一株誘導(dǎo)植物抗病抗逆的海洋生境芽孢桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體的說是由海洋生境獲得的芽孢桿菌CT2628 菌株（Bacillus sp.)通過人工誘變育種及培養(yǎng)發(fā)酵，活菌制劑對栽培植物具有防病、誘導(dǎo) 抗寒抗鹽的作用。該菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)， 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2014年3 月17日，保藏編號CGMCC No. 8921的CT2628菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前，環(huán)境保護(hù)和食品安全問題得到從中央到地方政府的普遍關(guān)注，減少化學(xué)農(nóng) 藥的使用無論對保護(hù)環(huán)境，還是對食品的源頭農(nóng)產(chǎn)品的安全，都具有重要的實(shí)際意義，生物 農(nóng)藥以其毒性低，與環(huán)境相容性好的特點(diǎn)，在世界范圍受到重視，活菌制劑是生物農(nóng)藥的一 大種類，這些有益菌通過定殖在植物體或寄生在害蟲體內(nèi)，發(fā)揮抑菌和殺蟲等作用。芽孢 桿菌是其中最著名的益生菌，作為各種酶的產(chǎn)生菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)；作為飼料添加劑 和醫(yī)藥，可抑制常見腸道病原菌，提高動物抗病能力，降低抗生素用量；其無毒、成本低、殺 蟲、抑菌能力強(qiáng)的特點(diǎn)，也為國內(nèi)外研發(fā)生物農(nóng)藥所關(guān)注，是世界產(chǎn)量最大的生物農(nóng)藥，新 資源、新用途的發(fā)現(xiàn)更是國內(nèi)外農(nóng)藥領(lǐng)域爭奪的對象。
[0003] 我國是土壤鹽漬化嚴(yán)重的國家之一，鹽漬化土壤總面積達(dá)3460萬公頃，相當(dāng)于耕 地的1/3,鑒于人多地少的特點(diǎn)，這些鹽漬化土壤仍被人們所利用栽種耐鹽作物，同時，早春 和晚秋的倒春寒每年也造成農(nóng)作物巨大損失。目前國內(nèi)外開發(fā)微生物農(nóng)藥由于生防菌都來 源于陸地，在含鹽量較高的土壤中難以存活、定殖，在鹽漬地土傳病害的防治效果較差；陸 地生防菌由于生境原因，較低的環(huán)境溫度限制了其發(fā)揮作用。近幾年受到國內(nèi)外關(guān)注的新 資源一海洋微生物，由于其原始生境的低溫高鹽特性，使其更易在鹽漬土壤和低溫環(huán)境發(fā) 揮作用，在新農(nóng)藥開發(fā)領(lǐng)域顯現(xiàn)其生境優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株誘導(dǎo)植物抗病、抗鹽、抗寒的海洋芽孢桿菌及可能在農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用，發(fā)明充分利用了海洋微生物這一特殊生境的天然資源，野生菌株已通過人 工誘變育種，生物學(xué)特性和農(nóng)藥活性穩(wěn)定，容易培養(yǎng)，培養(yǎng)周期短，操作方法簡便可行，對環(huán) 境沒有污染，所用原料廉價，生產(chǎn)成本低，開發(fā)前景好，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
[0005] 本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，為從海洋生境獲得海洋芽孢桿菌CT2628 菌株（Bacillus sp.)，經(jīng)人工誘變育種和培養(yǎng)條件優(yōu)化，其適宜的人工培養(yǎng)發(fā)酵的條件 為：
[0006] 1)以其保藏編號為：CGMCC No. 8921的CT2628菌株，菌株經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化測試，其 適宜的發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為：牛肉膏l(xiāng)_3g，蛋白胨2-3g，酵母粉l-3g，葡萄糖l-3g，NaCl， 20-25g，KC10. 3-0. 5g，MgCl2 ·7Η201· 9-2. 5g，F(xiàn)ePO40.0 1-0. 02g，水 1000ml，ρΗ7· 0-8. 0,上述 為培養(yǎng)液，加瓊脂16_19g為固體培養(yǎng)基；
