儀進行編程以選擇具有特定質(zhì)量的離子用于傳送至質(zhì)譜儀同時阻斷其他離子。在質(zhì)譜儀中精確控制離子運動的能力允許檢測方案具有更多的選選擇，這在分析大量代謝物(例如來自多通道實驗)時是有利的。

不同質(zhì)譜儀具有不同水平的分辨率，即，分辨離子之間的峰的能力與質(zhì)量密切相關(guān)。分辨率定義為R＝m/Δm，其中，m是離子質(zhì)量，Δm是質(zhì)譜中兩個峰之間的質(zhì)量差。例如，分辨率為1000的質(zhì)譜儀可將m/z為100.0的離子從m/z為100.1的離子中分辨出。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員會選擇分辨率適于待檢測的代謝物的質(zhì)譜儀。

質(zhì)譜儀可分辨具有較小質(zhì)量差的離子并能以高度的精確度測量離子的質(zhì)量。因此，由于質(zhì)譜儀可區(qū)分甚至密切相關(guān)的分子的質(zhì)量，可在同一實驗中一起使用質(zhì)量接近的代謝物。使用質(zhì)譜法實現(xiàn)的高度的分辨力和質(zhì)量精確度允許使用大的代謝物組，因為它們可被彼此區(qū)分開。

然后通過將對應(yīng)于代謝物的一個或多個質(zhì)譜中的峰與對應(yīng)于同位素富集的標準品的一個或多個質(zhì)譜中的峰進行比較，以確定測試樣品中代謝物的水平。在一個實施方案中，使用相對峰高。在另一個實施方案中，將峰下的面積積分并比較。

一旦已確定測試樣品或干血樣品中的代謝物水平，就可將其與正常水平的范圍作對比。如果所述水平在此正常范圍之外，則將干血樣品或從其獲得干血樣品的患者送交進一步分析。例如，可用一個或多個額外的血斑點重復(fù)四十測試以獲得平均水平。額外地或替代地，可使用本領(lǐng)域中已知的替代方法(例如使用血清樣品的免疫化學(xué)法或質(zhì)譜法)測量代謝物水平。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述系統(tǒng)包括三重四極(串聯(lián))質(zhì)量分析器的MRM操作模式。在MRM操作模式中，設(shè)置第一質(zhì)量分析四極以從穿過第一質(zhì)量分析四極的離子中選擇出特定“前體”離子，第二非質(zhì)量分析四極用于引起前體離子的受控制的解離，設(shè)置第三四極(第二質(zhì)量分析四極)以僅選擇前體離子的特定碎片離子或“產(chǎn)物”離子。前體和產(chǎn)物的組合稱為MRM離子對。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，MRM數(shù)據(jù)可以多種不同方式獲得，不同之處在于如何使激光與目標板上的樣品相互作用，例如，取決于所使用的消融模式?！肮鈻拧毕谀Ｊ缴婕凹す馐谝粋€或多個樣品上切割直線痕。為完成這種“光柵化”，在目標樣品斑點之前在非樣品位置發(fā)射激光束，然后可連續(xù)移動目標板以將新樣品置于激光沖擊點。這意味著激光解吸點將遇到一系列交替的目標板的樣品/非樣品部分。所得到的MRM數(shù)據(jù)包含一系列離子信號“峰”，其根據(jù)質(zhì)譜儀分析時間由每秒鐘離子計數(shù)指示，遇到樣品時具有非零信號，樣品斑點之間散布著零信號基線區(qū)域。根據(jù)激光功率、激光束下目標板的移動速度、被監(jiān)測的代謝物數(shù)目以及樣品組成，對于此消融模式，通常可在約0.25至5秒中獲得單一樣品(檢測一種或若干MRM離子對)的數(shù)據(jù)。

