本發(fā)明涉及酶學(xué)領(lǐng)域，特別涉及利用精氨酸酶活性的制劑或藥物，具體涉及一種精氨酸酶激活劑，含有該激活劑的精氨酸酶組合物及其在疾病治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

精氨酸酶I(EC 3.5.3.1；L-精氨酸水解酶)，是一種關(guān)鍵的哺乳動(dòng)物肝臟酶，其催化尿素循環(huán)中尿素形成的最終步驟，將精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸和尿素。精氨酸對于正常的人體細(xì)胞來說是半必須氨基酸，正常的人體細(xì)胞可以合成自身所需的精氨酸，而精氨酸對于癌細(xì)胞來說是必須氨基酸，很多癌細(xì)胞系是精氨酸營養(yǎng)缺陷型的。很多證據(jù)表明，體外精氨酸耗損(利用精氨酸降解酶或使用缺乏精氨酸的介質(zhì))會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的迅速破壞(Scott et al.,2000,Single amino acid(arginine)deprivation:rapid and selective death of cultured transformed and malignanat cells.Br.J.Cancer 83,800-810；Wheatley et al.,2000,Single amino acid(arginine)restriction:Growth and Death of cultured Hela and Human Diploid Fibroblasts.Cellular Physiol.Biochem.10,37-55)。當(dāng)肝癌病人發(fā)生意外肝損傷時(shí)，大量肝源的精氨酸酶I意外的進(jìn)入外周血液循環(huán)，肝癌胚抗原的水平明顯降低，而當(dāng)外周血液中的精氨酸酶含量回復(fù)正常范圍，肝癌胚抗原的水平明顯也隨之升高。目前的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，耗竭精氨酸可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生自噬，從而使腫瘤放緩或停止生長，延長癌癥病人存活期,為后續(xù)治療爭取時(shí)間(Chun A.Changou,2014，Arginine starvation-associated atypical cellular death involves mitochondrial dysfunction,nuclear DNA leakage,and chromatin autophagy.J.PNAS 39,14147-14152)。因此，使用精氨酸酶來治療癌癥，也是目前癌癥治療研究的一個(gè)重要方向。

通過精氨酸剝奪還可以對病毒進(jìn)行抑制。病毒感染是死亡的主要原因之一，每年病毒直接導(dǎo)致數(shù)百萬的死亡病例，包括肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)。然而，現(xiàn)有的抗病毒療法還存在一些問題或缺點(diǎn)。首先，有效的抗病毒藥物比較較少。很多現(xiàn)有的抗病毒物質(zhì)導(dǎo)致不利的副作用。大部分有效的療法(例如接種疫苗)只對單個(gè)病毒株具有高特異性。病毒經(jīng)常發(fā)生突變，使得其對藥物或疫苗產(chǎn)生抗性。因此，需要克服上述問題的新的抗病毒療法。實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)現(xiàn)精氨酸耗竭導(dǎo)致很多不同的病毒家族的復(fù)制受到抑制，所述病毒家族包括腺病毒(Rouse等，1963，Virology,20：357-365)和皰疹病毒(Tankersley,1964,J Bacteriol,87:609_13)。

但是，由于精氨酸酶藥理學(xué)半衰期短，在患者體內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)治療有效的血液水平，是將其臨床應(yīng)用的一大障礙。有些研究者通過將該蛋白與聚合物(例如聚乙二醇(PEG))偶聯(lián)來克服這一問題。作為具有惰性的、非毒性的生物降解性聚合物，PEG與生物分子的共價(jià)結(jié)合在生物技術(shù)和醫(yī)藥中具有重要的應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，具有生物學(xué)和藥學(xué)活性的蛋白的聚乙二醇化改善了藥代動(dòng)力學(xué)，從而延長了持續(xù)時(shí)間、改善了安全性(例如更低的毒性、免疫原性和抗原性)、增加了功效、降低了給藥頻率、提高了藥物溶解度和穩(wěn)定性、降低了蛋白質(zhì)水解性并促進(jìn)了藥物的可控釋放(Roberts et al.,2002,Adv Drug Deliv Rev,54:459-76；Harris&Chess,2003,Nat Rev Drug Discov,2:214-221)。隨著PEG化技術(shù)的發(fā)展，第二代PEG技術(shù)比第一代PEG技術(shù)相比在延長半衰期、修飾專一性等方面取得了長足的進(jìn)步，特別是雙臂及多臂PEG，具有更大的分子體積和特殊的分子形態(tài)，更有利于對藥物分子等的修飾與改性，達(dá)到更優(yōu)的綜合效果。以PEG-IFNα-2b為例，當(dāng)PEG化采用直鏈PEG(20k)時(shí)，半衰期約為40小時(shí)，藥物全身分布，按體重給藥，而采用大分子支鏈PEG(PEG-IFNα-2a(Y型40k))時(shí)，半衰期約為80小時(shí)，藥物可濃聚于靶器官如肝臟，無需按體重給藥，被FDA批準(zhǔn)用于慢性丙型肝炎和慢性乙型肝炎的治療。

