本申請要求2014年3月18日提交的美國臨時專利申請系列No.61/954914的優(yōu)先權，該申請以引用方式全文并入本文。

背景技術：

對于乳腺癌(BCa)患者而言，早期且個性化的診斷對于優(yōu)化可導致長期存活的治療而言是重要的。盡管乳房攝影術是檢測BCa的最廣泛使用的方法，但是很大程度上由于高的乳腺密度，大約20％的篩選乳房X照片會得到錯誤的陰性診斷。此外，在取得乳房X線照片的10名女性中，1名女性需要另外成像。然而，絕大多數(shù)的這些女性并未患有BCa，因為每1000個篩選的乳房X線照片中，僅2至4個得到癌癥診斷。因此，臨床上迫切需要研發(fā)用于BCa的早期診斷和監(jiān)測的新型最低侵入性診斷策略。

發(fā)明概述

在第一個方面中，本發(fā)明提供了由2至25個抗體檢測標志物組成的組合物，其中所述的組合物包含用于檢測針對至少2種蛋白質的人類自身抗體的試劑，其中所述的蛋白質選自ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2。在一個實施方案中，所述的組合物包含用于檢測針對至少2種蛋白質的人類自身抗體的試劑，其中所述的蛋白質選自ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2。在另一個實施方案中，所述的組合物包含用于檢測針對所述的組中的至少5種蛋白質的人類自身抗體的試劑。在另一個實施方案中，所述的組合物進一步包含用于檢測針對MUC1和/或GRN的人類自身抗體的試劑。在多個實施方案中，所述的組合物由2至20個、4至10個、以及5-10個抗體檢測標志物組成。在多個其他的實施方案中，所述的組合物包含用于檢測針對以下標志物組的一組標志物的人類自身抗體的試劑，其中所述的標志物組為：

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白,LRRC1和5MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；

DKK1,GAL1,顆粒體蛋白和LRRC15；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；

DKK1,GAL1和LRRC15；

ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；

GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

GAL1,GFRA1和LRRC15；

ANGPTL4,GAL1和LRRC15；

DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；

GAL1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1和GFRA1；

DKK1,GAL1和GFRA1；以及

GAL1,GFRA1和MUC1。

在另一個實施方案中，用于檢測人類自身抗體的試劑包括至少2種蛋白質，或它們的抗原片段。在另一個實施方案中，至少2種蛋白質或其抗原片段包含天然的細胞外結構域和/或天然分泌的蛋白質或它們的抗原片段。在其他的實施方案中，所述的試劑是可檢測標記的。在另一個實施方案中，所述的試劑固定在表面上。

在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于檢測乳腺癌或乳腺疾病復發(fā)的方法，其包括將由處于乳腺癌或乳腺癌復發(fā)風險下的受試對象得到的體液樣品與用于檢測自身抗體的一種或多種試劑接觸，其中所述的自身抗體對抗以下的一種或多種：ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2，其中對抗一種或多種蛋白質的自身抗體的存在與受試對象患有乳腺癌或乳腺癌復發(fā)的可能性相關。在另一個實施方案中，所述的試劑包含用于檢測自身抗體的試劑，其中所述的自身抗體針對以下的一種或多種：ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2。在多個其他的實施方案中，所述的試劑包含用于檢測針對兩種或多種、或者五種或多種所述的蛋白質的自身抗體的試劑。在另一個實施方案中，所述的試劑包含用于檢測針對以下標志物組的一組標志物的人類自身抗體的試劑，其中所述的標志物組為：

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白,LRRC1和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；

DKK1,GAL1,顆粒體蛋白和LRRC15；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；

DKK1,GAL1和LRRC15；

ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；

GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

GAL1,GFRA1和LRRC15；

ANGPTL4,GAL1和LRRC15；

DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；

GAL1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1和GFRA1；

DKK1,GAL1和GFRA1；以及

GAL1,GFRA1和MUC1。

在另一個實施方案中，所述的試劑包含用于檢測針對ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的人類自身抗體的試劑。在另一個實施方案中，所述的一種或多種試劑包含本發(fā)明的任意實施方案的或實施方案的組合的組合物。在另一個實施方案中，所述的接觸包括ELISA的用途。在另一個實施方案中，體液樣品包括得自受試對象的血清樣品。在另一個實施方案中，所述的方法將所述的受試對象鑒定為可能患有乳腺癌或乳腺癌復發(fā)。在另一個實施方案中，所述的方法進一步包括使用足以治療乳腺癌或乳腺癌復發(fā)的量的治療試劑來治療受試對象。

在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于治療患有乳腺癌的受試對象的方法，其包括：(a)檢驗由處于乳腺癌風險下的受試對象得到的體液樣品，并鑒定候選受試對象，該受試對象為：

(i)具有對抗ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的至少一者的自身抗體；和/或

(ii)不具有對抗GFRA1,GRN和/或LRRC15的自身抗體；以及

(b)使用足以治療乳腺癌的量的治療試劑來治療候選受試對象。

在一個實施方案中，所述的接觸包括使用縱向檢測篩選(Longitudinal Assay Screening)，其中在單一的檢驗和稀釋中檢測并定量所有的靶物生物標志。在另一個實施方案中，所述的體液樣品包含得自受試對象的血液樣品。

附圖簡述

圖1.抗原構象影響抗體識別。A.使用抗原進行ELISA分析，其中所述的抗原被設計具有天然構象。使用抗兔IgG涂敷各孔，再使用在293T細胞中形成的HER-2-ECD-rFc蛋白質涂敷各孔。在ELISA中使用針對天然HER-2,3F32(藍色),Herceptin(綠色)或針對變性的HER-2,3F27(紅色)的抗HER-2單克隆抗體的系列稀釋。在加入合適的二級抗體后發(fā)生反應。O.D.為針對所述的反應讀取的吸光率。B.使用變性抗原的ELISA分析。使用在E.coli中形成的純化的His-HER-2-ECD涂敷各孔，并加入系列稀釋的3F32(藍色),Herceptin(綠色)或3F27(紅色)。在加入二級抗體后，發(fā)生所述的反應。C.通過流式細胞儀在SKBR3細胞上檢測HER-2。熒光顯示在SKBR3細胞的表面上的HER-2的抗體識別。D.結合競爭測試，用于證明帶有構象抗原的ELISA的特異性。使用抗兔IgG預涂敷各孔，然后使用HER-2-ECD-rFc預涂敷。將純化的HER-2-Fc(黑色)或CD30-Fc(紫色)的嵌合蛋白質系列稀釋，并加入至恒定量的Herceptin，然后加入至各孔中。在與二級抗體溫育之后，發(fā)生反應。

圖2.用于對乳腺癌患者分類的ROC曲線比較。將針對7種抗原(即，ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,GRN,LRRC15和MUC1)的自身抗體的應答加入至邏輯回歸模型中，該模型包括年齡、BMI、種族和目前的吸煙狀況。針對所有的受試對象(上方)并通過乳腺癌的特定亞型來確定ROC曲線，其中所述的乳腺癌亞型包括ER陽性、侵入性、最大重量尺寸>1cm、原位的、淋巴結轉移和HER-2擴增的(下方)。

發(fā)明詳述

所引用的所有參考文獻均以引用方式全文并入本文。

在本申請中，除非另外陳述，否則所用的技術均可以在多個公知的參考文獻的任意一份中找到，例如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook,et al.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press),Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,edited by D.Goeddel,1991.Academic Press,San Diego,CA),“Guide to Protein Purification”in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis,et al.1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,2^nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),Gene Transfer and Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.),和the Ambion 1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。

在第一個方面中，本發(fā)明提供了由2至25個抗體檢測標志物組成的組合物，其中所述的組合物包含用于檢測針對至少2種人類蛋白質的人類自身抗體的試劑，其中所述的人類蛋白質選自ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2。本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)針對所述的蛋白質的自身抗體提供受試對象是否遭受乳腺癌(BCa)的指示。因此，例如在診斷測試中可以使用本發(fā)明的組合物，從而通過檢測得自受試對象的樣品中的抗體來分辨BCa和健康患者，或者檢測乳腺癌患者在治療后疾病的復發(fā)情況。在一個實施方案中，所述的組合物包含用于檢測針對至少2種人類蛋白質的人類自身抗體的試劑，其中所述的人類蛋白質選自ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2。

