本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，涉及一種分離阿利維A酸及異構(gòu)體的方法；本方法還涉及測定化妝品中添加的維A酸類及其異構(gòu)體或相同結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：
：

阿利維A酸是一種內(nèi)源性維甲酸，現(xiàn)用于局部外用強效糖皮質(zhì)激素無效的慢性手部濕疹患者，也用于治療皮膚卡波濟肉瘤。

阿利維A酸很容易與維A酸等其他異構(gòu)體發(fā)生異構(gòu)化而互相轉(zhuǎn)換，在合成和放置過程中均可能轉(zhuǎn)化為其他異構(gòu)體：

現(xiàn)有文獻主要是維A酸、異維A酸的測定方法，但其維A酸與阿利維A酸的分離度達不到1.5，且阿利維A酸的保留時間達到30min以上，對分析效果和效率都不能滿足要求。本發(fā)明人對比維A酸、異維A酸后，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)異維A酸的有關(guān)物質(zhì)測定方法均不能很好分離阿利維A酸與維A酸。見如下：

表1現(xiàn)有技術(shù)異維A酸測定方法

目前，維A酸類化合物不僅被應用于多種皮膚疾病以及癌癥預防和治療，也屢有發(fā)生不良企業(yè)或商家在化妝品中添加維A酸類藥物的情況。因此，研究將阿利維A酸與其異構(gòu)體分離，并進行定量檢測的方法很有現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能夠用于阿利維A酸及其5種異構(gòu)體的有效分離和測定的高效液相色譜方法，并提高分離檢測的效率。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種高效液相色譜法分離測定阿利維A酸及其5種異構(gòu)體的方法，為反相液相色譜法,色譜柱填料為十八烷基或八烷基鍵合硅膠，用含甲醇和酸的混合液的流動相洗脫后采用紫外檢測器進行檢測，其特征是：流動相中還含有叔丁基甲醚，含量占流動相總體積的15％-35％。

所述含甲醇和酸的混合液的體積比是：酸:水:甲醇＝0.2～2:30～70:70～30；

所述酸選自磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一種或多種，優(yōu)選為乙酸。

優(yōu)選十八烷基鍵合硅膠顆粒粒徑為3.5μm，柱長優(yōu)選為250mm。

其它分析條件：

色譜柱適用的柱溫范圍為20-40℃，優(yōu)選為30℃。

流動相的流速為0.2-2.0ml/min，優(yōu)選為0.5-1.5ml/min，更優(yōu)選為1.0ml/min。

紫外檢測器的檢測波長為350nm，檢測器型號不限，如可使用DAD或VWD檢測器。

本發(fā)明一個具體實施方式中，色譜柱為十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(Thermo Hypersil 250×4.6mm,5μm)。叔丁基甲醚：甲醇：1％冰乙酸＝15：60：25(v/v/v)；

操作方法為：取阿利維A酸、異構(gòu)體1、異構(gòu)體2、異構(gòu)體3、異構(gòu)體4、異構(gòu)體5對照品各適量，用甲醇溶解，配制成每1ml含阿利維A酸200μg、異構(gòu)體1、異構(gòu)體2、異構(gòu)體3、異構(gòu)體4、異構(gòu)體5各2μg的系統(tǒng)適用性溶液。

注入液相色譜儀，按本發(fā)明色譜條件(色譜柱填料為十八烷基鍵合硅膠，柱長為250mm，檢測波長為350nm，以叔丁基甲醚：甲醇：1％冰乙酸＝15：60：25(v/v/v))進行洗脫，流動相的流速為1.0ml/min，色譜柱柱溫箱溫度為30℃，進樣體積為20μl進行測定。

本發(fā)明方法適用于阿利維A酸及5種異構(gòu)體的分離和測定，可用于單獨檢測某一種異構(gòu)體，也可同時分離和檢測這5種異構(gòu)體?？捎糜诎⒗SA酸原料藥及阿利維A酸軟膠囊、阿利維A酸乳膏、阿利維A酸凝膠、各種化妝品中阿利維A酸及其異構(gòu)體的檢測和質(zhì)量控制，還可用于檢測服用阿利維A酸者體內(nèi)的生物代謝物。

實例1圖1中的阿利維A酸與維A酸分離達到2.67，阿利維A酸理論塔板數(shù)12067，阿利維A酸保留時間為8.831min，保留時間8.831min的峰純度為0.999,保留時間8.831min的峰對稱因子為1.02；而對比例例1圖2中阿利維A酸與維A酸分離明顯無法分開，理論塔板數(shù)5678，阿利維A酸保留時間為39.856min，保留時間為39.856min的峰純度為0.825，保留時間8.831min的峰對稱因子為1.38；通過對比實例1與對比例1，得出本發(fā)明的有以下有益處效果。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、阿利維A酸與異構(gòu)體分離較好，專屬性強。