在正常生理?xiàng)l件下，血漿精氨酸水平維持在正常范圍之間(100— 120μM)，肌肉是主要調(diào)節(jié)物。對于氨基酸缺乏，胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解途徑被激活(蛋白酶體和溶酶體)，將氨基酸釋放至循環(huán)中。這種氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制使多種氨基酸水平保持在恒定范圍。因?yàn)闄C(jī)體的氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制的存在，先前多種物理方法或精氨酸降解酶耗竭精氨酸的嘗試均以失敗告終。因此，想要靠降解酶耗竭精氨酸，降解酶必須要維持長時(shí)間足夠高的活力來抵消機(jī)體的氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制。

截止到2015年6月，美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的通過耗竭人體血液中的精氨酸治療癌癥的酶制劑有兩種，一是PEG修飾的支原體精氨酸脫亞氨酶(3期臨床)，另一種是PEG修飾人的精氨酸酶I(1期臨床)。二者的共同點(diǎn)是：都能耗竭人體血液中的精氨酸，都通過PEG修飾來延長半衰期；二者的差異如下：

PEG修飾的支原體精氨酸脫亞氨酶(ADI)的活性比PEG修飾人的精氨酸酶I(recombinant human arginase I,rhArg I)的活性高，但是在3期臨床中發(fā)現(xiàn)支原體精氨酸脫亞氨酶雖然進(jìn)行了PEG修飾，還是能引發(fā)免疫反應(yīng)，此外ADI降解血液中的精氨酸產(chǎn)生L-瓜氨酸和NH₃，后者有可能使患者血氨含量升高產(chǎn)生氨中毒癥狀。僅有精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase,ASS)表達(dá)缺失的癌細(xì)胞對ADI敏感，而非ASS表達(dá)缺失的癌細(xì)胞對ADI有抗性(Shen LJ et al.Resistance to the anti-proliferative activity of recombinant arginine deiminase in cell culture correlates with the endogenous enzyme,argininosuccinate synthetase.Cancer Lett 2003；191:165-70)。

PEG修飾人源精氨酸酶I不會(huì)引起免疫反應(yīng)，降解精氨酸產(chǎn)物是尿素和鳥氨酸，沒有發(fā)生氨中毒的風(fēng)險(xiǎn)，并且對ASS缺陷型和非ASS缺陷型的癌細(xì)胞均有抑制性。(Paul Ning-Man Cheng et al,PEGylated Recombinant Human Arginase(rhArg-PEG)Inhibits the In vitro and In vivo Proliferation of Human Hepatocellular Carcinoma through Arginine Depletion.Cancer Res 2007；67:(1)309-317)但是因?yàn)镻EG修飾人源精氨酸酶I活性較低(大約是前者的1/100)，在安全給藥量(1000-1600u/kg)范圍內(nèi)出現(xiàn)無效受試個(gè)體，而有效 受試個(gè)體,也需要給藥4周才能到達(dá)耗竭精氨酸的效果，雖然高劑量受試者(2500u/kg)給藥2周時(shí)達(dá)到了耗竭精氨酸的效果，但是有受試者出現(xiàn)了肝功能的損傷(Thomas Yau et al.A phase 1dose-escalating study of PEGylated recombinant human arginase 1(PEG-rhArg 1)in patients with advanced hepatocellular carcinoma.Invest New Drugs.2013Feb；31(1):99–107.)。因此提高活力是PEG修飾人源精氨酸酶I目前最迫切需要解決的問題。