在多個實施方案中，所述的組合物包含用于檢測針對所述的組中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種蛋白質的人類自身抗體的試劑。在多個其他的實施方案中，所述的組合物由2-24,2-23,2-22,2-21,2-20,2-19,2-18,2-17,2-16,2-15,2-14,2-13,2-12,2-11,2-10,2-9,2-8,2-7,2-6,2-5,2-4,2-3,3-25,3-24,3-23,3-22,3-21,3-20,3-19,3-18,3-17,3-16,3-15,3-14,3-13,3-12,3-11,3-10,3-9,3-8,3-7,3-6,3-5,3-4,4-25,4-24,4-23,4-22,4-21,4-20,4-19,4-18,4-17,4-16,4-15,4-14,4-13,4-14,4-13,4-12,4-11,4-10,4-9,4-8,4-7,4-6,4-5,5-25,5-24,5-23,5-22,5-21,5-20,5-19,5-18,5-17,5-16,5-15,5-14,5-13,5-12,5-11,5-10,5-9,5-8,5-7,5-6,6-25,6-24,6-23,6-22,6-21,6-20,6-19,6-18,6-17,6-16,6-15,6-14,6-13,6-12,6-11,6-10,6-9,6-8,6-7,7-25,7-24,7-23,7-22,7-21,7-20,7-19,7-18,7-17,7-16,7-15,7-14,7-13,7-12,7-11,7-10,7-9,7-8,8-25,8-24,8-23,8-22,8-21,8-20,8-19,8-18,8-17,8-16,8-15,8-14,8-13,8-12,8-11,8-10,8-9,9-25,9-24,9-23,9-22,9-21,9-20,9-19,9-18,9-17,9-16,9-15,9-14,9-13,9-12,9-11,9-10,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10-11,12,13,14,15或16種抗體檢測試劑組成。

如本領域那些技術人員所理解的那樣，所述的組合物可以包含適用于所述的組合物的預期用途的其他的抗體檢測標志物和對照。

在一個非限定性的實施方案中，所述的組合物可以進一步包含用于檢測針對黏蛋白-1(MUC1),HER-2(41),IGFBP2和顆粒體蛋白(GRN)中的一者或兩者的抗體的試劑。

在其他的實施方案中，所述的組合物包含或者由用于檢測人類自身抗體的試劑組成，其中所述的人類自身抗體針對以下標志物組中的一者，其中所述的標志物組在以下實施例(參見表5)中示出，從而提供用于診斷乳腺癌的強的預測值：

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白,LRRC1和5MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；

DKK1,GAL1,顆粒體蛋白和LRRC15；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；

DKK1,GAL1和LRRC15；

ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；

GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

GAL1,GFRA1和LRRC15；

ANGPTL4,GAL1和LRRC15；

DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；

GAL1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1和GFRA1；

DKK1,GAL1和GFRA1；以及

GAL1,GFRA1和MUC1。

在另一個實施方案中，所述的組合物包含或者由用于檢測針對人類ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的人類自身抗體的試劑組成。

抗體檢測標志物可以為可以用于檢測針對所述的蛋白質的抗體的任何合適的試劑，其中所述的蛋白質包括但不限于所述的蛋白質、分泌型蛋白質(例如天然分泌形式的蛋白質)、或蛋白質的細胞外結構域。分泌的蛋白質更容易于由腫瘤細胞傳遞至淋巴結，其中發(fā)生免疫細胞的相互作用，從而得到豐富的高親和性抗體。膜表面蛋白質通常以可溶的形式通過金屬蛋白酶依賴的切割由腫瘤細胞釋放。脫落的蛋白質(shed protein)比細胞內蛋白質更易于轉移至淋巴結中。因此，在一個實施方案中，抗體檢測標志物為所述的蛋白質的分泌的或膜部分。所述的人類蛋白質的分泌的或膜部分的示例性氨基酸序列如下所示：

ANGTPL4(SEQ ID NO:1)

KSPRFASWDEMNVLAHGLLQLGQGLREHAERTRSQLSALERRLSACGSACQGTEGSTDLPLAPESRVDPEVLHSLQTQLKAQNSRIQQLFHKVAQQQRHLEKQHLRIQHLQSQFGLLDHKHLDHEVAKPARRKRLPEMAQPVDPAHNVSRLHRLPRDCQELFQVGERQSGLFEIQPQGSPPFLVNCKMTSDGGWTVIQRRHDGSVDFNRPWEAYKAGFGDPHGEFWLGLEKVHSITGDRNSRLAVQLRDWDGNAELLQFSVHLGGEDTAYSLQLTAPVAGQLGATTVPPSGLSVPFSTWDQDHDLRRDKNCAKSLSGGWWFGTCSHSNLNGQYFRSIPQQRQKLKKGIFWKTWRGRYYPLQATTMLIQPMAAEAAS

DKK1(SEQ ID NO:2)

VSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH

EPHA2(SEQ ID NO:3)

KEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNL

LAMC2(SEQ ID NO:4)

TSRREVCDCNGKSRQCIFDRELHRQTGNGFRCLNCNDNTDGIHCEKCKNGFYRHRERDRCLPCNCNSKGSLSARCDNSGRCSCKPGVTGARCDRCLPGFHMLTDAGCTQDQRLLDSKCDCDPAGIAGPCDAGRCVCKPAVTGERCDRCRSGYYNLDGGNPEGCTQCFCYGHSASCRSSAEYSVHKITSTFHQDVDGWKAVQRNGSPAKLQWSQRHQDVFSSAQRLDPVYFVAPAKFLGNQQVSYGQSLSFDYRVDRGGRHPSAHDVILEGAGLRITAPLMPLGKTLPCGLTKTYTFRLNEHPSNNWSPQLSYFEYRRLLRNLTALRIRATYGEYSTGYIDNVTLISARPVSGAPAPWVEQCICPVGYKGQFCQDCASGYKRDSARLGPFGTCIPCNCQGGGACDPDTGDCYSGDENPDIECADCPIGFYNDPHDPRSCKPCPCHNGFSCSVMPETEEVVCNNCPPGVTGARCELCADGYFGDPFGEHGPVRPCQPCQCNNNVDPSASGNCDRLTGRCLKCIHNTAGIYCDQCKAGYFGDPLAPNPADKCRACNCNPMGSEPVGCRSDGTCVCKPGFGGPNCEHGAFSCPACYNQVKIQMDQFMQQLQRMEALISKAQGGDGVVPDTELEGRMQQAEQALQDILRDAQISEGASRSLGLQLAKVRSQENSYQSRLDDLKMTVERVRALGSQYQNRVRDTHRLITQMQLSLAESEASLGNTNIPASDHYVGPNGFKSLAQEATRLAESHVESASNMEQLTRETEDYSKQALSLVRKALHEGVGSGSGSPDGAVVQGLVEKLEKTKSLAQQLTREATQAEIEADRSYQHSLRLLDSVSRLQGVSDQSFQVEEAKRIKQKADSLSSLVTRHMDEFKRTQKNLGNWKEEAQQLLQNGKSGREKSDQLLSRANLAKSRAQEALSMGNATFYEVESILKNLREFDLQVDNRKAEAEEAMKRLSYISQKVSDASDKTQQAERALGSAAADAQRAKNGAGEALEISSEIEQEIGSLNLEANVTADGALAMEKGLASLKSEMREVEGELERKELEFDTNMDAVQMVITEAQKVDTRAKNAGVTIQDTLNTLDGLLHLMGM

SPON2(SEQ ID NO:5)

QPLGGESICSARAPAKYSITFTGKWSQTAFPKQYPLFRPPAQWSSLLGAAHSSDYSMWRKNQYVSNGLRDFAERGEAWALMKEIEAAGEALQSVHEVFSAPAVPSGTGQTSAELEVQRRHSLVSFVVRIVPSPDWFVGVDSLDLCDGDRWREQAALDLYPYDAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTVTEITSSSPSHPANSFYYPRLKALPPIARVTLLRLRQSPRAFIPPAPVLPSRDNEIVDSASVPETPLDCEVSLWSSWGLCGGHCGRLGTKSRTRYVRVQPANNGSPCPELEEEAECVPDNCV

