本發(fā)明涉及天然活性成分強(qiáng)心甾類固醇與奧曲肽的偶聯(lián)物及其制備方法和作為抗腫瘤藥物的用途。

背景技術(shù)：

近年來，基于臨床上化療藥物的毒副作用、耐藥性和經(jīng)濟(jì)性的多重考慮，人們紛紛把目光轉(zhuǎn)向從植物中獲取安全、高效、低毒的活性先導(dǎo)化合物。強(qiáng)心甾類固醇在過去幾百年來一直作為強(qiáng)心劑而倍受關(guān)注，進(jìn)入20世紀(jì)以來，隨著植物化學(xué)、生物化學(xué)、藥物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展及中藥分離技術(shù)的進(jìn)步，大量的強(qiáng)心甾類固醇物質(zhì)被證實(shí)具有良好體內(nèi)外抗腫瘤活性，且與其他臨床上常用化療藥物的抗腫瘤機(jī)理不同，是一種多效或者多機(jī)制的抗癌藥物。

強(qiáng)心甾類固醇成分具有多種抗腫瘤機(jī)制，其對(duì)惡性腫瘤的預(yù)防及治療具有重要意義，是一種新興的篩選腫瘤治療藥物的先導(dǎo)化合物。我國中藥植物資源豐富，關(guān)于強(qiáng)心甾類固醇的中藥活性篩選、機(jī)理研究、抗腫瘤新藥開發(fā)的投入和發(fā)展對(duì)腫瘤的預(yù)防和臨床治療具有重大的意義。不同的強(qiáng)心甾類固醇成分，其理化性質(zhì)各異，部分成分的疏水性強(qiáng)、水溶解性低，有些成分親水強(qiáng)、水溶解性好，但也存在共有的特性，如治療窗窄、系統(tǒng)性毒性強(qiáng)、不穩(wěn)定性、刺激性等。這些特性常導(dǎo)致其在臨床給藥和治療受到極大的限制。選擇合適的前體藥物設(shè)計(jì)，將先進(jìn)的藥物合成技術(shù)、前體藥物設(shè)計(jì)技術(shù)運(yùn)用于高效活性成分強(qiáng)心甾類固醇的產(chǎn)品開發(fā)中，合成出靶向性好、選擇性高和毒性低的前體藥物，對(duì)此類物質(zhì)的新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用十分關(guān)鍵，而此類研究勢(shì)必為中藥活性成分強(qiáng)心甾類固醇在臨床的應(yīng)用提供新思路和新方法。

奧曲肽，一種被廣泛研究的生長(zhǎng)激素抑制素類似物，選擇性結(jié)合生長(zhǎng)抑素受體sstr-2、sstr-3和sstr-5而對(duì)sstr-1和sstr-4的親和力較弱(參見：huom,zoua,yaoc,etal.biomaterials.2012,33:6393-6407.)。由于奧曲肽在人體內(nèi)的穩(wěn)定性好(半衰期為100min)而被臨床應(yīng)用于治療和診斷sstrs高表達(dá)的惡性腫瘤(參見：sclafanif,carnaghic,ditl,etal.tumori.2011,97:620-628.)。隨著其在腫瘤造影中的成功利用，奧曲肽亦被用于藥物腫瘤傳遞系統(tǒng)中，奧曲肽通過與抗腫瘤藥物偶聯(lián)來降低其毒性而提高腫瘤靶向性(參見：dejm,breemanwa,kwekkeboomdj,etal.accountsofchemicalresearch.2009,42.huangcm,wuyt,andchenst.chemistry&biology.2000,7:453-461.)

