專利名稱：被修飾的精氨酸脫亞胺酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶(deiminase)，涉及治療腫瘤的方法，涉及治療和/或抑制腫瘤轉移的方法。
背景技術：
惡性黑色素瘤(3期)和肝細胞瘤是在被診斷出一年之內(nèi)就致使大多數(shù)患者死亡的致死性疾病。在美國每年大約有16,000人死于這些疾病。黑色素瘤在美國的發(fā)病率正在快速增加，而在其他國家如澳大利亞，它的發(fā)病率更高。在世界上肝炎流行的地方，肝細胞瘤的發(fā)病率更高，例如在日本和臺灣，肝細胞瘤是首要的癌癥形式之一。對這些疾病的有效治療是非常急需的。
選擇性地缺失必需氨基酸的方法被用來治療某些癌癥。最著名的例子是應用L-天冬酰胺酶來降低天冬酰胺的水平以治療急性成淋巴細胞白血病。最常應用的L-天冬酰胺酶是從大腸桿菌中分離提取的。然而，該酶的臨床應用卻被其固有的抗原性和短的循環(huán)半衰期所限制，如Y.K.Park等在Anticancer Res.，1373-376(1981)中描述的。用聚乙二醇共價修飾的大腸桿菌L-天冬酰胺酶降低了其抗原性，延長了其循環(huán)半衰期，正如由Park在Anticancer Res.，同上；Y.Kamisaki等在J.Pharmacol.Exp.Ther.，216410-414(1981)；和Y.Kamisaki等在Gann.，7347-474(1982)中描述過的。盡管付出了巨大努力來鑒定其他用于治療癌癥的必需氨基酸降解酶，但沒有發(fā)現(xiàn)一個是合適的，主要是因為缺失必需氨基酸---由其定義---會導致無數(shù)嚴重的副作用。
曾有報道說降解非必需氨基酸如精氨酸的酶可能是控制某些形式的癌癥的有效方法。例如，由J.B.Jones在“精氨酸脫亞胺酶對小鼠白血病成淋巴細胞的作用”，博士論文，The University of Oklahoma，1-165頁(1981)中描述的從惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中提取的精氨酸脫亞胺酶(ADI)。盡管在體外能有效地殺死腫瘤細胞，從惡臭假單胞菌中提取的ADI在體內(nèi)卻沒能表現(xiàn)出有效性，因為它在中性pH下幾乎沒有酶活性，并從實驗動物的血液循環(huán)中被快速清除。來自精氨酸支原體的精氨酸脫亞胺酶被描述在，如Takaku et al，Int.J.Cancer，51244-249(1992)中和在美國專利NO.5,474,928中，在此將其公開全部引為參考。然而，與這樣一個異源蛋白質(zhì)的治療作用相關聯(lián)的一個問題是它的抗原性。Takaku等在Jpn.J.Cancer Res.，841195-1200(1993)中描述了用聚乙二醇通過氰尿酰氯基團對從精氨酸支原體中提取的精氨酸脫亞胺酶的化學修飾作用。然而，這個修飾的蛋白質(zhì)在代謝時卻是有毒的，因為從氰尿酰氯連接基上釋放了氰化物。
需要能降解非必需氨基酸但卻沒有與現(xiàn)有技術相聯(lián)系的問題的組合物。本發(fā)明涉及這些和其他重要的目的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，精氨酸脫亞胺酶被總體重均分子量為大約1,000到大約50,000的聚乙二醇直接地或通過一個生物相容性連接基團所修飾。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及治療包括(例如)肉瘤、肝細胞瘤和黑色素瘤的癌癥的方法。本發(fā)明還涉及治療和/或抑制腫瘤細胞轉移的方法。
本發(fā)明的這些和其他方面將要在以下對本發(fā)明的詳細描述中得到闡述。
圖示的簡要描述

圖1描述精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列，所示序列分別克隆自精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)(被標定為ADIPROT的上部氨基酸序列)、關節(jié)炎支原體(Mycoplasma arthritides)(被標定為ARTADIPRO的中間氨基酸序列)和人形支原體(Mycoplasma hominus)(被標定為HOMADIPRO的下部氨基酸序列)。
圖2A和2B表示單劑量天然精氨酸脫亞胺酶和用聚乙二醇(如分子量為5,000)修飾的精氨酸脫亞胺酶對小鼠血清精氨酸水平和血清瓜氨酸水平的作用。
圖3表示當PEG10,000通過不同的連接基團與ADI共價連接時對血清精氨酸水平的作用。
圖4表示以單劑量PEG-ADI注射時，連接基團和聚乙二醇的分子量對小鼠中瓜氨酸產(chǎn)生的作用。
圖5A和5B表示血清精氨酸和瓜氨酸水平對ADI-SS-PEG5,000的劑量反應。圖5C和5D表示血清精氨酸和瓜氨酸水平對ADI-SS-PEG20,000的劑量反應。