阿魏酸普遍存在于當(dāng)歸、川芎等中藥材中，具有抗凝、解除血管平滑肌痙攣，抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛和護(hù)肝等藥理作用，臨床上阿魏酸的鹽或酯(阿魏酸鈉、阿魏酸哌嗪等)廣泛被用于偏頭痛、腦血管病、腎小球病和肺動(dòng)脈病變等血管相關(guān)疾病(Mathew S et al.,Ferulic acid an antioxidant found naturally in plant cell walls and feruloyl esterases involved in its release and their applications.Crit Rev Biotechnol 2004；24(2-3):59-83)。此外，近些年發(fā)現(xiàn)阿魏酸具有抑制腫瘤生長的作用，其機(jī)制是抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的表達(dá)，并干擾VEGF的作用通路，使得VEGF功能減弱或喪失。目前從未發(fā)現(xiàn)阿魏酸類化合物可以激活精氨酸酶或有相關(guān)的活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了進(jìn)一步提高精氨酸酶的有效性，本發(fā)明提供了一種精氨酸酶組合物，其能夠增強(qiáng)精氨酸酶的活性，從而更加有效發(fā)揮其作用。

本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了阿魏酸類的化合物具有激活精氨酸酶，增強(qiáng)其活性的作用，并進(jìn)一步開發(fā)了相關(guān)的組合物，以用于科研或疾病的治療。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種精氨酸酶組合物(或稱為精氨酸酶與其激活劑的組合)，包含精氨酸酶和精氨酸酶激活劑，所述精氨酸酶激活劑包括選自以下通式1至通式5所表示的化合物及其異構(gòu)體或衍生物，及其組合：

其中，X選自O(shè)、N和S，

R₁、R₂和R₃各自獨(dú)立的選自氫、氘、鹵素、羥基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m為1至4的整數(shù)，n為1至3的整數(shù)，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基選自羥基、羧基、鹵素和C₁至C₁₀烷基。所述精氨酸酶和精氨酸酶激活劑可以單獨(dú)分別存在于所述組合中，也可以混合物的形式存在于所述組合中。在應(yīng)用時(shí)，精氨酸酶與上述激活劑可以在不同時(shí)間段分別依次施用。

通過上述精氨酸酶激活劑與精氨酸酶的組合，可以顯著提高精氨酸酶的活性，從而能夠在有限的時(shí)間內(nèi)更大的發(fā)揮降解精氨酸的活性，增強(qiáng)利用精氨酸酶進(jìn)行治療的效果。

優(yōu)選地，其中所述精氨酸酶與所述精氨酸酶激活劑的比例為1活性單位精氨酸酶：0.25nmol至80nmol精氨酸酶激活劑。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述衍生物包括鹽或酯，優(yōu)選鈉鹽、鉀鹽、和阿魏酸烷基酯，所述烷基為C1至C10的烷基，例如阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述精氨酸酶激活劑包括阿魏酸及其衍生物、丁烯基苯酞、丁苯酞、藁本內(nèi)酯、苯丙素類化合物，所述阿魏酸衍生物包括阿魏酸鹽例如阿魏酸鈉、阿魏酸酯和阿魏酸哌嗪(結(jié)構(gòu)如下)。

阿魏酸哌嗪

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述精氨酸酶為重組人源精氨酸酶，優(yōu)選重組人源精氨酸酶I。重組人源精氨酸酶的使用最大程度地降低了潛在的免疫反應(yīng)對療效的影響，也不會(huì)引起像化療藥物那樣引起的副作用所造成的不適。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述精氨酸酶為PEG化的精氨酸酶。精氨酸酶I的體內(nèi)半衰期很短，只有8至10分鐘，使用PEG化，可以大大延長其半衰期。優(yōu)選使用直鏈型或分枝型PEG，優(yōu)選Y型mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG2-NHS)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以進(jìn)一步包括另一種已知的精氨酸酶激活劑，如錳離子或甘氨酸，以進(jìn)一步增強(qiáng)精氨酸酶的活性。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了具有通式1至通式5的化合物作為精氨酸酶激活劑的應(yīng)用，

