本發(fā)明涉及一種基于衍生化技術(shù)的食用油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

食用油的主要成分是甘油三酯(triacylglycerols，TAG，占95％～98％)，甘油三酯是由1個(gè)甘油分子與3個(gè)脂肪酸分子縮合而成，脂肪酸占甘油三酯分子量構(gòu)成的95％以上。脂肪酸(Fatty acid，F(xiàn)A)是一系列長(zhǎng)度不等(C4～C36)的脂肪族羧酸，是最簡(jiǎn)單的一類(lèi)脂質(zhì)化合物，是組成其他脂質(zhì)的成分。脂肪酸在維持人體健康上起著重要的作用，飲食中脂肪酸的組成及含量與腫瘤、冠心病、心腦血管病和老年癡呆癥等各種疾病的發(fā)病率密切相關(guān)性。因此，脂肪酸的組成及其配比成為衡量食用油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的最重要指標(biāo)。

游離脂肪酸(Free fatty acid，F(xiàn)FA)又稱(chēng)非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acid，NEFA)，是中性脂肪分解成的物質(zhì)。食用油中的游離脂肪酸是甘油三酯的水解產(chǎn)物，由于其分子中既含有親水基團(tuán)也含有疏水基團(tuán)，傾向于集中在食用油的表面，降低表面張力，增加氧氣在食用油脂中擴(kuò)散速率，進(jìn)而加速食用油的氧化。并且，游離脂肪酸沒(méi)有甘油三酯穩(wěn)定，更容易導(dǎo)致油的氧化和酸敗，影響油的品質(zhì)和功能。在粗制油中FFAs組成可用于描述壓榨油的質(zhì)量和評(píng)估油損傷程度。FFA成分可以作為油品在不同水分、溫度、含氧量、光照貯藏以及煎炒過(guò)程中的降解參數(shù)。

傳統(tǒng)測(cè)定食用油中游離脂肪酸的方法主要有滴定法測(cè)定酸價(jià)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)。油脂酸價(jià)以中和1克油脂中游離脂肪酸所需的氫氧化鉀的毫克數(shù)來(lái)表示，是衡量油脂品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)油脂酸價(jià)的測(cè)定多采用氫氧化鉀滴定溶解于乙醇中的油至酚酞終點(diǎn)，雖然操作簡(jiǎn)單，但不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析，且該方法需要大量的試劑，構(gòu)成潛在的環(huán)境污染，此外，滴定法測(cè)定酸價(jià)得到的是食用油中游離脂肪酸總量，不能對(duì)各游離脂肪酸進(jìn)行定性分析，也不能得到各種游離脂肪酸的含量；氣相色譜法(GC)能夠提供食用油中各游離脂肪酸的定性與定量信息，但食用油中基質(zhì)復(fù)雜，游離脂肪酸含量低、具有強(qiáng)極性和弱揮發(fā)性，因此食用油中的游離脂肪酸很難直接經(jīng)GC分離，樣品需要先經(jīng)過(guò)復(fù)雜的分離純化過(guò)程(如液液萃取食用油中游離脂肪酸或者采用磁性納米顆粒富集食用油中的游離脂肪酸等)，然后再將純化出來(lái)的游離脂肪酸進(jìn)行甲酯化衍生后，才能進(jìn)行GC分離、定性和定量分析食用油中的游離脂肪酸，整個(gè)過(guò)程非常復(fù)雜，繁瑣，費(fèi)時(shí)，且需要耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑，此外，該方法還存在穩(wěn)定性差，檢測(cè)靈敏度低等缺點(diǎn)。

因此，現(xiàn)有的食用油中游離脂肪酸分析技術(shù)在分析通量、分析靈敏度以及準(zhǔn)確性方面都存在一些不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種基于衍生化技術(shù)的食用油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，解決了食用油中基質(zhì)復(fù)雜，游離脂肪酸含量低，難以純化和富集，以及游離脂肪酸在質(zhì)譜負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)電離效率低和檢測(cè)靈敏度不足的困難，實(shí)現(xiàn)了食用油中游離脂肪酸的高效、高靈敏定性定量分析。