圖6表示天然ADI、ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性。
圖7表示用ADI-SS-PEG5,000、ADI-SS-PEG12,000或ADI-SS-PEG20,000治療被注射了SK-mel 2人黑色素瘤細胞的小鼠時對腫瘤大小的作用。
圖8表示用ADI-PEG20,000治療被注射了SK-mel 28、SK-mel 2或M24-met人黑色素瘤細胞的小鼠時對腫瘤大小的作用。
圖9表示用ADI-PEG5,000、ADI-PEG12,000或ADI-PEG20,000治療被注射了人肝細胞瘤細胞SK-Hep 1的小鼠時對小鼠生存率的作用。
本發(fā)明的詳細描述正常細胞的生長不需要精氨酸，因為它們能通過由精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂解酶催化的一個兩步反應從瓜氨酸合成精氨酸。相反地，黑色素瘤、肝細胞瘤和一些其他的肉瘤不表達精氨琥珀酸合成酶；因而它們是精氨酸的營養(yǎng)缺陷型。這個代謝差別可用來開發(fā)對治療這些癌癥的安全而有效的治療劑。精氨酸脫亞胺酶催化精氨酸向瓜氨酸的轉化，可以被用來清除精氨酸。因此，精氨酸脫亞胺酶可以被用來治療黑色素瘤、肝細胞瘤和一些其他肉瘤。
天然精氨酸脫亞胺酶可在微生物中找到，是抗原性的，并在患者的血液循環(huán)中被快速清除掉。這些問題可通過用聚乙二醇(PEG)共價修飾精氨酸脫亞胺酶來克服。用聚乙二醇(通過或不通過連接基團)共價修飾的精氨酸脫亞胺酶在此可被稱為“ADI-PEG”。與天然精氨酸脫亞胺酶相比，ADI-PEG保留了它的大部分酶活性，具有很少的抗原性，有一個大大延長的循環(huán)半衰期，在治療腫瘤時是更有效的。
“聚乙二醇”或“PEG”是指環(huán)氧乙烷和水的直鏈或支鏈形式縮聚物的混合物，由一般分子式H(OCH2CH2)nOH來代表，在此n至少為4。用“聚乙二醇”或“PEG”連同其后面的數(shù)字后綴一同來表示它的大約平均分子量。例如，PEG5,000是指重均分子量大約為5,000的聚乙二醇；PEG12,000是指重均分子量大約為12,000的聚乙二醇；PEG20,000是指重均分子量大約為20,000的聚乙二醇。
“黑色素瘤”可以是一種從皮膚或其他器官(包括口腔、食道、肛門、陰道、小腦膜(leptomeningers)和/或結膜或眼睛)的黑色素細胞系統(tǒng)發(fā)展而來的惡性或良性腫瘤。術語“黑色素瘤”包括，例如，肢端-小痣(acral-lentginous)黑色素瘤、無黑色素的黑色素瘤、少年良性黑色素瘤、惡性小痣黑色素瘤、惡性黑色素瘤、結節(jié)黑色素瘤、甲床黑瘤和淺層擴散的黑色素瘤。
“肝細胞瘤”可以是肝的一種惡性或良性腫瘤，包括例如肝細胞性癌。
“患者”是指動物，優(yōu)選指哺乳動物，更優(yōu)選指人。
“生物相容性”是指通常地對生物學功能沒有傷害和不會導致任何不可接受程度的毒性(包括過敏和疾病狀態(tài))的物質(zhì)或化合物。
在本發(fā)明的公開中，以下的縮寫可能被應用PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脫亞胺酶；SS，琥珀酸琥珀酰亞胺酯；SSA，琥珀酰亞胺基琥珀酰胺；SPA，丙酸琥珀酰亞胺酯；NHS，N-羥基琥珀酰亞胺。
本發(fā)明基于一個意外發(fā)現(xiàn)，即用聚乙二醇修飾的ADI具有治療某些類型的癌癥和抑制癌癥轉移的顯著效果。ADI可以通過或不通過一個連接基團與聚乙二醇相聯(lián)，盡管優(yōu)選的實施方案應用了連接基團。
在本發(fā)明中，精氨酸脫亞胺酶的基因可從任何來源得到、克隆或生產(chǎn)，例如微生物、重組生物技術或其任何組合。優(yōu)選地，精氨酸脫亞胺酶從支原體屬的微生物中克隆得到。更優(yōu)選地，精氨酸脫亞胺酶從精氨酸支原體、人形支原體、關節(jié)炎支原體或其任何組合中克隆得到。特別地，在本發(fā)明中應用的精氨酸脫亞胺酶可以具有一個或多個在圖1中表示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，聚乙二醇(PEG)的總體重均分子量為從約1,000到約50,000；更優(yōu)選地為從約3,000到約40,000；更優(yōu)選地為從約5,000到約30,000；更優(yōu)選地為從約8,000到約30,000；更優(yōu)選地為從約11,000到約30,000；更優(yōu)選地為從約12,000到約28,000；更加優(yōu)選地為從約16,000到約24,000；更優(yōu)選地為從約18,000到約22,000；更優(yōu)選地為從約19,000到約21,000；最優(yōu)選地到約20,000。一般地，具有30,000或更高分子量的聚乙二醇難于溶解，制劑產(chǎn)量因而大大降低。所用聚乙二醇可是直鏈或支鏈，優(yōu)選為直鏈形式的。一般地，增加聚乙二醇的分子量可降低ADI的免疫原性。