其中，X選自O(shè)、N和S，

R₁、R₂和R₃各自獨(dú)立的選自氫、氘、鹵素、羥基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m為1至4的整數(shù)，n為1至3的整數(shù)，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基選自羥基、羧基、鹵素和C₁至C₁₀烷基。

其中所述衍生物包括鹽或酯，優(yōu)選鈉鹽、鉀鹽、和酯，例如阿魏酸烷基酯，所述烷基可以為C1至C10烷基，例如阿魏酸甲酯和阿魏酸乙酯。優(yōu)選地，所述精氨酸酶激活劑包括阿魏酸及其衍生物、丁烯基苯酞、丁苯酞、藁本內(nèi)酯、苯丙素類化合物，所述阿魏酸衍生物包括阿魏酸鹽例如阿魏酸鈉、阿魏酸酯和阿魏酸哌嗪。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述精氨酸酶激活劑用于與精氨酸酶聯(lián)合制備藥物，所述藥物用于治療癌癥、抗病毒、促進(jìn)膠原生成、促進(jìn)細(xì)胞分裂、加快傷口愈合、促進(jìn)組織再生與修復(fù)，以及抵抗炎癥反應(yīng)。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含如上所述的精氨酸酶組合物和藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明還提供了一種精氨酸酶激活劑，包括選自以下通式1至通式5所表示的化合物及其衍生物，及其組合：

其中，X選自O(shè)、N和S，

R₁、R₂和R₃各自獨(dú)立的選自氫、氘、鹵素、羥基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m為1至4的整數(shù)，n為1至3的整數(shù)，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基選自羥基、羧基、鹵素和C₁至C₁₀烷基。

附圖說明

圖1為人源精氨酸酶I的構(gòu)象示意圖，圖中用箭頭指出半胱氨酸(Cys)的位置，賴氨酸(Lys)用標(biāo)簽指出；

圖2為根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式制備的rh精氨酸酶I和mPEG2-NHS 單修飾rh精氨酸酶I的純化后電泳圖，Marker從上到下依次是：97.2KD，66,4KD，44.3KD，29.0KD，20.1KD，14.3KD，泳道1是：mPEG2-NHS單修飾的rh精氨酸酶I,泳道2是：rh精氨酸酶I；

圖3是mPEG2-NHS與蛋白質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)示意圖；

圖4是體外檢測中rhArg I與rhArg I-PEG的酶活力隨阿魏酸鈉濃度變化的曲線圖；

圖5是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的組合物在大鼠的精氨酸耗竭實(shí)驗(yàn)中，血液中精氨酸酶活力隨時(shí)間的變化曲線圖；

圖6是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中血液中精氨酸的含量隨時(shí)間的變化。

具體實(shí)施方式

下文將結(jié)合具體實(shí)施例來具體說明本發(fā)明的精神和原理，并驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的是，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例，其范圍應(yīng)由權(quán)利要求書限定。

實(shí)施例1：重組人源精氨酸酶I的制備

1.重組人源精氨酸酶I的表達(dá)

rhArg I的氨基酸序列如下所示，使含有rhArg I基因的Pgex-6p-1質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)于LB培養(yǎng)基中加入80ug/L氨芐青霉素，在37℃，220轉(zhuǎn)每分鐘培養(yǎng)，直到600nm光吸收值達(dá)到0.7-0.9，隨后降溫至16℃,220轉(zhuǎn)每分鐘培養(yǎng)。半小時(shí)后，加入乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，乳糖濃度為0.5mM，表達(dá)時(shí)間14-18小時(shí)。隨后在4℃，4000rpm離心40分鐘收集菌體。測沉淀細(xì)胞質(zhì)量。

2.純化

用PBS(內(nèi)含2mM/L的DTT)重懸(4L菌大概用100mL PBS)菌。超聲破菌后，14000轉(zhuǎn)/分鐘離心50分鐘。取上清，上清過GST親和柱，用 PBS(內(nèi)含2mM/L的DTT)洗雜后，用蛋白磷酸酶(pp酶)酶切過夜。第二天用50mM pH8.0Tris-HCl緩沖液配置的10mM的還原型谷胱甘肽的洗脫緩沖液從GST柱上洗脫下來，用10kD(截留值)的濃縮管進(jìn)行濃縮，并去除谷胱甘肽，隨后用AKTA過superdex75(GE公司)的分子篩,收集蛋白峰。分子篩superdex75的緩沖體系是PH8.5的50mM Bicine。最后用10KD(截留值)的濃縮管濃縮，rhArg I最終濃縮至5mg/ml。