在“離散”操作模式中，在激光處于非發(fā)射狀態(tài)下時，可將目標板置于激光沖擊點下，然后打開激光維持一些特定的時間段。在激光沒有發(fā)射時，質(zhì)譜儀記錄零信號(因為沒有離子產(chǎn)生)。當激光開始發(fā)射，激光束將材料從該特定位置解吸附，產(chǎn)生MRM信號“峰”。MRM信號強度從零迅速升至最大，然后由于樣品在目標板特定位置上被消耗而降低。通過關(guān)閉激光、或通過允許激光發(fā)射直至特定位置的樣品被完全消耗且不再有產(chǎn)生離子的樣品，使MRM信號水平回到零基線水平。激光發(fā)射停止后，隨后移動樣品板以為下次消融呈現(xiàn)新的樣品位置。根據(jù)激光功率、樣品組成和激光發(fā)射的時間長度，對于此消融模式，通?？稍谝幻雰?nèi)獲得孔內(nèi)單一樣品的數(shù)據(jù)。

其他消融模式涉及根據(jù)一些圖案移動樣品斑點，使得持續(xù)發(fā)射的激光在樣品斑點上產(chǎn)生圖案。這種“圖案光柵”模式在幾秒鐘至幾分鐘(取決于樣品斑點內(nèi)圖案的形式和速度)內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的離子流。所述模式中可包括一個或多個樣品斑點，當從一個樣品斑點移動至另一個時具有合適的適應(yīng)性?？蓸?gòu)建質(zhì)譜儀方法以進行大量不同測量，甚至包括質(zhì)譜儀掃描類型的混合。對于與用此技術(shù)(例如，前體或中性丟失掃描)的MRM分析通常需要的消融時間相比，需要更長消融時間的測量，圖案光柵是有用的。

在本發(fā)明的優(yōu)選的試劑盒和方法中，提取步驟(ii)是通過使用包含一種或多種有機溶劑的提取緩沖液來進行，離子化步驟(iii)是通過將所述提取的代謝物和內(nèi)部標準溶液經(jīng)液相色譜系統(tǒng)遞送至質(zhì)譜儀的離子源來進行，數(shù)據(jù)獲得步驟(iv)是用三重四極質(zhì)譜儀或高分辨質(zhì)譜儀進行，步驟(v)是通過選擇至少一種精確的質(zhì)荷比(m/z)離子(其對應(yīng)于所述樣品中存在的所述代謝物的至少一種計算的質(zhì)荷比(m/z))來進行。并且，實施對干血斑點中代謝物的直接串聯(lián)質(zhì)譜分析以用于新生兒篩查，而不需要化學(xué)衍生化。最優(yōu)選地，對串聯(lián)質(zhì)譜測量應(yīng)用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù)，使得每種代謝物具有其各自的前體和產(chǎn)物離子設(shè)置。

在本發(fā)明的最優(yōu)選的試劑盒和方法中，包括在進行質(zhì)譜(MS)分析之前通過液相色譜(LC)分離一種或多種代謝物的步驟，如上所述。因此，最優(yōu)選的試劑盒和方法是液相色譜-質(zhì)譜方法和試劑盒。

高壓液相色譜(HPLC)是基于柱的色譜形式，其通常被用于分析化學(xué)以分離、鑒定或檢測及定量分子。HPLC利用裝有色譜填充物質(zhì)(固定相)的柱、使流動相流過柱的泵，和檢測分子的豐度并顯示其相對于消逝時間在色譜柱上的保留(保留時間)的檢測器。保留時間隨固定相、被分析的分子及使用的溶劑的相互作用而變化。將含有代謝物的樣品手動地或通過自動的自動進樣器注入流動相。代謝物的極性、所使用的柱的固定相及流動相決定了代謝物的保留時間及其從干擾中的分離和可定量的程度。使用HPLC進行的氨基酸分離可用任何市售可得的LC設(shè)備進行，其使用自動或手動的進樣注射以及可調(diào)節(jié)的、持續(xù)的且可重復(fù)的溶劑流速。