本發(fā)明為解決上述提出的技術(shù)問(wèn)題，所采用的技術(shù)方案為：

一種基于衍生化技術(shù)的食用油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，包括如下步驟：

1)將待測(cè)食用油樣品用溶劑稀釋?zhuān)尤雰?nèi)標(biāo)后，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)后食用油中的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為帶正電荷的游離脂肪酸衍生物，得到待測(cè)樣品的進(jìn)樣溶液；

2)將步驟1)所得待測(cè)樣品的進(jìn)樣溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，采集游離脂肪酸衍生物的譜圖和譜峰數(shù)據(jù)；

3)定性分析：根據(jù)步驟2)所得譜圖中的質(zhì)荷比，確定對(duì)應(yīng)游離脂肪酸衍生物的準(zhǔn)分子離子峰，從而對(duì)待測(cè)樣品中的游離脂肪酸進(jìn)行定性分析；

4)定量分析：將脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品用溶劑稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入內(nèi)標(biāo)后，在與步驟1)相同的條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)后游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為帶正電荷的游離脂肪酸衍生物，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品的進(jìn)樣溶液；

5)a、將步驟4)所得標(biāo)準(zhǔn)樣品的進(jìn)樣溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，采集游離脂肪酸衍生物的譜圖和譜峰數(shù)據(jù)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中游離脂肪酸與內(nèi)標(biāo)的濃度比值為橫坐標(biāo)，游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；b、將步驟2)所得譜圖中游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待測(cè)食用油樣品中的游離脂肪酸進(jìn)行定量分析。

按上述方案，所述待測(cè)食用油樣品包括菜籽油、芝麻油、玉米油、亞麻籽油、橄欖油、紫蘇油、豬油、魚(yú)油等。

按上述方案，所采用的衍生試劑為一端含有一個(gè)氨基(-NH₂)，另一端含有一個(gè)叔胺基的化合物，通式表示為：NH₂-(CH₂)n-NR₂，其中，n取值范圍是2～4，R基團(tuán)為甲基，乙基等。優(yōu)選地，n＝2時(shí)衍生效果和質(zhì)譜檢測(cè)效果均較為理想，例如衍生試劑選擇N,N-二甲基乙二胺和N,N-二乙基乙二胺等。所述衍生試劑中的氨基與游離脂肪酸中的羧基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，將衍生試劑另一端的叔胺基基團(tuán)引入到游離脂肪酸中，從而引入一個(gè)易電離的正電荷基團(tuán)，將帶負(fù)電荷的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為帶正電荷的游離脂肪酸衍生物。

按上述方案，所述衍生化反應(yīng)的條件為：將食用油樣品用溶劑稀釋后加入內(nèi)標(biāo)、催化劑渦旋混勻，然后加入衍生試劑，反應(yīng)溫度為38～42℃，反應(yīng)時(shí)間為2～10min。

按上述方案，所述衍生化反應(yīng)中，以氘代十六烷酸(FA16:0-d4)為內(nèi)標(biāo)，以2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(2-chloro-1-methylpyridinium iodide，CMPI)和三乙胺(triethylamine，TEA)為催化劑，以N,N-二乙基乙二胺(N，N-diethyl-1，2-ethanediamine，DEEA)為衍生試劑，溶劑采用乙腈等有機(jī)溶劑。優(yōu)選地，在衍生化反應(yīng)體系中，脂肪酸的濃度為0.5～200nmol/L，內(nèi)標(biāo)的濃度為5～15nmol/L，催化劑三乙胺的濃度為0.5～0.7μmol/mL，催化劑2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物的濃度為0.1～0.5μmol/mL，衍生試劑N,N-二乙基乙二胺的濃度為0.6～1.2μmol/mL。