3.支鏈PEG修飾和純化

圖1中顯示了精氨酸酶1的構(gòu)象示意圖，圖2顯示了mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa)與蛋白質(zhì)的NH₂發(fā)生偶聯(lián)的過程。

由于mPEG2-NHS的分子量較大，受到空阻的限制，只和蛋白質(zhì)表面的NH₂反應(yīng)，與NH₂形成穩(wěn)定的酰胺鍵。精氨酸酶的濃度最終稀釋到1-2mg/mL。在4℃-25℃,PH6.0-9.0環(huán)境下，把精氨酸酶與mPEG2-NHS按照摩爾比1:1-30的比例混合，緩慢攪拌15-60分鐘。隨后用SDS-PAGE來監(jiān)測MPEG的修飾過程。隨后用陽離子交換柱分離反應(yīng)混合物，收集單修飾的精氨酸酶1的洗脫峰，用10kD的濃縮管進(jìn)行濃縮。

本專利中用40KD的Y型mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG2-NHS)修飾rhArg，與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別與優(yōu)勢在于：

(1)rhArg I沒做任何突變

先前的專利為了定點(diǎn)偶聯(lián)PEG做了突變

(2)PEG的種類和修飾點(diǎn)不同

先前的專利用5KD的PEG-SPA(香港)和20KD的mPEG-MAL(香港)，前者是第一代PEG修飾劑，分子量偏小，容易產(chǎn)生多修飾，產(chǎn)物不單一，修飾產(chǎn)物的半衰期短(3天)；后者的修飾點(diǎn)是半胱氨酸的還原型巰基，雖然能做到定點(diǎn)修飾和控制修飾數(shù)量，但是相對于賴氨酸側(cè)鏈的氨基，巰基與蛋白質(zhì)主鏈的距離只間隔一個(gè)單鍵，在這里引入大分子的PEG會(huì)干擾附近的蛋白質(zhì)主鏈的結(jié)構(gòu)，從而可能干擾蛋白質(zhì)的活性。香港理工大學(xué)的專利用 20KD的mPEG-MAL修飾rhArg的cys45，由人源精氨酸酶1的結(jié)晶結(jié)構(gòu)可知，這個(gè)半胱氨酸緊鄰兩個(gè)二級結(jié)構(gòu)，并且側(cè)鏈的巰基伸向蛋白質(zhì)內(nèi)側(cè)，與mPEG-MAL偶聯(lián)時(shí)空阻比較大，并且要把側(cè)鏈巰基拉到蛋白質(zhì)外側(cè)，這樣反應(yīng)效率低，而且會(huì)影響rhArg I的空間結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中用40KD的Y型mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG2-NHS)修飾N末端氨基和賴氨酸側(cè)鏈的氨基，mPEG2-NHS具有許多優(yōu)點(diǎn)，其產(chǎn)物的支化結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生較大的分子體積，多點(diǎn)修飾的幾率較直鏈的PEG修飾劑較低，這樣mPEG2-NHS就不大可能滲透到蛋白質(zhì)空間位阻大的區(qū)域，主要與伸展到蛋白質(zhì)外側(cè)的賴氨酸側(cè)鏈的氨基偶聯(lián)，賴氨酸側(cè)鏈與蛋白質(zhì)主鏈有5個(gè)單鍵的距離，并且柔性較強(qiáng)，mPEG2-NHS偶聯(lián)在這里對rhArg I的空間結(jié)構(gòu)的影響最小，對rhArg I的活性干擾相對前者較小，修飾產(chǎn)物的半衰期更長。