適于液相色譜的柱含有這樣的填充物質(zhì)：其包含非常小的通常為球形的顆粒(例如二氧化硅顆粒)，具有3-50微米的直徑和100-1000埃的孔徑。通常，HPLC用附著于所述小顆粒外表面的固定相進行；所述固定相可提供表面疏水性或使得能夠?qū)崿F(xiàn)離子改變或離子配對。色譜柱通常包括兩個口，一個入口用于接收樣品，一個出口用于排出可能包括或不包括樣品的流出物。

在本發(fā)明的一些實施方案中，樣品中的一種或多種氨基酸從入口進入柱，然后由溶劑或溶劑混合物洗脫，并最終在出口排出。在優(yōu)選的實施方案中，樣品中的一種或多種氨基酸從入口進入柱，其中在穿過所述柱的流被反轉(zhuǎn)后，然后由溶劑或溶劑混合物洗脫，并最終在入口向回排出(反向流動)。使用色譜柱反向流動時，特別是使用兩個連續(xù)色譜柱反向流動的第一色譜柱時，證明了有益于延遲親水氨基酸的洗脫并提高它們在質(zhì)量檢測器中的離子化，使得分析的靈敏度提高。

可選擇不同的溶劑或溶劑混合物用于洗脫氨基酸。例如，液相色譜可用在混合物中具有不同的溶劑量的梯度模式、在混合物中具有連續(xù)固定的溶劑量的恒定(isocratic)模式，或部分恒定部分梯度的混合模式進行。合適的溶劑和溶劑混合物包括鈉或鋰緩沖液(例如陽離子交換HPLC)或乙腈(用于反相HPLC)。

HPLC柱的內(nèi)徑是影響檢測靈敏度和分離選擇性的重要參數(shù)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，柱尺寸包括柱內(nèi)徑為2.1-3.0mm及柱長度為3-10cm。

液相色譜基于的原理是：將代謝物吸附于固定相并最終用流動相解吸附并洗脫至檢測單元，用于合適的檢測和/或定量。固定相和流動相的選擇都極大地影響色譜分離的成功。

反相HPLC(RP-HPLC或RPC)具有非極性的固定相以及水性的中度極性的流動相。一種常見的固定相是經(jīng)處理的二氧化硅。在這些固定相中，更加非極性的分子的保留時間更長，而極性分子洗脫的更快。流動相通常是水和易混合的極性有機溶劑(如甲醇、乙腈、四氫呋喃(THF))的二元混合物。反相色譜是基于分配(partition)并通常用于通過非極性差異來分離。

與反相HPLC相反，正相HPLC(NP-HPLC)使用極性固定相和非水性的非極性的流動相，并有效地用于分離易溶于非極性溶劑的代謝物。代謝物與極性固定相相聯(lián)并由其保留，直至最后洗脫。通常用于正相色譜的固定相是二氧化硅或具有氰基和/或氨基官能團的有機部分。在NP-HPLC中，最非極性的分子先洗脫，最極性的分子最后洗脫。流動相由非常非極性的溶劑組成，例如己烷或混有略微更極性的溶劑(如異丙醇、乙酸乙酯或氯仿)的己烷。隨著流動相中非極性溶劑的量的增加，保留會增加。NP-HPLC是基于吸附并通常被用于分析易溶于有機溶劑中的溶質(zhì)，基于其極性差異例如胺類、酸類、金屬絡(luò)合物等。

離子交換色譜的使用也可在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因為氨基酸(根據(jù)定義)含有至少一個氨基基團和一個羧酸基團，當流動相的pH與氨基酸的pKa不同時，它們可離子化并因而攜帶正電荷或負電荷。在7.0的中性pH以下，主要具有堿性基團(例如氨基基團)的氨基酸帶正電荷，而在7.0的中性pH以上，主要具有酸性基團(例如羧酸基團)的氨基酸帶負電荷。代表蛋白質(zhì)構(gòu)建塊的20種蛋白氨基酸的側(cè)鏈基團不同，這影響氨基酸的化學(xué)反應(yīng)性、離子電荷、相對親水性或疏水性以及極性。離子交換色譜是這樣的方法：其基于代謝物的電荷性質(zhì)允許對離子和極性分子的分離。帶電荷的氨基酸可以是酸性或堿性的。固定相表面陳列與具有相反電荷的分析物離子相互作用的離子官能團(R--X)。這類型的色譜進一步細分為陽離子交換色譜和陰離子交換色譜。目標代謝物(陰離子或陽離子)保留在固定相上，但可通過增加帶有相似電荷的物質(zhì)的濃度(將從固定相上置換分析物離子)來洗脫。例如，在陽離子交換色譜中，帶正電荷的分析物可通過添加帶正電荷的鈉離子而被置換。

