本發(fā)明涉及一種藏藥螃蟹甲的檢測(cè)方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

螃蟹甲為藏醫(yī)習(xí)用藥材，來(lái)源于唇形科糙蘇屬多年生草本植物螃蟹甲Phlomis younghusbandii Mukerjee的干燥塊根，藏語(yǔ)稱(chēng)“露木爾”，至今已有千余年的使用歷史。螃蟹甲有清熱疏風(fēng)，潤(rùn)喉散寒，生肌斂瘡，止咳化痰的作用，多用于治療風(fēng)濕感冒，咳嗽痰多，咽喉疫病，支氣管炎，肺病等。

螃蟹甲藥材被收載于衛(wèi)生部頒布藏藥第一冊(cè)的《藥品標(biāo)準(zhǔn)》中，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS3﹣BC﹣0124﹣95，僅性狀項(xiàng)，無(wú)其他鑒別、檢查及含量測(cè)定項(xiàng)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟需提高。含有螃蟹甲的中成藥有“七味螃蟹甲丸”、“催湯丸”，分別執(zhí)行《藥品標(biāo)準(zhǔn)》(藏藥第一冊(cè)，1995年版)和《中國(guó)藥典》(2010年版一部)，對(duì)螃蟹甲僅有鑒別項(xiàng)，且其鑒別分離效果并不理想，不能全面反映螃蟹甲藥材的質(zhì)量。近幾年對(duì)于螃蟹甲的研究較多，如《藏藥催湯丸的薄層色譜研究》采用乙醇提取后氯仿-甲醇(6：4)展開(kāi)，但其操作復(fù)雜，展開(kāi)效果不理想，并且氯仿為易制毒管制，使用不便；《藏藥螃蟹甲HPLC特征圖譜研究》以乙腈-水梯度洗脫，乙腈濃度變化為在第0-8-10-20-40-60-70分鐘，乙腈百分比濃度依次變?yōu)?-0-5-5-12.5-100-100，取用14個(gè)特征峰，但其梯度復(fù)雜，色譜圖的分離效果不太理想，聯(lián)峰、肩峰較多，實(shí)際重復(fù)該試驗(yàn)無(wú)法得到滿(mǎn)意的圖譜(見(jiàn)附圖8)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種藏藥螃蟹甲的檢測(cè)方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了一種藏藥螃蟹甲藥材的檢測(cè)方法，包括鑒別方法和/或HPLC特征圖譜檢測(cè)方法，能全面地反映螃蟹甲中所含化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種藏藥螃蟹甲的檢測(cè)方法，包括如下鑒別和/或特征圖譜方法：

A、薄層鑒別方法

取螃蟹甲藥材粉末0.5﹣2g，加乙醇5-20ml，加熱回流20-40分鐘，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；按照以上供試品溶液制備相同的方法制得對(duì)照藥材溶液；取上述兩種溶液各5 ﹣10μl點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，照薄層色譜法試驗(yàn)，以體積比4-8:1:0.2的異丙醇﹣甲醇-甲酸為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出后晾干；采用M法和/或N法顯色后，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；所述的M法為：置254nm紫外光燈下檢視；N法為：噴以體積比10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；

B、HPLC特征圖譜檢測(cè)方法

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈﹣體積分?jǐn)?shù)比為0.05％的磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫：乙腈體積百分變化為，0﹣15分鐘保持4％，15﹣60分鐘由12％升至40％，檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析時(shí)間60分鐘；

對(duì)照品溶液的制備：取山梔苷甲酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含山梔苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供試品溶液的制備：取藏藥螃蟹甲粉末0.5﹣2g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理60分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5﹣10μl，注入高效液相色譜儀，記錄60分鐘內(nèi)的色譜圖，即得螃蟹甲的HPLC特征圖譜；

所得螃蟹甲HPLC特征圖譜中的特征峰為13個(gè)，其中6號(hào)峰山梔苷甲酯為標(biāo)準(zhǔn)峰，13個(gè)峰與標(biāo)準(zhǔn)峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.133﹣0.147、0.363﹣0.401、0.752﹣0.831、0.817﹣0.903、0.854﹣0.944、1.000、1.090﹣1.205、1.132﹣1.251、1.267﹣1.401、1.307﹣1.438、1.365﹣1.509、1.393﹣1.540、1.522﹣1.683。