按上述方案，本發(fā)明對(duì)食用油中游離脂肪酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為帶正電荷的游離脂肪酸衍生物，在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，游離脂肪酸衍生物在質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)裂解中會(huì)產(chǎn)生一個(gè)固定質(zhì)量數(shù)的中性基團(tuán)(如衍生試劑為N，N-二乙基乙二胺時(shí)，中性基團(tuán)為NH-(CH₂CH₃)₂，質(zhì)量數(shù)為73Da)，因此采用質(zhì)譜中性丟失掃描模式，掃描中性丟失質(zhì)量數(shù)73Da(NLS73)，能夠選擇性的檢測(cè)到各脂肪酸衍生物的準(zhǔn)分子離子峰，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)食用油樣品中游離脂肪酸的定性定量分析，如圖10-11所示。

按上述方案，步驟1)和步驟4)所得進(jìn)樣溶液優(yōu)選經(jīng)過(guò)干燥、復(fù)溶、純化等預(yù)處理過(guò)程再進(jìn)行質(zhì)譜分析。所述預(yù)處理過(guò)程為一次以上，其中，干燥采用氮?dú)?、氦氣、氬氣等吹干；?fù)溶采用氯仿等有機(jī)溶劑；純化包括萃取與過(guò)濾等，其中萃取采用甲酸、水、氯仿組成的混合溶液；過(guò)濾采用孔徑為0.1～5μm的有機(jī)相濾膜。

按上述方案，所述質(zhì)譜分析的條件為：注射針泵進(jìn)樣，進(jìn)樣流速為10～30μL/min；電噴霧電離源(Electrospray Ionization，ESI)：正離子模式；質(zhì)譜掃描模式：73Da中性丟失掃描(73Da neutral loss scan)；離子源氣體1(Ion Source Gas 1，GS 1)：12kPa；碰撞能(collision energy，CE)：30～35eV；去簇電壓(declustering potential，DP)：70～80eV；入口電壓(Entrance Potential，EP)：10V；碰撞室輸出電壓(Collision Cell Exit Potential，CXP)：10V；質(zhì)量范圍：200～550m/z。

按上述方案，所述步驟4)中衍生化反應(yīng)的條件與步驟1)相同；步驟4)中質(zhì)譜分析的條件與步驟2)相同；所述步驟4)中的溶劑與步驟1)中相同。

按上述方案，所述步驟4)中標(biāo)準(zhǔn)溶液為一種或幾種脂肪酸的混合溶液，且所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中脂肪酸的濃度范圍均在0.5～200nmol/L。

本發(fā)明提出了一種基于衍生化技術(shù)的食用油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法。該方法采用一端含有一個(gè)氨基(-NH₂)，另一端含有一個(gè)叔胺基的化合物，如N,N-二甲基乙二胺作為衍生試劑，用于食用油中游離脂肪酸的衍生。衍生試劑中的氨基基團(tuán)與游離脂肪酸中的羧基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，將衍生試劑另一端的叔胺基基團(tuán)引入到游離脂肪酸中，從而引入一個(gè)易電離的正電荷基團(tuán)，而將帶負(fù)電荷的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為帶正電荷的游離脂肪酸衍生物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、食用油中基質(zhì)復(fù)雜，游離脂肪酸含量低，傳統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法需要首先對(duì)食用油中的游離脂肪酸進(jìn)行富集和純化，然后再對(duì)富集純化后的游離脂肪酸進(jìn)行甲酯化衍生后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，操作步驟非常復(fù)雜且檢測(cè)靈敏度低。而本發(fā)明中，在優(yōu)化的衍生條件下，衍生試劑中的氨基基團(tuán)特異性的和食用油中含有羧基基團(tuán)的游離脂肪酸類(lèi)化合物發(fā)生酰胺化縮合，因此無(wú)需對(duì)食用油樣品中的游離脂肪酸進(jìn)行富集和純化，直接將食用油稀釋后即可進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間僅需5分鐘左右，解決了食用油中基質(zhì)復(fù)雜，游離脂肪酸含量低，傳統(tǒng)分析方法純化和富集步驟復(fù)雜，所需時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。