也考慮了將離子配對色譜用于本發(fā)明的范圍內(nèi)。與離子交換色譜類似，離子配對色譜利用代謝物的可離子化性和電荷性質(zhì)用于色譜分離。然而，不同于交換離子，離子配對系統(tǒng)是使用全氟化的羧酸(例如十三氟庚酸(TDFHA)或三氟乙酸(TFA))作為流動相成分以及可接受電子或貢獻電子或兩者皆可的固定相來構(gòu)建。特別地，離子配對色譜可用于在反相柱上分離離子代謝物以抑制帶電荷的有機化合物的離子特性。離子配對試劑帶有與代謝物相反的電荷并疏水區(qū)以與固定相相互作用。被吸收的離子配對試劑的電荷與代謝物的電荷具有靜電相互作用。作為實例，胺類在反相柱上會產(chǎn)生嚴重的拖尾色譜峰，而添加離子配對試劑(例如三氟乙酸)減少拖尾。隨著柱相的改進和選擇更好的離子配對試劑，離子配對色譜不僅使色譜峰更尖銳，而且還調(diào)節(jié)反相柱上離子代謝物的保留。通常離子配對試劑包括四烷基銨離子和全氟化的有機酸。離子配對試劑的類型、離子配對試劑的濃度、流動相中有機改性劑的類型、有機改性劑的濃度(梯度)以及合適的柱選擇都對成功的離子配對色譜實驗至關(guān)重要。在優(yōu)選的實施方案中，使用離子配對色譜。

根據(jù)第五個實施方案，本發(fā)明的新生兒篩查試劑盒和方法還可擴展至包括對與嚴重疾病相關(guān)的變體蛋白質(zhì)和多肽的檢測。例如，已知血紅蛋白的多肽亞基的許多變體或突變體形式會導(dǎo)致多種形式的貧血，而且許多這樣的突變只涉及一個氨基酸。

優(yōu)選的試劑盒和方法會以經(jīng)特定選擇的電離物質(zhì)為目標。試劑盒和方法不僅可有利地用于檢測包含與標準不同的氨基酸的變體(如在下文所述的許多可能的已知的血紅蛋白病中)，還可有利地用于檢測多肽的糖基化形式中的變異、以及所預(yù)期的多肽序列中的一個或多個氨基酸殘基的缺失和/或增加。

根據(jù)所述第五個實施方案，試劑盒和方法特別可用于通過質(zhì)譜測試樣品，其中電離技術(shù)產(chǎn)生多重荷電光譜，以進一步檢測(a)已知多肽或多肽衍生物的存在與否，或(b)已知多肽或多肽衍生物的變體的存在與否，其中對樣品的掃描靶向于具有已知質(zhì)荷比的所選擇的電離物質(zhì)，質(zhì)荷比的預(yù)期值的缺失指示已知多肽或其衍生物的缺失，或變體多肽或其衍生物的存在是由質(zhì)荷比相對預(yù)期值的改變來指示。因此，所述方法允許在限制的質(zhì)荷范圍(質(zhì)量窗)上集中采集數(shù)據(jù)，以包括正常多肽和一種或多種目標變體多肽。以這種方式靶向是更加可重復(fù)的，并顯示對應(yīng)于正常質(zhì)荷比的峰，以及從患者(在這方面為純合子或雜合子)獲得的樣品中存在的因變異導(dǎo)致的相對于正常的改變。因此，所述方法可通常僅需要一個待靶向的限制的質(zhì)量窗。也可能將單獨的窗用于正常多肽和用于變體多肽?？墒褂妙~外的質(zhì)量窗用于靶向其他變體或其他多肽。

