專利名稱：新型可降解聚合物為載體的抗乳腺癌Her2疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征包括將HER2/neu342-350多肽和E75多肽囊縮到聚乳酸-羥基乙酸共聚物形成的納米顆粒中，形成大小約500納米到2微米之間的納米疫苗。這樣的疫苗能高效的被抗原遞呈細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)攝取，從而能顯著提高h(yuǎn)er2抗原肽的免疫原性。
背景技術(shù)：
:每年約有120萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌，約50萬(wàn)婦女死于乳腺癌。北美、北歐是乳腺癌的高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率約為亞非拉國(guó)家的4倍。我國(guó)雖是乳腺癌的低發(fā)地區(qū)，但其發(fā)病率正在逐年上升，發(fā)病的增長(zhǎng)速度卻高出高發(fā)國(guó)家I到2個(gè)百分點(diǎn)，尤其是滬、京、津及沿海地區(qū)是我國(guó)乳腺癌的高發(fā)區(qū)。更令人擔(dān)憂的是，與西方國(guó)家比較，我國(guó)乳癌患者發(fā)病年齡較輕，發(fā)病高峰年齡在40-49歲，比西方婦女早10-15年。基于嚴(yán)峻的形勢(shì)，乳腺癌的治療與防復(fù)發(fā)引起了人們的廣泛關(guān)注。乳腺癌的傳統(tǒng)治療方法:1.手術(shù)治療:手術(shù)適應(yīng)癥Halsted首創(chuàng)乳癌根治術(shù)，因手術(shù)合理，療效明確，近百年來(lái)成為人們治療乳癌所遵循的標(biāo)準(zhǔn)方式。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，對(duì)乳癌術(shù)式進(jìn)行了不少探索性修改，總的趨勢(shì)不外保守和擴(kuò)大兩方面，至今仍爭(zhēng)論不休。乳房局部切除和全乳切除是保守手術(shù)的代表性手術(shù)。2.放射治療:可以提高手術(shù)切除率使部分不能手術(shù)的患者再獲手術(shù)機(jī)會(huì)，由于放射抑制了腫瘤細(xì)胞的活力可降低術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率從而提高生存率，由于放射延長(zhǎng)了術(shù)前觀察時(shí)間有使部分已有亞臨床型遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例避免一次不必要的手術(shù)。3.化療:通過(guò)化療科盡早控制微轉(zhuǎn)移灶使原發(fā)癌及其周圍擴(kuò)散的癌細(xì)胞產(chǎn)生退變或部分被殺滅以減少術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，進(jìn)展期乳癌以及炎癥型乳癌限制了手術(shù)治療的實(shí)施術(shù)前化療可使腫瘤縮小以便手術(shù)切除，可以根據(jù)切除腫瘤標(biāo)本評(píng)價(jià)術(shù)前化療效果作為術(shù)后或復(fù)發(fā)時(shí)選擇化療方案的參考。4.乳腺癌的最新治療方法:腫瘤生物治療技術(shù)是近年來(lái)因生物技術(shù)發(fā)展而興起的一種全新的腫瘤治療手段，被認(rèn)為是除了手術(shù)、化療、放療之外的第四種腫瘤治療模式，具有副作用小、抗腫瘤活性高、適應(yīng)癥廣等特點(diǎn)。將生物技術(shù)用于腫瘤治療是提高和改變患者自身機(jī)體免疫功能的治本的方法，被認(rèn)為是攻克腫瘤的最終辦法，其應(yīng)用前景廣闊。自從人類腫瘤分子特征的提高導(dǎo)致腫瘤相關(guān)抗原可以被人體的T淋巴細(xì)胞所識(shí)別后，發(fā)展抗腫瘤疫苗已成為一種趨勢(shì)。腫瘤的疫苗是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤患者自身的免疫監(jiān)測(cè)和殺瘤功能，有效地殺滅患者術(shù)后和放化療后體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤，預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移和最終根治腫瘤的目的，具有特異性強(qiáng)，副作用輕等特點(diǎn)，正逐步成為腫瘤綜合治療中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前腫瘤治療基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)與發(fā)展方向