2、本發(fā)明所采用的衍生試劑中的氨基基團(tuán)與游離脂肪酸中的羧基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，將衍生試劑另一端的叔胺基基團(tuán)引入到游離脂肪酸中，從而引入一個(gè)易電離的正電荷基團(tuán)，而將帶負(fù)電荷的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為帶正電荷的游離脂肪酸衍生物，成功地實(shí)現(xiàn)了在正離子模式下檢測(cè)衍生化產(chǎn)物，提高了電離效率，減少電離抑制，大大提高了電噴霧質(zhì)譜靈敏度；同時(shí)，解決了游離脂肪酸在質(zhì)譜負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)電離效率低和檢測(cè)靈敏度不足的困難，實(shí)現(xiàn)了食用油中游離脂肪酸的高靈敏的檢測(cè)分析。

3、本發(fā)明對(duì)食用油中游離脂肪酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，游離脂肪酸衍生物在質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)裂解中會(huì)產(chǎn)生一個(gè)固定質(zhì)量數(shù)的中性基團(tuán)(如衍生試劑為N，N-二乙基乙二胺時(shí)，中性基團(tuán)為NH-(CH₂CH₃)₂，質(zhì)量數(shù)為73Da)，因此采用質(zhì)譜中性丟失掃描模式，掃描中性丟失質(zhì)量數(shù)73Da(NLS73)，能夠選擇性的檢測(cè)到各脂肪酸衍生物的準(zhǔn)分子離子峰。相比于傳統(tǒng)方法，本發(fā)明所采用的基于衍生化技術(shù)的食用油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法對(duì)食用油中游離脂肪酸類(lèi)化合物具有高選擇性，能特異性的對(duì)食用油中游離脂肪酸類(lèi)化合物進(jìn)行高選擇性分析，尤其適合于分析復(fù)雜基質(zhì)樣品中的游離脂肪酸類(lèi)化合物。

4、本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，待測(cè)食用油樣品直接稀釋后進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到的反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行色譜柱分離，直接進(jìn)入質(zhì)譜，在正離子模式下采用中性丟失掃描進(jìn)行分析，方法簡(jiǎn)便快捷，能夠?qū)崿F(xiàn)食用油中游離脂肪酸的高效、高選擇性、高靈敏的定性定量分析。

附圖說(shuō)明

圖1是質(zhì)譜分析16種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(癸酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、十五烷酸(15:0)、棕櫚油酸(16:1)、棕櫚酸(16:0)、亞麻酸(18:3)、亞油酸(18:2)、油酸(18:1)、硬脂酸(18:0)、十九烷酸(19:0)、二十碳五烯酸(EPA，20:5)、花生四烯酸(ARA，20:4)、二十碳烯酸(20:1)、花生酸(20:0)、二十二碳六烯酸(DHA，22:6))衍生物和內(nèi)標(biāo)(氘代十六烷酸，F(xiàn)A16:0-d4(IS))衍生物在正離子模式下進(jìn)行中性丟失掃描(73Da)(+NLS73Da)的質(zhì)譜圖；

圖2中：a為橄欖油樣品中的游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖，b為橄欖油中游離脂肪酸的含量圖；

圖3中：a為亞麻籽油樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖，b為亞麻籽油中游離脂肪酸的含量圖；

圖4中：a為紫蘇油樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖，b為紫蘇油中游離脂肪酸的含量圖；

圖5中：a為芝麻油樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖，b為芝麻油中游離脂肪酸的含量圖；

圖6中：a為玉米油樣品中的游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖，b為玉米油中的游離脂肪酸的含量圖；

圖7中：a為菜籽油樣品中的游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖，b為菜籽油中游離脂肪酸的含量圖；

圖8中：a為魚(yú)油樣品中的游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖，b為魚(yú)油中游離脂肪酸的含量圖；