4.體外酶學(xué)測試

精氨酸酶的活性可以通過檢測反應(yīng)釋放尿素的量來確定，測定尿素使用鄰苯二甲醛(OPA)法，尿素與OPA和NED(N-(1-萘基)乙烯-二胺鹽酸鹽)生成紅色化合物，顏色的深淺與酶的活性成正比。在50μl反應(yīng)系統(tǒng)中，含200mM的Tris-HCl(pH7.4)，20mM的L-精氨酸，100μM氯化錳，0.225μg/ml的精氨酸酶。37℃反應(yīng)2小時(shí)，加入200μl冷終止顯色液(1M H₂SO₄-50mM H₃BO₃-1.6mM OPA&NED)，室溫下20分鐘后顯色，然后立即在520nm吸光度的測量。rhArg I的活力約為300U/mg，rhArg I-PEG的活力保留了約81％。反應(yīng)體系中添加0-200μM的阿魏酸鈉，在0-200μM濃度下，阿魏酸鈉對rhArg I和rhArg I-PEG均有激活性，在50-60μM時(shí)達(dá)到最高激活率約為42％。未修飾的rhArg I與PEG修飾的rhArg I的活性隨阿魏酸鈉濃度變化曲線如圖4所示。

由圖4可見，隨著阿魏酸鈉的加入，精氨酸酶的活性急劇增加，并且在0-80μM的阿魏酸鈉濃度范圍內(nèi)，精氨酸酶活性隨著阿魏酸鈉濃度升高逐漸升高，因此，說明阿魏酸鈉對精氨酸酶激活作用在一定范圍內(nèi)能夠呈現(xiàn)一定 程度的線性關(guān)系。

在應(yīng)用于動(dòng)物或人體內(nèi)時(shí)，由于精氨酸酶和阿魏酸鈉各自有其安全劑量范圍，為了兼顧安全與酶活性，通過發(fā)明人多次評估實(shí)驗(yàn)得出：精氨酸酶與阿魏酸鈉的比例優(yōu)選為1活性單位精氨酸酶：0.25nmol至80nmol阿魏酸鈉，更優(yōu)選1活性單位精氨酸酶：1至10nmol阿魏酸鈉，最優(yōu)選1活性單位精氨酸酶：4至8nmol阿魏酸鈉。在此范圍內(nèi)，既可以保證安全用藥，又能夠最大限度地增強(qiáng)精氨酸酶的活性，通過其協(xié)同作用增強(qiáng)治療效果。

5.細(xì)胞學(xué)測試

對于每種癌細(xì)胞系，將在100μL培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的細(xì)胞(5×10³)接種到96孔板的板孔中并采用標(biāo)準(zhǔn)方法溫育24小時(shí)。用含有不同濃度的rhArg I-PEG，阿魏酸鈉(Sodium ferulic,SF)，rhArg I-PEG與阿魏酸鈉復(fù)合物(rhArg I-PEG&SF)之一的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)物培養(yǎng)基。單純r(jià)hArg I-PEG的添加濃度是0-1U/ml，rhArg I-PEG&SF中的rhArg I-PEG的添加濃度是0-1U/ml，阿魏酸鈉的添加濃度是300μM。將96孔板在37℃在95％空氣/5％CO₂環(huán)境中溫育3天。通過MTT測定法確定活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算50％的細(xì)胞生長抑制作用所需的上述3種藥物的量(以U/mL或單位/ml或ug/mL表示)即為IC50。

下表1展示了細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果，單純r(jià)hArg I-PEG和rhArg I-PEG&SF對4種癌細(xì)胞系有明顯的抑制性，并且，在相同癌細(xì)胞系中rhArg I-PEG&SF組的IC50明顯低于單純r(jià)hArg I-PEG組，單獨(dú)阿魏酸鈉本身對4種癌細(xì)胞系均沒有抑制性。

因此，如果阿魏酸鈉與精氨酸酶的組合物能夠?qū)Π┘?xì)胞系有抑制作用的話，是通過阿魏酸鈉與精氨酸酶協(xié)同作用，或者說是通過激活或增強(qiáng)精氨酸酶本身的活性來發(fā)揮作用，這屬于本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)并提出的阿魏酸鈉的作用。

表1

6.rhArg I-PEG和rhArg I-PEG&SF大鼠的精氨酸耗竭有效性測試

隨機(jī)選取大鼠分成5組，從第0天開始1-4組分別單劑量腹膜內(nèi)注射4000U/kg的rhArg I-PEG，第2-4組每12小時(shí)(2次/天)額外分別腹膜內(nèi)注射1mg/kg、5mg/kg或10mg/kg的SF，第5組為對照組僅注射PBS。隨后每2天抽血，測試血中rhArg I活力和精氨酸含量。結(jié)果如圖5和6所示。