發(fā)明內(nèi)容
:一種新型的抗乳腺癌Her2多肽疫苗的研制方法，其特征包括將HER2/neu342-350多肽和E75多肽等抗原肽囊縮到聚乳酸 -羥基乙酸共聚物形成的納米顆粒中，形成大小約500納米到2微米之間的納米疫苗，這樣的疫苗能高效的被抗原遞呈細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)攝取，從而顯著提高h(yuǎn)er2抗原肽的免疫原性，該疫苗的研制方法為:①通過(guò)固相方法合成HER2/neu 342-350多肽和E75多肽，具體固相合成步驟是氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個(gè)氨基被封閉基團(tuán)Fmoc-保護(hù)的氨基酸共價(jià)連接在固相載體上，20% pipe的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個(gè)氨基酸就接到了固相載體上了，DIEA提供一個(gè)堿性的反應(yīng)環(huán)境，HBTu作為縮合劑，將第二個(gè)氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽，重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，脫去保護(hù)基Fmoc-，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽；②多肽在可降解聚合物納米顆粒中的囊縮，取0.6ml含多肽的水溶液(10mg/mlin PBS),加入到4mlPLGA的二氯甲烷溶液中(15mg PLGA/ml 二氯甲烷)，用探頭式的超聲波破碎儀超聲乳化40秒，乳化過(guò)程中用冰浴冷卻，然后將此乳濁液加入到60ml含聚乙烯醇的水溶液中(2.5wt%PVA的水溶液)，超聲乳化2分鐘，然后攪拌過(guò)夜，讓有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈，3000g低速離心25分鐘去掉大顆粒，然后21000g超速離心25分鐘收集產(chǎn)物，洗三次，凍干得到納米疫苗。
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例1:合成新型樹枝狀化合物載體的抗乳腺癌Her2疫苗1.固相合成Her2抗原肽2.1.稱取樹脂于DCM( 二氯甲烷)，氬氣鼓動(dòng)5min ；2.2.稱取 Fmoc-Leu-OH 0.3mmol ；2.3.Fmoc-Leu-OH: DIEA = 1: 2 (n) IS氣鼓動(dòng) 90min ；2.4.DCM 洗滌 5 次(次 /min)；2.5.封閉樹脂活性 DCM: DIEA: MeOH = 3.4ml: 0.2ml: (X4ml 氬氣鼓動(dòng)IOmin ；2.6.DCM洗滌5次(次/min)，再DMF (二甲基甲酰胺)洗滌5次(次/min)，后20% pipe30min ；2.7.20% pipe洗滌一次，再DMF洗滌5次(次/min)，以脫出白色Fmoc粉末為宜；2.8.Fmoc-Met-OH (0.3mmol): HBTu: DIEA=I: I: 2 (η)氬氣鼓動(dòng) 90min ;2.9.DMF 洗滌 5 次(次 /min)；2.10.20% pipe IS氣鼓動(dòng) 30min ；2.11.20% pipe洗漆一次,DMF洗漆5次(次/min);依次加入后續(xù)Fmoc-氨基酸，重復(fù)8-12的操作，按文獻(xiàn)順序連接多肽，最后用95% TFA, 2.5% H20，2.5% TIS將合成好的肽段與固相樹脂脫離。2.抗原多肽在可降解聚合物PLGA納米顆粒中的囊縮。2.1配置抗原多肽的PBS水溶液(10mg/ml in PBS)2.2配置可降解聚合物PLGA的二氯甲烷溶液(15mg PLGA/ml 二氯甲烷)2.3取0.6ml含多肽的水溶液，加入到4ml PLGA的二氯甲烷溶液中2.4用探頭式的超聲波破碎儀超聲乳化40秒，乳化過(guò)程中用冰浴冷卻。2.5將此乳濁液加入到60ml含聚乙烯醇的水溶液中(2.5wt% PVA的水溶液)，超聲乳化2分鐘.