圖9中：a為豬油的游離脂肪酸的質(zhì)譜圖，b為豬油的游離脂肪酸含量圖；

圖10是游離脂肪酸衍生化反應(yīng)原理圖；

圖11是游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜分析原理圖。

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明中用到的脂肪酸縮寫(xiě)說(shuō)明：10:0，癸酸；12:0，月桂酸；14:0，肉豆蔻酸；15:0，十五烷酸；16:1，棕櫚油酸；16:0，棕櫚酸；18:3，亞麻酸；18:2，亞油酸；18:1，油酸；18:0，硬脂酸；19:0，十九烷酸；20:5，二十碳五烯酸；20:4，花生四烯酸；20:1，二十碳烯酸；20:0，花生酸；22:6，二十二碳六烯酸；IS，內(nèi)標(biāo)：氘代十六烷酸(FA16:0-d4)。

下述實(shí)施例中質(zhì)譜分析條件為美國(guó)Applied Biosystems公司4000Q-Trap質(zhì)譜檢測(cè)器。

下述實(shí)施例中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟如下：

1)將脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品分別用異丙醇配成1mg/mL的貯存溶液，然后用乙腈分別稀釋成濃度為0.5nmol/L，1nmol/L，2nmol/L，20nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，150nmol/L，200nmol/L脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液；

2)分別取50μL脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液到810μL的乙腈中，各加入10μL1μmol/L內(nèi)標(biāo)d4-16:0渦旋10s混勻后，再加入20μL20μmol/mL的2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)和30μL 20μmol/mL三乙胺(TEA)，渦旋60s；然后再加入50μL20μmol/mL的衍生試劑N，N-二乙基乙二胺，40℃超聲5min，衍生化反應(yīng)完成；

3)將步驟2)所得衍生化反應(yīng)后的溶液用氮?dú)獯蹈?，然后?mL的氯仿復(fù)溶，渦旋30s后，加入體積比為10:90:20的甲酸：水：氯仿溶液1mL，渦旋2min，棄上層溶劑；重復(fù)此操作2次，再用氮?dú)獯蹈?，并?mL的色譜純乙腈復(fù)溶，然后經(jīng)過(guò)2μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品的進(jìn)樣溶液；

4)將步驟3)所得標(biāo)準(zhǔn)樣品的進(jìn)樣溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，采集游離脂肪酸衍生物的譜圖和譜峰數(shù)據(jù)(見(jiàn)圖1)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中脂肪酸與內(nèi)標(biāo)的濃度比值為橫坐標(biāo)x，脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)表1)。

圖1為15種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(10:0、12:0、14:0、15:0、16:1、16:0、18:3、18:2、18:1、18:0、20:5、20:4、20:1、20:0、22:6)經(jīng)過(guò)衍生后進(jìn)行質(zhì)譜分析，在正離子模式下進(jìn)行73Da中性丟失(+NLS73Da)掃描的質(zhì)譜圖。

表1是16種游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以游離脂肪酸與內(nèi)標(biāo)濃度比值為橫坐標(biāo)，游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)。

表1

5)方法準(zhǔn)確度與精密度：以玉米油為代表，在樣品稀釋液中加入低、中、高濃度的脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度平行制備3個(gè)樣品，以回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表征準(zhǔn)確度，日內(nèi)精密度和日間精密度的評(píng)價(jià)是在3個(gè)工作日內(nèi)分別制備3個(gè)樣品，重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值。游離脂肪酸回收率的計(jì)算公式為，回收率＝(添加標(biāo)準(zhǔn)品后測(cè)的樣品中FFA含量-未添加標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)的實(shí)際樣品中FFA含量)/實(shí)際添加的量，由表2可見(jiàn)，待測(cè)樣品的回收率在85.3～117.6％，方法重復(fù)性在可接受范圍內(nèi)(RSD<10％)。

