專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種精氨酸脫酰酶共價(jià)修飾物、其制造方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，提供了一種新的聚乙二醇共價(jià)修飾精氨酸脫酰酶(PEG-ADI)，發(fā)明還涉及該修飾蛋白的制造方法以及該修飾蛋白在治療肝癌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝癌是一種發(fā)病率高、治愈率低、死亡率高的消化系統(tǒng)腫瘤。我國(guó)肝癌的發(fā)病率為34/10萬(wàn)，約占全部腫瘤疾病的15-20%，是全球肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家，目前有肝癌患者約50萬(wàn)人。我國(guó)每年有約10萬(wàn)人死于肝癌，約占全世界肝癌死亡人數(shù)的一半，惡性腫瘤死亡率中排名第2位。因此，肝癌治療藥物的研究關(guān)系到肝癌患者和全社會(huì)切身利益，一直是醫(yī)藥行業(yè)的研究熱點(diǎn)，具有重要的社會(huì)意義。再者，我國(guó)每年用于肝癌治療的費(fèi)用超過(guò)IO億元人民幣，因此開(kāi)發(fā)肝癌治療藥物具有可觀的經(jīng)濟(jì)前景。從治療手段上來(lái)說(shuō)，肝癌細(xì)胞的治療主要是外科治療、放射、化療、生物與綜合治療等。肝癌外科主要是肝癌切除、肝移植、局部栓塞治療等。切除和栓塞的治療方法適用于界限清楚、遠(yuǎn)離大血管的腫瘤，而且手術(shù)切除的預(yù)后差、五年存活率低。移植需要解決的主要問(wèn)題在于免疫排斥反應(yīng)，后者往往成為患者和社會(huì)重大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成功率也只有50%左右，5年存活率也很低。放療和化療對(duì)正常細(xì)胞也有殺傷作用，其特點(diǎn)是專(zhuān)一性差、副作用巨大，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也極大地干擾機(jī)體的正常功能，不利于長(zhǎng)期用藥。至今，F(xiàn)DA和歐洲藥監(jiān)部門(mén)沒(méi)有批準(zhǔn)一個(gè)專(zhuān)一用于肝癌治療的藥物。正由于肝癌缺乏有效控制方法，肝癌患者的預(yù)后極差。除可切除小型肝癌患者的5年存活率達(dá)到8090%外，不能手術(shù)肝癌患者自癥狀發(fā)作后的平均存活時(shí)間只有34個(gè)月，而發(fā)展中國(guó)家全部肝癌病例的平均5年存活率僅為5%左右。因此，尋找腫瘤細(xì)胞特異性的藥物是科學(xué)界始終關(guān)注的焦點(diǎn)。研究表明，癌細(xì)胞多是精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，這些細(xì)胞不能合成精氨酸，必須依賴(lài)外界的精氨酸來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖；而人體正常細(xì)胞是能夠自身合成精氨酸。這為腫瘤的治療提供了一個(gè)重要的線(xiàn)索。降低循環(huán)血液中的精氨酸濃度，必將導(dǎo)致癌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏，達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。支原體M.arginini是許多細(xì)胞培養(yǎng)的污染物微生物，它編碼的一種酶一精氨酸脫酰酶(argininedeiminase，ADI)具有專(zhuān)一降解精氨酸的作用，在水的參與下能夠把精氨酸分解為瓜氨酸和氨。ADI由arcA基因編碼，蛋白總量占M.arginini可溶蛋白的10%。除了支原體M.arginini以夕卜，其它i午多微生物如Mycoplasmahominis、Mycoplasmaarthritidis、Mycobacteriumtuberculosis、Lymediseasespirochetes禾口Str印tococcus等都編碼ADI，后者催化精氨酸代謝，為生物體提供能量。M.arginini編碼的ADI是由410個(gè)氨基酸組成的球型的生物大分子，分子量為46376.14，等電點(diǎn)為5.2，沒(méi)有分子內(nèi)二硫鍵，以二聚體形式出現(xiàn)。近年來(lái)，ADI引起了人們極大的興趣。據(jù)報(bào)道，ADI濃度在ng/ml的情況下可以抑制黑色素瘤、白血病、前列腺癌等細(xì)胞系的生長(zhǎng)。除了能夠減少特殊腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的精氨酸以外，近幾年的研究也認(rèn)為這種酶參與細(xì)胞凋亡，并且具有抑制一氧化氮(N0)合成、中和腫瘤壞死因子等作用。此外，新近的研究顯示ADI不但可以直接抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而且可以抑制腫瘤新血管的生成。而腫瘤新血管的形成被認(rèn)為是腫瘤生長(zhǎng)的重要環(huán)節(jié)。美國(guó)PhoenixPharmacologics現(xiàn)在正在進(jìn)行ADI修飾物治療肝細(xì)胞癌的III期臨床研究。