具有在本實施方案中描述的分子量的聚乙二醇可以與ADI和任選地一個生物相容性連接基團結合以用于治療癌癥，包括例如黑色素瘤、肝細胞瘤和肉瘤，優(yōu)選黑色素瘤。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，聚乙二醇(PEG)的總體重均分子量為從約1,000到約50,000；更優(yōu)選地為從約3,000到約30,000；更優(yōu)選地為從約3,000到約20,000；更優(yōu)選地為從約4,000到約12,000；更優(yōu)選地為從約4,000到約10,000；更優(yōu)選地為從約4,000到約8,000；更加優(yōu)選地為從約4,000到約6,000，最優(yōu)選地為約5,000。所用聚乙二醇可是直鏈或支鏈，優(yōu)選為直鏈形式的。具有在本實施方案中描述的分子量的聚乙二醇可以與ADI和任選地一個生物相容性連接基團結合以用于治療癌癥，包括例如黑色素瘤、肝細胞瘤和肉瘤，優(yōu)選肝細胞瘤。
用來共價連接PEG和ADI的連接基團可以是任何生物相容性連接基團。如上所述，“生物相容性”表示化合物或基團是非毒性的，可以在體外或體內(nèi)應用而并不引起損傷、病患、疾病或死亡。例如，PEG可以通過酯鍵、醚鍵、硫醇鍵或者酰胺鍵與連接基團相連。合適的生物相容性連接基團包括，例如，酯基、酰胺基、亞酰胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羥基、碳水化合物、順丁烯二酰亞胺基團(包括，例如，琥珀酸琥珀酰亞胺酯(SS)、丙酸琥珀酰亞胺酯(SPA)、羧甲酸琥珀酰亞胺酯(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羥基琥珀酰亞胺(NHS))、環(huán)氧基、氧基羰基咪唑基(包括，例如，羰基二咪唑基(CDI))、硝苯苯基(包括，例如，碳酸硝基苯酯(NPC)或碳酸三氯苯酯(TPC))、trysylate基、醛基、異氰酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、組氨酸基或伯胺。優(yōu)選地，生物相容性連接基是酯基和/或順丁烯二酰亞胺基團。更優(yōu)選地，連接基為SS、SPA、SCM、SSA或NHS，其中SS、SPA或NHS是更優(yōu)選的，SS或SPA是最優(yōu)選的。
另一選擇是，ADI可以通過氨基、巰基、羥基或羧基直接與PEG結合(即不用連接基)。
ADI可通過生物相容性連接基團與PEG共價結合，其方法在本領域中已有描述，例如，Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)；Zaplipsky與Lee，《聚乙二醇化學生物技術與生物醫(yī)學應用》，J.M.Harris編，Plenum Press，N.Y.，21章(1992)。在此將這些文獻公開全部引入本文作參考。
把PEG連接到ADI上會增加ADI的循環(huán)半衰期。一般地，PEG與ADI的伯胺相連。在精氨酸脫亞胺酶上聚乙二醇的結合位點的選擇是由在蛋白質(zhì)的活性域中的每一個這樣的位點的角色來決定的，這是本領域技術人員所知曉的。PEG可被連接到精氨酸脫亞胺酶的伯胺上去而不顯著地損失酶活性。例如，從精氨酸支原體、關節(jié)炎支原體和人形支原體中克隆的ADI有17個可被此程序修飾的賴氨酸。換言之，這17個賴氨酸都是ADI可通過生物相容性連接基團如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS與PEG相連接的可能位點。PEG也可以與ADI上的其他位點相連接。結合本發(fā)明的公開，這對于本領域的技術人員來說將是顯而易見的。
1到30個PEG分子可被共價連接到ADI上。優(yōu)選地，ADI被7到15個PEG分子修飾，更優(yōu)選地是9到12個PEG分子。易言之，精氨酸脫亞胺酶上伯氨基的大約30％到70％被PEG修飾，優(yōu)選為40％到60％，更優(yōu)選為45％到55％，最優(yōu)選為精氨酸脫亞胺酶上50％的伯氨基被PEG修飾。當PEG與ADI末端共價連接時，優(yōu)選只有1個PEG分子被應用。增加ADI上的PEG單位的數(shù)目能增加該酶的循環(huán)半衰期，然而增加ADI上的PEG單位的數(shù)目卻會減少該酶的比活性。因而，需要在這兩者之間達成平衡。從本發(fā)明公開的來看，這一點對于本領域的技術人員來說將是顯而易見的。
在本發(fā)明中，最優(yōu)選的生物相容性連接基團的一個共同特點是它們都通過順丁烯二酰亞胺基團與精氨酸脫亞胺酶的伯胺相連。一旦與精氨酸脫亞胺酶偶聯(lián)，SS-PEG就在緊鄰PEG處有一酯連接，它可使此位點對血清酯酶敏感，可在體內(nèi)使PEG從ADI上釋放出來。SPA-PEG和PEG2-NHS沒有酯連接，因此它們對血清酯酶不敏感。