表2

實(shí)施例1

一種基于衍生化技術(shù)的橄欖油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，包括如下步驟：

1)稱(chēng)取2mg橄欖油用正己烷稀釋至0.2mg/ml，作為待測(cè)樣品；

取60μL待測(cè)樣品加入830μL乙腈稀釋?zhuān)缓蠹尤?0μL1μmol/L內(nèi)標(biāo)FA16:0-d4渦旋10s混勻后，加入20μL20μmol/mL的2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)和30μL 20μmol/mL三乙胺(TEA)，渦旋60s；然后再加入50μL20μmol/mL的衍生試劑N，N-二乙基乙二胺(DEEA)，40℃超聲5min，衍生化反應(yīng)完成；

所得衍生化反應(yīng)后的溶液用氮?dú)獯蹈?，然后?mL的氯仿復(fù)溶，渦旋30s后，加入體積比為10:90:20的甲酸：水：氯仿溶液1mL，渦旋2min，棄上層溶劑；重復(fù)此操作2次，再用氮?dú)獯蹈?，并?mL的色譜純乙腈復(fù)溶，然后經(jīng)過(guò)2μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾，得到待測(cè)樣品的進(jìn)樣溶液；

2)將步驟1)所得待測(cè)樣品的進(jìn)樣溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，采集游離脂肪酸衍生物的譜圖和譜峰數(shù)據(jù)，如圖2所示；

其中，質(zhì)譜分析的條件為：注射針泵進(jìn)樣，進(jìn)樣流速為20μL/min，進(jìn)行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜分析條件為美國(guó)Applied Biosystems公司4000Q-Trap質(zhì)譜檢測(cè)器。電噴霧電離源(Electrospray Ionization，ESI)：正離子模式；質(zhì)譜掃描模式：73Da中性丟失掃描(73Da neutral lossscan)；離子源氣體1(Ion Source Gas 1，GS1)：12kPa；碰撞能(collision energy，CE)：32eV；去簇電壓(declustering potential，DP)：75eV；入口電壓(Entrance Potential，EP)：5V；碰撞室輸出電壓(Collision Cell Exit Potential，CXP)：10V；質(zhì)量范圍：210-550m/z

3)定性分析：根據(jù)步驟2)所得譜圖中的質(zhì)荷比，確定對(duì)應(yīng)游離脂肪酸衍生物的準(zhǔn)分子離子峰，從而對(duì)待測(cè)樣品中的游離脂肪酸進(jìn)行定性分析；根據(jù)質(zhì)譜圖2a，可以得到橄欖油中含有8種游離脂肪酸分別為：14:0、16:0、18:3、18:2、18:1、18:0以及20:0；

4)定量分析：將步驟2)所得譜圖中游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值1.401(14:0)、1.577(16:0)、0.012(18:3)、0.168(18:2)、1.622(18:1)、1.206(18:0)以及0.2156(20:0)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，對(duì)橄欖油待測(cè)樣品中的游離脂肪酸進(jìn)行定量分析，得到游離脂肪酸的含量如圖2b所示，分別為：424.94μg/g(14:0)、536.70μg/g(16:0)、37.63μg/g(18:3)、157.64μg/g(18:2)、1545.95μg/g(18:1)、562.14μg/g(18:0)以及11.67μg/g(20:0)。

實(shí)施例2

一種基于衍生化技術(shù)的亞麻籽油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，與實(shí)施例1的不同之處在于：實(shí)施例1中的橄欖油待測(cè)樣品替換為亞麻籽油待測(cè)樣品。

圖3a和圖3b是亞麻籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖和游離脂肪酸含量。根據(jù)質(zhì)譜圖3a，可以知道亞麻籽油待測(cè)樣品中含有8種游離脂肪酸，分別為14:0、16:1、16:0、18:3、18:2、18:1、18:0以及20:1；所得亞麻籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值分別為：0.200(14:0)、0.006(16:0)、0.122(18:3)、0.116(18:2)、0.199(18:1)、0.681(18:0)以及0.003(20:0)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，對(duì)亞麻籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸進(jìn)行定量分析，得到亞麻籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量如圖3b所示，分別為：112.14μg/g(14:0)、169.42μg/g(16:1)、292.42μg/g(16:0)、593.25μg/g(18:3)、174.50μg/g(18:2)、244.89μg/g(18:1)、504.76μg/g(18:0)以及62.53μg/g(20:1)。