SSR2(SEQ ID NO:6)

EEGARLLASKSLLNRYAVEGRDLTLQYNIYNVGSSAALDVELSDDSFPPEDFGIVSGMLNVKWDRIAPASNVSHTVVLRPLKAGYFNFTSATITYLAQEDGPVVIGSTSAPGQGGILAQREFDRRFSPH

GAL1(SEQ ID NO:7)

LRVRGEVAPDAKSFVLNLGKDSNNLCLHFNPRFNAHGDANTIVCNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGSVAEVCITFDQANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEAINYMAADGDFKIKCVAFD

GFRA1(SEQ ID NO:8)

DRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNFSLASGLEAKDECRSAMEALKQKSLYNCRCKRGMKKEKNCLRIYWSMYQSLQGNDLLEDSPYEPVNSRLSDIFRVVPFISDVFQQVEHIPKGNNCLDAAKACNLDDICKKYRSAYITPCTTSVSNDVCNRRKCHKALRQFFDKVPAKHSYGMLFCSCRDIACTERRRQTIVPVCSYEEREKPNCLNLQDSCKTNYICRSRLADFFTNCQPESRSVSSCLKENYADCLLAYSGLIGTVMTPNYIDSSSLSVAPWCDCSNSGNDLEECLKFLNFFKDNTCLKNAIQAFGNGSDVTVWQPAFPVQTTTATTTTALRVKNKPLGPAGSENEIPTHVLPPCANLQAQKLKSNVSGNTHLCISNGNYEKEGLGASSHITTKSMAAPPSCGLSPLLVLVVTALSTLLSLTETS

LRRC15(SEQ ID NO:9)

YHGCPSECTCSRASQVECTGARIVAVPTPLPWNAMSLQILNTHITELNESPFLNISALIALRIEKNELSRITPGAFRNLGSLRYLSLANNKLQVLPIGLFQGLDSLESLLLSSNQLLQIQPAHFSQCSNLKELQLHGNHLEYIPDGAFDHLVGLTKLNLGKNSLTHISPRVFQHLGNLQVLRLYENRLTDIPMGTFDGLVNLQELALQQNQIGLLSPGLFHNNHNLQRLYLSNNHISQLPPSVFMQLPQLNRLTLFGNSLKELSPGIFGPMPNLRELWLYDNHISSLPDNVFSNLRQLQVLILSRNQISFISPGAFNGLTELRELSLHTNALQDLDGNVFRMLANLQNISLQNNRLRQLPGNIFANVNGLMAIQLQNNQLENLPLGIFDHLGKLCELRLYDNPWRCDSDILPLRNWLLLNQPRLGTDTVPVCFSPANVRGQSLIIINVNVAVPSVHVPEVPSYPETPWYPDTPSYPDTTSVSSTTELTSPVEDYTDLTTIQVTDDRSVWGMTQAQSG

GRN(SEQ ID NO:10)

TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL

MUC1(SEQ ID NO:11)

APKPATVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPG

CD147(SEQ ID NO:12)

AAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSS

CD320(SEQ ID NO:13)

AGPSSGSCPPTKFQCRTSGLCVPLTWRCDRDLDCSDGSDEEECRIEPCTQKGQCPPPPGLPCPCTGVSDCSGGTDKKLRNCSRLACLAGELRCTLSDDCIPLTWRCDGHPDCPDSSDELGCGTNEILPEGDATTMGPPVTLESVTSLRNATTMGPPVTLESVPSVGNATSSSAGDQSGSPTAYG

CDH3(SEQ ID NO:14)

EPCRAVFREAEVTLEAGGAEQEPGQALGKVFMGCPGQEPALFSTDNDDFTVRNGETVQERRSLKERNPLKIFPSKRILRRHKRDWVVAPISVPENGKGPFPQRLNQLKSNKDRDTKIFYSITGPGADSPPEGVFAVEKETGWLLLNKPLDREEIAKYELFGHAVSENGASVEDPMNISIIVTDQNDHKPKFTQDTFRGSVLEGVLPGTSVMQMTATDEDDAIYTYNGVVAYSIHSQEPKDPHDLMFTIHRSTGTISVISSGLDREKVPEYTLTIQATDMDGDGSTTTAVAVVEILDANDNAPMFDPQKYEAHVPENAVGHEVQRLTVTDLDAPNSPAWRATYLIMGGDDGDHFTITTHPESNQGILTTRKGLDFEAKNQHTLYVEVTNEAPFVLKLPTSTATIVVHVEDVNEAPVFVPPSKVVEVQEGIPTGEPVCVYTAEDPDKENQKISYRILRDPAGWLAMDPDSGQVTAVGTLDREDEQFVRNNIYEVMVLAMDNGSPPTTGTGTLLLTLIDVNDHGPVPEPRQITICNQSPVRQVLNITDKDLSPHTSPFQAQLTDDSDIYWTAEVNEEGDTVVLSLKKFLKQDTYDVHLSLSDHGNKEQLTVIRATVCDCHGHVETCPGPWKGG

HER2(SEQ ID NO:15)

TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT

IGFBP2(SEQ ID NO:6)

EVLFRCPPCTPERLAACGPPPVAPPAAVAAVAGGARMPCAELVREPGCGCCSVCARLEGEACGVYTPRCGQGLRCYPHPGSELPLQALVMGEGTCEKRRDAEYGASPEQVADNGDDHSEGGLVENHVDSTMNMLGGGGSAGRKPLKSGMKELAVFREKVTEQHRQMGKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHIPNCDKHGLYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECHLFYNEQQEARGVHTQRMQ

LRP10(SEQ ID NO:17)

HPDRIIFPNHACEDPPAVLLEVQGTLQRPLVRDSRTSPANCTWLILGSKEQTVTIRFQKLHLACGSERLTLRSPLQPLISLCEAPPSPLQLPGGNVTITYSYAGARAPMGQGFLLSYSQDWLMCLQEEFQCLNHRCVSAVQRCDGVDACGDGSDEAGCSSDPFPGLTPRPVPSLPCNVTLEDFYGVFSSPGYTHLASVSHPQSCHWLLDPHDGRRLAVRFTALDLGFGDAVHVYDGPGPPESSRLLRSLTHFSNGKAVTVETLSGQAVVSYHTVAWSNGRGFNATYHVRGYCLPWDRPCGLGSGLGAGEGLGERCYSEAQRCDGSWDCADGTDEEDCPGCPPGHFPCGAAGTSGATACYLPADRCNYQTFCADGADERRCRHCQPGNFRCRDEKCVYETWVCDGQPDCADGSDEWDCSYVLPRK

SPINT2(SEQ ID NO:18)

ADRERSIHDFCLVSKVVGRCRASMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNNYLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDSEDHSSDMFNYEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEEACMLRCFRQQENPPLPLGSKV

SUSD2(SEQ ID NO:19)

QESCSMRCGALDGPCSCHPTCSGLGTCCLDFRDFCLEILPYSGSMMGGKDFVVRHFKMSSPTDASVICRFKDSIQTLGHVDSSGQVHCVSPLLYESGRIPFTVSLDNGHSFPRAGTWLAVHPNKVSMMEKSELVNETRWQYYGTANTSGNLSLTWHVKSLPTQTITIELWGYEETGMPYSQEWTAKWSYLYPLATHIPNSGSFTFTPKPAPPSYQRWRVGALRIIDSKNYAGQKDVQALWTNDHALAWHLSDDFREDPVAWARTQCQAWEELEDQLPNFLEELPDCPCTLTQARADSGRFFTDYGCDMEQGSVCTYHPGAVHCVRSVQASLRYGSGQQCCYTADGTQLLTADSSGGSTPDRGHDWGAPPFRTPPRVPSMSHWLYDVLSFYYCCLWAPDCPRYMQRRPSNDCRNYRPPRLASAFGDPHFVTFDGTNFTFNGRGEYVLLEAALTDLRVQARAQPGTMSNGTETRGTGLTAVAVQEGNSDVVEVRLANRTGGLEVLLNQEVLSFTEQSWMDLKGMFLSVAAGDRVSIMLASGAGLEVSVQGPFLSVSVLLPEKFLTHTHGLLGTLNNDPTDDFTLHSGRVLPPGTSPQELFLFGANWTVHNASSLLTYDSWFLVHNFLYQPKHDPTFEPLFPSETTLNPSLAQEAAKLCGDDHFCNFDVAATGSLSTGTATRVAHQLHQRRMQSLQPVVSCGWLAPPPNGQKEGNRYLAGSTIYFHCDNGYSLAGAETSTCQADGTWSSPTPKCQPGRSYA