在本發(fā)明中，特別的連接基團似乎并不影響PEG-ADI的循環(huán)半衰期或其酶比活性。然而，在本發(fā)明中應用生物相容性基團是重要的。與蛋白質(zhì)相連的PEG或者是一個單鏈，如在SS-PEG、SPA-PEG或SC-PEG中，或者也可應用PEG的支鏈，如在PEG2-NHS中。在本發(fā)明中優(yōu)選的連接基團的結構式列于下。
SS-PEG
SPA-PEG
PEG2-NHS
本發(fā)明的化合物的治療有效劑量是能有效地抑制腫瘤生長的劑量。一般地，治療以小劑量開始，以便不斷增加劑量直到達到此條件下的最適。一般地，本發(fā)明的化合物的治療劑量可以從大約1到大約200mg/kg，每星期兩次到每兩星期一次。例如，劑量可以是2ml靜脈內(nèi)注射劑形式的大約1mg/kg每星期一次，到大約20mg/kg每3天一次。ADI-SS-PEG5,000的最適劑量可以是大約每星期兩次，而ADI-SS-PEG20,000的最適劑量可以是從大約每星期一次到每兩星期一次。在注射前，PEG-ADI可與磷酸鹽緩沖液或為本領域的熟練人員所熟知的任何其他適合的溶液混合。PEG-ADI制劑可如需求的那樣以固體(冷凍干燥)或液體制劑形式給藥。
本發(fā)明的方法可包括在體內(nèi)或在體外的應用。在體外的應用(包括細胞培養(yǎng)的應用)中，可將在此描述的化合物加到培養(yǎng)的細胞中去并接著溫育。應用在該領域中周知的抗體生產(chǎn)技術，本發(fā)明的化合物也可用來促進單克隆和/或多克隆抗體的產(chǎn)生。單克隆和/或多克隆抗體可被廣泛用于診斷，這對于本領域的熟練人員來說是顯然的。
在體內(nèi)施用本發(fā)明的化合物的方法依賴于要達到的目的。正如本領域的熟練人員所認識到的那樣，施用本發(fā)明的化合物PEG-ADI可通過以下途徑完成，例如口腔內(nèi)、鼻腔內(nèi)、腹膜內(nèi)、腸胃外、靜脈內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、間質(zhì)內(nèi)(interstitally)、動脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、滑膜腔內(nèi)(intrasynoial)、經(jīng)上皮、經(jīng)皮施用來完成。
實施例本發(fā)明在以下的實施例中得到進一步的說明。這些實施例只是為了說明的目的，而不是用來限定本發(fā)明的范圍。實施例1重組ADI的生產(chǎn)從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)得到精氨酸支原體(ATCC23243)、人形支原體(ATCC23114)、關節(jié)炎支原體(ATCC23192)培養(yǎng)物。
從精氨酸支原體、人形支原體和關節(jié)炎支原體中克隆出精氨酸脫亞胺酶，在大腸桿菌中表達，方法如S.Misawa等在J.Biotechnology，36145-155(1994)中的描述，在此將該文獻全部引為參考。圖1給出了從每一個上述種而來的精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列。上面的氨基酸序列被標示為ADIPROT，是從精氨酸支原體來的；中間的氨基酸序列被標示為ARTADIPRO，是從關節(jié)炎支原體來的；下面的氨基酸序列被標示為HOMADIPRO，是從人型支原體來的。每一種氨基酸序列都有多于96％的保守性。通過本領域的熟悉人員知曉的方法鑒定的各個蛋白質(zhì)的特征，包括酶的比活性、Km、Vmax和最適pH，都揭示出它們是生化不可區(qū)分的。最適pH應用檸檬酸鹽緩沖液(pH5-6.5)、磷酸鹽緩沖液(pH6.5-7.5)和硼酸鹽緩沖液(pH7.5-8.5)來確定。通過把酶與不同濃度的精氨酸溫育并定量生成的瓜氨酸的方法來測定Km和Vmax。不同酶的Km為大約0.02到0.06μM，Vmax為大約15-20μmol/分鐘/mg，這些數(shù)值都在各自的標準誤差之內(nèi)。
用聚合酶鏈式反應擴增精氨酸脫亞胺酶基因，應用由如T.Ohno等在Infect.Immun.，583788-3795(1990)(在此全部引為參考)中公布的精氨酸支原體的序列衍生的如下的引物對5’-GCAATCGATGTGTATTTGACAGT-3’5’-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3’
聚合酶鏈式反應產(chǎn)品作為Bam H1-Hind III片段被克隆到表達質(zhì)粒pQE16上去。DNA序列分析表明本片段與如上由T.Ohno等在Infect.Immun.，(同上)中描述的具有相同的序列。在支原體中編碼色氨酸的ADI基因內(nèi)的5個TGA密碼子在大腸桿菌中進行基因表達前通過寡聚核苷酸定點誘變被改變?yōu)門GG密碼子，這一技術由例如J.R.Sayers等在Biotechniques，13592-596(1992)中給出。在內(nèi)涵體中表達的重組ADI占細胞總蛋白10％的水平。
