本發(fā)明涉及用于確定受試者的結直腸癌狀態(tài)的試劑和方法。

背景技術：

在uk，每年超過40,000名患者被診斷患有結直腸癌。在結直腸癌的管理中，結腸鏡檢(colonscopy)是重要的診斷和治療方法。黃金標準是用于篩查一般人群以及用于監(jiān)測處于發(fā)展癌癥的高風險的患者的白光內(nèi)窺鏡檢查。在篩選結腸鏡檢查和乙狀結腸鏡檢查中，已經(jīng)表明早期檢測結直腸病變降低了結直腸癌死亡率。然而，表面型和凹陷型腫瘤(flatanddepressedneoplasm)的檢測呈現(xiàn)出特別的挑戰(zhàn)。有助于檢測和表征異型增生性病變(dysplasiticlesion)的最新進展包括色譜內(nèi)鏡檢查、窄帶成像(nbi)、自體熒光(afi)和共焦內(nèi)顯微鏡檢查。

開發(fā)輔助工具以特異性鑒別癌變前的結直腸異型增生和癌癥，并幫助區(qū)分良性增生性息肉(hp)與顯著病變，如無蒂鋸齒狀息肉(sessileserratedpolyp)(ssp)和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditionalserratedadenoma)(tsa)，具有減少假陰性的發(fā)生率的潛力，并且是高度期望的。

此外，在肛門內(nèi)鏡顯微手術(tems)和內(nèi)鏡粘膜切除術(emr)過程中的關鍵問題是確定切除邊緣位置，即腫瘤或異型增生組織終止和正常組織開始的位置。使用常規(guī)白光可視化，通常難以辨別邊緣位置，特別是對于平面型或地毯樣病變。因此，可以將異型增生或癌性組織與正常組織區(qū)分開的工具將允許完全切除異常組織，并且將是高度期望的。

技術實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的目的是提供一種輔助工具，以允許確定受試者或樣品的結直腸癌狀態(tài)，并且還提供更精確地限定受試者或樣品(具有異常的致瘤性或異型增生的組織)中的切除邊緣的方法。本發(fā)明可以用于確定受試者是否患有結直腸癌或結直腸異型增生，和/或確定特定受試者的適當?shù)闹委熀?或預后。本發(fā)明還可以用于監(jiān)測癌癥或異型增生進展或者結直腸癌或異型增生治療的有效性。

根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了確定受試者的結直腸癌狀態(tài)的方法，包括向結腸或直腸表面施加能夠區(qū)分a)成熟的糖基化形式的muc2和b)不完全或異常的糖基化形式的muc2的試劑(藥劑)，并確定試劑結合至結腸或直腸表面的程度。

在另一方面，本發(fā)明提供了能夠區(qū)分a)成熟的糖基化形式的muc2和b)不完全或異常的糖基化形式的muc2的試劑，其用于確定受試者的結直腸癌狀態(tài)。特別地，該試劑可用于治療、診斷、預后或監(jiān)測結直腸癌或異型增生的進展。

在又一方面，本發(fā)明提供能夠區(qū)分a)成熟的糖基化形式的muc2和b)不完全或異常的糖基化形式的muc2的試劑在制備用于確定受試者的結直腸癌狀態(tài)的藥物中的用途。該用途可以是用于治療、診斷、預后或監(jiān)測結直腸癌或異型增生的進展。

優(yōu)選地，試劑僅結合或主要結合成熟的糖基化形式的muc2，或者僅結合或主要結合不完全或異常的糖基化形式的muc2。

優(yōu)選地，當確定試劑結合結腸或直腸區(qū)域的表面的程度時，鑒定試劑結合或不結合或者更優(yōu)選結合至的區(qū)域。

短語“結直腸癌狀態(tài)”包括結直腸癌的任何表現(xiàn)，包括結直腸異型增生。例如，結直腸癌狀態(tài)包括結直腸癌或結直腸異型增生的存在或不存在；結直腸癌或結直腸異型增生的進展；受試者對結直腸癌或結直腸異型增生的治療的有效性或反應；和/或患有結直腸癌或結直腸異型增生的受試者的預后。

可以使用本發(fā)明的方法用于，例如用于以下中的任何一種或多種：診斷結直腸癌或結直腸異型增生；對患有結直腸癌或結直腸異型增生的受試者的預后提供建議；診斷ssp和/或tsa；診斷hp；區(qū)分ssp/tsa和hp；監(jiān)測疾病進展；監(jiān)測受試者對特定治療的有效性或反應；和/或幫助治療結直腸癌或結直腸異型增生。

可以將該試劑離體(exvivo)施加于結直腸組織的切除或活檢樣品?？商娲兀梢詫⒃撛噭w內(nèi)施加于受試者的結腸和/或直腸表面，例如，可以將試劑局部施加至受試者的結腸和/或直腸的表面上?？梢詫⒃噭﹪婌F到受試者的結腸和/或直腸的表面上。可以使用內(nèi)窺鏡或結腸鏡施加該試劑，或者可以通過灌腸劑(enema)的方式施用。可替代地，可以以膠囊或小袋的形式口服給予試劑，并且在結腸鏡檢查或腸道手術前作為腸道制劑的一部分釋放。

試劑可以是蛋白質、肽、小分子或抗體。試劑優(yōu)選具有區(qū)分在結腸和/或直腸表面(表現(xiàn)出成熟的糖基化的muc2)的上皮表面上發(fā)現(xiàn)的粘液和其它復合糖蛋白，與在上皮表面(其中muc2的糖基化不完全或異常)上發(fā)現(xiàn)的粘液和其它復合糖蛋白的能力。

試劑可以是凝集素。凝集素是特異性的糖類識別蛋白。凝集素可以是多花紫藤凝集素(wisteriafloribundaagglutinin)(wfa)或雙花扁豆凝集素(dolichosbiflorusagglutinin)(dba)。凝集素，例如wfa或dba，可優(yōu)選結合成熟的糖基化muc2，允許正常組織與具有癌癥或異型增生的組織清楚地區(qū)分開。

muc2，也稱為粘蛋白2，是一種在人類中由muc2基因編碼的蛋白并且作為粘蛋白家族的一部分。muc2是主要的粘蛋白，并且由上皮層(epitheliallining)中的杯狀細胞(將muc2分泌至大腸的腔管中)分泌至粘膜表面上。muc2連同少量粘蛋白相關蛋白在結腸/大腸中聚合成凝膠，其中該凝膠的按重量計80％是作為粘蛋白的翻譯后修飾所添加的寡糖側鏈。這種凝膠提供了用于保護腸上皮的不溶性粘液屏障。

muc2的糖基化隨著組織從正常轉移到異型增生到癌變而改變。更具體地，當組織變?yōu)楫愋驮錾虬┬詴r，糖基化水平降低或變得異常。糖基化的這種變化可以意味著與正常組織相關的成熟糖基化muc2良好結合的試劑，不再結合或較不良地結合至具有異型增生的、異常的(例如具有ssp/tsa)或是癌性的組織。

可以將試劑標記以允許其易于可視化。例如，試劑可以用熒光團標記。熒光團可以是熒光素、羅丹明(tritc)、香豆素、花青(例如，cy5或cy5.5)或licorirdye800cw紅外染料?？商娲?，標記可以是放射性標記。試劑可以是標記的wfa或標記的dba。

通過使用標記試劑，可以在受試者的離體或體內(nèi)的樣品中可視化和區(qū)分結腸/直腸組織的區(qū)域(其中muc2糖基化不完全或異常)，以及糖基化完全的和成熟的區(qū)域。muc2的不完全或異常糖基化的區(qū)域可以是癌前異型增生或癌癥的區(qū)域，或者可以是ssp或tsa。muc2的完全或成熟糖基化區(qū)域可以代表正常組織的區(qū)域。通過能夠確定具有不同muc2糖基化模式的這些不同區(qū)域，可以進行更準確的診斷和/或預后。能夠區(qū)分正常組織與異型增生或癌組織也可以允許施用更加靶向的治療。例如，如果可以清楚地看到癌癥或異型增生的區(qū)域，則治療劑的施用可以更有靶向性，并且任何外科手術可以更準確。如果所有異型增生或癌性組織可以在第一種情況下被移除或治療的話，那么這可以具有減少重復治療或外科手術的需要的優(yōu)點。它還將降低異型增生或癌癥復發(fā)的風險。

