一種高溫細(xì)菌地衣芽孢桿菌及其防治煙葉霉變應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域和防治倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本 發(fā)明涉及利用一種人工分離的高溫微生物菌株，該微生物適用于防治倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變。 所述的高溫微生物是高溫細(xì)菌地衣芽孢桿菌JicAefli/hrazis)B-3。本發(fā)明還包 括該微生物防治倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 倉儲(chǔ)煙葉霉變是個(gè)全球性的問題，在煙葉倉儲(chǔ)損耗中占很大的比例，每年損失巨 大。目前，在防治倉儲(chǔ)煙葉霉變方面的技術(shù)措施主要有控制煙葉入庫水分含量、控制倉庫空 氣相對(duì)濕度、倉庫噴灑化學(xué)藥劑消毒、改善煙葉包裝條件等。這些措施雖然對(duì)減少煙葉霉變 起到一定作用，但在實(shí)際生產(chǎn)中，很難達(dá)到理想的倉儲(chǔ)環(huán)境條件，煙葉中的霉菌一旦遇到適 宜的溫濕度條件，煙葉就會(huì)發(fā)生霉變，并迅速蔓延。
[0003] 據(jù)報(bào)道，引起倉儲(chǔ)煙葉霉變的微生物類群有130屬231種，類群十分復(fù)雜，這可能 也是煙葉霉變防治難的原因。目前利用生物方法防治煙葉霉變的研究不多，使用化學(xué)藥劑 預(yù)防煙葉霉變有較好的效果，但隨著吸煙與健康問題的引入，化學(xué)藥劑污染環(huán)境以及殘留 問題急需解決，最好的防治方法就是進(jìn)行生物防治，研究表明微生物防治方法是一種比較 有效環(huán)保的方法，利用生物之間產(chǎn)生拮抗的機(jī)理，可以通過拮抗菌株抑制煙葉霉變。
[0004] 目前國內(nèi)相關(guān)研究還比較少，朱大恒等研究證明烤煙葉面優(yōu)勢(shì)菌種混合配制成生 物制劑（TFA)具有抑制煙葉霉變的作用，韓錦峰等將分離篩選到的幾株優(yōu)勢(shì)菌混合配制成 生物制劑（TFA)用于煙葉發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFA既可加速烤煙發(fā)酵，提高煙葉品質(zhì)，同時(shí)具有 抑制煙葉霉變的作用。李梅云等利用煙葉上的優(yōu)勢(shì)菌來抑制煙葉霉變菌株，但效果不穩(wěn)定。
[0005] 煙葉的儲(chǔ)藏階段會(huì)"發(fā)熱出汗"，它是煙葉的陳化階段，也是煙葉極易發(fā)生霉變的 時(shí)期。倉儲(chǔ)階段是在一個(gè)相對(duì)較高溫度下進(jìn)行的，關(guān)于高溫細(xì)菌防治煙葉霉變的研究鮮見 報(bào)道，高溫細(xì)菌可以在高溫環(huán)境中仍有很好的活力，可望獲得較好的煙葉防霉變效果。來源 于陳化煙葉的高溫細(xì)菌，在倉儲(chǔ)陳化煙葉上生長(zhǎng)有更強(qiáng)的適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)，抑制煙葉霉變有很 好的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，針對(duì)目前倉儲(chǔ)煙葉霉變不易得到很好控 制，提供一株適用于防治倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變的高溫微生物即地衣芽胞桿菌的新菌株，利用 該微生物地衣芽孢桿菌B-3菌株能夠防治倉儲(chǔ)煙葉霉變，提高倉儲(chǔ)陳化煙葉品質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明所述地衣芽孢桿菌B-3系從云南玉溪煙廠陳化煙葉中分離獲得，為一種防 治倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變的高溫細(xì)菌菌株，已在保藏單位保藏，保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏日期為2014年10月25日，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2014499。
[0008] 本發(fā)明所述高溫細(xì)菌地衣芽孢桿菌（ifeciWiAs JicAefli/hrazis ) B-3應(yīng)用于防治 倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變。
[0009] 本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌B-3菌株經(jīng)PCR技術(shù)，DNA測(cè)序儀分析，該菌株的16S rDNA序列由1430個(gè)堿基組成。
[0010] 用BLAST程序?qū)-3菌株的16S rDNA序列和GenBank中已登錄的16S rDNA序列 進(jìn)行核苷酸同源性比較，結(jié)果與已報(bào)道的地衣芽孢桿菌（SaciWiA? JicAefli/hrazid (登錄 號(hào)FJ641025)的16S rDNA序列同源性達(dá)到99. 9%。
