專利名稱：新型樹枝狀化合物為載體的抗乳腺癌Her2疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征包括將HER2/neu342-350多肽和E75多肽等抗原肽連接到樹枝狀化合物(dendrimer)的表面，通過提高疫苗的分子量來提高其免疫原性；同時(shí)將能高效誘導(dǎo)體內(nèi)免疫反應(yīng)的Toll樣受體(TLR)的配基和刺激CD4+Th細(xì)胞增殖的抗原(Th抗原)，一起連接到樹枝狀化合物的表面，來進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫原性。
背景技術(shù)：
:每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌，約50萬婦女死于乳腺癌。北美、北歐是乳腺癌的高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率約為亞非拉國家的4倍。我國雖是乳腺癌的低發(fā)地區(qū)，但其發(fā)病率正在逐年上升，發(fā)病的增長速度卻高出高發(fā)國家I到2個(gè)百分點(diǎn)，尤其是滬、京、津及沿海地區(qū)是我國乳腺癌的高發(fā)區(qū)。更令人擔(dān)憂的是，與西方國家比較，我國乳癌患者發(fā)病年齡較輕，發(fā)病高峰年齡在40-49歲，比西方婦女早10-15年?；趪?yán)峻的形勢，乳腺癌的治療與防復(fù)發(fā)引起了人們的廣泛關(guān)注。乳腺癌的傳統(tǒng)治療方法:1.手術(shù)治療:手術(shù)適應(yīng)癥Halsted首創(chuàng)乳癌根治術(shù)，因手術(shù)合理，療效明確，近百年來成為人們治療乳癌所遵循的標(biāo)準(zhǔn)方式。近半個(gè)世紀(jì)以來，對乳癌術(shù)式進(jìn)行了不少探索性修改，總的趨勢不外保守和擴(kuò)大兩方面，至今仍爭論不休。乳房局部切除和全乳切除是保守手術(shù)的代表性手術(shù)。2.放射治療:可以提高手術(shù)切除率使部分不能手術(shù)的患者再獲手術(shù)機(jī)會(huì)，由于放射抑制了腫瘤細(xì)胞的活力可降低術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率從而提高生存率，由于放射延長了術(shù)前觀察時(shí)間有使部分已有亞臨床型遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例避免一次不必要的手術(shù)。3.化療:通過化療科盡早控制微轉(zhuǎn)移灶使原發(fā)癌及其周圍擴(kuò)散的癌細(xì)胞產(chǎn)生退變或部分被殺滅以減少術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，進(jìn)展期乳癌以及炎癥型乳癌限制了手術(shù)治療的實(shí)施術(shù)前化療可使腫瘤縮小以便手 術(shù)切除，可以根據(jù)切除腫瘤標(biāo)本評價(jià)術(shù)前化療效果作為術(shù)后或復(fù)發(fā)時(shí)選擇化療方案的參考。4.乳腺癌的最新治療方法:腫瘤生物治療技術(shù)是近年來因生物技術(shù)發(fā)展而興起的一種全新的腫瘤治療手段，被認(rèn)為是除了手術(shù)、化療、放療之外的第四種腫瘤治療模式，具有副作用小、抗腫瘤活性高、適應(yīng)癥廣等特點(diǎn)。將生物技術(shù)用于腫瘤治療是提高和改變患者自身機(jī)體免疫功能的治本的方法，被認(rèn)為是攻克腫瘤的最終辦法，其應(yīng)用前景廣闊。自從人類腫瘤分子特征的提高導(dǎo)致腫瘤相關(guān)抗原可以被人體的T淋巴細(xì)胞所識(shí)別后，發(fā)展抗腫瘤疫苗已成為一種趨勢。腫瘤的疫苗是通過誘導(dǎo)腫瘤患者自身的免疫監(jiān)測和殺瘤功能，有效地殺滅患者術(shù)后和放化療后體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤，預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移和最終根治腫瘤的目的，具有特異性強(qiáng)，副作用輕等特點(diǎn)，正逐步成為腫瘤綜合治療中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前腫瘤治療基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)與發(fā)展方向