優(yōu)選的，上述薄層鑒別方法為：

取螃蟹甲藥材粉末1g，加乙醇10ml，加熱回流30分鐘，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；按照以上供試品溶液制備相同的方法制得對(duì)照藥材溶液；取上述兩種溶液各5μl點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，照薄層色譜法試驗(yàn)，以體積比6:1:0.2的異丙醇﹣甲醇﹣甲酸為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出晾干，采用M法和/或N法顯色后，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；所述的M法為：置254nm紫外光燈下檢視；N法為：噴以體積比10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

優(yōu)選的，上述HPLC特征圖譜檢測(cè)方法為：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈﹣體積分?jǐn)?shù)比為0.05％的磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫：乙腈體積百分變化為，0﹣15分鐘保持4％，15﹣60分鐘由12％升至40％；檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm；流速：1.0ml/min；分析時(shí)間60分鐘；

對(duì)照品溶液的制備：取山梔苷甲酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含山梔苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供試品溶液的制備：取藏藥螃蟹甲粉末1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理60分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，記錄60分鐘內(nèi)的色譜圖，即得螃蟹甲的HPLC特征圖譜；

所得螃蟹甲HPLC特征圖譜中的特征峰為13個(gè)，其中6號(hào)峰山梔苷甲酯為標(biāo)準(zhǔn)峰，13個(gè)峰與標(biāo)準(zhǔn)峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.140、0.382、0.791、0.860、0.899、1.000、1.148、1.191、1.334、1.369、1.437、1.466、1.602。

本發(fā)明中所述的重量份與體積份的單位對(duì)應(yīng)關(guān)系為g/ml或Kg/L。

有益效果

本發(fā)明提供了一種藏藥材螃蟹甲的檢測(cè)方法，以對(duì)螃蟹甲進(jìn)行較全面的質(zhì)量檢測(cè)。本發(fā)明以一定比例的異丙醇﹣甲醇﹣甲酸為展開(kāi)劑，選擇254nm紫外檢視和/或噴以硫酸乙醇加熱顯色方法，所得圖譜斑點(diǎn)清楚，分離度較高；以乙腈﹣體積分?jǐn)?shù)比為0.05％的磷酸水溶液為流動(dòng)相，通過(guò)梯度洗脫，得到螃蟹甲的HPLC特征圖譜，并確立13個(gè)特征峰，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)全面，所得特征峰分離度較好，峰形清晰。

附圖說(shuō)明

圖1、圖2為以三氯甲烷﹣甲醇(6:4)為展開(kāi)劑所得TLC鑒別圖譜；

圖3、圖4為以三氯甲烷﹣甲醇(9:1)為展開(kāi)劑所得TLC鑒別圖譜；

圖5、圖6為以異丙醇﹣甲醇﹣甲酸(6:1:0.2)為展開(kāi)劑所得TLC鑒別圖譜；

圖7為流動(dòng)相1所得HPLC圖譜；

圖8為流動(dòng)相2所得HPLC圖譜；

圖9為流動(dòng)相3所得HPLC圖譜；

圖10為螃蟹甲藥材HPLC特征圖譜；

圖11為山梔苷甲酯標(biāo)準(zhǔn)峰圖譜；

其中，圖1、3、5為254nm紫外燈下檢視圖；圖2、4、6為硫酸乙醇加熱顯色圖；圖1-6中，1為螃蟹甲對(duì)照藥材點(diǎn)樣點(diǎn)，2、3、4分別為螃蟹甲三個(gè)批次20150103、20150204、20150301的螃蟹甲樣品點(diǎn)樣點(diǎn)；圖7-圖11中，橫坐標(biāo)為時(shí)間，單位：分鐘，縱坐標(biāo)為電壓，單位：毫伏特。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)例1：薄層鑒別檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)

分別取三個(gè)批次20150103、20150204、20150301螃蟹甲藥材粉末1g，加乙醇10ml，加熱回流30分鐘，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；同法制得對(duì)照藥材溶液。取上述兩種溶液各5μl點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，照薄層色譜法試驗(yàn)，分別以文獻(xiàn)方法，即三氯甲烷﹣甲醇(體積比6:4)、三氯甲烷﹣甲醇﹣水(體積比13:7:2)、石油醚(60﹣90℃)﹣乙酸乙酯﹣丙酮﹣甲酸(體積比15:15:10:1)、三氯甲烷﹣甲醇(9:1)、異丙醇﹣甲醇﹣甲酸(體積比4:1:0.2)、異丙醇﹣甲醇﹣甲酸(體積比6:1:0.2)、異丙醇﹣甲醇﹣甲酸(體積比8:1:0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。噴以體積比10％硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。判定：在供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