假定試劑優(yōu)先與異常的、異型增生或癌性的組織結合，則試劑可以與藥物偶合，允許藥物被遞送到異常組織?？商娲?，如果試劑靶向正常組織，其可以與保護劑偶合以在放射治療期間“屏蔽”正常細胞免受輻射。

本發(fā)明的方法可以用于確定惡化前的結直腸異型增生和/或癌癥。特別地，本發(fā)明的方法可以用于將良性增生性息肉(hp)與顯著病變，如無蒂鋸齒狀息肉(ssp)和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(tsa)區(qū)分開來。良性hp通常與成熟的糖基化muc2相關，而ssp和tsa與具有不完全或異常糖基化的muc2相關。因此，本發(fā)明的方法具有降低在診斷結直腸癌中的假陰性發(fā)生率的潛力，這是特別重要的，因為缺失的ssp可以導致通過鋸齒狀路徑發(fā)展結直腸癌。如果它們可以被看到的話，使用結直腸組織的常規(guī)白光可視化，通常很難辨別什么是良性hp和什么是ssp或tsa。本發(fā)明的方法解決了這個問題。

本發(fā)明的方法還可以允許在樣品中更精確地限定癌癥或異型增生的邊緣。因此允許更加完全和準確地移除這樣的組織。

本發(fā)明的方法優(yōu)選地允許將正常結直腸粘膜與異型增生和/或癌組織區(qū)分開。這可以通過利用與正常組織相比，在異常、癌癥和異型增生的組織中muc2的糖基化模式的差異來實現(xiàn)。

在一種實施方式中，標記的wfa或dba可用于將惡化前結直腸異型增生和/或癌癥與正常組織區(qū)分開。標記的wfa和dba都將優(yōu)選地與成熟的糖基化muc2結合，因此任何標記的組織可以被認為是正常的，并且任何未標記的組織或顯著減少的標記組織可以被認為是異型增生或癌性的，并且可以在它們倆之間看到相當明顯的分界。

試劑可以通過將其溶解或分散在合適的可流動的載體賦形劑，如水、醇或水-醇液體中來配制用于給予。載體賦形劑可以用天然或合成的增稠劑，如樹膠、丙烯酸酯或改性纖維素來增稠。制劑還可包含有效量的潤滑劑，如天然或合成的脂肪或油，即，三脂肪酸甘油酸酯或卵磷脂。也可以包括無毒的非離子表面活性劑作為潤濕劑和分散劑。

可以旨在以小于約100μg/ml，優(yōu)選小于約50μg/ml，更優(yōu)選小于約25μg/ml或小于約20μg/ml，或小于約10μg/ml或約5μg/ml的劑量施用試劑。

在另一方面，本發(fā)明提供了測定受試者的結直腸區(qū)域的結直腸癌狀態(tài)的方法，包括向該區(qū)域局部施加凝集素，如wfa或dba，并測定其結合的程度。優(yōu)選地，凝集素能夠區(qū)分具有成熟的糖基化的muc2和具有不完全或異常糖基化的muc2。

凝集素可以從天然來源分離，或者可以進行重組合成或化學合成。

如果凝集素是wfa或dba，則提及wfa或dba旨在包括全長凝集素及其任何功能衍生物，例如截短形式或修飾形式，其保留區(qū)分具有成熟的糖基化的muc2和具有不完全或異常糖基化的muc2的能力。

在另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者的結直腸癌或異型增生的方法，包括：

·向受試者的結腸和/或直腸區(qū)域局部施加能夠主要結合至與健康組織相關的成熟的糖基化形式的muc2或者與異型增生或癌癥相關的不完全或異常糖基化形式的muc2的標記試劑；

·使施加試劑的結直腸區(qū)域可視化并且觀察試劑已經(jīng)結合的位置；和

·切除或治療與不完全或異常糖基化形式的muc2相關的組織。

在實施方式中，試劑僅結合或主要結合至與健康組織相關的成熟的糖基化形式的muc2。如果在該實施方式中，試劑用熒光團標記，則當照射時，其將主要在健康組織上發(fā)熒光，并且任何癌性或異型增生或異常的組織將具有很少或不具有熒光。通過觀察熒光的模式，健康的和異型增生的或癌性的組織之間的分界將比簡單地在白光下清楚更多，并且將允許更準確地去除盡可能多的異型增生和/或癌性組織。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定受試者中的癌性或異型增生的結直腸組織的試劑盒，其包含i)主要結合至成熟的糖基化形式的muc2或者不完全或異常糖基化形式的muc2的標記試劑；和ii)將標記試劑局部施加于受試者的結腸和/或直腸區(qū)域的表面的說明。試劑可以是wfa或dba。

試劑可以旨在經(jīng)由內(nèi)窺鏡施用。試劑可以如本文所描述的。

在另一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)測受試者的結直腸癌或異型增生的進展的方法，包括：

i)向受試者的結腸和/或直腸區(qū)域局部施加能夠主要結合至與健康組織相關的成熟的糖基化形式的muc2或者與異型增生或癌癥相關的不完全或異常糖基化形式的muc2的標記試劑；以及

ii)使結直腸區(qū)域可視化并且觀察試劑結合位置；以及

iii)在稍后的時間點，重復步驟i)和ii)并確定異型增生或癌癥組織的程度是否已改變。

步驟ii)和iii)之間的時間可以是數(shù)周、數(shù)個月或幾年，優(yōu)選至少1個月、2個月、3個月或更長。

在一種實施方式中，步驟iii)優(yōu)選在施用治療或除去一些組織之后進行。

基于步驟iii)中的觀察，可以對下一個作用方案作出決定，例如如果異型增生或癌癥的區(qū)域沒有減少，則可以建議進一步的組織切除，或者可以建議進一步的化療或放射治療。

監(jiān)測受試者中的結直腸癌或異型增生的進展的方法可以不包括受試者的任何治療。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于選擇治療方案的測定法，該測定法包括：

i)向受試者的結腸和/或直腸區(qū)域局部施加能夠主要結合至與健康組織相關的成熟的糖基化形式的muc2或與異型增生或癌癥相關的不完全或異常糖基化形式的muc2的標記試劑；

ii)使結直腸區(qū)域可視化并且觀察試劑結合位置；

iii)基于試劑的結合確定受試者是否患有任何異型增生或癌癥組織；

iv)如果存在異型增生或癌癥組織，決定施用化學療法、放射療法和/或者去除異型增生或癌癥組織。

根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了一種裝置，包括：

i)配置成可視化特定熒光團的內(nèi)窺鏡或結腸鏡；

ii)還包括含有如本文所述的試劑的工作通道(workingchannel)的內(nèi)窺鏡或結腸鏡；以及

iii)連接到內(nèi)窺鏡或結腸鏡的輸出模塊，用于顯示和/或分析由內(nèi)窺鏡或結腸鏡獲得的圖像。

本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的裝置在確定受試者的結直腸癌狀態(tài)中的用途。該用途可包括將內(nèi)窺鏡或結腸鏡插入至結腸或受試者：施用能夠區(qū)分a)成熟的糖基化形式的muc2和b)不完全或異常糖基化形式的muc2的熒光團標記試劑；觀察標記試劑在結腸中結合的模式；以及分析在輸出模塊上的結果。輸出模塊可以是監(jiān)視器。

在本發(fā)明的任何方面，受試者可以是人或非人類的動物。優(yōu)選地，受試者是人?？商娲?，受試者也可以是馬、牛、綿羊、靈長類動物(例如，猴)、山羊、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠或小鼠或任何其它合適的動物。

