專利名稱：高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株及用它生產(chǎn)l-瓜氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株及用它生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase, ADI),是一種能夠分解L-精氨酸的蛋白質(zhì)。學(xué)者們首先從支原體Mycoplasma arginini提取物中純化得到ADI,研究發(fā)現(xiàn)該酶可以抑制動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)，精氨酸脫亞胺酶不僅能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的體外增殖，還能夠抑制體內(nèi)的惡性腫瘤的增生。精氨酸脫亞胺酶作為一種新型抗腫瘤物質(zhì)，已經(jīng)受到越來(lái)越多研究者的重視。據(jù)報(bào)道，精氨酸脫亞胺酶能催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-瓜氨酸，該酶促反應(yīng)僅一步， 可有效避免L-瓜氨酸全合成途徑中復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)作用，使L-瓜氨酸可以積累到較高的濃度。L-瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，血管舒張作用，穩(wěn)定血壓以及診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，與L-鳥(niǎo)氨酸、L-精氨酸等合用于治療高氨血癥，應(yīng)用前景十分廣闊。由此可見(jiàn)，精氨酸脫亞胺酶作用廣泛，具有非常重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。此前所報(bào)道的精氨酸脫亞胺酶大多來(lái)自于支原體，而支原體是病原微生物，容易引起病害，有較大的危險(xiǎn)性，且支原體為寄生性微生物，培養(yǎng)難度較大，不利于精氨酸脫亞胺酶的發(fā)酵生產(chǎn)。本文中所研究的精氨酸脫亞胺酶生產(chǎn)菌株是糞鏈球菌，該菌株安全性好，易于發(fā)酵制備，有利于精氨酸脫亞胺酶的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。但是目前的研究結(jié)果仍未達(dá)到令人滿意的水平，主要是由于菌種活力較低，難以工業(yè)化應(yīng)用。誘變選育是利用物理或化學(xué)因素處理微生物細(xì)胞群體，促使其中少數(shù)細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)(主要是DNA)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引發(fā)微生物遺傳性狀發(fā)生變化，然后設(shè)法從群體中篩選出少量?jī)?yōu)良突變菌株的過(guò)程。誘變篩選高產(chǎn)菌株一直是國(guó)內(nèi)外科研工作者在這方面研究的熱點(diǎn)方法。紫外誘變相對(duì)于其他幾種射線(X射線、0射線、Y射線等)來(lái)說(shuō)最易取材，對(duì)人體的傷害也最小，是最簡(jiǎn)單方便而且又十分有效的一種物理誘變方法?；瘜W(xué)誘變是使用化學(xué)誘變劑與生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生作用，并改變其結(jié)構(gòu)，使其后代發(fā)生變異的一種誘變方法?；瘜W(xué)誘變劑誘發(fā)突變率高，而且染色體畸變較少，對(duì)處理材料損傷輕，有的化學(xué)誘變劑只限于DNA的某些特定部位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有精氨酸脫亞胺酶生產(chǎn)菌種的缺陷，解決比酶活低的問(wèn)題。本發(fā)明提供一種利用紫外線、硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法對(duì)精氨酸脫亞胺酶生產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變育種，篩選得到了一株高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶的突變株，并且對(duì)該突變株進(jìn)行發(fā)酵，利用精氨酸脫亞胺酶能催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化成為L(zhǎng)-瓜氨酸的性質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)新生成L-瓜氨酸的量，來(lái)計(jì)算精氨酸脫亞胺酶的活力，發(fā)現(xiàn)突變株的酶活力有了很大的提高。本發(fā)明以糞鏈球菌(streptococcus faecalis)ATCC 10180為出發(fā)菌株,利用紫外線、硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法進(jìn)行誘變育種，篩選得到了一株高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶的突變株，即幾鏈球菌(streptococcus faecalis)BM-2。