一株產(chǎn)精氨酸酶的菌株mqo-154的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)精氨酸酶的菌株MQ0-154,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鳥氨酸是1877年，杰弗在喂養(yǎng)安息香酸的鳥類尿液的水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的，因此得 名。它是細菌細胞膜和多肽類抗生素的組成成分，可以作為氨基酸輸液原料。能促進生長 激素的分泌，以協(xié)助機體代謝過多的脂肪，與精氨酸配合使用具有很好的減肥效果。在動物 體內(nèi)主要參與尿酸循環(huán)，對于體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重要作用。鳥氨酸是維持免疫系統(tǒng)和肝 功正常不可缺少的，能解毒氨及幫助肝再生，除在醫(yī)藥上作為試劑與注射液外，還通常與精 氨酸一起用作保肝、強身、解毒劑之類藥劑的原料。在皮膚和結(jié)締組織中含有高濃度的鳥氨 酸對于愈合和修復(fù)損傷組織非常有益。鳥氨酸是由體內(nèi)的精氨酸合成的，反過來，它又是瓜 氨酸、脯氨酸和谷氨酸的前體。鳥氨酸能將氨轉(zhuǎn)化為尿素與谷氨酰氨，因此補充鳥氨酸可為 解毒途徑提供酶的作用物。當(dāng)身體制造尿素，精氨酸便會被新陳代謝掉，身體轉(zhuǎn)為制造鳥氨 酸。用動物做的實驗證明鳥氨酸和精氨酸能令身體生產(chǎn)更多合成代謝的、促進生長的荷爾 蒙，包括胰島素和生長荷爾蒙，來促進肌肉生長。此外，鳥氨酸還用于配制恢復(fù)疲勞的發(fā)泡 飲料。
[0003] 在生物體內(nèi)，鳥氨酸能在尿素循環(huán)（Krebs. Henseleit循環(huán)）中起作用。尿素循 環(huán)分為4步，能夠?qū)⑸矬w內(nèi)天冬氨酸以及氨中的氮元素轉(zhuǎn)化為尿素，因而是生物體內(nèi)的 主要排氨方式。動物利用新陳代謝將體內(nèi)多余的氮元素轉(zhuǎn)化為尿素的主要器官是肝臟，體 內(nèi)的精氨酸在精氨酸酶的催化作用下水解，產(chǎn)生尿素和鳥氨酸。精氨酸水解后產(chǎn)生的鳥氨 酸，將會與氨甲酰磷酸反應(yīng)，進而產(chǎn)生瓜氨酸，瓜氨酸會進一步與天冬氨酸反應(yīng)而生成精氨 基琥珀酸，精氨基琥珀酸最終會在酶的催化作用下進一步被分解為延胡索酸以及精氨酸等 產(chǎn)物。由于該反應(yīng)的第一步是將精氨酸轉(zhuǎn)化為尿素，反應(yīng)到最后又生成了精氨酸，周而復(fù) 始，所以該反應(yīng)稱為尿素循環(huán)。由于目前全世界氨基酸產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，各地的科學(xué)家逐漸 認識到了 L-鳥氨酸的多種生物功能，其中日本最為突出，他們在20世紀(jì)40年代就開始對 L-鳥氨酸有所研究，在10-20年后就有許多文章發(fā)表，且多數(shù)是以專利的形式發(fā)表的。其 中包括鳥氨酸生產(chǎn)菌株、鳥氨酸高產(chǎn)菌株的選育、鳥氨酸的定量分析以及發(fā)酵法生產(chǎn)-鳥 氨酸的發(fā)酵條件優(yōu)化等，并且以專利文獻的形式發(fā)表。但是此期間在國內(nèi)卻很少聽到對 于-鳥氨酸的研究。直至1998年至2000年間，才報道有張克旭、潘韻和陳寧等人曾做過 關(guān)于L-鳥氨酸的菌種篩選和發(fā)酵方面的研究，有幾篇論文發(fā)表。與國外的研究相比，我國 L-鳥氨酸產(chǎn)業(yè)還處于起步階段，所研究的面很窄，而且研究進展較慢，目前僅發(fā)展到搖瓶試 驗階段，要進行工業(yè)化生產(chǎn)還需要我們進行大量的試驗和研究。和國外相比，我國對鳥氨酸 的研究有很大的差距，研究面窄，進展不大，僅限于搖瓶試驗，離工業(yè)化生產(chǎn)還有很長的路 要走。