CST2(SEQ ID NO:20)

WSPQEEDRIIEGGIYDADLNDERVQRALHFVISEYNKATEDEYYRRLLRVLRAREQIVGGVNYFFDIEVGRTICTKSQPNLDTCAFHEQPELQKKQLCSFQIYEVPWEDRMSLVNSRCQEA

在另一個實施方案中，抗體檢測標志物為采用其天然形式的蛋白質，例如上文公開的那些。如所附的實施例中所公開的那樣，本發(fā)明人利用真核表達系統(tǒng)而形成帶有構象的腫瘤抗原，該腫瘤抗原適當?shù)卣郫B并包含用于自身抗體檢測的非連續(xù)的抗原表位。所述的蛋白質可以以任何合適的形式使用，在一個非限定性實施方案中，所述的蛋白質可以為Fc融合蛋白質。

在所有上述的實施方案中，可以使用可檢測的標簽來標記抗體檢測試劑。在一個實施方案中，可檢測標簽(用于檢測針對一種蛋白質的自身抗體的試劑)不同于檢測針對其他蛋白質的自身抗體的可檢測標簽。用于檢測標簽的方法包括但不限于分光鏡,光化學,生物化學,免疫化學,物理或化學技術?？梢允褂萌魏魏线m的可檢測標簽。

所述的組合物可以以凍干形式或者溶液形式冷凍儲存。在一個實施方案中，所述的組合物可以放置在固體支撐體上，例如微陣列或微板形式；這種實施方案有利于所述的組合物在對照檢測測試中的使用。例如抗IgG可以用于預涂敷微孔板的孔，并且抗體檢測試劑(例如本文所討論的蛋白質)可以加入至預涂敷的孔中。

在第二個方面中，本發(fā)明提供了用于檢測乳腺癌或乳腺癌復發(fā)的方法，其包括將由處于乳腺癌或乳腺癌復發(fā)風險下的受試對象得到的液體樣品與用于檢測自身抗體的一種或多種試劑接觸，其中所述的自身抗體針對人類ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2中的一種或多種，其中針對一種或多種蛋白質的自身抗體的存在與受試對象患有乳腺癌或乳腺癌復發(fā)的可能性有關。

在一個實施方案中，所述的組合物包含用于檢測人類自身抗體的試劑，其中所述的人類自身抗體針對選自人類ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2中的至少2種蛋白質。

如本領域那些技術人員所理解的那樣，所述的方法可以包括適用于本發(fā)明的預期用途的其他抗體檢測標志物和對照的用途。在一個非限定性實施方案中，所述的組合物可以進一步包含用于檢測針對黏蛋白-1(MUC1),HER-2(41),IGFBP2和顆粒體蛋白中的一種或兩種的抗體的試劑。

在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述的組合物包含或由用于檢測針對以下標志物組中的一組的人類自身抗體的試劑組成：

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白,LRRC1和5MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,顆粒體蛋白,LRRC15和MUC1；

DKK1,GAL1,GFRA1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,顆粒體蛋白和LRRC15；

DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；

DKK1,GAL1,顆粒體蛋白和LRRC15；

ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；

DKK1,GAL1和LRRC15；

ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；

GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

GAL1,GFRA1和LRRC15；

ANGPTL4,GAL1和LRRC15；

DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；

GAL1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；

ANGPTL4,GAL1和GFRA1；

DKK1,GAL1和GFRA1；以及

GAL1,GFRA1和MUC1。

在另一個實施方案中，所述的組合物包含或由用于檢測針對ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的人類自身抗體的試劑組成。

抗體檢測標志物可以為任何合適的試劑，其中所述的試劑可以用于檢測針對所述的蛋白質的抗體，所述的蛋白質包括但不限于所述的蛋白質、分泌型蛋白質(例如天然分泌形式的蛋白質)、或蛋白質的細胞外結構域。分泌的蛋白質更容易于由腫瘤細胞傳遞至淋巴結，其中發(fā)生免疫細胞的相互作用，從而得到豐富的高親和性抗體。膜表面蛋白質通常以可溶的形式通過金屬蛋白酶依賴的切割由腫瘤細胞釋放。脫落的蛋白質比細胞內蛋白質更易于轉移至淋巴結中。因此，在一個實施方案中，抗體檢測標志物為所述的蛋白質的分泌的或膜部分。所述的人類蛋白質的分泌的或膜部分的示例性氨基酸序列如本發(fā)明所公開。

在另一個實施方案中，所述的抗體檢測標志物包含或由本發(fā)明的組合物組成。

可以在任何合適的條件下實施所述的接觸，其中所述的條件用于促進液體樣品中自身抗體與所述的試劑之間的結合，從而形成可以檢測的結合復合物。本領域的那些技術人員可以根據(jù)本文的教導，基于預期的測試來確定合適的此類條件。類似地，任何合適的其他步驟可以用于所述的方法中，例如一個或多個洗滌或其他步驟以除去未結合的試劑。

可以使用任何合適的檢測技術，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)，珠基測試平臺(例如the Luminex系統(tǒng))，2-D陣列基測試平臺(例如和the‘Longitudinal Assay Screening’平臺，其能夠在單一檢驗和稀釋下在臨床相關濃度下定量由患者樣品得到的所有列舉的乳腺癌標志物)。在一個實施方案中，所述的組合物可以放置在固體支撐體上，例如微陣列、載玻片、膜、微板形式或珠。所述的實施方案有利于所述的組合物的用途。示例性的此類測試在實施例中提供。

類似地，可以使用任何合適的液體，包括但不限于得自受試對象的血清樣品。血漿樣品或血液樣品。所述的受試對象可以為任何處于乳腺癌風險之下的受試對象，例如人類受試對象。

在進一步的實施方案中，所述的方法鑒定所述的受試對象可能患有乳腺癌，并且其中所述的方法進一步包括使用足以治療乳腺癌的量的治療試劑來治療受試對象。

在上述任意一個實施方案的一個非限定性實施方案中，ANGPTL4,DKK1,GAL1和MUC1自身抗體應答與BCa有關；并且針對GFRA1,GRN和LRRC15的自身抗體應答與BCa呈負相關。

在一個特定的實施方案中，所述的試劑包括ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15；其中針對GFRA1,GRN和LRRC15的自身抗體應答與BCa呈負相關。如實施例中詳細描述的那樣，當針對7種抗原的自身抗體應答被加入至基礎模型(包括年齡、體質指數(shù)(BMI)、種族和目前吸煙狀況)中時，所述的測試具有以下診斷能力：c-stat(95％CI),0.82(0.78至0.86)；敏感性,73％；特異性,76％；和PLR(95％CI),3.04(2.34至3.94)。所述的模型在風險十分位上校準(Hosmer-Lemeshow,p＝0.13)，并且在BCa的特異性亞型(包括雌激素受體陽性、HER-2陽性、侵入性、原位和腫瘤尺寸>1cm)中實施良好。表5中提供其他示例性標志物組的診斷能力。

在第三個方面中，本發(fā)明提供了用于治療患有乳腺癌的受試對象的方法，其包括：(a)檢驗由處于乳腺癌風險下的受試對象得到的體液樣品，以及鑒定候選受試對象，該受試對象為：