技術人員將理解，本發(fā)明的任何一種實施方式和/或方面的優(yōu)選特征可以應用于本發(fā)明的所有其它實施例和/或方面。

附圖說明

參照附圖，現(xiàn)在僅通過實施例的方式詳細描述本發(fā)明，其中：

圖1-示出了用于在本發(fā)明中使用的選擇的熒光凝集素。圖1(a)示出了在30個結直腸癌細胞系和22個正常粘膜樣品之間差異表達的鞘糖脂生物合成途徑中涉及的基因的mrna微陣列的分級群集(hierarchicalclustering)。(紅色代表較高的表達，藍色代表較低的表達)。與癌癥相比，兩種基因在正常組織中顯示出清楚的統(tǒng)計學上顯著更高的表達，b3galt4(邦費羅尼多重檢驗(bonferronimultipletest)校正的p＝3,1×10-13)和st6galnac6(p＝5.2×10-13)。圖1(b)示出了基于正常(n＝6)和癌癥(n＝6)樣品中組織微陣列上的總熒光水平，galnac結合凝集素的初始篩選的結果。篩選的凝集素包括尾穗莧(acl)、洋紫荊(bpl)、多花紫藤(wfa)、雙花扁豆(dba)、長柔毛野豌豆(vvl)和槐凝集素(sja)。非配對t檢驗****p<0.0001，***p<0.001，*p<0.05。圖1(c)示出了從以下各項獲得的的ffpe切片的圖像的代表性實例：正常、低度異型增生(lgd)、高度異型增生(hgd)和侵襲性結直腸癌。藍色(dapi)、綠色(wfa-熒光素)、紅色(dba-羅丹明)和合并的通道、×5目標、比例尺200μm。圖1(d)示出了在非配對樣本中的正常的(n＝21)、lgd(n＝21)、hgd(n＝9)和癌癥(n＝10)的ffpe切片中wfa-熒光素和dba-羅丹明的熒光的點圖。圖中的數(shù)據(jù)為平均值±sem。(t檢驗，****p<0.0001)。圖1(e)示出了從ffpe組織微陣列的、配對的正常(n)和結直腸癌(c)樣本所獲得的圖像的實例。dapi(藍色)、wfa-熒光素(綠色)×5目標、比例尺200μm。圖1(f)示出了配對的ffpe正常的和結直腸癌的樣本(n＝24)的熒光的定量。配對t檢驗(****p<0.0001)。

圖2-示出了wfa與成熟形式的muc2的結合。用dapi(藍色)、wfa-熒光素(綠色)和muc2a(左，紅色)、muc2d(中間，紅色)或pr5d5(右，紅色)染色的正常人結腸上皮、低度異型增生(lgd)、高度異型增生(hgd)和癌癥的代表性免疫熒光ffpe系列切片×5目標。比例尺為200μm，h+e圖像(h+eimage)×4目標。圖15示于示出了詳述結腸上皮隱窩(crypt)染色的頂部小圖的放大圖像。其它實施例的熒光定量示于圖17a中，每組中n＝5。wfa不結合在隱窩基部的muc2陽性細胞，但越來越多地結合至隱窩中更高的杯狀細胞，并且強烈地結合到分泌的粘液，表明wfa結合至成熟的，可能還有更成熟但不完全成熟的糖基化形式的muc2。應注意，在muc2表達存在下，wfa與lgd結合的減少，表明糖基化的早期變化導致在lgd中wfa結合的減少，而不是muc2蛋白表達的變化。在hgd和癌癥樣本中，wfa結合和muc2蛋白表達都喪失。

圖3-示出了在來自fap患者和apcmin小鼠的腺瘤上的wfa染色。圖3(a)示出了來自患有家族性腺瘤性息肉病(fap)的患者的結腸上皮的ffpe切片，其顯示在由組織學上正常的上皮包圍的早期息肉中的低度異型增生。wfa-熒光素(綠色)、muc2a(紅色)和dapi(藍色)?！?目標。甚至在早期腺瘤性息肉中，wfa結合和muc2蛋白表達的水平都嚴重降低。比例尺為200μm。h+e圖像，×5目標。參見用于熒光定量的圖17(b)，n＝5。圖3(b)包括用wfa-熒光素染色的來自野生型回腸(wild-typeileum)和結腸以及來自min小鼠(apcmin/+)的正常的回腸和回腸息肉的ffpe切片的代表性圖像。dapi(藍色)和wfa-熒光素(綠色)×20目標，比例尺200μm，h+e圖像，×20目標。參見用于熒光定量的圖17(c)，n＝5。圖3(c)包括用dapi(藍色)和wfa-熒光素(綠色)染色的來自野生型和muc2-/-小鼠的回腸、近端結腸和遠端結腸的ffpe切片的代表性圖像×20目標。與野生型相比，muc2-/-小鼠中結合腸上皮的wfa減少。比例尺為200μm，h+e圖像，×20目標。參見用于熒光定量的圖17(d)，n＝5

圖4-示出了ucffpe樣本的wfa和muc2免疫熒光。圖4包括用dapi(藍色)、muc2a(紅色)和wfa-熒光素(綠色)染色的患有潰瘍性結腸炎的患者的樣本的ffpe切片的圖像的實例，×5目標。所有實施例均來自潰瘍性結腸炎的患者。頂部小圖示出了活性的、發(fā)炎的組織，無異型增生。中間圖示出了具有低度異型增生(lgd)的潰瘍性結腸炎。底部小圖示出了患有癌癥(ca)的潰瘍性結腸炎。h+e圖像，×4目標。其他實施例的熒光定量示于圖17(e)中，每組n＝5。

圖5-表明wfa結合由增生性息肉產(chǎn)生的粘蛋白，但不結合由無蒂鋸齒狀息肉、傳統(tǒng)的鋸齒狀息肉和粘液性癌產(chǎn)生的粘蛋白。示出了人(a)增生性息肉(hp)、(b)無蒂鋸齒狀息肉(ssp)、(c)傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(tsa)和(d)粘液性癌(ca)的代表性免疫熒光ffpe系列切片。用dapi(藍色)、wfa-熒光素(綠色)和muc2a(紅色)×5目標染色。h+e圖像，×4目標。其他實施例的熒光定量示出于圖17(f)中，每組n＝5。

圖6-示出了wfa對新鮮切開的活檢樣本的應用。圖6(a)示出了來自用wfa-熒光素1:200在37℃下標記10分鐘的直腸乙狀結腸的新鮮配對的正常粘膜和癌切開活檢樣品的代表性白光圖像(頂部小圖)和ivis200熒光圖像(中間圖)。白色比例尺等于2cm。色標(右上)表示熒光強度。h+e染色切片(底部小圖)來自成像樣本×4目標。黑色比例尺等于200μm。圖6(b)示出了在37℃下施加wfa-熒光素(n＝12)10分鐘后，使用ivis200照相機成像的新鮮配對的正常和結直腸癌樣品的熒光定量。配對t檢驗(***p<0.001)，正常比癌癥的熒光平均比率為2.5。

圖7-使用整個器官新鮮組織(直腸乙狀結腸癌的前切除)提供了熒光wfa的驗證。圖7(a)示出了沿縱向打開的樣本的白光圖像。直腸乙狀結腸癌以虛線突出顯示。相鄰粘膜宏觀上正常。藍色條＝10cm。圖7(b)示出了在37℃下施加wfa-熒光素10分鐘然后簡單地洗滌兩次后，使用ivis200照相機獲取的樣本的熒光圖像。圖7(c)示出了在(b)×4目標中示出的組織學切片。黑色標尺條等于200μm。

圖8-示出了獲得自患有潰瘍性結腸炎和dalm的患者的完全新鮮的樣本的離體成像。圖8(a)示出了縱向打開的來自患有慢性潰瘍性結腸炎、dalm形成和遠端節(jié)食疾病的患者的全結腸切除(totalcolectomy)樣本的白光圖像。常規(guī)結腸鏡檢查能夠在切除術前的中橫結腸中確定大的dalm區(qū)域(大箭頭，由虛線圈住)，但是不能檢測到更近端的小dalm區(qū)域(小箭頭，由虛線包圍)，如通過熒光wfa所示出的。藍色虛線表示不含粘膜的樣本的區(qū)域。藍色條＝10cm。圖8(b)示出了在37℃下施加wfa-熒光素10分鐘，然后簡單地洗滌兩次后，使用ivis200照相機獲取的樣本的熒光圖像，其覆蓋在灰度圖像(greyscaleimage)和網(wǎng)格上從而允許wfa熒光與組織結構關聯(lián)。圖8(c)示出了具有強度比例尺的樣本的熒光圖像。圖8(d)示出了映射到(b)中所示的網(wǎng)格的組織的組織結構，顯示了非發(fā)炎組織(網(wǎng)格e4)、發(fā)炎組織(網(wǎng)格h3)、大型dalm(網(wǎng)格d2)和更微細的在白光內(nèi)窺鏡檢查期間不明顯的dalm區(qū)域(網(wǎng)格b6)?！?目標黑色比例尺等于200μm。