該菌株已于2011年06月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia :北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4990。本發(fā)明幾鏈球菌(streptococcusfaecalis)BM-2 CGMCC No. 4990 具有以下微生物學(xué)特性菌體直徑在0. 5-2 iim之間，固體培養(yǎng)物主要以雙球菌為主，也有少量呈3-5個(gè)排列的短鏈，液體培養(yǎng)物以長(zhǎng)鏈為主；菌落均為圓形、乳白色，表面微凸?jié)駶?rùn)，邊緣整齊，半透明，直徑I _2mm。本發(fā)明的幾鏈球菌(streptococcusfaecalis)BM-2CGMCC No. 4990 的培養(yǎng)及發(fā)酵(I)固體培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基(后者不含瓊脂)由下列重量份的組分組成
酪蛋白胨5-50份、牛肉膏5-50份、酵母提取物1-30份、葡萄糖1_30份、乙酸鈉1-30份、檸檬酸二銨1-30份、吐溫801-30份、磷酸氫二鉀1-30份、七水硫酸鎂0. 1_1份、一水硫酸錳0. 01-0. I份、瓊脂10-50份和水1000份；培養(yǎng)條件pH 6. 0-8. 0，培養(yǎng)溫度為25-40°C，培養(yǎng)時(shí)間20_60h。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成(重量份)葡萄糖5-50份、玉米漿2-50份、蛋白胨5-50份、牛肉膏2-50份、精氨酸2-50份、磷酸二氫鉀1-20份、七水硫酸鎂0. 1_1份、氯化鈉1_20份、一水硫酸錳0. 01-0. 05份和水1000份。以幾鏈球菌(streptococcusfaecalis)BM-2CGMCC No. 4990 生產(chǎn) L-瓜氨酸的方法，其特征是，(I)取一支保存有幾鏈球菌(streptococcus faecalis)BM-2CGMCC No. 4990 的甘油管，室溫放置至融化，吸取0. 5-lml菌液接種至一級(jí)種子搖瓶中，25-40°C培養(yǎng)20_60h ；(2)按照1%的接種量接種至二級(jí)種子搖瓶中，25_40°C培養(yǎng)20_60h ；(3)然后按照1-5 %的接種量接種至發(fā)酵罐中，培養(yǎng)20_60h，培養(yǎng)條件溫度25-40°C，轉(zhuǎn)速150-300r/min，pH 6. 0-7. 0 ;發(fā)酵過(guò)程中流加補(bǔ)料液(葡萄糖和氨水)，使發(fā)酵液中葡萄糖的含量不低于0. 5g/L，pH維持在6. 0-7. 0之間。本發(fā)明的有益效果是第一，本發(fā)明涉及的精氨酸脫亞胺酶突變菌株經(jīng)30L發(fā)酵罐小試發(fā)酵，產(chǎn)L-瓜氨酸量達(dá)到98g/L，較出發(fā)菌株產(chǎn)L-瓜氨酸量提高了 50 %，且連續(xù)發(fā)酵5批后，發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)L-瓜氨酸穩(wěn)定，產(chǎn)L-瓜氨酸水平明顯高于已經(jīng)報(bào)道的菌株，具有重要的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。第二，本發(fā)明提供的一株精氨酸脫亞胺酶高產(chǎn)突變株產(chǎn)酸量高，性狀穩(wěn)定，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，也為構(gòu)建基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例I高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株BM-2的選育(I)出發(fā)菌株ATCC 10180菌懸液的制備用無(wú)菌接種針挑取I環(huán)斜面保存的糞鏈球菌(streptococcus faecalis)ATCC10180菌株，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。活化后挑取一環(huán)新鮮菌體用無(wú)菌鹽水進(jìn)行稀釋，菌液濃度稀釋至IO7個(gè)/ml，得到菌懸液。固體培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基(后者不含瓊脂)由下列重量組分組成酪蛋白胨10份、牛肉膏20份、酵母提取物20份、葡萄糖20份、乙酸鈉10份、檸檬酸二銨5份、吐溫802份、磷酸氫二鉀2份、七水硫酸鎂0. I份、一水硫酸錳0. 05份、瓊脂20份和水1000份制備平板菌種的工藝條件pH 7. 0，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間24h。(2)出發(fā)菌株紫外線誘變吸取0. Iml稀釋好的菌懸液涂布在固體平板培養(yǎng)基上，紫外燈(功率20W，照射距離35cm)照射一定時(shí)間(2min)后，30°C下避光培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。選擇致死率在70-80%的平板上的邊緣平滑、大小均勻的菌落，進(jìn)行發(fā)酵搖瓶初篩試驗(yàn)。(3)紫外線突變菌株的發(fā)酵搖瓶初篩誘變后，從平板上挑選200株生長(zhǎng)良好的菌株接種至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌株，接入IOOml種子培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)24h。