中國專利申請(qǐng)cn201010583339.0《一種杠柳次苷的制備方法》，是關(guān)于杠柳次苷的制備方法，未涉及到該藥在抗腫瘤活性方面的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是，提供天然活性成分強(qiáng)心甾類固醇與奧曲肽的偶聯(lián)物及其制備方法。

本發(fā)明的目的之二是，提供強(qiáng)心甾類固醇與奧曲肽的偶聯(lián)物的體外抑瘤評(píng)價(jià)。

本發(fā)明的目的之三是，提供所述的偶聯(lián)物納米粒在治療肝癌中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種強(qiáng)心甾類固醇與奧曲肽的偶聯(lián)物，它是強(qiáng)心甾類固醇通過二元羧酸的羧基與強(qiáng)心甾固醇連接，隨后二元羧酸再與奧曲肽連接得到強(qiáng)心甾類固醇與奧曲肽的偶聯(lián)物。

上述的偶聯(lián)物，所述的強(qiáng)心甾類固醇可以是杠柳苷元、杠柳次苷或杠柳毒苷等。

一種制備上述的強(qiáng)心甾類固醇與奧曲肽的偶聯(lián)物的方法，它包括如下步驟：

步驟1.稱取強(qiáng)心甾類固醇和酸酐適量，強(qiáng)心甾類固醇和酸酐的摩爾比為1/2～1/10，加二氯甲烷混勻至溶解，加入一定量三乙胺和4-二甲氨基吡啶(dmap)，三乙胺和4-二甲氨基吡啶與強(qiáng)心甾類固醇的摩爾比為1/1/10～1/1/5，攪拌反應(yīng)24h后，采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干二氯甲烷，采用c8柱純化，洗脫劑為不同比例甲醇-0.1％甲酸水，得到羧基化強(qiáng)心甾類固醇衍生物(sppg)，所述的酸酐可以是丁二酸酐、馬來酸酐等二元酸酐，所得到的羧基化強(qiáng)心甾類固醇衍生物經(jīng)紅外及esi-ms表征；

步驟2.稱取步驟1產(chǎn)物、二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)適量加入體積比為2:1的二氯甲烷(dcm)與四氫呋喃(thf)的混合溶劑溶解羧基化強(qiáng)心甾類固醇衍生物(sppg)、二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的摩爾比為1/2/2～1/2/4，密封室溫，磁力攪拌反應(yīng)2～24h后，氮?dú)獯蹈桑尤?0％乙腈-水超聲混溶，采用c8柱純化，洗脫劑為不同比例的乙腈-0.05％三氟乙酸(tfa)水溶液，tlc檢測(cè)，收集斑點(diǎn)，直接凍干，得nhs-ppg樣品。

步驟3.稱取步驟2產(chǎn)物nhs-ppg適量，用加入50％乙腈-含0.1m4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)的水溶液溶解，加入奧曲肽，奧曲肽與nhs-ppg的摩爾比為1.5/1～5/1，n-甲基嗎啉調(diào)節(jié)ph值為8.0～9.0，密封，室溫，磁力攪拌反應(yīng)12～24h后，用液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析，反應(yīng)產(chǎn)物的純化通過高效液相色譜半制備得到三種強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽偶聯(lián)物，它們分別是奧曲肽(丙氨酸)-強(qiáng)心甾類固醇偶聯(lián)物、奧曲肽(賴氨酸)-強(qiáng)心甾類固醇偶聯(lián)物和強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽-強(qiáng)心甾類固醇偶聯(lián)物。

上述的方法，步驟1所述的強(qiáng)心甾類固醇包括杠柳苷元、杠柳次苷、杠柳毒苷等強(qiáng)心甾類固醇類物質(zhì)。

上述的方法，步驟1或步驟2中的純化方法不限于c8、c18填料柱層析及液相制備純化，也可以采用硅膠柱層析純化。

上述的方法，步驟1中強(qiáng)心甾類固醇和酸酐的摩爾比優(yōu)選為1/2～1/10。

上述的方法，步驟1中有機(jī)溶劑除二氯甲烷外，也可以選自dmso、乙酸乙酯、dmf中的一種或者多種混合溶劑

本發(fā)明人對(duì)天然活性成分強(qiáng)心甾類固醇與奧曲肽的偶聯(lián)物體外作用于腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性明顯強(qiáng)于強(qiáng)心甾類固醇原型藥，而對(duì)正常細(xì)胞的毒性明顯弱于強(qiáng)心甾類固醇原型藥。