結(jié)果分析：

展開(kāi)劑為三氯甲烷﹣甲醇(體積比6:4)、三氯甲烷﹣甲醇﹣水(體積比13:7:2)、石油醚(60﹣90℃)﹣乙酸乙酯﹣丙酮﹣甲酸(體積比15:15:10:1)：Rf值較大，斑點(diǎn)集中在溶劑前沿位置，其中254nm紫外檢視可見(jiàn)藥材斑點(diǎn)長(zhǎng)帶，無(wú)法清晰分辨；硫酸乙醇加熱顯色后斑點(diǎn)有重疊，無(wú)法滿(mǎn)足鑒別目的；展開(kāi)劑為三氯甲烷﹣甲醇(體積比6:4)的TLC圖譜見(jiàn)圖1、圖2；

展開(kāi)劑為三氯甲烷﹣甲醇(體積比9:1)：展開(kāi)斑點(diǎn)Rf值較小，斑點(diǎn)集中在點(diǎn)樣位置，斑點(diǎn)未充分展開(kāi)，重疊嚴(yán)重，無(wú)法達(dá)到鑒別目的；展開(kāi)劑為三氯甲烷﹣甲醇(體積比9:1)的TLC圖譜見(jiàn)圖3、圖4；

展開(kāi)劑為異丙醇﹣甲醇﹣甲酸(體積比4:1:0.2)、異丙醇﹣甲醇﹣甲酸(體積比6:1:0.2)、異丙醇﹣甲醇﹣甲酸(體積比8:1:0.2)，藥材斑點(diǎn)Rf值在0.4﹣0.7之間，且分離良好，顯色清晰。展開(kāi)劑為異丙醇﹣甲醇﹣甲酸(體積比4:1:0.2)的TLC圖譜見(jiàn)圖5、圖6。

因此，在體積份數(shù)比為4﹣8:1:0.2的異丙醇﹣甲醇﹣甲酸展開(kāi)劑條件下，有較好的展開(kāi)效果。其中，體積份數(shù)比6:1:0.2的異丙醇﹣甲醇﹣甲酸的展開(kāi)劑展開(kāi)效果最好。

實(shí)驗(yàn)例2：標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜的獲得實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

試驗(yàn)儀器：高效液相色譜儀：Agilent 1260

電子天平：島津AUW﹣220D

紫外分光光度計(jì)：島津UV﹣2450

對(duì)照品：山梔苷甲酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)批號(hào)：111873﹣201103

供試品：螃蟹甲(金訶藏藥股份有限公司提供)批號(hào)：20150101、20150103、20150204、20150205、20150301、20150302、20150303、20150401、20150402、20150403。

2、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm；流速：1.0ml/min；分析時(shí)間：60分鐘。

對(duì)照品溶液的制備：取山梔苷甲酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含山梔苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供試品溶液的制備：取藏藥螃蟹甲粉末1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理60分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：按供試品溶液的制備方法得到供試品溶液，190﹣600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，根據(jù)紫外吸收?qǐng)D譜，選定245nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相選擇：按供試品溶液的制備方法得到供試品溶液，分別采用下列流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：

流動(dòng)相1：乙腈(A)﹣水(B)，梯度洗脫：0﹣8分鐘乙腈保持8％，8﹣35分鐘乙腈由8％升至35％，35﹣50分鐘乙腈由35％升至75％，50﹣75分鐘乙腈保持75％；

流動(dòng)相2：乙腈(A)﹣水(B)，梯度洗脫：0﹣8分鐘乙腈保持0％，8﹣10分鐘乙腈由0％升至5％，10﹣20分鐘乙腈保持5％，20﹣40分鐘乙腈由5％升至12.5％，40﹣60分鐘乙腈由12.5％升至100％，60﹣70分鐘乙腈保持100％；

流動(dòng)相3：乙腈(A)﹣體積分?jǐn)?shù)比為0.05％的磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0﹣15分鐘乙腈保持4％，15﹣60分鐘乙腈由4％升至40％；

3、結(jié)果：見(jiàn)圖7-9。

流動(dòng)相1圖譜：出峰較多但集中于前30分鐘，重疊峰較多，分離度不理想；

流動(dòng)相2圖譜：出峰偏少，且60分鐘后出峰重疊，分離度較差；

流動(dòng)相3圖譜：出峰較多，分離度較好。

4、HPLC特征圖譜：取10批螃蟹甲按供試品溶液的制備方法得到供試品溶液，按上述色譜條件獲得10批螃蟹甲制劑的高效液相色譜圖，以這10批螃蟹甲制劑特征圖譜為基礎(chǔ)，采用《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》進(jìn)行評(píng)價(jià)，在245nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的相似度大于0.85的圖譜。如圖10所示。