圖9-示出了經(jīng)肛門內(nèi)窺鏡顯微手術(tems)樣本的新鮮離體成像。圖9(a)顯示了來自在先前息肉切除術和放射治療后直腸癌復發(fā)的患者的tems樣本的白光圖像。黑色條＝5cm。圖9(b)是在37℃下施加wfa-熒光素10分鐘然后簡單地洗滌兩次后，使用ivis200照相機所獲取的樣本的熒光圖像。由網(wǎng)格覆蓋的圖像，使得wfa熒光與組織結構相關聯(lián)。圖9(c)是樣本的灰度圖像。圖9(d)是具有強度比例尺的樣本的熒光圖像。圖9(e)示出了映射到圖9(b)所示的網(wǎng)格的組織的組織結構，顯示了非異型增生組織(網(wǎng)格g1、g2和d3，×4目標)、低度異型增生(網(wǎng)格c3，×4目標)的區(qū)域，和以前活檢的具有裸露的上皮、纖維化(f)和潛在的復發(fā)性直腸癌(ca)的區(qū)域(網(wǎng)格c2，×2目標)。黑色標尺條等于200μm。紅色條尺等于400μm。

圖10-示出了在施加wfa-cy5之后，使用660nm熒光內(nèi)窺鏡系統(tǒng)的白光和熒光成像。圖10(a)是前切除樣本的白色光圖像(左)和熒光圖像(中間)。白色比例尺1cm。與包圍在虛線內(nèi)的癌癥(ca)相比，非異型增生(nd)組織是明亮的。組織結構(histology)×4目標(右)黑色條200μm。圖10(b)是具有覆蓋網(wǎng)格以便與組織結構(右)×4目標相關的tems樣本的白光圖像(左)和熒光圖像(中間)。白色條5cm。黑色條200μm，框3是具有最亮熒光的非異型增生的組織?？?是侵襲性癌癥并與最黑暗的熒光區(qū)域相關。框1具有中等水平的熒光，并且是組織學上高度異型增生的(hgd)。圖10(c)是來自患有多個左側息肉的患者的前切除樣本的白光圖像(左)和熒光圖像(中間)。白色比例尺1cm。由于該樣本的尺寸，成像系統(tǒng)以寬視場模式使用。所有取樣的息肉(樣本1-5)是管狀腺瘤(ta)，并且這些息肉與非異型增生組織(樣本6)相比具有低得多的熒光。組織結構×4目標(右)。黑色條2000m。圖10(d)是前切除樣本的白光圖像(左)和熒光圖像(中間)。白色比例尺1cm。該樣本在模擬結腸鏡檢查的條件下在吹入(insufflation)下成像。在該標本中有兩個癌癥病變，一個在白光內(nèi)窺鏡檢查(ca1，紅色箭頭)內(nèi)可見，另一個平面病變(flatlesion)在白光可視下不明顯(ca2，藍色包圍)，但具有低wfa-cy5熒光。nd＝非異型增生(non-dysplastic)。組織結構×4目標(右)。黑色條2000m。

圖11-示出了用熒光凝集素(acl-熒光素，bpl-568，wfa-熒光素，dba-568，vvl-熒光素，sja-568，dapi藍)染色的正常的和癌癥的ffpe樣本的代表性圖像?！?目標。比例尺200μm。

圖12-示出了用wfa-熒光素和dba-羅丹明染色的正常的、lgd、hgd和侵襲性結直腸癌ffpe樣本的另一圖像?！?目標，比例尺200μm。

圖13-示出了競爭性結合測定的結果，并且表明隨著游離n-乙酰半乳糖胺(galnac)濃度的增加，wfa的結合降低，表明wfa對組織樣本上游離的galnac殘基的特異性。dapi(藍色)和wfa-熒光素(綠色)，×5目標，比例尺200μm。底部小圖為wfa熒光的定量，n＝5。

圖14-示出了與正常結腸上皮(n)和結直腸癌(c)相比，來自2名患者的配對樣本的單克隆抗muc2(muc2d，左)和wfa凝集素(右)的蛋白質印跡。用單克隆抗肌動蛋白抗體作為加樣對照來檢測印跡。應注意，wfa與以正常組織中的與muc2相同水平運行的蛋白結合，并且與配對的正常組織相比，在癌癥中wfa結合和muc2結合的水平都顯著降低。

圖15-示出了圖2頂部小圖的頂部小圖放大圖。正常人結腸上皮wfa-熒光素(綠色)和muc2a(左，紅色)、muc2d(中間，紅色)或pr5d5(右，紅色)×16目標，比例尺200μm。應注意，wfa不與隱窩底部的杯狀細胞結合，但表現(xiàn)出其與成熟的杯狀細胞的結合增加。wfa還與已經(jīng)由杯狀細胞分泌到隱窩腔中的粘液結合。

圖16-示出了用dapi(藍色)、wfa-熒光素(綠色)和pr5d5(左，紅色)(×20目標)或muc2a(右，紅色)(×5目標)染色的正常人結腸上皮的免疫熒光ffpe切片的另一實施例，表明wfa與在隱窩的腔內(nèi)的分泌的粘液(左)以及襯在結腸上皮的頂部的杯狀細胞和成熟粘液(右)結合。比例尺200μm。

圖17-示出了熒光的定量，與圖3、4和5相關的另外ffpe圖像的wfa和muc2a熒光的定量。每組n＝5(****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，ns＝不顯著(notsignificant))

(a)與圖2相關-正常、lgd、hgd和癌癥組織，非配對t檢驗

(b)與圖3a相關-fap正常的與fap小息肉，配對t檢驗

(c)與圖3b相關-野生型回腸和結腸，以及來自min小鼠(apcmin/+)的正?；啬c和回腸息肉，配對t檢驗

(d)與圖3c相關-來自野生型和muc2-/-小鼠的回腸、近端結腸和遠端結腸，非配對t檢驗

(e)與圖4相關-具有炎癥、lgd和癌癥的潰瘍性結腸炎，非配對t檢驗

(f)與圖5相關-增生性息肉(hp)，無蒂鋸齒狀息肉(ssp)，傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(tsa)和粘液性癌(ca)，非配對t檢驗。

圖18-示出了用dapi(藍色)和wfa-熒光素(綠色)×20目標染色的來自野生型和muc2-/-小鼠的回腸、近端結腸和遠端結腸的ffpe切片的圖像的另一實例。比例尺200μm。

圖19-示出了用wfa-熒光素(綠色)、muc2a/muc2d/pr5d5(紅色)和dapi(藍色)染色的，×5目標的sw1222和hct116細胞系的圖像。sw1222可以分化成所有三種的上皮細胞系，包括用wfa標記的并且與muc2和pr5d5染色共定位的杯狀細胞。hct116是具有高比例的癌干細胞的細胞系，并且不分化形成杯狀細胞。muc2a、muc2d、pr5d5或wfa無一結合至hct116，與該細胞系不表達muc2并且不產(chǎn)生杯狀細胞的事實一致。

圖20-示出了用dapi(藍色)、muc2a(紅色)和wfa-熒光素(綠色)染色的3個單獨的增生性息肉樣本的ffpe切片的圖像(×5目標)的另一實例。比例尺200μm。

圖21-示出了用dapi(藍色)、muc2a(紅色)和wfa-熒光素(綠色)染色的3個分離的無蒂鋸齒狀息肉樣本的ffpe切片的圖像(×5目標)的另一實例。比例尺200μm。

圖22-示出了來自用dapi(藍色)、muc2a(紅色)和wfa-熒光素(綠色)染色的傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤樣本(底部小圖)的ffpe切片的圖像(×5目標)的另一實例。在頂部小圖上示出了來自同一患者的正常上皮。在中間圖中示出了正常上皮過渡到tsa的接合處，其中tsa由虛線白線(dashedwhiteline)突出顯示。比例尺200μm。