培養(yǎng)完畢，將種子液按照I %的比例接種至200ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，370C，200r/min培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液離心，棄沉淀，測(cè)定上清液中的L-瓜氨酸含量。從200株突變株中篩選到20株L-瓜氨酸產(chǎn)量提高的菌株，對(duì)20株菌進(jìn)行傳代試驗(yàn)，傳至第10代時(shí)，進(jìn)行30L罐試驗(yàn)。發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量份組分組成葡萄糖40份、玉米漿20份、蛋白胨5份、牛肉10份、精氨酸10份、磷酸二氫鉀5份、七水硫酸鎂0. 5份、氯化鈉2份、一水硫酸錳0. 02份和水1000份。(4)紫外線突變菌株的30L罐發(fā)酵復(fù)篩將紫外初篩后獲得的20株突變株在平板上活化，取平板上的單菌落接至200ml種子培養(yǎng)基中，37 °C，200r/min培養(yǎng)24h。向30L發(fā)酵罐中，按5 %的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)條件37°C，200r/min，pH7. 0，發(fā)酵到第5周期開(kāi)始流加補(bǔ)料液，使發(fā)酵液中葡萄糖的含量不低于0. 5g/L，pH值維持在6. 5-7. 0之間(截止到發(fā)酵結(jié)束，一般需要補(bǔ)加葡萄糖500g，補(bǔ)加20%氨水500ml)。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液中L-瓜氨酸產(chǎn)量。以L-瓜氨酸產(chǎn)量提高的菌株為出發(fā)菌株再次進(jìn)行紫外誘變，初篩、復(fù)篩。經(jīng)過(guò)三輪誘變篩選，最終得到一株L-瓜氨酸產(chǎn)量最高的突變株ATCC 10180-A,其L-瓜氨酸產(chǎn)量達(dá)到70g/L。(5)紫外誘變突變株菌懸液的制備，硫酸二乙酯誘變用無(wú)菌接種針挑取I環(huán)斜面保存的紫外誘變突變株ATCC10180-A，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。活化后挑取一環(huán)新鮮菌體用無(wú)菌鹽水進(jìn)行稀釋，菌液濃度稀釋至IO7個(gè)/ml，得到菌懸液。取2mL菌懸液，加至15mL pH6. 5的磷酸緩沖液，向其中加入0. 5mL硫酸二乙酯，35°C處理40min。取0. ImL處理液涂布于固體平板上，37°C培養(yǎng)24h后，從中選出生長(zhǎng)良好的菌落300株，接入斜面，4°C冰箱保存。(6)紫外誘變突變株的發(fā)酵搖瓶初篩
挑取一環(huán)斜面保存的菌株接入IOOmL種子培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量將種子培養(yǎng)基接入至200mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液離心，棄沉淀，測(cè)定上清液中L-瓜氨酸的含量。從300株突變株中篩選到10株L-瓜氨酸產(chǎn)量提高的菌株，對(duì)這10株菌進(jìn)行傳代試驗(yàn)，傳至第10代時(shí)，進(jìn)行30L罐試驗(yàn)。(7)紫外誘變突變株的30L發(fā)酵罐發(fā)酵復(fù)篩
將10株突變株在新鮮固體平板上活化，挑取平板上的單菌落接于200mL種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h。向30L發(fā)酵罐中，按5 %接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)條件溫度37°C，轉(zhuǎn)速200r/min，pH7.0。發(fā)酵到第8周期開(kāi)始流加補(bǔ)料液(截止到發(fā)酵結(jié)束，一般需要補(bǔ)加葡萄糖800g，補(bǔ)加20 %氨水800ml)。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液中L-瓜氨酸產(chǎn)量。經(jīng)篩選，得到一株L-瓜氨酸產(chǎn)量最高的突變株BM-2，其L-瓜氨酸產(chǎn)量達(dá)到98g/L。(8)將該突變株，進(jìn)行甘油管保存 先將該菌株涂于茄子瓶中，30 V培養(yǎng)30h后，用30 %的甘油將其保存于深冷管中，置于-70°C冰箱內(nèi)。(9)突變菌株微生物學(xué)特性菌體直徑在0. 5-2 U m之間，固體培養(yǎng)物 主要以雙球菌為主，也有少量呈3-5個(gè)排列的短鏈，液體培養(yǎng)物以長(zhǎng)鏈為主；菌落均為圓形、乳白色，表面微凸?jié)駶?rùn)，邊緣整齊，半透明，直徑1_2_。實(shí)施例2L-瓜氨酸生產(chǎn)方法種子培養(yǎng)基組成(重量份)酪蛋白胨7. 5份、牛肉膏10份、酵母提取物5份、葡萄糖10份、乙酸鈉5份、檸檬酸二銨2份、吐溫801份、磷酸氫二鉀4份、七水硫酸鎂0. 3份、一水硫酸錳0. 03份和水1000份；發(fā)酵培養(yǎng)基組成(重量份)葡萄糖5份、玉米漿2份、蛋白胨10份、牛肉膏30份、精氨酸20份、磷酸二氫鉀5份、七水硫酸鎂0. 5份、氯化鈉3份、一水硫酸錳0. 03份和水1000 份。