進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物的組織分布特性。以h22肝癌實(shí)體瘤為模型進(jìn)行組織分布實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物具有腫瘤靶向性。

強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物在治療肝癌中的應(yīng)用。以h22肝癌實(shí)體瘤為模型進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物抑制h22肝癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)的作用強(qiáng)于強(qiáng)心甾類固醇原型藥，可用于治療肝癌。

有益效果

(1)本發(fā)明合成強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽偶聯(lián)物，分別是杠柳苷元-奧曲肽和杠柳次苷-奧曲肽偶聯(lián)物，其中強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物活性最強(qiáng)。

(2)本發(fā)明制備得到強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物具有明顯腫瘤細(xì)胞選擇性和腫瘤組織靶向性，提高了強(qiáng)心甾類固醇的體內(nèi)抑瘤活性，降低了藥物的體內(nèi)毒性。

附圖說明：

圖1、oct(phe)-s-ppg合成路線圖。

圖2、oct(phe)-s-ppm合成路線圖。

圖3、杠柳苷元-奧曲肽偶聯(lián)物的表征:a:反應(yīng)液的lc-ms總離子圖；b:¹h-nmr圖，其中a為ppg；b為oct(phe)-s-ppg；c為oct(lys)-s-ppg；d為oct-2s-2ppg；e為oct。

圖4、杠柳次苷-奧曲肽偶聯(lián)物的表征：a，hplc圖；b，ppm(a)、oct(b)、sppm(c)、oct(phe)–s-ppm(d)、oct(lys)-s-ppm(e)和oct-2s-2ppm(f)的紅外圖譜；c，¹h-nmr圖。

圖5、oct，ppg，oct(phe)-s-ppg，oct(lys)-s-ppg和oct-2s-2ppg的體外細(xì)胞毒性：a為受試藥物作用于hepg2細(xì)胞72h；b為受試藥物作用于正常人肝細(xì)胞l-0272h。

圖6、杠柳次苷-奧曲肽偶聯(lián)物作用于hepg-2、mcf-7和l-02細(xì)胞72h后細(xì)胞毒性。

圖7、ppg和oct(phe)-s-ppg尾靜脈注射給藥后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)后血漿及各個(gè)臟器中藥物含量(μg/g)(n＝5)。

圖8、ppm和oct(phe)-s-ppm尾靜脈注射給藥后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)后血漿及各個(gè)臟器中藥物含量(μg/g)(n＝5)。

圖9、oct(phe)-s-ppg和ppg對(duì)h22肝癌實(shí)體瘤的藥效圖：(a)給藥后實(shí)體瘤體積生長(zhǎng)變化曲線圖；(b)給藥后小鼠的體重變化圖；(c)給藥11天后的實(shí)體瘤及其重量(d)。

圖10、oct(phe)-s-ppm和ppm對(duì)h22肝癌實(shí)體瘤的藥效圖：(a)給藥后實(shí)體瘤體積生長(zhǎng)變化曲線圖；(b)給藥后小鼠的體重變化圖；(c)給藥11天后的實(shí)體瘤及其重量(d)。