實(shí)施例3

一種基于衍生化技術(shù)的紫蘇油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，與實(shí)施例1的不同之處在于：實(shí)施例1中的橄欖油待測(cè)樣品替換為紫蘇油待測(cè)樣品。

圖4a和圖4b是紫蘇油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖和游離脂肪酸含量。根據(jù)質(zhì)譜圖4a，可以知道紫蘇油待測(cè)樣品中含有7種游離脂肪酸，分別為14:0、16:0、18:3、18:2、18:1、18:0以及20:0；所得亞麻籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值分別為：1.151(14:0)、1.356(16:0)、0.284(18:3)、0.129(18:2)、0.106(18:1)、0.964(18:0)以及0.015(20:0)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，對(duì)紫蘇油待測(cè)樣品中游離脂肪酸進(jìn)行定量分析，得到紫蘇油待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量如圖4b所示，分別為：422.05μg/g(14:0)、457.73μg/g(16:0)、689.84μg/g(18:3)、120.83μg/g(18:2)、34.38μg/g(18:1)、435.69μg/g(18:0)以及8.96μg/g(20:0)。

實(shí)施例4

一種基于衍生化技術(shù)的芝麻油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，與實(shí)施例1的不同之處在于：實(shí)施例1中的橄欖油待測(cè)樣品替換為芝麻油待測(cè)樣品。

圖5a和圖5b是芝麻油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖和游離脂肪酸含量。根據(jù)質(zhì)譜圖5a，可以知道芝麻油待測(cè)樣品中含有7種游離脂肪酸，分別為14:0、16:0、18:3、18:2、18:1、18:0以及20:0。所得芝麻油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值分別為：1.327(14:0)、1.442(16:0)、0.013(18:3)、0.786(18:2)、1.435(18:1)、1.358(18:0)以及0.049(20:0)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，對(duì)芝麻油待測(cè)樣品中游離脂肪酸進(jìn)行定量分析，得到芝麻油待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量如圖5b所示，分別為：479.67μg/g(14:0)、527.95μg/g(16:0)、34.20μg/g(18:3)、1382.37μg/g(18:2)、1229.63μg/g(18:1)、641.49μg/g(18:0)以及64.05μg/g(20:0)。

實(shí)施例5

一種基于衍生化技術(shù)的玉米油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，與實(shí)施例1的不同之處在于：實(shí)施例1中的橄欖油待測(cè)樣品替換為玉米油待測(cè)樣品。

圖6a和圖6b是玉米油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖和游離脂肪酸含量。根據(jù)質(zhì)譜圖6a，可以知道玉米油待測(cè)樣品中含有5種游離脂肪酸，分別為14:0、16:0、18:3、18:2以及18:0；所得玉米油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值分別為：0.848(14:0)、0.622(16:0)、0.005(18:3)、0.059(18:2)以及0.292(18:0)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，對(duì)玉米油待測(cè)樣品中游離脂肪酸進(jìn)行定量分析，得到玉米油待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量如圖6b所示，分別為：236.04μg/g(14:0)、146.06μg/g(16:0)、15.10μg/g(18:3)、65.93μg/g(18:2)以及124.89μg/g(18:0)。

實(shí)施例6

一種基于衍生化技術(shù)的菜籽油樣品中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，與實(shí)施例1的不同之處在于：實(shí)施例1中的橄欖油待測(cè)樣品替換為菜籽油待測(cè)樣品。