來自上面三種支原體的各種蛋白質(zhì)具有大約95％的同源性，并可用柱層析純化。從1升發(fā)酵液中可提取大約1.2克純蛋白。重組ADI在37℃下能穩(wěn)定2個星期，在4℃下至少能保存8個月。應用為本領域的熟練人員所知曉的方法測定，該蛋白對精氨酸有高親和性(0.04μM)，最適生理pH為從7.2到7.4。實施例2重組ADI的復性與純化用被較少修飾的ADI蛋白質(zhì)復性，其方法被Misawa等在J.Biotechnology，36145-155(1994)中描述，在此將其全部引做參考。100克細胞漿被重新懸浮于800ml 10mM K2PO4(pH7.0)、1mM EDTA(緩沖液1)中，細胞在微流量計(Microfluidics Corporation，Newton，MA)中通過兩次以打散細胞。加入Triton X-100使其終濃度為4％(v/v)。在4℃將勻漿物攪拌30分鐘，接著用13,000g離心30分鐘。收集沉淀并重新懸浮在含有0.5％ Triton X-100的1升緩沖液1中。用具有100kD截留率的空纖維柱(Microgon Inc.，Laguna Hills，CA)將溶液對5倍體積的變性緩沖液(50mM Tris HCl，pH8.5，10mM DTT)透濾。加入鹽酸瓜氨酸使其終濃度為6M，在4℃下將溶液攪拌15分鐘。將溶液在重折疊緩沖液1(10mM K2PO4，pH7.0)中稀釋100倍，在15℃下攪拌48小時，用15,000g離心去除顆粒。
得到的上清液在事先用重折疊緩沖液平衡過的Q Sepharose PastFlow(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)柱上濃縮。用含有0.2M NaCl的重折疊緩沖液洗脫ADI。此純化程序產(chǎn)生ADI蛋白質(zhì)，由SDS-PAGE測定其純度大于95％。從1千克細胞漿中能產(chǎn)生8克純的復性ADI蛋白質(zhì)，這相當于每升發(fā)酵液中產(chǎn)生200mg純化的ADI。
用由Oginsky等在Meth.Enzymol.，(1957)3639-642中描述的微修飾法測定ADI的活性。把在0.1M Na2PO4，pH7.0(BUN測定緩沖液)中的10μl樣品置于96孔微滴定培養(yǎng)板中，加入40μl在BUN測定緩沖液中的0.5mM精氨酸，蓋上培養(yǎng)板，在37℃下溫育15分鐘。加入20μl完全BUN試劑(Sigma Diagnostics)，把培養(yǎng)板在100℃下溫育10分鐘。接著把培養(yǎng)板冷卻至22℃，并在490nm下用微滴定板讀數(shù)儀(Molecular Devices，Inc.)分析。每分鐘能把1μmol L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸的酶量定為1.0IU。用Pierce考馬斯藍蛋白測定試劑(PierceCo.，Rockford，IL)測定蛋白濃度，用牛血清白蛋白做標準。
純化的ADI制劑的酶活性為15-25IU/mg。實施例3PEG和ADI的連接PEG在100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中與ADI共價連接。簡言之，在磷酸鹽緩沖液中的ADI與過量100摩爾的PEG混合。在室溫下攪拌反應1小時，接著把混合物透析以除去未結合的PEG。
第一個實驗用來評估在PEG-ADI復合物中應用的連接基團的作用。PEG10,000和ADI通過四種不同的連接基團形成共價鍵酯基或順丁烯二酰亞胺基團，包括SS、SSA、SPA和SSPA，在此PEG的總體重均分子量為5,000、10,000、12,000、20,000、30,000和40,000；環(huán)氧基，環(huán)氧-PEG，在此PEG的總體重均分子量為5,000；支鏈PEG基，PEG2-NHS，在此PEG的總體重均分子量為10,000、20,000和40,000。
把得到的復合物5.0IU注射到小鼠中去(每組5只小鼠)。為確定血清中的精氨酸水平，小鼠被從眼眶后的血管叢處放血(100μl)。收集后立即加入等體積50％(w/v)的三氯乙酸。離心(13,000g，30分鐘)除去沉淀，把上清取出并貯存在-70℃。用從Beckman Instruments得到的自動氨基酸分析儀和試劑分析樣品，使用制造商提供的操作程序。此方法對瓜氨酸的靈敏度極限為約2-6μM，測量值的重復性在8％之內(nèi)。用氨基酸分析來確定血清精氨酸的量。正如圖3的結果所顯示的，共價連接PEG和ADI的連接基團并沒有令人欣喜的使ADI降低體內(nèi)血清精氨酸水平的效果。易言之，連接基團對實驗結果并不是必需的，除了在體內(nèi)的應用中必須使用無毒的連接基團之外。