日本NipponMining公司通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，ADI能夠在體內(nèi)、體外抑制6種腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)動(dòng)物的生存時(shí)間。德國(guó)Essen的科研單位和醫(yī)院聯(lián)合試驗(yàn)，已經(jīng)證明ADI抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)比asparaginase更有效，也能抑制成神經(jīng)細(xì)胞瘤。韓國(guó)漢城也在研究E.coli表達(dá)的ADI在抑制NO合成方面的調(diào)控作用。眾多基礎(chǔ)和臨床研究報(bào)告的結(jié)果證實(shí)了ADI的藥理作用，據(jù)此可以樂(lè)觀地期望ADI成為一個(gè)強(qiáng)有力的腫瘤治療藥物。ADI直接作為藥物有一些不利方面由于ADI來(lái)源于微生物，應(yīng)用于人會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原性；ADI半衰期僅為4小時(shí)左右，需要頻繁用藥以維持藥效濃度。因而降低ADI的免疫原性、增強(qiáng)穩(wěn)定性、降低血清清除率，延長(zhǎng)半衰期就成為亟待解決的問(wèn)題。目前延長(zhǎng)蛋白藥物半衰期的方法主要基于三種原理1、增大蛋白藥物的分子量，減少腎小球?yàn)V過(guò)率；2、利用游離型藥物和結(jié)合型藥物在血漿內(nèi)形成平衡的特點(diǎn)，緩慢釋放游離型蛋白藥物，使結(jié)合型藥物和游離型藥物的平衡向游離型藥物方向移動(dòng)；3、減少異源蛋白的免疫原性，從而減少其體內(nèi)清除率。聚乙二醇是中性、無(wú)毒且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的極少數(shù)能作為體內(nèi)注射藥用的合成聚合物之一。具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，并且沒(méi)有免疫原性。當(dāng)藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時(shí)，可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子，改變它們?cè)谒芤褐械纳锓峙湫袨楹腿芙庑?，在其修飾的藥物周?chē)a(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識(shí)別。聚乙二醇類(lèi)修飾劑的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)因它們的相對(duì)分子量和注射給藥方式而異，分子量越大，半衰期越長(zhǎng)。隨著PEG化學(xué)的高速發(fā)展以及許多PEG衍生化試劑的商品化、PEG修飾藥物的優(yōu)越性和PEG修飾蛋白藥物的陸續(xù)上市，如羅氏公司已上市的的PEG-IFN、安進(jìn)公司已上市的PEG-GCSF等等，都表現(xiàn)出更加優(yōu)越的臨床效應(yīng)，并帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。體內(nèi)外藥效試驗(yàn)表明，多PEG修飾的ADI能夠分解精氨酸，并能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠存活時(shí)間。目前，美國(guó)PhoenixPharmacologics等多家公司開(kāi)展了ADI修飾物的I-II期臨床試驗(yàn)，取得了較好的療效。用于治療肝細(xì)胞癌的III期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。目前還沒(méi)有關(guān)于單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾精氨酸脫酰酶氨基端形成的新分子的任何文獻(xiàn)報(bào)道。而這種修飾可以形成單一的修飾產(chǎn)物，易于進(jìn)行質(zhì)量控制，在制備藥物的實(shí)踐中優(yōu)勢(shì)明顯。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)PEG-ADI及其制備方法，在制備肝癌治療藥物中有應(yīng)用前景。該蛋白具有以下特點(diǎn)1、特異性降解精氨酸。2、免疫原性低于ADI。3、更長(zhǎng)的半衰期。4、是由單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾在精氨酸脫酰酶氨基端形成的結(jié)構(gòu)單一的修飾物。這種新的修飾蛋白PEG-ADI用于治療肝癌具有明顯的優(yōu)勢(shì)1、減少過(guò)敏反應(yīng)，便于多療程或持續(xù)用藥。2、增加血漿半衰期，減少注射次數(shù)，延長(zhǎng)給藥間隔，減少患者痛苦，提高患者依從性。本發(fā)明采用下述技術(shù)方案(1)PEG的相對(duì)分子量的選擇考慮到共價(jià)修飾蛋白的生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)兩方面的因素，優(yōu)選平均分子量為20000、一端以甲基封閉、另一端己經(jīng)活化的甲氧基聚乙二醇丙醛作為修飾劑，分子式為CH3-(0-CH2-CH2)n-CH0。