(i)具有對抗ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的至少一者的自身抗體；和/或

(ii)不具有對抗GFRA1,GRN和/或LRRC15的自身抗體；以及

(b)使用足以治療乳腺癌的量的治療試劑來治療候選受試對象。

實施例

實施例1

乳腺癌(BCa)患者激起了對抗癌癥蛋白質的自身抗體應答，這反映并放大了與腫瘤發(fā)生有關的細胞改變。檢測血漿中的自身抗體可以提供用于BCa早期檢測的最低侵入性機制。為了鑒定激發(fā)激素應答的癌癥蛋白質，我們生成針對BCa基因富集的cDNA文庫，其中所述的BCa基因編碼了膜和分泌的蛋白質，與細胞內蛋白質相比，它們更可能誘導肌體應答。為了生成能夠被患者抗體高效識別的帶有構象的抗原，建立真核表達策略。針對對抗20種不同抗原的自身抗體的活性，使用ELISA測量由200名BCa患者和200名年齡匹配的健康對照得到的血漿，其中所述的抗原被設計為帶有構象的抗原表位。使用條件邏輯回歸模型來選擇對抗20種不同抗原的自身抗原應答的組合，從而將BCa患者與健康對照分類。最佳組合包括ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15，然而，對抗GFRA1,GRN和LRRC15的自身抗體應答與BCa呈負相關。當將對抗7種抗原的自身抗體應答加入至基礎模型(包括年齡、BMI、種族和目前吸煙狀況)中時，所述的測試具有以下診斷能力：c-stat(95％CI),0.82(0.78至0.86)；敏感性,73％；特異性,76％；和PLR(95％CI),3.04(2.34至3.94)。所述的模型在風險十分位上校準(Hosmer-Lemeshow,p＝0.13)，并且在BCa的特異性亞型(包括雌激素受體陽性、HER-2陽性、侵入性、原位和腫瘤尺寸>1cm)中實施良好。

引言

對于乳腺癌(BCa)患者而言，早期且個性化的診斷對于優(yōu)化可導致長期存活的治療而言是重要的。盡管乳房攝影術是檢測BCa的最廣泛使用的方法，但是很大程度上由于高的乳腺密度，大約20％的篩選乳房X照片會得到錯誤的陰性診斷(1)。此外，在取得乳房X線照片的10名女性中，1名女性需要另外成像(2)。然而，絕大多數(shù)的這些女性并未患有BCa，因為每1000個篩選的乳房X線照片中，僅2至4個得到癌癥診斷(3)。因此，臨床上迫切需要研發(fā)用于BCa的早期診斷的新型最低侵入性診斷策略。

目前，不存在建立的腫瘤標志物，該腫瘤標志物被分泌至外周循環(huán)中，可以通過血液檢驗用于BCa的診斷的測量。當前，臨床實踐中接收的腫瘤標志物為腫瘤基預測標志物，例如雌激素受體(ER),HER-2擴增,21-基因Oncotype DX和70-基因MammaPrint(6-12)。所有這些都需要侵入性活組織檢查或手術過程來獲得用于評估的腫瘤組織，從而使患者具有沉重的負擔。血清腫瘤標志物是有價值的工具，其允許最低侵入性的取樣過程，從而促進癌癥的早期診斷，并允許治療后跟蹤預后(4,5)。然而，由腫瘤細胞產生的腫瘤標志物在外周循環(huán)中通常具有相對低的濃度，特別是在早期階段的疾病中。

在此，我們報告了鑒定腫瘤抗原候選物的分子方法的用途，其中所述的腫瘤抗原候選物在BCa患者中激發(fā)了抗體應答。之前，我們有膜相關的多核糖體(MAP)RNA生成了BCa cDNA文庫，其中所述的RNA編碼分泌的和膜的蛋白質，并由正常組織中減去該RNA文庫(29)。分泌的蛋白質更易于由腫瘤細胞傳遞至淋巴結，其中發(fā)生免疫細胞的相互作用，從而得到豐富的高親和性抗體。膜表面蛋白質通常以可溶的形式通過金屬蛋白酶依賴的切割由腫瘤細胞釋放。脫落的蛋白質比細胞內蛋白質更易于轉移至淋巴結中(30,31)。因此，使用編碼膜和分泌的TAA的克隆子富集所得的扣除文庫(稱為膜相關的多核糖體cDNA文庫(MAPcL))，其中所述的克隆子在BCa中高度豐富，并且優(yōu)選地應該在患者中誘導抗體應答(29)。此外，我們建立了用于生產重組抗原作為Fc融合蛋白質的方法，其中所述的Fc融合蛋白質被設計成具有天然構象，其是膜和分泌的蛋白質的表達所必需的，其中所述的蛋白質在患者中可以誘導抗體應答。

我們已經(jīng)研發(fā)帶有構象的抗原的ELISA基策略，從而通過檢測對抗一組TAA的自身抗體來區(qū)分BCa和健康患者。20種抗原選自MAPcL中所代表的最豐富的基因，并生成Fc融合蛋白質。由200名新診斷的BCa患者和200名作為年齡匹配的對照的健康女性收集血液。使用ELISA，針對對抗20種不同的MAPcL衍生抗原的自身抗體的存在來篩選400個血漿樣品。7種抗原與患者的人口統(tǒng)計學的組合產生最佳的陽性似然比，從而卻分健康和BCa患者。

材料和方法

質粒構建

就MAPcL-兔Fc-標記的抗原的制備而言，2種構建體pSecTag2(Invitrogen,Carlsbad,CA)和pFUSE-rIgG-Fc1(InvivoGen,San Diego,CA)因其克隆的限制性位點的可利用性，均用于生成20個MAPcL-rFc表達構建體。使用pFUSE-rIgG-Fc1作為模板，使用引物5’-CCGGATATCAGCAAGCCCACGTGCCCACC-3’(SEQ ID NO:21)和5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTC-ATTTACCCGGAGAGCGGGAG-3’(SEQ ID NO:22)(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)通過擴增兔IgG的Fc部分來修飾pSecTag2。使用EcoRV和NotI消化rFc PCR產物，并加入至被稱為pSecTag2-rFc的pSecTag2中，其中所述的pSecTag2-rFc包含用于分泌的IgK信號序列。pFUSE-rIgG-Fc1包含Il2信號序列。為了保持2個質粒之間的信號序列一致性，使用pSecTag2作為模板，通過PCR擴增IgK前導序列。然后，使用IgK信號序列來替換IL2前導序列，從而形成pFUSE-IgK-rFc。

20種MAPcL基因的編號示于表1中，其中所述的基因用作用于克隆和預測信號序列的模板。使用SignalP確定各編碼蛋白質的信號序列(32,33)。如果蛋白質包含跨膜結構域，則僅編碼的細胞外部分被包含在內。使用TMHMM數(shù)據(jù)庫來預測跨膜結構域(34)。由克隆片段編碼的氨基酸編號示于表1中。利用SfiI和KpnI限制性位點將ANGPTL4,CDH3,DKK1,SPON2,SSR2,CST2,GFRA1和GAL1自定義克隆至pSecTag2-rFc中(Genscript,Piscataway,NJ)。利用KpnI和BamHI限制性位點將EPHA2,IGFBP2和LAMC2自定義克隆至pSecTag2-rFc中。利用SfiI和BamHI限制性位點將GRN,MUC1和LRRC15自定義克隆至pSecTag2-rFc中。利用SfiI和XhoI限制性位點將HER-2,LRP10,SPINT2和SUSD2克隆至pFUSE-IgK-rFc中。利用BamHI和SacII限制性位點將CD147克隆至pFUSE-IgK-rFc中。利用EcoRI和XhoI限制性位點將CD320克隆至pFUSE-IgK-rFc中。

表1.用于形成rFc融合蛋白質的MAPcL候選物

*使用SignalP確定各編碼的蛋白質的信號序列，并且表達構建體中不包含這些序列(32,33)。氨基酸編號表明在Ig信號序列與兔IgG的Fc部分之間克隆的蛋白質的編碼部分，從而生成分泌的MAPcL-rFc融合蛋白質。

就His標記的HER-2的制備而言，使用引物5’-CCCAAGCTTGCAGCACCCAAGTGTGCACCGGCAC-3’(SEQ ID NO:23)和5’-GTGCTCGAGTCACGTC-AGAGGGCTGGCTCTCTGCTCG-3’(SEQ ID NO:24)通過PCR來擴增HER-2。使用HindIII和XhoI消耗產物，并直接克隆至pET-28a表達載體中。

細胞培養(yǎng)物

在具有10％FBS的DMEM中培養(yǎng)293T和SKBR3細胞系。在潮濕的溫育箱中將培養(yǎng)物保持在37℃及5％CO₂下。對于支原體，所有的細胞系經(jīng)鑒別和檢驗為陰性。