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明公開了新型抗乳腺癌多肽疫苗，其特征在于包括一個(gè)來源于HER2/neu(表皮生長因子受體)的E75多肽片段，一個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞(Th，T輔助細(xì)胞)抗原決定基，一個(gè)TLR(toll-like receptor, toll樣細(xì)胞受體)的配基,和連接這三組分的半胱氨酸,該疫苗的研制方法為:①以半胱氨酸為底物，通過高氯酸的氧化作用形成二聚化的半胱氨酸，加入乙酸叔丁酯與氨基酸的羧基酯化，加入棕櫚酰氯，在氨基處形成?；磻?yīng)，還原二硫鍵并加入環(huán)氧丙醇，在巰基處形成開環(huán)氧的氧化反應(yīng)，再加入棕櫚酰氯，在兩個(gè)羥基處發(fā)生?；磻?yīng)，去掉最初半胱氨酸上的保護(hù)基，便制出Pam3Cys化合物；②氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個(gè)氨基被封閉基團(tuán)Fmoc-保護(hù)的氨基酸共價(jià)連接在固相載體上，20% pipe的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個(gè)氨基酸就接到了固相載體上了，DIEA提供一個(gè)堿性的反應(yīng)環(huán)境，HBTu作為縮合劑，將第二個(gè)氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽，重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度，脫去保護(hù)基Fmoc-，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽；③最后，將Pam3Cys上的羧基和E75多肽上的氨基通過縮合反應(yīng)連接。本發(fā)明與現(xiàn)有同類疫苗相比，結(jié)構(gòu)新穎，合成方法獨(dú)到，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例1:新型樹枝狀化合物為載體的抗乳腺癌Her2疫苗1.固相合成Th抗原決定基，Her2抗原肽，以及含Pam3的多肽2.1.稱取樹脂于DCM( 二氯甲烷)，氬氣鼓動(dòng)5min ；2.2.稱取 Fmoc-Leu-OH 0.3mmol ；2.3.Fmoc-Leu-OH: DIEA= 1: 2 (n) IS氣鼓動(dòng) 90min ; 2.4.DC M 洗滌 5 次(次 /min)；2.5.封閉樹脂活性 DCM: DIEA: MeOH = 3.4ml: 0.2ml: (X4ml 氬氣鼓動(dòng)IOmin ；2.6.DCM洗滌5次(次/min)，再DMF (二甲基甲酰胺)洗滌5次(次/min)，后20% pipe30min ；2.7.20% pipe洗滌一次，再DMF洗滌5次(次/min)，以脫出白色Fmoc粉末為宜；2.8.Fmoc-Met-OH (0.3mmol): HBTu: DIEA=I: I: 2 (η)氬氣鼓動(dòng) 90min ;2.9.DMF 洗滌 5 次(次 /min)；2.10.20% pipe IS氣鼓動(dòng) 30min ；2.11.20% pipe洗漆一次,DMF洗漆5次(次/min);依次加入后續(xù)Fmoc-氨基酸，重復(fù)8-12的操作，按文獻(xiàn)順序連接多肽，最后用95% TFA, 2.5% H20,2.5% TIS將合成好的肽段與固相樹脂脫離。但要注意的是在Th多肽和Her2抗原多肽的N-末端增加一個(gè)半胱氨酸，以便利用其硫原子來實(shí)現(xiàn)與樹枝狀高分子的連接。而合成含Pam3Cys的多肽，將含PamsCys的化合物(其末端為自由羧酸)作為普通氨基酸一樣，在固相上進(jìn)行連接。2.多肽與樹枝狀高分子化合物的連接含Pam3Cys的多肽，Th多肽，Her2抗原肽按一定比例溶在PBS緩沖液/DMSO的混合溶劑中，加入G4或G5代的樹枝狀高分子，然后加入SMCC偶聯(lián)劑，室溫反應(yīng)過夜，透析純化(半透膜的截止分子量8K)。
3.連接產(chǎn)物的表征。通過分析型的高效液相色譜以及核磁共振儀進(jìn)行最總產(chǎn)物的表征，確信各個(gè)多肽與 樹枝狀高分子的連接。
權(quán)利要求