第二個實驗用來衡量連接基團和PEG的分子量在體內(nèi)對血清瓜氨酸的作用。把總量為5.0IU的ADI和PEG-ADI的各種組合施給小鼠(每組5只)。為確定血清中的精氨酸水平，小鼠被從眼眶后的血管叢處放血(100μl)。收集后立即加入等體積50％(w/v)的三氯乙酸。離心(13,000g，30分鐘)除去沉淀，把上清取出并貯存在-70℃。用從Beckman Instruments得到的自動氨基酸分析儀和試劑分析樣品，使用制造商提供的操作程序。此方法對瓜氨酸的靈敏度極限為約2-6μM，測量值的重復性在8％之內(nèi)。確定瓜氨酸的量，用曲線下的面積大致表示，為μmol天。
在圖4中，空白圓圈表示由天然ADI產(chǎn)生的瓜氨酸量，實心圓圈是ADI-SC-PEG，空白四方形是ADI-SS-PEG，空白三角形是ADI-SPA-PEG，實心三角是支鏈PEG-NHS-PEG2。圖4的結果表明PEG的分子量決定PEG-ADI組合的效果。PEG-ADI復合物的有效性并不必然地基于PEG結合到ADI上的方法和手段，除了在體內(nèi)的應用中必須使用生物相容性連接基團外。
圖4的結果也顯示PEG的最適分子量為20,000。盡管PEG30,000在藥物動力學上看起來比PEG20,000優(yōu)越，但PEG30,000更不溶解，這使它的應用更加困難。依賴于酶活性恢復的產(chǎn)量，對于PEG5,000和PEG12,000大約是90％，對于PEG20,000大約是85％，對于PEG30,000大約是40％。因而，正如由瓜氨酸產(chǎn)量所決定的那樣，PEG20,000是在產(chǎn)量和循環(huán)半衰期之間的最佳平衡。
在第三個實驗中，決定了血清精氨酸缺乏和瓜氨酸產(chǎn)生對ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的劑量效應。小鼠(每組5只)被單次注射0.05IU、0.5IU或5.0IU ADI-SS-PEG5,000或ADI-SS-PEG20,000。在所示的時間如上所述收集血清，通過氨基酸分析來定量血清精氨酸(圖5A和5C)和血清瓜氨酸(5B和5D)。兩種制劑都誘導一種劑量依賴型的血清精氨酸水平降低和血清瓜氨酸水平增高。然而，由ADI-SS-PEG20,000誘導的效果比由ADI-SS-PEG5,000誘導的更好，持續(xù)期也更長。實施例4ADI介導的細胞毒性的選擇性用一些人類腫瘤來展示精氨酸脫亞胺酶介導的細胞毒性的選擇性。特別地，人類腫瘤在體外被用來檢驗對ADI-SS-PEG5,000(50ng/ml)的敏感性。7天后檢定培養(yǎng)物的存活。被定義為“被抑制的”培養(yǎng)物，必須有多于95％的細胞吸收臺盼藍染料。正常細胞的宿主也被檢驗，包括內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、上皮細胞和成纖維細胞，并沒有一個被ADI-SS-PEG5,000抑制。盡管精氨酸脫亞胺酶對于正常細胞和大多數(shù)腫瘤細胞沒有明顯的毒性，但ADI-SS-PEG5,000能大大地抑制從ATCC、MSKCC和歐洲商業(yè)性取得的所有人類黑色素瘤和肝細胞瘤。
表1精氨酸脫亞胺酶細胞毒性的選擇性
在一組平行的實驗里，mRNA被從腫瘤中分離出來。用人精氨琥珀酸合成酶cDNA做探針的Northern印跡顯示在對精氨酸脫亞胺酶治療的敏感性和不能表達精氨琥珀酸合成酶之間存在完全的一致性。此數(shù)據(jù)暗示ADI的細胞毒性是因其不能誘導精氨琥珀酸合成酶導致的。因而，這些細胞不能從瓜氨酸合成精氨酸，不能合成生長所必須的蛋白質(zhì)。實施例5循環(huán)半衰期Balb C小鼠(每組5只)被靜脈內(nèi)單劑量注射5.0IU的天然精氨酸脫亞胺酶或者用聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶的不同制劑，如圖3A與3B所示。為確定血清中的精氨酸與瓜氨酸水平，小鼠被從眼眶后的血管叢處放血(100μl)。收集后立即加入等體積50％(w/v)的三氯乙酸。離心(13,000g，30分鐘)除去沉淀，把上清取出并貯存在-70℃。用從Beckman Instruments得到的自動氨基酸分析儀和試劑分析樣品，使用由制造商提供的操作程序。此方法對精氨酸的靈敏度極限為約6pM，測量值的重復性在8％之內(nèi)。
在單劑量施用天然ADI(實心圓圈)或ADI-SS-PEG(空白三角)后測量血清精氨酸水平的劑量依賴性下降，如圖2A中實心圓圈所示；和血清瓜氨酸水平的上升，如圖2B中空白三角所示。然而，血清精氨酸的下降和血清瓜氨酸的上升都是短暫的，它們很快恢復到正常。精氨酸缺乏的半衰期簡列于下表。
表2血清精氨酸缺乏的半衰期