圖23-示出了用dapi(藍色)、muc2a(紅色)和wfa-熒光素(綠色)染色的3個分離的粘液性癌癥樣本的ffpe切片的圖像(×5目標)的另一實例。比例尺200μm

圖24-是使用整個器官新鮮組織的熒光wfa的驗證：用于憩室病的乙狀結腸切除。圖24(a)示出了縱向打開的樣本的白光圖像。該樣本含有多個憩室，但不含任何異型增生病變，因此用作陰性對照。藍色比例尺10cm。圖24(b)示出了在37℃下施加wfa-熒光素10分鐘，然后簡單地洗滌兩次后，使用ivis200照相機所獲取的樣本的熒光圖像。圖像疊加到樣本的灰度圖像上。圖24(c)是樣本的灰度圖像。圖24(d)是具有強度比例尺的樣本的熒光圖像。

圖25-是使用ivis200照相機對用wfa-熒光素標記的切除的整個結直腸樣本的熒光成像的定量?；跓晒獾牟町愃剑_定感興趣的區(qū)域用于進一步的組織學分析。計算樣本1、2和3的正常與癌癥的熒光比^λ。計算樣本4的正常與異型增生的熒光比。平均比率＝2.6。沒有ca/異型增生在樣本5中進行比率計算，樣本4的正常結腸粘膜是uc背景上的遠端保留結腸粘膜λλ(distalsparedcolonicmucosa)。

圖26-示出了圖26(a)中的新切除的傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(tsa)的白光圖像。黑色條＝5cm。圖26(b)示出了在37℃下施加wfa-熒光素10分鐘然后簡單地洗滌兩次后，使用ivis200照相機所獲取的樣本的熒光圖像。圖像疊加到樣本的灰度圖像上。圖26(c)是確認診斷tsa，×4目標的樣本的h+e切片。比例尺200μm。圖26(d)是樣本的灰度圖像，并且圖26(e)是具有強度比例尺的樣本的熒光圖像。

圖27-示出了用熒光wfa-熒光素和wfa-cy5，dapi藍)共染色的×5目標的正常結腸上皮(ffpe)的圖像，證明兩種標記試劑的良好的共定位，并證實用cy5偶合wfa不改變其結合特異性。比例尺200μm。

圖28-在頂部小圖中示出了：在施加wfa-cy5后，來自患有潰瘍性結腸炎和dalm的患者的前切除樣本的白光圖像(左)和熒光圖像(中)。白色比例尺1cm。網(wǎng)格疊加在熒光圖像上(右)。wfa-cy5能夠區(qū)分異型增生的平面型區(qū)域(網(wǎng)格a5)和非異型增生的組織(網(wǎng)格b1)，即使這在白光內(nèi)窺鏡檢查中不明顯。該樣本在網(wǎng)格d4和在c6/c7的邊界也有兩個侵襲性ca的區(qū)域。組織學×4目標(下部圖)黑色條200μm。

圖29示出了在圖29(a)中的白光圖像，以及在圖29(b)中的在施加wfa-cy5后的右半結腸切除樣本的熒光圖像。白色比例尺1cm。該樣本在模擬結腸鏡檢查的條件下在吹入下成像。熒光的暗區(qū)與癌癥(ca)相關，包圍在紅線圖29(c)內(nèi)。還有一個具有癌癥的壞死區(qū)域，包圍在使用白光內(nèi)窺鏡檢查不容易看到但是通過低熒光突出顯示的藍線內(nèi)。組織學×4目標(下部圖)黑色條200μm。

圖30示出了使用660nm的熒光內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，用wfa-熒光素標記的切除的全結直腸樣本的熒光成像的定量。樣本1、2和3和5是指在圖10中所示的那些。rt＝放射治療(radiotherapy)。計算樣本1、2、4、5和6的正常與癌癥的熒光比。計算樣本3的正常與異型增生的比率。平均比率＝3.6。

圖31示出了新鮮的tems樣本的圖像：在施加wfa-cy5并重復洗滌后的白光圖像和熒光圖像。盡管進行多次洗滌，但仍存在良好的信號，證實wfa與粘膜表面緊密結合。藍色比例尺5cm。

具體實施方式

結果

選擇與正常的、異型增生的和癌組織差別結合的凝集素

在30個結直腸癌細胞系和22個正常的組織樣本中，比較鞘糖脂生物合成途徑中所選擇的一組基因的mrna表達水平。結果表明，與結直腸癌相比，兩種基因b3galt4和st6galnac6在正常組織中顯著上調(圖1a)。這些基因分別編碼作用于n-乙酰半乳糖胺(galnac)的半乳糖轉移酶和唾液酸轉移酶。糖基轉移酶在異型增生的組織中的較低水平的表達導致不完全糖基化的側面改變(sidechange)和改變的凝集素結合。

結合galnac的凝集素，多花紫藤凝集素(wfa)在本文中表現(xiàn)為能夠區(qū)分正常組織和結直腸癌。當熒光標記的wfa暴露于正常的和癌癥的福爾馬林固定石蠟包埋(ffpe)樣本時，wfa和dba顯示優(yōu)選地與正常組織結合(圖1b和圖11)。wfa和dba對正常結腸上皮、低度異型增生(lgd)、高度異型增生(hgd)和癌癥的石蠟包埋切片的結合示于圖1c和圖12中。在正常組織中，wfa和dba表現(xiàn)為共定位并結合至杯狀細胞和分泌的粘液。與來自一群具有增加的異型增生的患者(分別從正常至lgd至hgd和癌癥)的結腸上皮細胞的結合逐漸減少(圖1d)。

進一步研究了在從24名患者獲得的結直腸組織微陣列中的配對的正常和癌癥樣本中，熒光wfa區(qū)分正常組織和癌性組織的能力(圖1e)。微陣列上每個位置的總體平均熒光對于正常組織為27.6單位，相對于癌癥為4.8單位(配對t檢驗，p<0.0001)(圖1f)。使用系列ffpe切片，游離galnac的濃度增加足以防止wfa與這些組織切片的結合(圖13)，證實wfa對galnac的特異性。

wfa凝集素最主要與成熟的糖基化形式的muc2結合

由于muc2是由杯狀細胞產(chǎn)生的粘液的主要組分，進行實驗以證明muc2是與muc2結合的主要蛋白質。使用wfa凝集素和muc2特異性單克隆抗體的蛋白質印跡證實，wfa識別與muc2具有相同分子大小的糖蛋白，并且該糖蛋白存在于正常樣本中，但在配對的癌癥樣本中顯著減少(圖14)。為了確認wfa和muc2之間的相互作用，使用2種不同的muc2抗體(muc2(a)和muc2(d))和識別杯狀細胞中的粘蛋白的抗體pr5d5進行共免疫熒光染色(圖2、圖15、圖16和圖17a)。雖然在隱窩底部缺乏wfa染色，但是muc2(a)和wfa都將杯狀細胞膜染色，強烈地表明wfa與更成熟或完全糖基化形式的muc2結合。muc2(d)定位于鄰近杯狀細胞膜的er，與其鑒定muc2蛋白質骨架一致。盡管存在更多的wfa與位于隱窩的腔中的粘蛋白結合，但是wfa和pr5d5表現(xiàn)出顯著程度的重疊(圖16)，這表明，與主要染色杯狀細胞顆粒內(nèi)的粘蛋白的pr5d5相比，wfa可以與更成熟或完全糖基化的未包裝形式的粘蛋白結合。

然后使用這三種抗體檢查異型增生的組織和癌組織，并且注意到，雖然在低度異型增生中wfa結合減少，但是在該階段仍然存在muc2蛋白表達(圖2，圖17a)。然而，muc2表達和wfa結合均在hgd和癌癥中喪失。這表明如通過wfa結合所檢測到的，muc2糖基化的變化發(fā)生在muc2蛋白骨架表達水平變化之前。