蛋白質生產

在293T細胞中生產MAPcL-rFc融合蛋白質。簡言之，根據(jù)制造商的說明書，使用Effectene(Qiagen,Valencia,CA)轉染293T細胞。在轉染過程中，將細胞在具有2％FBS的DMEM中培養(yǎng)所述的細胞。收獲包含分泌的融合蛋白質的上清液，離心從而清除細胞碎片，并補充0.1％疊氮化鈉。在E.coli BL21(Invitrogen,Carlsbad,CA)中生產His-HER-2，并使用IMAC親和層析進行純化。

夾心ELISA

使用磷酸鹽緩沖的生理鹽水稀釋的2μg/ml山羊抗兔Fc(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)過夜涂敷微量滴定板(Nalge Nunc,Rochester,NY)。在標準的封閉緩沖液(0.5％牛血清白蛋白和0.1％疊氮化鈉，處于磷酸鹽緩沖的生理鹽水中)中將包含rFc融合蛋白質的上清液進行1:3的系列稀釋。將平板洗滌一次，并將系列稀釋的上清液轉移至微量滴定板上。將已知濃度的兔IgG進行相似的稀釋，并將其加入到微量滴定板的一排中，從而定量培養(yǎng)物培養(yǎng)基中存在的融合蛋白質的量。在溫育2小時后，將平板洗滌2次，并加入在標準的封閉緩沖液(具有0.05％Tween 20)中以1:3000稀釋的50μl HRP-綴合的山羊抗兔IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)。在2小時溫育后，將平板洗滌4次，并使用100μl/孔的TMB底物(Pierce,Rockford,IL)顯色。在使用50μl/孔的2N H₂SO₄達到5分鐘后，終止顯色反應，并在450nm下測量吸光率，從而確定濃度。減去在690nm下的吸光率，從而除去背景信號。

構象的與變性的HER-2蛋白質的抗體識別

對于構象的HER-2測試而言，使用處于PBS中的2μg/ml山羊抗兔Fc(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)過夜涂敷微量滴定板。然后，將HER-2-ECD-rFc加入至各孔(100μl/孔)中。對于變性的HER-2而言，使用處于PBS中的2μg/ml His-HER-2-ECD過夜涂敷微量滴定板。

在所述的測試中使用3種HER-2抗體：抗-HER-2 3F27(US Biological,Swampscott,MA),抗-HER-2 3F32(US Biological,Swampscott,MA)和Herceptin(Genentech,South San Francisco,CA)。將各種抗體在具有0.05％Tween 20的標準封閉緩沖液中稀釋成1μg/ml。然后，系列稀釋所述的抗體。在洗滌一次后，將50μl/孔系列稀釋的抗體加入至平板中，并在室溫下溫育2小時。將平板洗滌3次，并在稀釋1:3000下加入種類的合適的HRP-綴合的二級抗體。將平板洗滌4次，并使用100μl/孔TMB底物顯色5分鐘。使用50μl/孔2N H₂SO₄終止顯色。在450nm下測量吸光率，并減去造成背景的690nm的吸光率。

使用相同的抗體通過流式細胞儀染色SKBR3BCa細胞中的HER-2。使用Cell Dissociation Solution Non-enzymatic 1x(Sigma,St.Louis,MO,編號#C5914)使SKBR3細胞由盤上脫離。將2x10⁵細胞與0.5μg/ml各種抗體在室溫下溫育1小時。然后洗滌細胞，并加入用于合適的種類的1:200稀釋的PE-綴合的抗體。再次洗滌細胞，懸浮于FACS緩沖液(具有5％牛血清白蛋白和0.1％疊氮化鈉的PBS)中，并通過流式細胞儀分析。

Herceptin結合的競爭

使用4μg/ml山羊抗兔Fc涂敷微量滴定板，并過夜溫育。在洗滌1次后，將100μl/孔的HER-2-ECD-rFc加入至各孔中，并過夜溫育。將HER-2-Fc和CD30-Fc嵌合蛋白質(R&D Systems,Minneapolis,MN)由10μg/ml的起始濃度進行系列稀釋。加入Herceptin至各系列稀釋的嵌合蛋白質的最終濃度為10ng/ml。將平板洗滌2次，并將50μl/孔的嵌合蛋白質/Herceptin混合物用于平板中。然后將平板洗滌3次，并將1:3000稀釋的HRP山羊抗人IgG用于各孔(50μl/孔)中。在洗滌4次后，將100μl/孔TMB底物加入至各孔中。在5分鐘后，使用50μl/孔2N H₂SO₄終止顯色。在450nm下測量吸光率，并減去690nm的吸光率。

患者

該病例的納入標準為超過30歲的女性，這些女性均在Sanford Health,Sioux Falls,SD被新近診斷為BCa(任何類型)。要求患者提供額外的一10ml EDTA管的血液，然后進行乳房切除術、乳房腫瘤切除術、放療、化療或其他治療。如果受試對象之前具有任何類型的癌癥史，則僅排除這種病例的受試對象。健康對照受試對象在6個月內具有陰性乳房X線照片，然后抽血。如果受試對象具有任何類型的早期癌癥史或自身免疫疾病史，則排除該健康受試對象。所有患者均提供書面的知情同意書，并且the Sanford Health IRB批準了研究方案。由10/08/09至4/17/12，收集由200名BCa患者得到的血液樣品。此外，由10/16/09至1/19/11，收集200名年齡匹配的健康對照血液樣品。對于招募的患者的特征，參見表2。

表2.患者臨床和病理學特征

血清收集

在10ml EDTA管中收集血液，并在2000x g下離心10分鐘。移出管中的血漿，等分并儲存在-80℃，直至篩選自身抗體的存在情況。

帶有構象的抗原ELISA

使用處于磷酸鹽緩沖的生理鹽水中的4μg/ml山羊抗兔Fc(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)過夜涂敷微量滴定板(Nalge Nunc,Rochester,NY)。將平板洗滌1次，并加入100μl/孔MAPcL-rFc融合蛋白質。將平板溫育2小時，并洗滌2次。然后，使用50μl/孔優(yōu)化的封閉緩沖液(具有0.5％牛血清白蛋白、0.2％奶粉、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、20mM L-谷氨酰胺、20mM L-精氨酸、0.1％疊氮化鈉、10％山羊血清和0.05％Tween20的磷酸鹽緩沖的生理鹽水)涂敷平板。將平板在37℃下溫育1小時，并洗滌1次。加入在優(yōu)化的封閉緩沖液中以1:100稀釋的血清樣品，并在室溫下溫育2小時。然后，將平板洗滌3次，并使用在標準的封閉緩沖液(具有0.05％Tween20)中以1:3000稀釋的HRP-綴合的山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)檢測自身抗體。將平板在室溫下溫育1小時，洗滌4次，并使用100μl/孔TMB底物(Pierce,Rockford,IL)顯色15分鐘。使用50μl/孔2N H₂SO₄終止顯色，并在450nm下測量吸光率。減去690nm下的吸光率，從而除去背景信號。各96孔板均包含得自BCa受試對象的14份樣品和得自正常乳房X線照片受試對象的14份樣品。在相同的平板上以3次重復檢驗各樣品。僅各平板中的一行經(jīng)過封閉緩沖液作為ELISA的陰性對照。

統(tǒng)計方法

使用貪婪卡尺匹配算法(35)在3年內以1:1將對照與200名BCa患者單獨匹配，同時對測定數(shù)據(jù)是盲態(tài)的。對于各受試對象而言，通過3個重復的測量值的平均值減去封閉緩沖液的平均值來轉化抗原的水平。如果差值低于0，則將其設定為0，并且取得平方根，從而產生更對稱的分布。

對于連續(xù)的和分類的數(shù)據(jù)而言，分別使用兩樣本t檢驗和Chi-squared檢驗來檢驗BCa患者和對照之間的人口統(tǒng)計學和自身抗體應答的差異。通過將對各抗原的自身抗體的應答加入至邏輯回歸模型(其已經(jīng)包含年齡、BMI、種族和目前吸煙狀況)來檢驗c-統(tǒng)計(即，一致性指數(shù)，受試者工作特征(ROC)曲線下的面積)的增益改善。使用Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度測量來檢驗模型的校準，其中所述的測量通過比較各病例的預測值和觀察值(概率的十分位數(shù))而構建了Chi-squared統(tǒng)計(36)。