根據(jù)本發(fā)明的方法，電離技術(shù)用于產(chǎn)生多重荷電光譜，以檢測(a)已知多肽或多肽衍生物的存在與否，或(b)已知多肽或多肽衍生物的變體的存在與否，其中對樣品的掃描靶向于具有已知質(zhì)荷比的所選擇的電離物質(zhì)，質(zhì)荷比的預(yù)期值的缺失指示已知多肽或其衍生物的缺失，或變體多肽或其衍生物的存在是由質(zhì)荷比相對預(yù)期值的改變來指示。

因此，本發(fā)明的本實施方案的試劑盒和方法可用于檢測任何蛋白質(zhì)變異，例如蛋白質(zhì)突變或野生型蛋白質(zhì)的異常濃度。因此，任何導(dǎo)致產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)的遺傳性疾病都可用本實施方案的試劑盒和方法來檢測。優(yōu)選地，檢測血紅蛋白變異、白蛋白、肌紅蛋白(myoblobin)、細胞色素以及多種先天性疾病(例如糖基化障礙)有關(guān)的變體蛋白。

本發(fā)明的優(yōu)選試劑盒和方法用于檢測臨床上重要的血紅蛋白變體，例如Hb S、Hb C、HbD^Punjab、HbO^Arab、HbLepore、Hb E、δβ地中海貧血、遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白癥(HPFH)和阿爾法零型地中海貧血癥。進一步優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法用于檢測以下臨床上重要的血紅蛋白變體：S、C、E、D^Punjab和O^arab。待檢測的蛋白質(zhì)變體可以是任何蛋白質(zhì)，包括糖蛋白。特別地，指示代謝障礙的特定糖蛋白可使用本發(fā)明的方法來檢測。

血紅蛋白變體分析可與對上述代謝物(即來自如干血斑點的相同樣品或來自如大量不同干血斑點的不同樣品的谷氨酰胺以其他氨基酸、肉堿、酰基肉堿、SUAC、ASA)的分析同時或相繼進行。

本發(fā)明另一實施方案的方法或試劑盒可進一步包括步驟(v)測定樣品中多肽的酶活性、和/或步驟(vi)測定所述多肽的氨基酸組成。測定酶活性的步驟可包括(a)將用于所述酶活性的底物加入所述樣品中，及(b)分析樣品中所述底物的存在與否和/或所述酶活性在所述底物上導(dǎo)致的產(chǎn)物的存在與否。測定氨基酸組成的步驟可包括(i)加入肽鏈內(nèi)切酶如胰蛋白酶(ii)在肽鏈內(nèi)切酶處理后分析所述樣品中的多肽，及(iii)推知所述多肽的氨基酸組成。

實施例

實施例1：谷氨酰胺、賴氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸水平的確定

為確定對谷氨酰胺、賴氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸的測量的線性度，制備最多20mM的各分析物的標準溶液，并將10μL注入串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測量各離子/轉(zhuǎn)換(圖6-8)。

實施例2：干血樣品中谷氨酰胺和賴氨酸水平的確定

為確定對干血斑點(DBS)中賴氨酸和谷氨酰胺的總和的測量的線性度，在健康供體的血液中加入賴氨酸。使用離子交換色譜通過標準氨基酸確定等份試樣中確定賴氨酸和谷氨酰胺的內(nèi)源性濃度(圖9)。

實施例3：干血樣品中谷氨酰胺和賴氨酸的總和的確定

圖10顯示對谷氨酰胺和賴氨酸的總和的測量的推薦結(jié)果。對于賴氨酸和谷氨酰胺，將賴氨酸和甘氨酸的參考范圍繪圖，聯(lián)通所計算的這2種參考范圍(較低參考之和-較高參考范圍之和)，180份健康新生兒的DBS的測量值，患有經(jīng)證明的OTC缺乏癥的患者的2份樣品的測量值，患有尿素循環(huán)缺陷(UCD)的患者的預(yù)期范圍。