圖7a和圖7b是菜籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖和游離脂肪酸含量。根據(jù)質(zhì)譜圖7a，可以知道菜籽油待測(cè)樣品中含有7種游離脂肪酸，分別為14:0、16:0、18:3、18:2、18:1、18:0以及20:1；所得菜籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值分別為：1.046(14:0)、1.086(16:0)、0.046(18:3)、0.162(18:2)、0.528(18:1)、1.061(18:0)以及0.018(20:1)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，對(duì)菜籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸進(jìn)行定量分析，得到菜籽油待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量如圖7b所示，分別為：354.80μg/g(14:0)、335.75μg/g(16:0)、115.57μg/g(18:3)、118.20μg/g(18:2)、383.82μg/g(18:1)、486.17μg/g(18:0)以及114.91μg/g(20:1)。

實(shí)施例7

一種基于衍生化技術(shù)的魚(yú)油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，與實(shí)施例1的不同之處在于：實(shí)施例1中的橄欖油待測(cè)樣品替換為魚(yú)油待測(cè)樣品。

圖8a和圖8b是魚(yú)油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖和游離脂肪酸含量。根據(jù)質(zhì)譜圖8a，可以知道魚(yú)油待測(cè)樣品中含有12種游離脂肪酸，分別為：14:0、16:1、16:0、18:3、18:2、18:1、18:0、20:5、20:4、20:1、20:0以及22:6；所得魚(yú)油待測(cè)樣品的游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值分別為：0.661(14:0)、0.0903(16:1)、1.247(16:0)、0.029(18:3)、0.242(18:2)、0.269(18:1)、1.097(18:0)、0.124(20:5)、0.0182(20:4)、0.0218(20:1)、0.0249(20:0)以及0.0218(22:6)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，對(duì)魚(yú)油待測(cè)樣品中游離脂肪酸進(jìn)行定量分析，得到魚(yú)油待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量如圖8b所示，分別為：206.45μg/g(14:0)、28.58μg/g(16:1)、482.23μg/g(16:0)、88.58μg/g(18:3)、276.23μg/g(18:2)、136.66μg/g(18:1)、593.43μg/g(18:0)、357.76μg/g(20:5)、116.12μg/g(20:4)、156.38μg/g(20:1)、30.61μg/g(20:0)以及116.52μg/g(22:6)。

實(shí)施例8

一種基于衍生化技術(shù)的豬油中游離脂肪酸的質(zhì)譜分析方法，與實(shí)施例1的不同之處在于：實(shí)施例1中的橄欖油待測(cè)樣品替換為豬油待測(cè)樣品。

圖9a和圖9b是豬油待測(cè)樣品中游離脂肪酸衍生物的質(zhì)譜圖和游離脂肪酸含量。根據(jù)質(zhì)譜圖9a，可以知道豬油待測(cè)樣品中含有9種游離脂肪酸，分別為14:0、16:1、16:0、18:3、18:2、18:1、18:0、20:1以及20:0；所得豬油待測(cè)樣品的游離脂肪酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度比值分別為：0.319(14:0)、0.059(16:1)、0.957(16:0)、0.0209(18:3)、0.457(18:2)、1.200(18:1)、0.822(18:0)、0.0366(20:1)以及0.0191(20:0)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，對(duì)豬油待測(cè)樣品中游離脂肪酸進(jìn)行定量分析，得到豬油待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量如圖9b所示，分別為：54.25μg/g(14:0)、14.54μg/g(16:1)、282.89μg/g(16:0)、65.58μg/g(18:3)、428.82μg/g(18:2)、1086.41μg/g(18:1)、384.36μg/g(18:0)、191.56μg/g(20:1)以及16.06μg/g(20:0)。

綜上所述，本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，待測(cè)食用油樣品直接稀釋后進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到的反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行色譜柱分離，直接進(jìn)入質(zhì)譜，在正離子模式下采用中性丟失掃描進(jìn)行分析，方法簡(jiǎn)便快捷，能夠?qū)崿F(xiàn)食用油中游離脂肪酸的高效、高選擇性、高靈敏的定性定量分析。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變換，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。