為了研究wfa結合的喪失是否是癌發(fā)生期間的早期現(xiàn)象，檢查了來自家族性腺瘤性息肉病(fap)患者的小息肉上的wfa和muc2的染色模式(圖3a，圖17b)。雖然wfa和muc2a對相鄰的正常上皮強烈染色，但是fap中的小腺瘤失去muc2a和wfa染色兩者，即使在早期也是如此。還進行了實驗以研究wfa的差別結合是否發(fā)生在fap的多發(fā)性腸道瘤(min)小鼠模型中(圖3b，圖17c)。min小鼠對于截短的ape突變是雜合的，并且在小腸和大腸中自發(fā)地發(fā)展多發(fā)性腺瘤。與人類組織一樣，發(fā)現(xiàn)wfa與min小鼠的正常上皮中的粘液和杯狀細胞強烈結合，但不與鄰近的異型增生性息肉結合，這表明在致癌過程中發(fā)生的糖基化變化在物種之間是保守的。

為了評估由于結合muc2而導致的wfa染色的程度，檢查了muc2敲除小鼠中的wfa熒光。數(shù)據(jù)顯示在muc2敲除中，wfa在其中將預期看到杯狀細胞的區(qū)域中的結合顯著減少。存在一些結合到刷狀緣上皮的殘基，最可能是非muc2糖基化蛋白上的galnac殘基(圖3c、圖17d和圖18)。

為了證實wfa結合杯狀細胞的特異性，對兩種結直腸癌細胞系sw1222和hct116進行免疫熒光。sw1222具有分化為所有三種上皮細胞系的能力，而hct116細胞系主要由缺乏分化能力和不形成杯狀細胞的癌干細胞組成。雖然wfa與sw1222結合，并與muc2和pr5d5染色共定位，但是wfa不與不表達muc2也不結合pr5d5的hct116結合(圖19)，證實缺乏杯狀細胞導致缺乏wfa結合。

熒光標記的wfa對ffpe的臨床相關性

由于異型增生和炎癥之間的內(nèi)窺鏡差異可以是微小的，進行實驗以確定wfa是否可以區(qū)分在潰瘍性結腸炎(uc)背景上的異型增生。在ffpe切片中，雖然wfa結合到非異型增生的發(fā)炎組織，但其在異型增生的組織中的結合減少，并且在癌性病變中wfa結合和muc2蛋白表達明顯減少(圖4和圖17e)，使得wfa成為癌癥篩查，甚至在uc中的有用的診斷工具。

在常規(guī)結腸鏡檢查中，hp和ssp之間形態(tài)的細微差異也存在特定的診斷挑戰(zhàn)。鑒于hp是良性病變，ssp被認為是通過鋸齒狀途徑的癌前體，突出了可以區(qū)分這兩種病變的臨床工具的發(fā)展的最重要的意義。

將wfa施加于一組ffpe切片(包括hp、ssp、tsa和粘液性癌)，并且顯示當wfa結合至hp時，wfa不結合其他三種類型的病變(圖5、圖17f、圖20-23)。然而，基于muc2a免疫熒光，所有4種病變的muc2蛋白繼續(xù)高水平表達，證實wfa結合的喪失是由于糖基化的變化，而不是muc2表達的喪失或功能性杯狀細胞的喪失。這些發(fā)現(xiàn)教導良性hp可以憑借wfa結合與病理學顯著的息肉區(qū)分開，并證明糖基化，而不是muc2蛋白表達的變化是ssp和tsa以及常規(guī)腺瘤發(fā)育的早期步驟。

使用新鮮組織驗證wfa

將熒光素標記的wfa應用于來自12位患者的正常和癌組織的新鮮配對的切開活檢組織(圖6)。使用ivis200照相機捕獲熒光度，并且然后定量，表明來自正常組織的熒光高于癌性組織的熒光(配對t檢驗，p<0.001)。wfa在切除后30分鐘內(nèi)直接應用于新鮮樣本，包括前切除術(圖7)。wfa結合現(xiàn)在示出了非異型增生和癌癥組織之間的清楚的分界。然而，具有憩室病的乙狀結腸樣本(圖24)清楚地表明，與相鄰的正常粘膜相比，憩室病不改變wfa的結合。這些整個樣本和其他樣本的熒光的定量示于圖25中。使用ivis200照相機，正常與癌癥/異型增生比率的平均比率為2.6。

將熒光wfa應用至來自經(jīng)受異型增生相關性病變或腫塊(dalm)(其與增加的發(fā)展癌的風險相關，并且由于使用類固醇灌腸劑而與遠端保留相關)切除的患者的離體新鮮切除的組織(圖8a)。將wfa局部施加于樣本上10分鐘，簡單地洗滌兩次，然后使用ivis200照相機成像(圖8b和c)。wfa與非異型增生的遠端結腸強烈結合(圖8b，網(wǎng)格e4)，并且能夠檢測大dalm(圖8b，網(wǎng)格d2)和在先前的內(nèi)窺鏡檢查中未注意到的另一小的平面型dalm(圖8b，網(wǎng)格b6)。與沒有異型增生的發(fā)炎組織相比，這些區(qū)域具有較低的熒光水平(圖8b，網(wǎng)格h3)。

研究了wfa在鑒別來自患者(患有要求放射治療的先前切除的癌性直腸息肉)的經(jīng)肛門內(nèi)窺鏡顯微手術(tems)樣本中的異型增生的潛在臨床應用(圖9)。wfa能夠區(qū)分無異型增生(圖9b，網(wǎng)格g1、g2和d3)、低度異型增生(圖9b，網(wǎng)格c3)和具有潛在殘留癌的纖維化(圖9b，網(wǎng)格c2)的區(qū)域。在這個樣本中，癌癥的區(qū)域非常接近于切除邊緣。這證明了wfa在識別異常組織中的潛在效用，因此在內(nèi)窺鏡手術期間指導切除邊緣。

為了證實在ffpe切片中，tsa的減少的wfa結合的觀察結果，進行了新鮮切除的tsa的全樣本成像，其示出了使用ivis200照相機的wfa的最小結合(圖26)。

使用具有熒光功能的臨床內(nèi)窺鏡系統(tǒng)對用wfa標記的新鮮樣本進行成像

作為原理的證明，使用具有660nm的激發(fā)波長的熒光啟動的內(nèi)窺鏡使新鮮樣本離體成像，以使來自組織自體熒光的干擾最小化。wfa-cy5和wfa-熒光素表現(xiàn)為共定位(圖27)。在獲得基線白光內(nèi)窺鏡圖像和自身熒光圖像后，將cy5標記的wfa凝集素局部施加于粘膜表面10分鐘，簡單地洗滌兩次，然后可視化。代表性的視圖示出于圖10中。第一個樣本是具有直腸乙狀結腸癌的前切除術，并且wfa顯然能夠區(qū)分非異型增生和癌性組織之間的邊界(圖10a)。第二個樣本是tems切除，并且wfa-cy5能夠通過降低熒光水平來證明正常粘膜與高度異型增生和侵襲性癌癥的區(qū)別(圖10b)。第三個樣本是來自患有多個左側結腸息肉但沒有先前的息肉病家族史的患者的前切除術(圖10c)，其中與相鄰正常粘膜相比，管狀腺瘤發(fā)出更小的熒光。由于該樣本的尺寸，成像系統(tǒng)以寬視場模式使用。我們的第四個樣本來自患有潰瘍性結腸炎、dalm和兩種同時癌癥的患者(圖28)。wfa-cy5能夠區(qū)分異型增生的非異型增生平面型區(qū)域與非異型增生組織，即使這在白光內(nèi)窺鏡檢查中不明顯。

為了模擬結腸鏡條件，前切除樣本被吹氣并插管，允許用熒光內(nèi)窺鏡觀察粘膜表面(圖10d)。在施加wfa-cy5后，確定了大的平面型癌性病變，其該病變在白光下不可見，但通過其與wfa-cy5的低結合來鑒定。類似地，在結腸鏡條件下觀察右半結腸切除術樣本，并且wfa-cy5能夠鑒定具有癌癥的平面型異常壞死區(qū)域，其在單獨的白光成像上不明顯(圖29)。

使用熒光內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，正常與癌癥/異型增生的平均的熒光比率為3.6(圖30)。重復沖洗多達20次也顯示基本上洗不掉wfa-cy5，證實其與粘膜表面強烈結合(圖31)。