國(guó)內(nèi)鍵凱等公司銷(xiāo)售該產(chǎn)品，可以方便獲得。(2)修飾位點(diǎn)的選擇根據(jù)蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系，本發(fā)明優(yōu)選不與受體結(jié)合的蛋白質(zhì)N末端殘基作為修飾位點(diǎn)，這樣修飾后的蛋白質(zhì)能夠保留較高的生物活性。易于得到均一性的產(chǎn)品。這種方式修飾的ADI目前文獻(xiàn)沒(méi)有報(bào)道。(3)ADI蛋白的獲得為了獲得支原體ADI基因(序列可以從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)査到)，可以采用PCR或者RT-PCR的方法擴(kuò)增兩條基因(膜板微生物可以從中國(guó)菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)獲得)，同樣也可以采取全合成的方法。優(yōu)選的方法是全合成ADI基因，通過(guò)基因重組技術(shù)，利用大腸桿菌表達(dá)獲得ADI包涵體，通過(guò)對(duì)包涵體變性、復(fù)性、DEAE柱純化、Arg-s印horose4B柱提純，得到ADI純品。(4)PEG共價(jià)修飾ADI的工藝流程PEG修飾反應(yīng)需要高度的特異性和溫和的反應(yīng)條件，為得到高產(chǎn)率、均一較高的目的修飾產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中優(yōu)選的反應(yīng)條件為反應(yīng)緩沖體系為磷酸或其它具有緩沖作用的鹽溶液，適當(dāng)濃度的NaCNBH3、藥物濃度0.5-25mg/ml、反應(yīng)物間的計(jì)量關(guān)系比PEG:ADI(摩爾比)為5:1-50、反應(yīng)時(shí)間2-16h、反應(yīng)溫度2-25°C。(5)對(duì)共價(jià)修飾產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，通過(guò)陰離子交換層析和凝膠排阻層析可得到純度達(dá)98%以上純品。目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)可因PEG的分子量大小而有輕微變化。(6)采用體外精氨酸降解試驗(yàn)檢驗(yàn)新共價(jià)修飾蛋白質(zhì)的生物活性。附圖l.液相純度分析修飾產(chǎn)物純度大于95%具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:ADI蛋白的獲得按照生物化學(xué)原理，分別對(duì)全基因的正反兩條鏈進(jìn)行分段合成，然后進(jìn)行退火、連接。合成中把支原體編碼色氨酸的密碼子TGA該為T(mén)GG，并在基因編碼鏈5'端分別加入BamHI酶切位點(diǎn)和Sail酶切位點(diǎn)。測(cè)序正確后連接入pBV220載體，構(gòu)建成pBV220-ADI載體，大腸桿菌表達(dá)，經(jīng)破菌、離心收集包涵體、洗滌包涵體、包涵體變性、復(fù)性、DEAE純化，Arg-s印harose4B精制獲得獲得純品。實(shí)施例2:PEG化反應(yīng)流程設(shè)計(jì)3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，將甲氧基聚乙二醇丙醛(CH3-(0-CH2-CH2)n-CH0)與ADI以摩爾比5/1、10/1、20/1比例混合，分別于4'C、8。C、25X:下進(jìn)行反應(yīng)，分別于4h、8h、16h取樣。SDS-PAGE檢測(cè)，確定反應(yīng)效率。實(shí)施例3:目標(biāo)產(chǎn)物的分離、純化將PEG化反應(yīng)產(chǎn)物用20mMPH7.0PB稀釋5倍，DEAE層析柱吸附修飾后蛋白，以加入80mMNaCl的上樣緩沖液解吸附目的蛋白，得到樣品純度大于80%，用分子篩凝膠柱S-200進(jìn)一步分離精制。實(shí)施例4:目標(biāo)產(chǎn)物的鑒定SDS-PAGE測(cè)定共價(jià)修飾蛋白分子量約為66KD，純度均在98%以上。采用體外精氨酸降解實(shí)驗(yàn)檢査共價(jià)修飾蛋白的生物活性。基本原理是ADI催化精氨酸轉(zhuǎn)變成瓜氨酸，后者與diacetylmono-oxime結(jié)合，在460nm處有強(qiáng)吸收，在一定的線(xiàn)性范圍內(nèi)，反應(yīng)液460nm處吸光度的變化量與反應(yīng)的氨基酸量成正比。操作步驟為(1)37。C孵育酶和底物混合物1小時(shí)，混合物組成(50mM精氨酸150ul、50mM醋酸鹽緩沖液(PH5.5)2.3ml、酶適量、濃度0.05%的疊氮鈉3.6ul)。(2)加入2M的鹽酸0.5ml終止反應(yīng)。(3)1ml終止過(guò)反應(yīng)的上清液中加入H3P04-H2S04(3/1，V/V)1.5ml和250uldiacetylmono-oxime(1.5%)的10%甲醇溶液，黑暗中95。C反應(yīng)30分鐘，冷卻10分鐘。(4)460nm測(cè)光吸收值，該值反應(yīng)了瓜氨酸的生成量?；盍挝欢x1分鐘反應(yīng)時(shí)間內(nèi)催化1微摩爾精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?