在評估各抗原之后，具有年齡匹配的階層的多變量條件邏輯回歸分析用于確定使Akaike’s Information Criterion最低的抗原的亞組(37)；針對BMI、種族和目前的吸煙狀況來調整所有的模型。進行探索性亞組分析來確定在BCa的特定類型中是否差異地實施了抗原的多變量亞組。在以下亞組中檢驗多變量模型：侵入性、原位、ER陽性、腫瘤最大尺寸>1cm、淋巴結轉移和HER-2陽性。使用the Bonferroni校正，標準水平α設定為≤0.05/20抗原＝0.0025。(Cary,NC)9.3版軟件用于所有的分析。

結果

被設計為具有天然構象的腫瘤相關抗原的形成

為了鑒定激發(fā)患者中激素應答的TAA，編碼膜和分泌的蛋白質的候選基因選自MAPcL中所示的最豐富的基因。由于蛋白質上僅10％的抗原表位為線性連續(xù)的序列(24)，所以我們采用真核表達細胞來形成帶有構象的腫瘤抗原，該腫瘤抗原適當?shù)卣郫B，并包含用于檢測自身抗體的非連續(xù)的抗原表位。編碼細胞外結構域(ECD)或分泌的蛋白質的不具有候選MAPcL的信號序列的序列為進入pSecTag2-rFc載體或pFUSE-IgK-rFc(取決于限制性酶的克隆位點)中的兔IgG(rFc)的Fc區(qū)域的克隆的5’。載體中所包含的IgK前導序列指導融合蛋白質被分泌。編碼融合蛋白質的載體瞬間被轉移至293T細胞中，并且相應的融合蛋白質被分泌至培養(yǎng)基中。使用夾心ELISA證實分泌的融合蛋白質的生產，并且通過與建立的CD147-rFc標準(數(shù)據(jù)未示出)的比較來確定濃度。

為了證明所形成的MAPcL-rFc蛋白質被設計成折疊成天然構象，使用市售可得的對抗天然的(單克隆抗體3F32和Herceptin)或變形的(單克隆抗體3F27)HER-2蛋白質的所形成的抗-HER-2抗體來進行ELISA分析。對由HER-2的ECD組成的2種抗原進行分析：在293T細胞中形成的帶有構象的HER-2-ECD-rFc蛋白質和在細菌細胞中生產的并且在鎳柱上純化的His-HER-2-ECD蛋白質?？固烊坏腍ER-2抗體(3F32)識別在293T中產生的HER-2-ECD-rFc(圖1A)，但是不能檢測在細菌中產生的純化的His-HER-2-ECD蛋白質(圖1B)。此外，Herceptin不能檢測由細菌純化的變性的His-HER-2-ECD蛋白質(圖1B)。然而，當HER-2-ECD-rFc蛋白質用作ELISA分析的抗原時，對于Herceptin觀察到強烈的應答(圖1A)。盡管對抗變性的HER-2而生成的3F27抗體不能檢測HER-2-ECD-rFc蛋白質(圖1A)，但是該抗體對細菌HER-2-ECD具有強烈的應答(圖1B)。

為了證明購買抗體對天然的與變形的抗原表位的特異性識別，對未固定的SKBR3細胞實施流式細胞儀，其中所述的SKBR3細胞為已知具有HER-2擴增的BCa細胞系(38)。由于表面HER-2在未固定的SKBR3細胞上保持了其天然構象，所以對變性的HER-2具有特異性的抗-HER-2 3F27抗體不能通過流式細胞儀檢測SKBR3細胞的細胞膜上的表面HER-2(圖1C)。當抗-HER-2 3F32抗體和Herceptin(其均識別構象的HER-2)用于流式細胞儀分析時，觀察到熒光的大的遷移，表明抗體識別SKBR3細胞膜上存在的HER-2(圖1C)。

進行結合競爭測試來證明帶有構象的抗原ELISA特異性地識別MAPcL抗原。使用抗兔IgG預涂敷各孔，然后使用HER-2-ECD-rFc預涂敷。對購買的HER-2-Fc和CD30-Fc純化的嵌合蛋白質(R&D Systems)進行系列稀釋，并加入各孔的恒定量的Herceptin(10ng/ml)中。在加入HRP綴合的二級抗人IgG抗體后，進行反應。Herceptin與HER-2-ECD-rFc的結合與加入HER-2-Fc競爭，但是不與CD30-Fc蛋白質競爭(圖1D)。該結果表明Herceptin與帶有構象的融合蛋白質的HER-2-ECD部分特異性地結合。

使用帶有構象的抗原ELISA針對自身抗體，對患者進行篩選

通過克隆編碼rFc序列的ECD或分泌的蛋白質5’的序列而形成被設計成包含天然構象的20種MAPcL-rFc融合抗原(對所有20種抗原的特性參見表1)。將表達質粒單獨地轉染至293T細胞中，并且MAPcL-rFc融合蛋白質分泌至培養(yǎng)基中。通過夾心ELISA分析定量20種融合蛋白質(數(shù)據(jù)未示出)。為了檢測由患者收集的血漿中的自身抗體，使用生成的MAPcL-rFc抗原來進行帶有構象的抗原ELISA。為了固定MAPcL-rFc融合蛋白質，使用抗兔IgG對96孔板的孔進行預涂敷。將由轉染的293T細胞得到的培養(yǎng)基(其包含生成的MAPcL-rFc融合蛋白質，該蛋白質被設計成具有天然的構象)加入至預涂敷的孔中。為了減少平板的改變并增加測試的重復性，將使用得自各個單獨患者的血漿的3個重復樣品分布在96孔板上。在加入HRP綴合的二價抗人IgG抗體后，使平板顯色，并測量各孔的吸光率。使用帶有構象的ELISA，針對對抗20種抗原的自身抗體的反應性來評價由新近診斷為BCa的患者收集得到的200份血漿樣品和由200名年齡匹配的健康受試對象得到的血漿。

200名BCa患者和200名健康對照的平均(SD)年齡為59(11)歲，并且97％的這些患者確認為白色人種(表2)。癌癥患者是更加超重的(29.7與27.1kg/m²,p<0.0001)并且具有不同吸煙習慣(p＝0.014)，這樣在癌癥受試對象中的目前的吸煙者比健康對照中更普遍(11％與4％)。200名BCa患者呈現(xiàn)出疾病的不均一性，其中所述的疾病由74％的侵入性、24％淋巴結轉移、86％ER陽性、17％HER-2陽性和12％三陰性BCa組成(表2)。分析針對單個抗原的自身抗體應答的吸光率讀值，我們確定在BCa患者與對照之間，在對抗12種TAA(即，ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,HER-2,IGFBP2,LAMC2,MUC1,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2)的自身抗體應答中存在顯著的Bonferroni調整后差異(表3)。在BCa患者中檢測較高水平的這些自身抗體。在針對年齡、種族、BMI和目前吸煙狀況調節(jié)的邏輯回歸模型中，針對MUC1(1.83),DKK1(1.77)和GAL1(1.75)(均為p<0.0001)的自身抗體應答具有最大的優(yōu)勢比(OR)，這樣在對抗這3種抗原的任意一種的自身抗體的應答中，SD每增加1，患者可能患有BCa為大約1.8倍(表3)。當對抗12種抗原(即，GAL1,DKK1,MUC1,ANGPTL4,EPHA2和IGFBP2)中的6種抗原的自身抗體應答均單獨地加入至針對年齡、BMI、種族和目前吸煙狀況而調節(jié)的基礎邏輯回歸模型中時，所述的自身抗體的應答還增加ROC曲線下的面積(均為p<0.05)。6個模型中的5個模型在風險十分位上校準(最低Hosmer-Lemeshow p＝0.13)，但是包含IGFBP2的模型未校準(p＝0.016)。

表3.自身抗體的吸光率測量及其與乳腺癌的相關性

數(shù)據(jù)顯示為的平均值(SD)；*使用t檢驗來檢驗各組之間的差異；顯著的Bonferroni調整后p值<0.05/20＝0.0025以黑體示出；使用針對年齡、種族、BMI和目前吸煙狀況調整的邏輯回歸模型來確定自身抗體中SD每增加1，乳腺癌患病率的優(yōu)勢比(95％CI)；當將自身抗體加入至調整后邏輯回歸模型中時，確定ROC曲線下面積的改變(即，c統(tǒng)計)。