1.一種新型的抗乳腺癌Her2多肽疫苗的研制方法，其特征包括將HER2/neu 342-350多肽和E75多肽等抗原肽連接到樹枝狀化合物(dendrimer)的表面,通過提高疫苗的分子量來提高其免疫原性；同時(shí)將能高效誘導(dǎo)體內(nèi)免疫反應(yīng)的Toll樣受體(TLR)的配基和刺激CD4+Th細(xì)胞增殖的抗原(Th抗原)，一起連接到樹枝狀高分子的表面，來進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫原性，該疫苗的研制方法為:①合成含Pam3的Toll樣受體的配基，以半胱氨酸為底物，通過高氯酸的氧化作用形成二聚化的半胱氨酸，加入乙酸叔丁酯與氨基酸的羧基酯化，力口入棕櫚酰氯，在氨基處形成?；磻?yīng)，還原二硫鍵并加入環(huán)氧丙醇，在巰基處形成開環(huán)氧的氧化反應(yīng)，再加入棕櫚酰氯，在兩個(gè)羥基處發(fā)生?；磻?yīng)，去掉最初半胱氨酸上的保護(hù)基，便制出Pam3Cys化合物；②通過固相方法合成多肽，包括Her2的抗原肽、Th的抗原肽以及Pam3在碳端連接SKKKK等多肽的制備,并且在每個(gè)多肽的末端增加一個(gè)半光氨酸,用于與樹枝狀化合物的連接用，具體固相合成步驟是氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個(gè)氨基被封閉基團(tuán)Fmoc-保護(hù)的氨基酸共價(jià)連接在固相載體上，20% pipe的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個(gè)氨基酸就接到了固相載體上了，DIEA提供一個(gè)堿性的反應(yīng)環(huán)境，HBTu作為縮合劑，將第二個(gè)氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽，重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度，脫去保護(hù)基Fmoc-，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽多肽與樹枝狀化合物的偶聯(lián)，選用末端為自由氨基的G4或G5代的樹枝狀化合物，通過SMCC偶聯(lián)劑，在H20/DMS0作溶劑下，將Pam3多肽、Th多肽、Her2的抗原肽等按一定比例將入到反應(yīng)液中，連接到樹枝狀化合物的表面上，產(chǎn)物通過透析純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹枝狀化合物為載體的疫苗的制備方法，其特征在于:Her2多肽疫苗是通過樹枝狀化合物作為載體來提高它的免疫原性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹枝狀化合物為載體的疫苗的制備方法，其特征在于:該疫苗還通過在樹枝狀化合物表面連接Toll樣受體的配基，以及Th抗原等手段進(jìn)一步提高疫苗的免疫原性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹枝狀化合物為載體的疫苗的制備方法，其特征在于:抗原肽，Th多肽或Pam3多肽等通過SMCC作為連接劑，在水/DMSO作為混合溶劑中，連接到樹枝狀化合物上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹枝狀化合物為載體的疫苗的制備方法，其特征在于:抗原肽，Th多肽和Pam3多肽按一定比例提前混勻，然后同時(shí)連接到樹枝狀高分子載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征包括將HER2/neu 342-350多肽和E75多肽等抗原肽連接到樹枝狀化合物(dendrimer)的表面，通過提高疫苗的分子量來提高其免疫原性；同時(shí)將能高效誘導(dǎo)體內(nèi)免疫反應(yīng)的Toll樣受體(TLR)的配基和刺激CD4+Th細(xì)胞增殖的抗原(Th抗原)，一起連接到樹枝狀化合物的表面，來進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫原性。
文檔編號(hào)A61K47/48GK103191423SQ20121000116
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者洪章勇, 尹芝南 申請人:南開大學(xué)