微摩爾瓜氨酸的酶量定義為1個(gè)活力單位(IU)。PEG共價(jià)修飾后保留活性為修飾前的40—50X。實(shí)施例5:無(wú)菌過(guò)濾、分裝、凍干純品可加入甘露醇等輔料制成小容量注射劑或者凍干制劑?？刹捎?但不僅限于)緩沖體系為10mMPB、pH6.8、5%甘露醇。在環(huán)境潔凈度達(dá)到百級(jí)的條件下，用0.22uM微孔濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行分裝、凍干、封口、貼簽、裝箱。保存于28'C的冷藏環(huán)境中。實(shí)施例6:免疫原性用實(shí)施例2制備的分子量20KD的PEG-ADI進(jìn)行免疫原性測(cè)定。每周一次靜脈注射PEG-ADI,連續(xù)8周免疫Balbc小鼠。每4周對(duì)小鼠取血，用ELISA法測(cè)定抗ADI的抗體。以450nm檢測(cè)抗原抗體著色反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的量與著色程度成正比。表1.PEG-ADI與ADI剌激抗體的測(cè)定結(jié)果U50nm吸收值)時(shí)間(周)ADIPEG-ADI10020.025030.073040.1030.0150.2220.06060.3640.13570.3980.21680.4120.254PEG-ADI從抗體產(chǎn)生的時(shí)間及數(shù)量來(lái)說(shuō)都比未修飾的ADI有明顯的優(yōu)勢(shì)，免疫原性顯著下降。實(shí)施例7:循環(huán)半衰期測(cè)定用實(shí)施例2制備的分子量20KD的PEG-ADI進(jìn)行循環(huán)半衰期的測(cè)定。單次給藥后，血清中精氨酸濃度的降低和瓜氨酸濃度的升高作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)小鼠給藥后，不同時(shí)間尾靜脈取血，常規(guī)方法制備血清,用HPLC分析測(cè)定精氨酸和瓜氨酸的含量。表2PEG-ADI與ADI循環(huán)半衰期測(cè)定結(jié)果[血漿精氨酸、瓜氨酸濃度(uM)]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果表明，未修飾的ADI很快被清除，而PEG-ADI20000半衰期約為7-8天。實(shí)施例8:體外抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)檢測(cè)在體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。分別選擇MH134和MethA作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。總細(xì)胞數(shù)約為5X108。分別加入6ug/ml的PEG20000-ADI，不同時(shí)間對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算存活百分比。表3.PEG-ADI對(duì)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用腫瘤細(xì)胞數(shù)(1X108)時(shí)間MH134MethA12h4.23.824h1.71.448h0.80.772h0.40.396h0.30.權(quán)利要求1、一種聚乙二醇共價(jià)修飾的精氨酸脫酰酶。2、權(quán)利要求1所述的聚乙二醇是直鏈、分子量為5-40KD的單甲氧基聚乙二醇丙醛。3、權(quán)利要求2所述的聚乙二醇，優(yōu)選的分子量是20KD。4、權(quán)利要求1所述的精氨酸脫酰酶是來(lái)自支原體的生物提取物或者重組方法制備的支原體精氨酸脫酰酶。5、權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的精氨酸脫酰酶，其又一個(gè)特點(diǎn)是由聚乙二醇丙醛的醛基與精氨酸脫酰酶氨基端的氨基發(fā)生反應(yīng)后形成的單一修飾產(chǎn)物。6、權(quán)利要求1-5所述的聚乙二醇共價(jià)修飾的精氨酸脫酰酶在制備用于治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，提供了一種與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道都不相同的新型單甲氧基聚乙二醇丙醛修飾的精氨酸脫酰酶，該修飾物具有結(jié)構(gòu)均一的特點(diǎn)，不同于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的PEG化精氨酸脫酰酶。本發(fā)明公開(kāi)了該修飾物的
背景技術(shù)：
，詳細(xì)公布了技術(shù)方案，并提供了實(shí)施例。發(fā)明提供的物質(zhì)及其制備方法在制備肝癌治療藥物的實(shí)踐中有較廣泛應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61K38/50GK101096664SQ200710111250公開(kāi)日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年6月19日優(yōu)先權(quán)日2006年7月13日發(fā)明者佘妙琴,吳彥卓,徐明波,楊仲璠,王俊玲,連治國(guó),雷建軍申請(qǐng)人:北京雙鷺立生醫(yī)藥科技有限公司