所得螃蟹甲HPLC特征圖譜中的特征峰為13個(gè)，其中6號(hào)峰山梔苷甲酯為標(biāo)準(zhǔn)峰，13個(gè)峰與標(biāo)準(zhǔn)峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.133﹣0.147、0.363﹣0.401、0.752﹣0.831、0.817﹣0.903、0.854﹣0.944、1.000、1.090﹣1.205、1.132﹣1.251、1.267﹣1.401、1.307﹣1.438、1.365﹣1.509、1.393﹣1.540、1.522﹣1.683。

實(shí)驗(yàn)例3：HPLC特征圖譜檢測(cè)方法的方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)

1、精密度試驗(yàn)

取批號(hào)為20150403批螃蟹甲樣品，按上述供試品溶液的制備方法得到的供試品溶液一份，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次測(cè)定，結(jié)果表明：本發(fā)明提供的特征圖譜檢測(cè)方法精密度良好。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 螃蟹甲HPLC特征圖譜精密度考察結(jié)果(相對(duì)保留時(shí)間)

2、重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為20150403批螃蟹甲樣品，按上述供試品溶液的制備方法得到的供試品溶液六份，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明：本發(fā)明提供的特征圖譜檢測(cè)方法重復(fù)性良好。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 螃蟹甲HPLC特征圖譜重復(fù)性考察結(jié)果(相對(duì)保留時(shí)間)

3、穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為20150403批螃蟹甲樣品，按上述供試品溶液的制備方法得到的供試品溶液一份，在上述色譜條件下分別在0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明：本發(fā)明提供的特征圖譜檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 螃蟹甲HPLC特征圖譜穩(wěn)定性考察結(jié)果(相對(duì)保留時(shí)間)

下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例所述的效果。

實(shí)施例1：一種藏藥螃蟹甲的檢測(cè)方法，包括

A、薄層鑒別方法

取螃蟹甲藥材粉末1g，加乙醇10ml，加熱回流30分鐘，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；同法制得對(duì)照藥材溶液。取上述兩種溶液各5μl點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，照薄層色譜法試驗(yàn)，以體積比6:1:0.2的異丙醇﹣甲醇﹣甲酸為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出晾干，置254nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，和，噴以體積比10％硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

B、HPLC特征圖譜檢測(cè)方法

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈﹣體積分?jǐn)?shù)比為0.05％的磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫：乙腈體積百分變化為，0﹣15分鐘保持4％，15﹣60分鐘由12％升至40％；檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm；流速：1.0ml/min；分析時(shí)間60分鐘；

對(duì)照品溶液的制備：取山梔苷甲酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含山梔苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供試品溶液的制備：取藏藥螃蟹甲粉末1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理60分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，記錄60分鐘內(nèi)的色譜圖，即得螃蟹甲的HPLC特征圖譜。

實(shí)施例2：根據(jù)實(shí)施例1中HPLC檢測(cè)方法得到特征圖譜，其中特征峰為13個(gè)，其中6號(hào)峰山梔苷甲酯為標(biāo)準(zhǔn)峰，13個(gè)峰與標(biāo)準(zhǔn)峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.140、0.382、0.791、0.860、0.899、1.000、1.148、1.191、1.334、1.369、1.437、1.466、1.602。

實(shí)施例3：一種藏藥螃蟹甲的檢測(cè)方法

薄層鑒別方法，步驟如下：

取螃蟹甲藥材粉末1g，加乙醇10ml，加熱回流30分鐘，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；同法制得對(duì)照藥材溶液。取上述兩種溶液各5μl點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，照薄層色譜法試驗(yàn)，以體積比6:1:0.2異丙醇﹣甲醇﹣甲酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。顯色方法為：置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

實(shí)施例4：一種藏藥螃蟹甲的檢測(cè)方法

為薄層鑒別方法，操作步驟同實(shí)施例3，顯色方法為：噴以體積比10％硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

實(shí)施例5：一種藏藥螃蟹甲的檢測(cè)方法

HPLC特征圖譜檢測(cè)方法，步驟如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈(A)﹣體積分?jǐn)?shù)比為0.05％的磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫：0﹣15分鐘乙腈保持4％，15﹣60分鐘乙腈由12％升至40％；檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm；流速：1.0ml/min；分析時(shí)間：60分鐘。

對(duì)照品溶液的制備：取山梔苷甲酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含山梔苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供試品溶液的制備：取藏藥螃蟹甲粉末1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理60分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，記錄60分鐘內(nèi)的色譜圖，即得螃蟹甲的特征圖譜。