本實驗表明正常細胞和組織能夠在細胞內(nèi)把瓜氨酸轉回到精氨酸，而黑色素瘤和肝細胞瘤因為缺少精氨琥珀酸合成酶卻不能。實施例6PEG修飾的ADI的抗原性為測定天然ADI、ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性，應用由例如Park在Anticancer Res.(同上)和Kamisaki在J.Pharmacol.Exp.Ther.(同上)中描述的程序。簡言之，Balb C小鼠(每組5只)被靜脈內(nèi)每星期注射大約0.5IU(100μg蛋白質(zhì))天然ADI、ADI-SS-PEG5,000或ADI-SS-PEG20,000，共12星期。在實驗開始和在第4、8、12周時，動物被從眼眶后的血管叢處放血(0.05ml)。血清被分離出來并貯存在-70℃。用ELISA測定抗ADI的IgG的滴度。50μg ADI被加到96孔微滴定培養(yǎng)板的每一孔中，在室溫下溫育4小時。用PBS洗培養(yǎng)板，接著用胎牛血清(1mg/ml)進行包被以封閉非特異蛋白結合位點，并貯存于4℃。第二天把小鼠的血清稀釋并加到孔中。一小時后，用PBS洗培養(yǎng)板，把與過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗鼠IgG加到孔中。把培養(yǎng)板溫育30分鐘，接著用微滴定培養(yǎng)板閱讀儀測定所得的UV吸收。滴度被定義為導致比背景吸收(大約0.50OD)增加兩倍的血清的最高稀釋度。
結果示于圖6?？瞻讏A圈代表從注射天然ADI的動物中得到的數(shù)據(jù)，有非常的抗原性。實心圓圈代表從注射ADI-SS-PEG5,000的動物中得到的數(shù)據(jù)，而空白三角代表從注射ADI-SS-PEG20,000的動物中得到的數(shù)據(jù)。從圖6可以看到，ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000比天然ADI具有顯著少的抗原性。例如，4次的注射天然ADI就導致106的滴度，而4次任何的PEG-ADI制劑注射都沒能產(chǎn)生任何可測的抗體。然而，在8次注射之后，ADI-PEG5,000具有大約102的滴度，而ADI-PEG20,000卻沒能誘導免疫系統(tǒng)的如此反應，直到12次注射之后。此結果顯示把PEG結合到ADI上鈍化了對蛋白質(zhì)的免疫反應。實施例7人黑色素瘤的腫瘤抑制測定PEG-ADI在裸鼠中對人黑色素瘤(SK-Mel 28)生長的作用。裸鼠(每組5只)被注射106個SK-mel 2人黑色素瘤細胞，允許細胞生長直到腫瘤直徑到達大約3-5mm。小鼠或不被處理(空白圓圈)，或用5.0IU的ADI-SS-PEG5,000(實心三角)、ADI-SS-PEG12,000(空白三角)或ADI-SS-PEG20,000(實心圓圈)每星期處理一次，共處理12星期。每星期測量腫瘤大小，腫瘤的平均直徑示于圖7。
圖8表示ADI-SS-PEG20,000對在裸鼠體內(nèi)生長的三種人黑色素瘤(SK-mel 2，SK-mel 28，M24-met)的作用。允許腫瘤生長直到其直徑大約為3-5mm。其后，動物被每星期注射一次5.0IU的ADI-SS-PEG20,000。結果示于圖8，表明PEG-ADI抑制腫瘤生長，使腫瘤慢慢縮小并消失。因為腫瘤沒有精氨琥珀酸合成酶，不能合成蛋白質(zhì)(因為ADI消除了精氨酸而腫瘤不能制造它)，因而使細胞“饑餓致死”。
因為M24-met人黑色素瘤是高度轉移性的，注射M24-met人黑色素瘤細胞的動物在處理后4周被處死，并確定動物肺中轉移灶的數(shù)目。對照動物平均有32個轉移灶，而用ADI-SS-PEG20,000處理的動物卻沒有任何轉移灶。此結果似乎表明ADI-SS-PEG20,000不僅抑制原發(fā)性黑色素瘤的生長，也同時抑制轉移灶的形成。
有趣的是，注意到在超過200只被試動物中，在對照組中的平均轉移灶數(shù)目為49±18，而只在1只被處理的動物中發(fā)現(xiàn)一個單一轉移灶被發(fā)現(xiàn)。實施例8人黑色素瘤的腫瘤抑制檢測PEG5,000-ADI在體內(nèi)抑制人肝細胞瘤生長的能力。裸鼠(每組5只)被注射106SK-Hep 1人肝細胞瘤細胞。腫瘤被允許生長兩星期，接著用5.0IU的SS-PEG5,000-ADI(實心圓圈)、SS-PEG12,000-ADI(實心三角)或SS-PEG20,000-ADI(空白三角)將動物每星期處理一次。結果示于圖9。未處理的動物(空白圓圈)都在3星期內(nèi)死去。相比較，用ADI處理的動物有一個很較長的壽命，如圖9中可見。所有存活的小鼠在6個月后被安樂死，尸檢表明它們都沒有腫瘤。
令人驚奇的是，PEG5,000-ADI在體內(nèi)抑制肝細胞瘤生長是最有效的。這種現(xiàn)象發(fā)生的機制是未知的。本發(fā)明不被任何理論所束縛，看起來用SS-PEG5,000-ADI配制的蛋白質(zhì)在肝中被隔離。較大分子量的PEG卻不如此，這可能是因為肝內(nèi)皮的獨特性和空間(窗)的尺寸使得較大分子量的PEG-ADI偶合物被排除在外。實施例9對人的應用PEG5,000-ADI和PEG20,000-ADI在體外與正常人血清溫育，其對精氨酸濃度的作用由氨基酸分析確定，發(fā)現(xiàn)此酶有完全的活性，并能以涉及小鼠的實驗中相同的動力學降解所有可測的精氨酸。反應用0.1ml體積在37℃反應1小時。并且，在人血清中的精氨酸和瓜氨酸水平與在小鼠中發(fā)現(xiàn)的相同。PEG-蛋白在人體中比在小鼠中循環(huán)更長的時間。例如，與腺苷脫亞胺酶、天冬酰氨酶、葡萄糖腦苷脂酶(glucocerbrocidase)、尿酸酶、血紅蛋白和超氧化物歧化酶偶聯(lián)的PEG的循環(huán)半衰期都比相同制劑在小鼠中的循環(huán)半衰期長5到10倍。這在過去意味著對人類的劑量通常是在小鼠中應用的劑量的1/5到1/10。依此，PEG-ADI在人體中應該比它在小鼠內(nèi)循環(huán)更長的時間。