(I)取一支甘油管，室溫放置至融化，吸取Iml菌液接種至一級(jí)種子搖瓶中，30°C培養(yǎng)30h后；(2)按照I %的接種量接種至二級(jí)種子搖瓶中，30°C培養(yǎng)30h ；(3)然后按照5%的接種量接種至30L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)35h，培養(yǎng)條件溫度30°C，轉(zhuǎn)速150r/min，pH 6. 5-7. O。發(fā)酵到第10周期開(kāi)始流加補(bǔ)料液(葡萄糖和氨水)，使發(fā)酵液中葡萄糖的含量不低于0. 5g/L，pH維持在6. 5-7. 0之間，截止到發(fā)酵結(jié)束，共補(bǔ)加葡萄糖800g，補(bǔ)加20%氨水800ml。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液中L-瓜氨酸含量可達(dá)到98. 5g/L。實(shí)施例3種子培養(yǎng)基組成(重量份)酪蛋白胨20份、牛肉膏5份、酵母提取物10份、葡萄糖20份、乙酸鈉10份、檸檬酸二銨10份、吐溫8010份、磷酸氫二鉀10份、七水硫酸鎂0. 5份、一水硫酸錳0. 05份和水1000份；發(fā)酵培養(yǎng)基組成(重量份)葡萄糖20份、玉米漿10份、蛋白胨20份、牛肉膏20份、精氨酸30份、磷酸二氫鉀10份、七水硫酸鎂0. 8份、氯化鈉10份、一水硫酸錳0. 02份和水1000份。(I)取一支甘油管，室溫放置至融化，吸取0. 5ml菌液接種至一級(jí)種子搖瓶中，37°C培養(yǎng)24h后;(2)按照I %的接種量接種至二級(jí)種子搖瓶中，37°C培養(yǎng)24h ；(3)然后按照3%的接種量接種至30L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)30h，培養(yǎng)條件溫度37°C，轉(zhuǎn)速170r/min，pH 6. 5-7. O。發(fā)酵到第8周期開(kāi)始流加補(bǔ)料液(葡萄糖和氨水)，使發(fā)酵液中葡萄糖的含量不低于0. 5g/L，pH維持在6. 5-7. 0之間，截止到發(fā)酵結(jié)束，共補(bǔ)加葡萄糖700g，補(bǔ)加20%氨水650ml。對(duì)發(fā)酵液中L-瓜氨酸進(jìn)行測(cè)定，含量達(dá)到99. 5g/L。
權(quán)利要求
1.糞鏈球菌(streptococcusfaecal is) BM-2CGMCC No. 4990。
2.以權(quán)利要求I所述的幾鏈球菌(streptococcusfaecal is) BM-2CGMCC No. 4990生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法，其特征是， (1)取一支保存有幾鏈球菌(streptococcusfaecal is) BM-2CGMCC No. 4990 的甘油管，室溫放置至融化，吸取0. 5-lml菌液接種至一級(jí)種子搖瓶中，25-40°C培養(yǎng)20_60h ； (2)按照1%的接種量接種至二級(jí)種子搖瓶中，25-40°C培養(yǎng)20-60h； (3)然后按照1-5%的接種量接種至發(fā)酵罐中，培養(yǎng)20-60h，培養(yǎng)條件溫度25-40°C，轉(zhuǎn)速150-300r/min，pH 6. 0-7. 0 ;發(fā)酵過(guò)程中流加補(bǔ)葡萄糖和氨水，使發(fā)酵液中葡萄糖的含量不低于0. 5g/L，pH維持在6. 0-7. 0之間。
3.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法，其特征是，所述步驟⑴和⑵的搖瓶種子培養(yǎng)基由下述重量份的組分組成酪蛋白胨5-50份、牛肉膏5-50份、酵母提取物1-30份、葡萄糖1-30份、乙酸鈉1-30份、檸檬酸二銨1-30份、吐溫801-30份、磷酸氫二鉀1_30份、七水硫酸鎂0. 1-1份、一水硫酸錳0. 01-0. I份和水1000份；所述步驟(3)的發(fā)酵培養(yǎng)基由下述重量份的組分組成葡萄糖5-50份、玉米漿2-50份、蛋白胨5-50份、牛肉膏2_50份、精氨酸2-50份、磷酸二氫鉀1-20份、七水硫酸鎂0. 1-1份、氯化鈉1-20份、一水硫酸錳.0.01-0. 05 份和水 1000 份。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株及用它生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法。本發(fā)明高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株為糞鏈球菌(streptococcus faecalis)BM-2 CGMCC No.4990。該菌株經(jīng)30L發(fā)酵罐小試發(fā)酵，產(chǎn)L-瓜氨酸量達(dá)到98g/L，較出發(fā)菌株產(chǎn)L-瓜氨酸量提高了50％，且連續(xù)發(fā)酵5批后，發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)L-瓜氨酸穩(wěn)定，產(chǎn)L-瓜氨酸水平明顯高于已經(jīng)報(bào)道的菌株，具有重要的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102703339SQ20111025042
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者劉倩, 王震, 鄭雄敏 申請(qǐng)人:山東恩貝生物工程有限公司