討論

本文提供的結果顯示，與異型增生和癌組織相比，凝集素wfa和類似地能夠區(qū)分成熟的muc2糖基化和不完全或異常muc2糖基化的任何試劑，更強烈地與正常組織結合。任何內(nèi)窺鏡檢查的輔助工具的關鍵要求是清楚地區(qū)分正常組織與異常組織的能力。這里證明，出于四個原因，熒光wfa具有成為臨床上有用的輔助內(nèi)窺鏡工具的潛力。首先，熒光wfa可用于識別平面型病變(原本被白光內(nèi)窺鏡檢查所遺漏)，例如在患有潰瘍性結腸炎的患者中的dalm。如圖8突出顯示的，在白光內(nèi)窺鏡檢查中，實際上不可能區(qū)分炎癥和異型增生。如圖10d和圖29突出顯示的，與明顯腫瘤相鄰的平面型病變也可能被遺漏。其次，它可以穩(wěn)健地將hp與更顯著的息肉，如ssp/tsa/粘液性ca區(qū)分。這是一個非常重要的臨床發(fā)現(xiàn)，因為到目前為止，還沒有已知的標志物可以將hp和顯著性息肉區(qū)分。盡管hp可以保守地管理，但越來越多的證據(jù)表明ssp可以通過鋸齒狀途徑進展到結直腸癌。因此，早期鑒定ssp對于預防結直腸癌的發(fā)展至關重要。第三，wfa可以區(qū)分低度異型增生和高度異型增生/早期侵襲性癌癥。具有幫助區(qū)分這兩種情況的工具在臨床上是非常有用的，因為前者可以通過內(nèi)窺鏡息肉切除術進行管理，而后者將需要對受影響的腸進行正式的外科手術切除，因此要求更加侵襲性的過程。因此，wfa可以在內(nèi)窺鏡檢查時表征息肉，并幫助決定最合適的管理后方法(managemetpostprocedure)。第四，wfa可以幫助指導內(nèi)窺鏡息肉切除術期間或經(jīng)肛門內(nèi)窺鏡顯微外科手術(tems)期間的切除邊緣，特別是在之前已經(jīng)經(jīng)歷了手術并且將極其難以根據(jù)單獨的白色內(nèi)窺鏡檢查來判斷哪些區(qū)域需要去除的患者，如圖9突出顯示。

本文提供的結果表明，這是發(fā)生在異型增生發(fā)展早期的muc2的糖基化的變化，由于muc2蛋白表達仍存在于低度異型增生中，其導致wfa結合減少。這在以前沒有被描述過。

本文提供的數(shù)據(jù)充分表明wfa在結腸和直腸中的主要結合靶標是在結腸隱窩的上部和分泌的粘蛋白中的成熟的糖基化muc2。但是，wfa不結合到隱窩的底部，其中muc2的形式是不成熟的。

數(shù)據(jù)表明熒光標記的wfa可用于幫助在內(nèi)窺鏡粘膜切除術和tems期間指導切除邊緣，特別是在識別平面型的、微小的病變或異型增生中。即使在潰瘍性結腸炎的背景下，當這樣的病變原本可能在白光內(nèi)窺鏡檢查中被遺漏時，這可以是可能的。未能檢測息肉切除術后的殘余息肉組織(有發(fā)展間隔癌的風險)可能比以前猜想的更常見，在最近美國大規(guī)模研究中發(fā)生31％的病例為鋸齒狀病變，并且17％的病例為大型(10-20mm)腺瘤。數(shù)據(jù)還顯示，特異性糖基化改變發(fā)生在在顯著病變(包括ssp、tsa和粘液性癌癥)的發(fā)展中，但不是在良性hp中。采用這些糖基化差異來區(qū)分hp和顯著性息肉尚未在之前描述，并且在臨床上可能是非常有用的，特別是鑒于使用常規(guī)白光內(nèi)窺鏡檢查或高級內(nèi)窺鏡成像技術，如窄帶成像技術來區(qū)分hp與ssp的困難。由于ssp是結直腸癌的鋸齒狀路徑中的前體病變，因此ssp的早期檢測特別重要。

使用660nm熒光內(nèi)窺鏡，觀察到正常與癌癥/異型增生的平均的熒光比率為3.6。

用于能夠進行熒光啟動的內(nèi)窺鏡檢查的初步評估的離體樣本是在新鮮切除的結直腸整體器官(回收30分鐘內(nèi)成像)，并且在旨在模擬體內(nèi)內(nèi)窺鏡可視化的條件下進行。wfa凝集素對聚糖的結合親和力(kd)較強(在0.01至1.0nm之間)。數(shù)據(jù)顯示，wfa與結直腸粘膜緊密結合，因為在標記的新鮮組織上進行多達20次的重復洗滌后，熒光信號仍然明亮(圖31)。該結果對于使用凝集素作為分子成像工具的能夠體內(nèi)進行熒光內(nèi)窺鏡檢查的發(fā)展顯然是非常有希望的。凝集素的局部施加將在技術上與染色內(nèi)鏡染料的施加相似，其是常規(guī)進行的。

人類中wfa的最低口服毒性劑量為710μg/kg，在75kg的人中，這等于53.25mg。在這些實驗中，wfa以5μg/ml的濃度局部施加于新鮮組織，通常使用20ml的溶液。假設所有化合物將在結腸中被吸收，這小于最低口服毒性劑量的1/500，由于將是在小腸中進行大多數(shù)吸收，這將是不大可能的。在實際中，wfa將局部施加于結腸并且將繞過小腸。

方法

細胞系和細胞培養(yǎng)

之前已經(jīng)描述了所有使用的細胞系的起源和培養(yǎng)條件36。選擇細胞系組以反映相當數(shù)量的復制錯誤缺陷型(rer+)(n＝14)細胞系和復制錯誤熟練(rer-)(n＝16)型細胞系。rer+細胞系：cck81、dld1、gp2d、hca7、hct116、hct15、lovo、ls180、ls174t、ls411、rko、snuc2b、sw48和vac05。rer-細胞系：c80、c84、c99、cc20、col0741、hra19、ht29、lim1863、ls513、ncih716、pcjw、rcm1、skco1、sw1222、sw1417和widr。

基因表達微陣列

根據(jù)制造商的說明，使用rneasy小型試劑盒(qiagen)提取總rna。根據(jù)制造商的說明(affymetrix)，使用人類基因組u133+2芯片，將每個樣本的20微克rna送至paterson癌癥研究所的分子生物學核心設備(molecularbiologycorefacility)進行基因表達微陣列分析。使用partekgenomicssuite軟件分析微陣列數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉換，rma歸一化(利用gc校正)，使用用于probeset匯總(probesetsummarization)的medianpolish的分位數(shù)歸一化作為軟件中的可選設置。通過比較癌細胞系(n＝30)與正常對照(n＝20)的平均表達水平，由t檢驗通過低概率鑒定差異表達的基因。如在partek軟件中實施的，對多個測試的p值進行校正。

福爾馬林固定和新鮮冷凍樣本的免疫組織化學

福爾馬林固定和新鮮冷凍的正常結腸粘膜、異型增生組織和結直腸癌的樣本獲得自英國牛津大學醫(yī)院的臨床病理系。所有樣本的診斷由顧問組織病理學家(lmw)確認。所用材料由牛津郡臨床研究倫理委員會(oxfordshireclinicalresearchethicscommitee)批準。對于ffpe塊，將樣本切成4μm厚的切片，并安裝到顯微鏡載玻片(menzel-glasersuperfrostplus)上。將切片在histoclear中脫石蠟2次持續(xù)3分鐘，并在100％乙醇、100％工業(yè)甲基化酒精(ims)和70％ims中每次水合2分鐘。然后將載玻片在蒸餾水中洗滌。使用dakotargetretrieval溶液在100℃下進行抗原修復20分鐘，然后冷卻至室溫1小時。然后將載玻片在pbs中洗滌兩次，并在0.5％的pbs吐溫中洗滌一次，每次5分鐘。然后使用疏水性immedge筆(vectorlab)將組織樣本包圍，并使用invitrogen封閉劑(0.1g/10mlpbs吐溫)封閉30分鐘。