在此描述的每一種專利、專利申請和公開物的全部都在此被引為參考。
本發(fā)明的各種改變，除了在此描述的以外，結合本說明書，對于本領域中的熟練人員將是顯而易見的。這些改變也同樣落在所附的權利要求書的范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種化合物，該化合物包括通過連接基團與聚乙二醇共價相連的精氨酸脫亞胺酶，其中聚乙二醇具有范圍在大約12,000到大約40,000的總體重均分子量。
2.權利要求1的化合物，其中所說的連接基團是順丁烯二酰亞胺基團。
3.權利要求2的化合物，其中所說的順丁烯二酰亞胺基團是琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、羧甲酸琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺或其組合。
4.權利要求3的化合物，其中所說的順丁烯二酰亞胺基團是琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯或其組合。
5.權利要求1的化合物，其中所說的精氨酸脫亞胺酶來自支原體屬的微生物。
6.權利要求5的化合物，其中所說的微生物選自由精氨酸支原體、人型支原體、關節(jié)炎支原體或其組合組成的一組微生物。
7.權利要求1的化合物，其中所說的精氨酸脫亞胺酶與大約7個到大約15個聚乙二醇分子共價連接。
8.權利要求7的化合物，其中所說的精氨酸脫亞胺酶與大約9個到大約12個聚乙二醇分子共價連接。
9.權利要求1的化合物，其中所說的聚乙二醇具有在大約12,000到大約30,000范圍內(nèi)的總體重均分子量。
10.一種延長精氨酸脫亞胺酶的循環(huán)半衰期的方法，該方法包括通過連接基團把所說的精氨酸脫亞胺酶與聚乙二醇共價相連來修飾所說的精氨酸脫亞胺酶，其中聚乙二醇具有在大約12,000到大約40,000范圍內(nèi)的總體重均分子量。
11.一種治療患者的腫瘤的方法，該方法包括施用治療有效量的權利要求1的化合物給所說的患者。
12.權利要求11的方法，其中所說的腫瘤是黑色素瘤。
13.權利要求12的方法，其中所說的聚乙二醇具有大約20,000的總體重均分子量。
14.權利要求12的方法，其中所說的連接基團是順丁烯二酰亞胺基團。
15.權利要求14的方法，其中所說的順丁烯二酰亞胺基團是琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、羧甲酸琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺或其組合。
16.一種治療患者的肝細胞瘤的方法，該方法包括施用治療有效量的包括通過連接基團與聚乙二醇共價連接的精氨酸脫亞胺酶的化合物給所說的患者，其中聚乙二醇具有大約5,000的總體重均分子量。
17.權利要求16的方法，其中所說的連接基團是順丁烯二酰亞胺基團。
18.權利要求17的方法，其中所說的順丁烯二酰亞胺基團是琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、羧甲酸琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺或其組合。
19.權利要求11的方法，其中所說的腫瘤是肉瘤。
20.一種治療與抑制患者的腫瘤轉移的方法，該方法包括施用治療有效量的權利要求1的化合物給所說的患者。
21.一種包括通過連接基團與聚乙二醇共價連接的精氨酸脫亞胺酶的化合物，其中聚乙二醇具有在大約1,000到大約40,000范圍內(nèi)的總體重均分子量，其中連接基團選自順丁烯二酰亞胺基團、酰胺基、亞酰胺基、氨基甲酸酯基、酯基、環(huán)氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪氨酸基、半胱氨酸基、組氨酸基和其組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及用聚乙二醇改性的精氨酸脫亞胺酶、治療癌癥的方法及治療和/或抑制腫瘤轉移的方法。
文檔編號A61K38/50GK1255944SQ98805066
公開日2000年6月7日 申請日期1998年5月12日 優(yōu)先權日1997年5月12日
發(fā)明者邁克·A·克拉克 申請人:鳳凰藥理學公司