[0011] 構(gòu)建了 B-3菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，B-3菌株與ifeciWiA? FJ641025聚在一起，鑒定菌株B-3為地衣芽抱桿菌（ifeciUiA? ) B-3。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于地衣芽孢桿菌B-3具有對(duì)人體安全健康和環(huán)境友好的特點(diǎn)，而 且在環(huán)境溫度25°C~55°C對(duì)防治倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變有顯著效果，特別在環(huán)境溫度高溫時(shí) 也對(duì)倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變有明顯防治效果。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌B-3在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)特征(正面)。
[0014] 圖2為本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌B-3菌體特征(掃描電鏡4000倍)。
[0015] 圖3為本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌B-3菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分支節(jié)點(diǎn)上的數(shù) 字表示經(jīng)過1000次bootstrap分析所支持的結(jié)果，線段標(biāo)尺0. 005表示0. 5%的序列差異 的分支長(zhǎng)度。 具體實(shí)施例
[0016] 本發(fā)明是采用從云南煙葉上分離到的高溫細(xì)菌一地衣芽孢桿菌B-3作為發(fā)酵菌 株，來防治倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變的效果測(cè)定。
[0017] 地衣芽孢桿菌B-3以煙葉液體培養(yǎng)基為原料，通過液態(tài)發(fā)酵方式，獲得菌液，配制 適宜比列，對(duì)烘烤煙葉進(jìn)行噴灑，菌液的細(xì)胞濃度10sCFU/mL，按5-15%質(zhì)量比的用量對(duì)烘 烤煙葉噴灑，可以達(dá)到防治倉儲(chǔ)陳化煙葉霉變的作用，也縮短了煙葉陳化時(shí)間。
[0018] 本發(fā)明的地衣芽孢桿菌分類命名為地衣芽孢桿菌JicAefli/hrazis) B-3，已在保藏單位保藏. 保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏單位地址：中國武漢武漢 大學(xué)，保藏日期為2014年10月20日，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2014499。
[0019] 1.地衣芽孢桿菌芽胞桿菌B-3的鑒定 地衣芽孢桿菌B-3 (CCTCC M 2014499)的菌落形態(tài)特征：在煙葉粉末培養(yǎng)基上，菌落 表面粗糙皺褶，扁平不透明，邊緣不整齊，粘著，擴(kuò)展，褐色，24h后菌落直徑為4mm，如圖1所 不。
[0020] 地衣芽孢桿菌B-3菌株的細(xì)胞形態(tài)特征： 革蘭氏染色呈陽性，桿狀，大小為0. 5 μπι~0. 9 μπιΧ 1. 70 μπι~3. 1 μπι，芽孢近中生， 能運(yùn)動(dòng)。如圖2所示。
[0021] 地衣芽孢桿菌芽胞桿菌Β-3的生理生化特征：生長(zhǎng)溫度20~70°C，適宜生長(zhǎng)溫度 25~55°C，pH4~9，明膠液化、硝酸鹽還原酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、蛋白水解、甲基紅試驗(yàn)、 V. P試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)均為陽性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陰性，能夠利用甘露糖、 阿拉伯糖、木糖產(chǎn)酸，不能利用麥芽糖、鼠李糖產(chǎn)酸。
[0022] 本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌B-3菌株經(jīng)PCR技術(shù)，DNA測(cè)序儀分析，該菌株的16S rDNA序列由1430個(gè)堿基組成。用BLAST程序?qū)-3菌株的16S rDNA序列和GenBank中已 登錄的16S rDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，結(jié)果與已報(bào)道的地衣芽孢桿菌（ 登錄號(hào)：FJ641025)的16S rDNA序列同源性達(dá)到99%，構(gòu)建了 B-3菌株的 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖3所示。鑒定其為地衣芽孢桿菌。
[0023] 所述的地衣芽胞桿菌B-3菌株的16S rRNA的核苷酸序列，如序列表所示。
[0024] 本發(fā)明的地衣芽胞桿菌B-3菌株的應(yīng)用方法是：菌種活化一種子液制備一發(fā)酵 培養(yǎng)一配制菌液適宜濃度一噴灑煙葉一倉儲(chǔ)(人工陳化）一卷煙。
[0025] 地衣芽胞桿菌B-3菌株的種子液體培養(yǎng)基（g/L):煙葉粉末1，酵母粉3,蛋白胨 5, NaCl 3, pH 自然。
[0026] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):煙葉粉末1，酵母粉3，蛋白胨5，NaCl 3，pH自然。
[0027] 稀釋液（g/L):煙葉粉末1. 5, pH自然。