現(xiàn)有技術(shù)方法，對比例1中，其他異構(gòu)體之間都能很好分離，但阿利維A酸與維A酸分離度達不到分離要求，本發(fā)明的方法實施例1中，不但其他異構(gòu)體之間都能很好分離，而且阿利維A酸與維A酸分離達到2.67；現(xiàn)有技術(shù)方法對比例1中，阿利維A酸的理論塔板數(shù)5678，本發(fā)明的方法實施例1中，阿利維A酸的理論塔板數(shù)為12067；現(xiàn)有技術(shù)方法對比例1中，阿利維A酸峰的的峰對稱因子為1.38，峰純度為0.825；本發(fā)明的方法實施例1中，阿利維A酸峰的的峰對稱因子為1.02，峰純度為0.999。對比例和實施例，各異構(gòu)體出峰順序一致，現(xiàn)有技術(shù)不能對阿利維A酸與維A酸分離，而本發(fā)明方法能將阿利維A酸與維A酸完全分開，在進行分離阿利維A酸與維A酸時專屬性更強。

2、用時短，提高了效率。

現(xiàn)有技術(shù)方法，對比例1中，各異構(gòu)體均比本發(fā)明的實施例的保留強，阿利維A酸和維A酸保留時間為39.856min，本發(fā)明實施例1中的方法阿利維A酸和維A酸保留時間分別為8.831min為9.995min；本發(fā)明比現(xiàn)有技術(shù)的分離效率高。

3、結(jié)果更準確。

本發(fā)明由于分離的專屬性更高后，進行含量測定時，就不會將阿利維A酸和維A酸一起作為阿利維A酸或維A酸的進行含量和有關(guān)物質(zhì)的計算，故比現(xiàn)有技術(shù)方法更準確。

注：以上所述現(xiàn)有技術(shù)，指“EP7.5版異維A酸原料藥質(zhì)量標準”中有關(guān)測定異維A酸及其制劑的標準方法。并將色譜柱的原色譜柱柱長150mm換為分離更好的長色譜柱250mm。

表2本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)方法對比

注：

各對比例采用現(xiàn)有技術(shù)方法測定，具體指“EP7.5版異維A酸原料藥質(zhì)量標準”中規(guī)定的方法，并將標準規(guī)定的原色譜柱柱長150mm換為分離更好的長色譜柱250mm。

各實施例采用本發(fā)明的方法檢測。

附圖說明

圖1為采用本發(fā)明的方法檢測阿利維A酸混合異構(gòu)體的色譜圖，各峰從左至右，依次為：異構(gòu)體4、異構(gòu)體5、異構(gòu)體2、異構(gòu)體3、阿利維A酸、異構(gòu)體1；

圖2為采用EP7.5異維A酸方法測定阿利維A酸混合異構(gòu)體的色譜圖，各峰從左至右，依次為：異構(gòu)體4、異構(gòu)體5、異構(gòu)體2、異構(gòu)體3、阿利維A酸。(可看出阿利維A酸和異構(gòu)體1未分開)；

圖3為采用本發(fā)明的方法檢測阿利維A酸光降解雜質(zhì)的色譜圖，各峰從左至右，依次為：異構(gòu)體2、阿利維A酸、異構(gòu)體1，未知雜質(zhì)1、未知雜質(zhì)2；

圖4為采用EP7.5方法檢測阿利維A酸光降解雜質(zhì)的色譜圖，各峰從左至右，依次為：異構(gòu)體2、阿利維A酸、未知雜質(zhì)1、未知雜質(zhì)2。(可看出阿利維A酸和異構(gòu)體1未分開)；

圖5為采用本發(fā)明的方法檢測阿利維A酸軟膠囊的色譜圖，各峰從左至右，依次為阿利維A酸、維A酸；

圖6為采用本發(fā)明的方法檢測阿利維A酸軟膠囊的色譜圖2，各峰從左至右，依次為阿利維A酸、維A酸。

圖7為采用本發(fā)明的方法檢測阿利維A酸軟膠囊生物代謝的色譜圖，各峰從左至右，依次為阿維A、阿利維A酸、維A酸。

具體實施方式

以下所舉實施例是為了更清楚地對本發(fā)明的內(nèi)容進行說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅限于實施例中所舉。所以，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對實施方案進行非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

除特別說明，以下實施例和對比例采用的儀器及色譜柱等條件如下：

日本島津SHIMADZU LC-20AT液相色譜儀，檢測器：UV；色譜工作站：LCsolution， 色譜柱：十八烷基鍵合硅膠或八烷基鍵合硅膠，流速：1.0ml/min；色譜柱柱溫箱溫度為30℃。