[0007] 2)菌株在上述固體培養(yǎng)基置23°C -28°C溫箱培養(yǎng)3-5天，將固體培養(yǎng)基生長好的 菌體刮下，接入步驟1中的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天為種子液，再將種子液按I : 10接入40-50L上述 培養(yǎng)液中，23°C _28°C，轉(zhuǎn)速150rpm，振蕩培養(yǎng)3-5天獲得發(fā)酵物，根據(jù)需要可用相同方法擴(kuò) 大到目標(biāo)培養(yǎng)量。
[0008] 所述的一株誘導(dǎo)植物抗病抗逆的海洋生境芽孢桿菌，其特征在于：菌株特性為菌 落濁黃色，表面大多有褶，有時光滑，后期在蛋白胨培養(yǎng)基上產(chǎn)生深藍(lán)色素；菌體桿狀，革蘭 氏染色陽性0. 6-1. 9 μ mX 2. 9-5. 9 μ m，無莢膜，周生鞭毛，芽孢中生，聚集成鏈狀，水解淀 粉，明膠、接觸酶、VP試驗(yàn)均為陽性，能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖產(chǎn)酸，酪氨酸水解陰性， 不分解木質(zhì)素，還原硝酸鹽，利用檸檬酸鹽。
[0009] 所述的一株誘導(dǎo)植物抗病抗逆的海洋生境芽孢桿菌，其特征在：經(jīng)過海洋生境 芽孢桿菌CT2628菌株處理，在低溫0°C _2°C條件下番茄電解質(zhì)外滲率和丙二醛含量分 別降低了 98. 66%和63. 12%，可溶性糖、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、脯氨酸分別提高 了 62.47%，62.16%，205.13%，342.11%，在鹽害恥(：10.5-0.6%脅迫下，丙二醛降低了 72. 38%，可溶性糖、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、脯氨酸分別提高了 80. 47%，89. 33%， 117. 44%，230. 53%，CT2628菌株誘導(dǎo)植物抗寒及抗鹽效果顯著。
[0010] 所述的一株誘導(dǎo)植物抗病抗逆的海洋生境芽孢桿菌，其特征在于：CT2628菌株 采用常規(guī)的對峙培養(yǎng)法和抑菌率統(tǒng)計(jì)法篩選獲得，靶標(biāo)菌為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重的9種 植物病原真菌：稻癌霉菌Pyricularia oryzae、爺鏈孢菌Alternaria solani、鐮孢霉菌 Fusarium oxysporum、灰葡萄抱菌Botrytis cinerea、大而輪枝菌Verticillium dahliae、 芽枝霉菌 Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、絲核菌 Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum作為祀標(biāo)菌進(jìn)行抑菌測試，對峙培養(yǎng)法抑菌圈 26-35mm，抑菌率統(tǒng)計(jì)法抑菌率78. 00-88. 20%，均屬于強(qiáng)抑菌活性。
[0011] 所述的一株誘導(dǎo)植物抗病抗逆的海洋生境芽孢桿菌，其特征在于：海洋芽孢桿菌 菌株在普通耕作土及海濱鹽漬土的栽種的黃瓜、番茄、辣椒、甘藍(lán)、甜瓜、茄子均可以正常 定殖，浸根栽種4-6天后在植物根、莖、葉的最高定植數(shù)分別可達(dá)6. OOX 103、8. 30X 103、 4. 65X 103,定殖群體數(shù)可維持15-20天。