7.血液中精氨酸的含量隨時(shí)間的變化結(jié)果說明

血液中rhArg I-PEG活力和精氨酸含量隨時(shí)間的變化如圖5和6所示。單獨(dú)注射rhArg I-PEG的T1/2約為10天，單獨(dú)注射rhArg I-PEG后的10天內(nèi)能維持精氨酸的10μM以下的低濃度水平，而SF的注射量為5或10mg/kg時(shí)可以使維持精氨酸低濃度水平的時(shí)間延長約2天，并且10-20天的血中精氨酸濃度明顯低于單獨(dú)注射rhArg I-PEG時(shí)的精氨酸濃度，說明SF的聯(lián)合使用可以提高rhArg I-PEG的活性，加速耗竭精氨酸。

具體而言，由圖5可見，注射了阿魏酸鈉SF的大鼠中rhArg I活力顯著高于未注射阿魏酸鈉的大鼠中的rhArg I活力，并且能夠更長時(shí)間維持較高的rhArg I活力，從而為精氨酸酶發(fā)揮作用爭取了時(shí)間。

由圖6可見，與沒有添加SF僅僅使用rhArg I-PEG相比，rhArg I-PEG與SF協(xié)同作用，能夠在更長時(shí)間內(nèi)保持精氨酸濃度在極低水平。如果用在癌癥治療中，更長時(shí)間的極低精氨酸水平能夠更加有效地遏制癌細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的自噬，從而達(dá)到治療癌癥的效果。

上述實(shí)施例說明，本發(fā)明的精氨酸酶激活劑能夠有效增強(qiáng)精氨酸酶的 活性，從而能夠有效增強(qiáng)其對癌細(xì)胞等靶點(diǎn)的作用。

上文中僅僅以阿魏酸鈉為例，說明了本發(fā)明的精氨酸酶激活劑對精氨酸酶活性的促進(jìn)作用，并僅僅示出了阿魏酸鈉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)際上，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，例如丁烯基苯酞、丁苯酞、藁本內(nèi)酯、苯丙素類化合物的化合物也能夠?qū)崿F(xiàn)增強(qiáng)精氨酸酶活性的作用，其構(gòu)效關(guān)系等數(shù)據(jù)并未在此提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解的是，上述化合物的衍生物，例如能夠在體內(nèi)代謝后與阿魏酸鈉等上述化合物生成相同的產(chǎn)物的衍生物，也能夠具有上述效果，因此，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

綜上，精氨酸酶降解精氨酸為多胺、脯氨酸,促進(jìn)細(xì)胞分裂和膠原的形成,加快傷口愈合和組織再生及修復(fù)，并且對炎癥后期由病原微生物造成的組織損傷進(jìn)行修復(fù)和重塑。此外，精氨酸酶降解精氨酸得到的鳥氨酸，進(jìn)一步降解可以生成兩種重要的多胺---精脒(spermidine)和精胺(sper-mine)，它們是微生物和培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的強(qiáng)力生長促進(jìn)劑，對核酸代謝有多種影響。在這種情況下，本發(fā)明的精氨酸酶組合物由于精氨酸酶激活劑的存在，提高了精氨酸酶的活性，從而能夠具有如下技術(shù)效果，或者說可以在如下領(lǐng)域更好地發(fā)揮精氨酸酶的作用：

1.促進(jìn)細(xì)胞分裂，加快傷口愈合和組織再生及修復(fù)，可以應(yīng)用于加速外傷、手術(shù)傷口愈合，移植組織擴(kuò)增，血管再生及建立側(cè)支循環(huán)；

2.促進(jìn)膠原的生成，與所有膠原蛋白相關(guān)的用途相關(guān)，抗衰老，美容，抗癌等等；

3.拮抗M1型巨噬細(xì)胞的促炎癥作用，緩解及修復(fù)炎癥造成的組織損傷，即抗炎作用。

并且，本發(fā)明使用的阿魏酸鈉等為臨床常用藥，毒性低，未發(fā)現(xiàn)明顯的副反應(yīng)，安全系數(shù)大,可安全應(yīng)用于人體。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。