然后將載玻片與熒光標記的凝集素在黑暗中在37℃下孵育10分鐘，隨后用pbs吐溫洗滌兩次。熒光標記的(熒光素或羅丹明)和生物素化凝集素多花紫藤(wfa)、雙花扁豆(dba)、尾穗莧(acl)、洋紫荊(bpl)、長柔毛野豌豆(vvl)和槐凝集素(sja)購買自美國的伯林蓋姆(burlingame)的vector實驗室，并以1:200(10μg/ml)的稀釋度使用。通過將wfa凝集素與過量的游離galnac糖(200mm，vector實驗室)在4℃下孵育12小時來進行競爭性結合測定。

使用一抗pr5d5(內(nèi)部小鼠mab)1：200、muc2(a)abeam(epr6144)1:250兔mab、muc2(d)dako(克隆ccp58)1:100小鼠mab進行共染色，在4℃下孵育過夜。二抗包括在室溫下孵育1小時的山羊抗小鼠hrp(1：100invitrogen)、山羊抗兔hrp(1：100invitrogen)和鏈霉親和素hrp(1：100invitrogen)，然后是tyramidealexafluor568(invitrogen)10分鐘。使用含有dapi(vectorlaboratories，burlingame，ca，usa)的vectashield封固劑將蓋玻片固定在組織樣本上。使用蔡司axioscope2plus顯微鏡、蔡司axio觀察顯微鏡(zeissaxioobservermicroscope)和蔡司lsm510meta共聚焦顯微鏡檢查這些載玻片。用axioscope和蔡司zen軟件捕獲代表性圖像。

細胞系的免疫組織化學

將sw1222和hct116細胞系以3×10^λ5個細胞/孔的密度接種在nunc單孔室載玻片中，如上所述在培養(yǎng)基中生長5天，然后用冰冷(ice-cold)甲醇固定，隨后用2％甲醛固定，每次5分鐘。然后將載玻片在pbs中洗滌兩次，并在0.5％的pbs吐溫中洗滌一次持續(xù)5分鐘，然后使用invitrogen封閉劑封閉30分鐘。然后將載玻片用如上對于ffpe切片所述的凝集素和抗體染色。

人組織裂解物

將來自正常組織和成對癌癥樣本的新鮮粘膜在冷凍裂解緩沖液(1％np-40，0.5％脫氧膽酸鈉，1mmedta，150mmnacl，50mmtris堿，ph8.3)中精細切碎，隨后在冰上超聲處理15分鐘。將該提取物的上清液用于實驗。使用標準bca試劑盒(pierce)進行蛋白質定量。

凝膠電泳

蛋白樣本在垂直電泳單元(invitrogen)中運行。將30微克的蛋白與4×laemmli樣本上樣緩沖液混合，然后在70℃下變性10分鐘。將10孔的3-8％的tris-醋酸鹽凝膠(tris-acetategel)(pre-castgel，invitrogen)置于垂直電泳裝置中，并浸沒在tris-醋酸鹽sds運行緩沖液中。在加載蛋白樣本和10μlhimark預染色的分子量標記物(invitrogen)之前，用電泳緩沖液洗滌每個孔。然后將加載樣本在凝膠中在150v下轉化60分鐘。

蛋白質印跡

將pvdf膜用于免疫印跡。將膜在甲醇中預浸泡。1×轉移緩沖液由50ml的20×轉移緩沖液(invitrogen)、750ml的milliq水和200ml的甲醇組成。通過在轉移緩沖液中，在360毫安下，冰上電泳(biorad系統(tǒng)，usa)90分鐘，將蛋白質從凝膠轉移到膜上。轉移后，將膜在pbs-t中洗滌，并在室溫下在搖擺平臺上用5％的marvel在pbs-t中封閉1小時。然后將膜與適當?shù)囊豢乖诜忾]溶液中，在室溫下孵育1小時。在用pbst洗滌3次5分鐘后，將膜與辣根過氧化物酶(hrp)偶合的二抗在封閉溶液中，在室溫下孵育1小時。將膜用pbs-t洗滌三次，每次5分鐘。使用化學發(fā)光(amershameclprime蛋白質印跡檢測試劑，ge醫(yī)療保健，uk)，并在a和b以1:1比例的ecl溶液中，在黑暗中孵育5分鐘，將抗體信號放大。除去過量的ecl溶液，將膜暴露于富士膠片(fujifilm)(tokyo，japan)片材，然后使用srx-201膜處理器(konicaminolta，東京，日本)顯影。

使用的一抗和凝集素包括wfa-生物素1:200(vector)、muc21:100(小鼠mabdako)和肌動蛋白1:1000(兔pabsigma-aldrich)。所使用的二抗包括鏈霉素-hrp1:2000(invitrogen)、兔抗小鼠hrp1:10,000(dako)和豬抗兔hrp1:2000(dako)。

計算熒光水平和統(tǒng)計分析

凝集素的結合程度通過比較來自每種情況的正常組織和癌性組織的配對樣本(對于結直腸組織微陣列和新鮮組織樣本二者)之間的熒光量的來評估。使用imagej(國家衛(wèi)生研究院)分析圖像。對于每個圖像，由3個讀數(shù)計算熒光的平均背景水平，并且從粘膜層的平均熒光水平(也由3個讀數(shù)計算)中減去。然后將調整的熒光用于統(tǒng)計分析。使用用于macos×的graphpadprism版本5，graphpad如見，sandiegocaliforniausa，www.graphpad.com進行配對t檢驗。

新鮮組織分析

根據(jù)當?shù)貍惱砦瘑T會，從牛津radcliffebiobank獲得新鮮切開的活檢組織和整個器官組織。將凝集素離體局部施加于樣本，并在37℃下孵育10分鐘以模擬體內(nèi)結腸鏡條件。然后用pbs洗滌樣本兩次，并使用具有熒光功能的ivis200照相機(caliperlifesciences)捕獲圖像。ivis照相機設置：曝光時間l秒，激發(fā)波長(gfp濾光片)445-490nm，發(fā)射波長(gfp濾光片)515-575nm，像素組合因子4。

多花紫藤凝集素與cy5的偶合

在bicine緩沖液(100mm，ph8.5)中以比蛋白質15倍摩爾過量的染料，用cy5染料(pa25001，單反應性染料，ge醫(yī)療保健，uk)將多花紫藤凝集素(l-1350，vectorlaboratoriesltd.，uk)在室溫下標記2小時。在pd-10柱(17-0851-01，ge醫(yī)療保健，uk)上從游離染料中分離標記的凝集素，并在納米分光光度計上分析。使用在280nm和650nm下的光密度以粗略估計凝集素的濃度和標記比。

660nm熒光內(nèi)窺鏡

將cy5標記的wfa凝集素溶液以5μg/ml的濃度施加到新鮮切下的組織樣本上，并用pbsa洗滌兩次。所有成像在660nm的激發(fā)波長下，在1-3mwcm-2范圍內(nèi)的功率密度下進行，通過storzhopkinsii10mm直徑的剛性腹腔鏡(rigidlaparoscope)的環(huán)形照明端口(ringilluminationport)遞送到組織表面。還通過相同的端口提供來自白色發(fā)光二極管的白光照明。使用以20-160ms的積分時間操作的固態(tài)(solid-state)(ccd)視頻速率照相機，用內(nèi)部開發(fā)的檢測系統(tǒng)進行檢測。其輸出用dfg/usb2pro圖像捕獲系統(tǒng)(theimagingsource，德國)數(shù)字化。使用adobepremiereprocs5.5(sanjose，ca，usa)程序進行視頻編輯。

小鼠組織

本研究中使用的動物是apcmin，muc2-/-和在c57b1/6背景上維持>6代的野生型小鼠。所有步驟根據(jù)homeofficeuk法規(guī)和1986年的動物(科學操作，scientificprocedures)法或由瑞典實驗室動物倫理委員會在哥德堡所批準的進行。將所有小鼠置于溫度(21-22℃)和照明(12小時光照和12黑暗)的標準化條件下，隨意提供食物和水。

通過頸脫位處死小鼠。立即取出腸道，分為小腸和大腸。將腸縱向打開，在pbs中洗滌，在10％中性緩沖福爾馬林(nbf)中固定過夜，并包埋在石蠟中。對于muc2-/-實驗，將腸在carnoy固定劑(60％干燥甲醇，30％氯仿，10％冰醋酸)中固定，然后石蠟包埋。