2.6攪拌過(guò)夜，讓有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈。2.7在3000g下低速離心25分鐘去掉大顆粒.
2.8在21000g下超速離心25分鐘收集產(chǎn)物，洗三次，凍干得到納米疫苗?！?br> 權(quán)利要求
1.一種新型的抗乳腺癌Her2多肽疫苗的研制方法，其特征包括將HER2/neu 342-350多肽和E75多肽等抗原肽囊縮到聚乳酸-羥基乙酸共聚物形成的納米顆粒中，形成大小約500納米到2微米之間的納米疫苗，這樣的疫苗能高效的被抗原遞呈細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)攝取，從而顯著提高h(yuǎn)er2抗原肽的免疫原性，該疫苗的研制方法為:①通過(guò)固相方法合成HER2/neu 342-350多肽和E75多肽，具體固相合成步驟是氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個(gè)氨基被封閉基團(tuán)Fmoc-保護(hù)的氨基酸共價(jià)連接在固相載體上，20% pipe的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個(gè)氨基酸就接到了固相載體上了，DIEA提供一個(gè)堿性的 反應(yīng)環(huán)境，HBTu作為縮合劑，將第二個(gè)氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽，重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，脫去保護(hù)基Fmoc-，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽；②多肽在可降解聚合物納米顆粒中的囊縮，取0.6ml含多肽的水溶液(10mg/ml in PBS)，加入到4ml PLGA的二氯甲烷溶液中(15mg PLGA/ml 二氯甲烷)，用探頭式的超聲波破碎儀超聲乳化40秒，乳化過(guò)程中用冰浴冷卻,然后將此乳濁液加入到60ml含聚乙烯醇的水溶液中(2.5wt%PVA的水溶液)，超聲乳化2分鐘，然后攪拌過(guò)夜，讓有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈，3000g低速離心25分鐘去掉大顆粒，然后21000g超速離心25分鐘收集產(chǎn)物，洗三次，凍干得到納米疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PLGA肽囊的抗乳腺癌納米疫苗的制備方法，其特征在于:將Her2多肽囊縮到可降解聚合物PLGA中，制成粒徑在500納米到2微米之間的納米疫苗，可顯著提高抗原肽的免疫原性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PLGA肽囊的抗乳腺癌納米疫苗的制備方法，其特征在于:所使用的Her2蛋白上的抗原肽包括HER2/neu 342-350多肽和E75多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PLGA肽囊的抗乳腺癌納米疫苗的制備方法，其特征在于:Her2抗原肽納米疫苗制備過(guò)程中，將合成好的Her2抗原肽通過(guò)雙乳化的方式囊縮到可降解的聚合物PLGA中。
全文摘要
本發(fā)明公開了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征包括將HER2/neu 342-350多肽和E75多肽囊縮到聚乳酸-羥基乙酸共聚物形成的納米顆粒中，形成大小約500納米到2微米之間的納米疫苗。這樣的疫苗能高效的被抗原遞呈細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)攝取，從而能顯著提高h(yuǎn)er2抗原肽的免疫原性。我們通過(guò)納米技術(shù)對(duì)Her2抗原肽進(jìn)行處理，將其囊縮到納米大小的由可降解聚合物PLGA制成的納米顆粒中。該納米疫苗在體內(nèi)能被抗原遞呈細(xì)胞巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞高效攝取，具有很強(qiáng)的免疫原性，且PLGA可降解聚合物作為FDA批準(zhǔn)的藥用輔料，在體內(nèi)可以完全降解，無(wú)毒性。該納米疫苗制備簡(jiǎn)單，物理性質(zhì)穩(wěn)定，免疫原性高，可同時(shí)刺激體液免疫和細(xì)胞免疫，是理想的抗乳腺癌的Her2疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/00GK103191419SQ20121000116
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者洪章勇, 尹芝南 申請(qǐng)人:南開大學(xué)