[0004] 鳥氨酸是精氨酸的衍生物，在醫(yī)藥、保健、食品和化工等領(lǐng)域具有廣泛用途，市場 需求逐年增長，國內(nèi)外尚無大規(guī)模生產(chǎn)的報道。鳥氨酸生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法、微生物發(fā)酵 法和酶轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)法工藝繁雜，環(huán)境污染嚴(yán)重，副產(chǎn)物多且不易分離；微生物發(fā)酵法由于 缺乏性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株和生產(chǎn)工藝的系統(tǒng)研究，限制了該方法的發(fā)展和應(yīng)用。酶轉(zhuǎn)化法 是精氨酸在精氨酸酶的專一作用下生成鳥氨酸，產(chǎn)品純度高，是最具開發(fā)潛力的鳥氨酸生 產(chǎn)方法，優(yōu)質(zhì)廉價的精氨酸原料和轉(zhuǎn)化酶的獲得是該方法的關(guān)鍵。
[0005] 鳥氨酸的生產(chǎn)方法有4種：發(fā)酵法：酶法；化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解提取法。
[0006] (1)發(fā)酵法發(fā)酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對菌株的 質(zhì)誘變等處理，選育出各種營養(yǎng)缺陷型及氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株，以解除代謝調(diào)節(jié) 中的反饋抑制與阻遏，達到過量合成某種氨基酸的目的。發(fā)酵法包括直接發(fā)酵法和添加前 體發(fā)酵法。氨基酸產(chǎn)生菌是實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的前提，在氨基酸發(fā)酵的建立和改進中 起著非常重要的作用。根據(jù)氨基酸產(chǎn)生菌的遺傳性狀，可將其分為四類：第一類為直接使 用野生型菌株由糖和銨鹽發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，如谷氨酸；第二類為營養(yǎng)缺陷型變異株；第三 類為氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株；第四類為營養(yǎng)缺陷型（或滲漏型）兼結(jié)構(gòu)類似物抗件 變異株。應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)鳥氨酸因產(chǎn)酸水平較低實用價值不大。發(fā)酵法主要是利用精氨酸 (Arg-)或瓜氨酸（Cit-)的營養(yǎng)缺陷型突變株來積累鳥氨酸。Takay asu等在營養(yǎng)缺陷型 菌株的基礎(chǔ)上篩選到具有霉酚酸抗性的突變株，最高產(chǎn)量可達50g/L ;李環(huán)等利用混合菌 種發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸，產(chǎn)量達40g/L左右。發(fā)酵法原料成本低廉，但是發(fā)酵液中成分復(fù)雜，后 續(xù)分離困難。
[0007] (2)化學(xué)合成法化學(xué)法制備鳥氨酸根據(jù)化學(xué)反應(yīng)機理可分為有機合成法和精氨 酸水解法兩種。該法采用基礎(chǔ)化工原料合成鳥氨酸，原料來源廣泛且成本低。然而該法經(jīng) 過多步化學(xué)反應(yīng)合成，收率偏低；其原料中的氰化氫為劇毒致癌物，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)盡量避 免使用?；瘜W(xué)法合成出的鳥氨酸為DL型混合物，產(chǎn)物的手性拆分亦給該工藝增加了難度和 成本，這些方面都成為該法的主要缺陷所在。化學(xué)法是利用弱堿水解精氨酸得到鳥氨酸和 少量瓜氨酸?；瘜W(xué)法生產(chǎn)鳥氨酸產(chǎn)物為DL-型外消旋體，分離困難，生產(chǎn)過程不易控制，現(xiàn) 已被淘汰。