為了增加帶有構象的ELISA的預測能力，使用條件邏輯回歸分析來確定針對一組抗原的自身抗體的應答，其中所述的條件邏輯回歸分析引入了單獨的年齡匹配研究設計，并針對BMI、種族和目前吸煙狀況進行調節(jié)。具有最佳模型擬合的組(即，最低AIC)包含針對以下7種抗原的自身抗體應答：ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15(表4)。在這7中抗原中，當被加入至基礎模型中時，僅針對ANGPTL4,DKK1,MUC1和GAL1的自身抗體應答單獨地顯示ROC曲線下面積顯著增加(表3)。在完全的調整后邏輯回歸模型(包含所述的一組抗原)中，目前吸煙狀況在普遍的BCa中具有最大的OR(95％CI)，OR＝7.88(2.68-23.2)；并且BMI還為顯著的風險因素，每增加1kg/m²，OR＝1.09(1.04-1.13)(表4)。GAL1的OR為6.73(3.42–13.3)，這樣在對抗GAL1的自身抗原應答中，SD每增加1，患者可能患有BCa為幾乎7被。當針對對抗其他抗原的應答進行調節(jié)時，對抗GFRA1(OR＝0.41),GRN(OR＝0.55)和LRRC15(OR＝0.32)的自身抗體應答均與普遍的BCa的優(yōu)勢值呈負相關(表4)。綜上，對抗7種抗原一組的自身抗體應答將ROC曲線下面積由0.64增加至0.82(p<0.0001)，并具有以下診斷量度：敏感性(72.9％)，特異性(76.0％)，和陽性似然比(95％CI)3.04(2.34至3.94)(圖2)。所述的模型也在風險十分位上校準(Hosmer-Lemeshow,p＝0.13)。

表4.用于乳腺癌的多變量邏輯回歸模型優(yōu)勢比

*由于單獨的1:1的年齡匹配。

由于BCa為異質性疾病，所以可行的是對抗抗原的組合的自身抗體應答可以分類BCa的亞型，這不同于將所有BCa亞型作為一個整體進行分析。BCa樣品可以分成單獨的BCa亞型：侵入性、原位的、ER陽性的、腫瘤最大尺寸>1cm、淋巴結轉移和HER-2陽性。除了年齡、BMI、種族和目前吸煙狀況以外，使用對抗7種抗原組合的自身抗體反應性來檢驗各亞型中將所述的病例與對照區(qū)分的能力(圖2)。在BCa的所有亞型中，相似地形成7種抗原的組合模型；c統(tǒng)計為0.81至0.85。在BCa亞型中，當針對對抗7種抗原的組合的自身抗原應答進行分析時，原位腫瘤具有最大的ROC曲線下面積(0.8520,p<0.0001)。由于4種意外的BCa具有極低的模型概率，所以當僅考慮具有淋巴結轉移的這些癌癥時，所述的模型未校準(Hosmer-Lemeshow p＝0.0036)。

討論

BCa的早期檢測允許內科醫(yī)生在疾病轉移前的初始階段進行治療，由此允許更高比率的減輕或者患者長期存活。檢測患者血液中針對腫瘤蛋白質生成的自身抗體的存在是用于BCa檢測的理想方法。但是，必須鑒定腫瘤抗原，然后弄清患者中特異性自身抗體的應答。我們生成了編碼膜和分泌的蛋白質的文庫，其中所述的蛋白質在BCa中高表達，并且可以激發(fā)免疫應答。

我們示出在我們的測試中，抗原構象改變了抗體結合親和性，并且自身抗體的檢測受到抗原表位的構象的限制(圖1)。我們使用一組有效的樣品來研發(fā)帶有構象的ELISA，其中所述的一組樣品由新近診斷為BCa患者在手術、化療或放射治療之前收集得到的200份血漿樣品組成。此外，由200名年齡匹配的受試對象收集血漿，其中所述的受試對象通過在之前的6個月內的確認的正常的乳房X線照片所定義(表2)。使用ELISA，針對對抗20種TAA的自身抗體應答來單獨地篩選所有400份血漿樣品，其中所述的TAA被設計為包含它們的天然構象。在我們的測試中所分析的20種TAA中，有4種之前報告為在BCa患者中產生抗體應答：MUC1(39,40),HER-2(41),IGFBP2(15)和GRN(42)。檢測對抗20種抗原中的12種抗原的自身抗體對于區(qū)分正常的和癌癥樣品而言是具有統(tǒng)計學意義的(表3，黑體)。但是，在我們的測試中，我們未觀察到針對GRN的有意義的自身抗體應答。在12種有意義的抗原中，9種抗原之前與BCa自身抗體無關。就我們所知，這是首次報告在BCa患者中對抗ANGPTL4,CST2,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPINT2,SPON2和SSR2的自身抗體的檢測(表3)。

之前已經(jīng)顯示篩選對抗一組抗原的血清從而檢測自身抗體與篩選對抗僅單一的抗原以檢測自身抗體相比，會增加測試的敏感性(17)。該發(fā)現(xiàn)符合以下事實：BCa為異質性疾病(43)，并且各個單獨的患者的免疫系統(tǒng)是不同的。7種TAA的組合(由ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15組成)具有最大的診斷能力(表4)。與用于檢測BCa自身抗體的之前公開的多個抗原組相比(17,44-46)，這7種TAA的組合是獨特的，并且我們的研究包含BCa的最大患者群體和健康樣品。有趣地，在7種抗原的組合中，有4種抗原單獨地具有統(tǒng)計學意義(表3)，而3種抗原(GFRA1,GRN和LRRC15)本身不具有統(tǒng)計學意義(表3)。而且，GFRA1,GRN和LRRC15是與BCa負相關的，表明患者中較低量的這些自身抗體與較高水平的直接相關的自身抗體組合會增加患有BCa的可能性(表4)。當將7種抗原加入至目前吸煙狀況和BMI的了解情況中時，測試的敏感性和特異性分別為72.9％和76.0％。ROC曲線下的面積(95％CI)為0.82(0.77至0.85)，并且?guī)в袠嬒蟮腅LISA的陽性似然比為3.04。由于BCa為異質性疾病，所以患者分為腫瘤特征，包括ER陽性、HER-2陽性、原位、侵入性、腫瘤尺寸和淋巴結轉移。對于所有的組而言，7種抗原的組合均良好地實施(圖2)。這些結果表明所述的測試具有潛在的臨床用途。用于BCa的一種血清復發(fā)標志物(目前用于臨床)為黏蛋白相關抗原CA27.29。使用識別MUC1的單克隆抗體在患者的血液中檢測CA27.29抗原。由于CA27.29腫瘤標志物的低敏感性，所以所述的檢驗用于跟蹤患者的BCa復發(fā)(47)。與傳統(tǒng)的CA27.29腫瘤標志物相比，本發(fā)明所述的帶有構象的ELISA顯示出大有前途。

目前，乳房攝影術為用于BCa篩選的標準方法。但是，形成乳房X線照片所需的機器是昂貴的，需要專業(yè)的醫(yī)學人員操作，并且在運輸至醫(yī)療服務不足的地區(qū)是一種挑戰(zhàn)。用于BCa早期檢測的血液檢驗的研發(fā)是用于篩選的大幅的進步。抽血是普通的過程，并且血液可以容易地遞送至臨床試驗室用于分析。本研究證明對抗抗原(被設計成包含構象的抗原表位)的自身抗體的應答的組合是用于BCa檢測的有前途的策略。其他研究將集中于其他抗原的鑒定，從而改善所述的測試用于轉換至臨床的敏感性和特異性。

表5.自身抗體的組合的亞組以及它們與乳腺癌的相關性

＝陽性似然比，敏感性/(100-特異性)；ROC＝受試者工作特征曲線；AUC＝曲線下面積；*當將一組抗體加入至針對年齡、種族、BMI和目前吸煙狀況而調節(jié)的邏輯回歸模型時，確定ROC曲線下面積的改變(即，c統(tǒng)計)(均為p值<0.0001)。

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