實施例1 本發(fā)明方法檢測阿利維A酸6種混合異構(gòu)體

取阿利維A酸、異構(gòu)體1、異構(gòu)體2、異構(gòu)體3、異構(gòu)體4、異構(gòu)體5標準品共同溶解于甲醇，配制成每1ml含阿利維A酸、異構(gòu)體1、異構(gòu)體2、異構(gòu)體3、異構(gòu)體4、異構(gòu)體5各2μg的系統(tǒng)適用性溶液。

取20μl注入液相色譜儀；

色譜條件：色譜柱：ODS柱(Thermo Hypersil 250mm×4.6mm，3.5μm)，檢測波長為350nm，以叔丁基甲醚：甲醇：1％乙酸＝15：60：25(v/v/v)進行洗脫，記錄色譜圖。

得圖1為采用本發(fā)明的方法檢測阿利維A酸6種混合異構(gòu)體的色譜圖。

對比例1 EP7.5異維A酸方法測定阿利維A酸6種混合異構(gòu)體

采用的儀器及色譜柱和系統(tǒng)適用性溶液同實施例1。

取實施例1的待測樣品溶液20μl注入液相色譜儀，按EP7.5異維A酸的色譜方法，以甲醇-水-冰乙酸(770:225:5)進行洗脫，記錄色譜圖。

得圖2為采用EP7.5異維A酸方法測定阿利維A酸混合異構(gòu)體的色譜圖。

實施例2 本發(fā)明方法檢測阿利維A酸光降解雜質(zhì)

由于維A酸類藥物，光降解溶液異構(gòu)化，故將阿利維A酸進行光強制降解后得到的光降解物質(zhì)進行測定。

將阿利維A酸原料藥，在照度5000XL條件下10小時樣品，用甲醇稀釋成600μg的樣品溶液，取10μl注入液相色譜儀；

色譜條件：色譜柱：ODS柱(Thermo Hypersil 250mm×4.6mm，3.5μm)，檢測波長為355nm，以叔丁基甲醚：甲醇：2％甲酸＝25：45：30(v/v/v)進行洗脫，記錄色譜圖。

得圖3采用本發(fā)明的方法檢測阿利維A酸光降解雜質(zhì)的色譜圖。

對比例2 EP7.5方法檢測阿利維A酸光降解雜質(zhì)

取實施例2的待測樣品溶液20μl注入液相色譜儀；

色譜柱：ODS柱(Thermo Hypersil 250mm×4.6mm，3.5μm)，檢測波長為355nm，進樣量為10μl；流速：1.5ml/min，按EP7.5異維A酸的色譜方法，以甲醇-水-冰乙酸 (770:225:5)進行洗脫，記錄色譜圖。

得圖4采用EP7.5方法檢測阿利維A酸光降解雜質(zhì)的色譜圖。

實施例3 本發(fā)明方法檢測阿利維A酸軟膠囊(一)

取阿利維A酸軟膠囊，剪開，用10ml二氯甲烷將內(nèi)容物溶解，然后加入甲醇混勻定容至100ml，過濾，即得約含阿利維A酸約100ug/ml的供試液；取供試液10μl；

色譜條件：八烷基鍵合硅膠色譜柱(Boston Green C84.6mm×250mm，5μm)，檢測波長為350nm，以叔丁基甲醚：甲醇：0.5％乙酸＝35：30：35(v/v/v)進行洗脫，記錄色譜圖。

得色譜圖為圖5。

實施例4 本發(fā)明方法檢測阿利維A酸軟膠囊(二)

除流動相不同，其余與實施例3實驗內(nèi)容完全相同。

流動相是：叔丁基甲醚：甲醇：0.3％磷酸＝20：40：40(v/v/v)。

得色譜圖為圖6。

實施例5 本發(fā)明方法檢測阿利維A酸軟膠囊生物代謝物

內(nèi)標工作液：取適量阿維A，用甲醇稀釋得40μg/ml的內(nèi)標工作液。

取服用了阿利維A酸軟膠囊的血0.5ml，加入4.0ug/mL內(nèi)標阿維A酸溶液50μL，渦旋震蕩30s混勻，加乙醚5mL，渦旋震蕩3min，4000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上層有機相于另一尖底試管，置40℃水浴中通氮氣流揮干。殘留物溶于100μl甲醇：DMF(1:1v/v)，振蕩30s，13000rpm離心3min，取上清液進樣40μl；

以叔丁基甲醚：甲醇：2％三氟乙酸＝23：47：30(v/v/v)進行洗脫，記錄色譜圖。

得色譜圖為圖7。