[0008] (3)蛋白質(zhì)水解提取法以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過酸、堿或酶水 解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種氨基酸的方法稱為水解法。隨著氨基酸生產(chǎn) 技術(shù)的進步。由蛋白質(zhì)水解法提取氨基酸這一古老的生產(chǎn)方法受到很大的沖擊，傳統(tǒng)的水 解法生產(chǎn)谷氨酸已失去其存在的價值。
[0009] (4)酶法酶法生產(chǎn)鳥氨酸就是利用動植物或微生物體內(nèi)的精氨酸酶作催化劑，水 解精氨酸，生成鳥氨酸和尿素；酶法生產(chǎn)氨基酸具有工藝簡單、周期短、耗能低、專一性強、 收率高等特點。L-精氨酸酶廣泛存在于動物的肝臟、植物、酵母和細菌中傳統(tǒng)的酶法制備鳥 氨酸方法，采用以牛肝為酶源，從牛肝中提取L-精氨酸酶，以成品精氨酸為合成底物轉(zhuǎn)化 鳥氨酸。酶法生產(chǎn)鳥氨酸專一性強，反應(yīng)條件溫和，避免采用氰化氫等有毒化學(xué)品，同時底 物轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品較純，有利于后續(xù)分離，但是精氨酸酶的來源不易，底物精氨酸的成本也 較高。如何獲得廉價的合成底物和酶源是這一方法能否成功應(yīng)用的關(guān)鍵。
[0010] 本技術(shù)采用發(fā)酵法生產(chǎn)的精氨酸純化液為原料，采用假單胞菌產(chǎn)生的精氨酸酶轉(zhuǎn) 化生產(chǎn)鳥氨酸，原料易得，酶成本低廉，結(jié)合固定化酶技術(shù)，可節(jié)約鳥氨酸生產(chǎn)成本，制造出 高質(zhì)量的產(chǎn)品。申請人多年來致力于發(fā)酵法生產(chǎn)精氨酸及其衍生物關(guān)鍵技術(shù)的研究，擁有 年產(chǎn)500噸的精氨酸生產(chǎn)線。鑒于國內(nèi)外市場需求強勁的現(xiàn)狀，申請人對鳥氨酸高效生物 制造技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化進行研究，創(chuàng)造性的提出了微生物酶法生產(chǎn)鳥氨。依托現(xiàn)有精氨酸技術(shù) 和原料優(yōu)勢，選育了生產(chǎn)鳥氨酸的精氨酸酶的高效菌株，以精氨酸為原料通過酶轉(zhuǎn)化獲得 鳥氨酸。本發(fā)明產(chǎn)品純度高易分離，同時克服了原料和酶昂貴不易獲取的劣勢，具有規(guī)模化 生產(chǎn)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)精氨酸酶的菌株MQ0-154,本發(fā)明經(jīng)過對蘇云金芽 孢桿菌（土壤分離）進行紫外誘變和化學(xué)誘變，篩選到一株精氨酸酶活性較高的菌株，經(jīng)分 離純化后獲得菌株MQ0-154,其保藏編號為：CGMCC No. 10728 ;保藏單位為：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期為：2015年4月21日；保藏地址為：北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0012] 菌株MQ0-154的生物特性為：該菌株在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，成乳白色菌落，濕 潤，表面無光澤，菌苔厚且不透明，菌落較大，邊緣不規(guī)則菌體呈桿狀，細胞長約3-4 μ m，直 徑1-2 μ m，具有內(nèi)生芽孢，不能運動，好氧或兼性厭氧。菌株MQ0-154的分類命名為蘇云金 芽抱桿菌（Bacillus thuringensis) 〇
[0013] 利用菌株MQ0-154制備精氨酸酶的方法，步驟如下：
[0014] (1)斜面培養(yǎng)：將菌