[0012] 所述的一株誘導(dǎo)植物抗病抗逆的海洋生境芽孢桿菌，其特征在于：海洋生 境芽孢桿菌菌株對黃瓜、番茄、辣椒的白粉、早疫、疫霉、灰霉4種病害，預(yù)防效果可達(dá) 77. 1% -89. 0%，治療效果59. 0% -62. 4%，防與治的效果均高于傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥多菌靈。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：具有誘導(dǎo)植物抗病、抗鹽、抗寒的海洋生境芽孢桿菌及在農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)的應(yīng)用，充分利用了海洋微生物這一特殊生境的天然資源，野生菌株已通過人工誘變 育種，生物學(xué)特性和農(nóng)藥活性穩(wěn)定，容易培養(yǎng)，培養(yǎng)周期短，操作方法簡便可行，對環(huán)境沒有 污染，所用原料廉價，生產(chǎn)成本低，開發(fā)前景好，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例中，本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下：
[0015] 實(shí)施例1 :CT-2628菌株的人工培養(yǎng)及發(fā)酵
[0016] 以保藏編號為：CGMCC No. 8921的CT-2628菌株，經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化測試，牛肉膏l(xiāng)-3g， 蛋白胨 2-3g，酵母粉 l-3g，葡萄糖 l-3g，NaCl，20-30g，KC10. 3-0. 5g，MgCl2 ·7Η201· 9-2. 5g， FePO40.0 1-0. 02g，水1000ml，pH7. 0-8. O上述為培養(yǎng)液，加瓊脂16-19g為固體培養(yǎng)基；
[0017] 在上述固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并用常規(guī)方法測試其理化特征，菌株特性如下：菌株特 性為菌落濁黃色，表面大多有褶，有時光滑，后期在蛋白胨培養(yǎng)基上產(chǎn)生深藍(lán)色素；菌體桿 狀，革蘭氏染色陽性0. 6-1. 9 μ mX 2. 9-5. 9 μ m，無莢膜，周生鞭毛，芽孢中生，聚集成鏈狀， 水解淀粉，明膠、接觸酶、VP試驗(yàn)均為陽性，能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖產(chǎn)酸，酪氨酸水解 陰性，不分解木質(zhì)素，還原硝酸鹽，利用檸檬酸鹽。
[0018] 菌株在上述固體培養(yǎng)基置23°C -28°C溫箱培養(yǎng)3-5天，將固體培養(yǎng)基生長好的菌 體刮下，接入步驟1中的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天為種子液，再將種子液按I : 10接入40-50L上述培 養(yǎng)液中，23°C _28°C，轉(zhuǎn)速150rpm，振蕩培養(yǎng)3-5天獲得發(fā)酵物，根據(jù)需要可用相同方法擴(kuò)大 到目標(biāo)培養(yǎng)量；
[0019] 實(shí)施例2 :CT_2628菌株對多種植物病原真菌的離體抑菌活性：
[0020] 發(fā)酵液采用常規(guī)的對峙培養(yǎng)法、抑菌率統(tǒng)計(jì)法，靶標(biāo)菌為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重的9 種植物病原真菌：稻癌霉菌Pyricularia oryzae、爺鏈孢菌Alternaria solani、鐮孢霉菌 Fusarium oxysporum、灰葡萄抱菌Botrytis cinerea、大而輪枝菌Verticillium dahliae、 芽枝霉菌 Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、絲核菌 Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum進(jìn)行抑菌測試結(jié)果顯示如下：
[0021] 表1CT-2628對植物病原菌抑菌活性
[0028] 測試1,簡稱Tl :對峙培養(yǎng)測試，以抑菌圈大小表示菌株活性，" + "表示抑菌圈為 20-25mm "++"表示抑菌圈為26-30mm "+++"表示抑菌圈為30-35mm ;
[0029] 測試2,簡稱T2 :對病原菌的抑制率，抑制率=(對照菌落半徑-處理菌落半徑）/ 對照菌落半徑X 100%
[0030] 由上表數(shù)據(jù)可知，CT-2628菌株對9種農(nóng)業(yè)危害嚴(yán)重的病原真菌，具有很好的抑菌 效果，在對峙培養(yǎng)法中，除絲核菌Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum抑菌