圖11、oct(phe)-s-ppg和ppg組的心臟和肝臟組織的病理切片圖(h&estaining,×100or×400)。

圖12、ppm和oct(phe)-s-ppm組治療h22實(shí)體瘤小鼠后的心臟、肝臟和腫瘤的病理切片圖(h&e染色，×20)。

具體實(shí)施方式

以下所列實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1.奧曲肽-杠柳苷元偶聯(lián)物的制備

稱取杠柳苷元20mg和丁二酸酐30mg，加3ml二氯甲烷混勻至溶解，加入一定量三乙胺和4-二甲氨基吡啶(dmap)，攪拌24h后，采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干二氯甲烷，加50％甲醇-0.1％甲酸水溶解樣品，上c8反相硅膠柱純化，50％甲醇-0.1％甲酸水和55％甲醇-0.1％甲酸水各100ml，通過tlc、lc檢測(cè)，tlc條件為二氯甲烷比甲醇為10:1，5％磷鉬酸顯色，lc條件為，色譜柱，watersodsc18(150mm*4.6mm)，流動(dòng)相為58％甲醇-0.1％甲酸水，流速為1ml/min，波長(zhǎng)為220nm，rt＝12.3min，收集顯色點(diǎn)，合并濃縮得到12mg，經(jīng)紅外及esi-ms表征為羧基化杠柳苷元(pps)。

稱取pps(10mg，0.0204mmol)，dcc(7.79mg，0.0408mmol，2×excess)，nhs(5.0mg，0.0408mmol，2×excess)加入3mldcm+thf(2:1，v/v)溶解，密封，室溫，磁力攪拌反應(yīng)2h后，氮?dú)獯蹈?，加?0％乙腈-水超聲混溶，加入c8柱純化，洗脫劑為20％乙腈-0.05％tfa水和50％乙腈-0.05％tfa水各100ml，tlc檢測(cè)，收集斑點(diǎn)，直接凍干，得nhs-ppg樣品8mg，得率為74.20％。

取nhs-ppg(3.5mg，0.0059mmol)，用加入50％乙腈-水(0.1mhepes)溶解，加入oct12.1mg(0.0119mmol，2excess)，n-甲基嗎啉調(diào)節(jié)ph值為8.0左右，密封室溫，磁力攪拌反應(yīng)24h后，用液相-質(zhì)譜進(jìn)行分析。反應(yīng)產(chǎn)物的純化通過高效液相色譜半制備完成。流速4ml/min，流動(dòng)相溶劑從0.01min的30％a(0.05％tfa水溶液)和70％溶劑b(0.0.5％tfa-乙腈溶液)到90min的80％溶劑a和20％溶劑b。制備流程如圖1所示。

實(shí)施例2.奧曲肽-杠柳次苷偶聯(lián)物的制備

稱取杠柳次苷(27.1mg，0.05mmol)和丁二酸酐(30mg，0.3mmol)，加入3ml二氯甲烷混勻至溶解，加入一定量三乙胺和dmap，攪拌24h后，采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干二氯甲烷，加20％乙腈-0.05％tfa水溶解樣品，上c8反相硅膠柱純化，洗脫液為20％乙腈-0.05％tfa水和40％乙腈-0.05％tfa水各150ml，通過tlc、lc檢測(cè)，tlc條件為二氯甲烷比甲醇為10︰1，5％磷鉬酸顯色，lc條件為，色譜柱，watersodsc18(150mm*4.6mm)，流動(dòng)相為40％乙腈-0.05％tfa水，流速為1ml/min，rt＝5.1min，收集顯色點(diǎn)，合并濃縮得到hooc-ppm(26mg)。

稱取hooc-ppm(12.8mg，0.02mmol)，dcc(7.79mg，0.0408mmol，2×excess)，nhs(5.0mg，0.0408mmol，2×excess)加入3mldcm+thf(2:1)溶解，密封，室溫，磁力攪拌反應(yīng)2h后，氮?dú)獯蹈?，加?0％乙腈-水超聲混溶，采用c8柱純化，洗脫劑為20％乙腈-0.05％tfa水和50％乙腈-0.05％tfa水各100ml，tlc檢測(cè)nhs-ppm，收集斑點(diǎn)，直接凍干，得nhs-ppm樣品10.5mg，得率為71.27％。

稱取nhs-ppm(7.4mg，0.01mmol)，加入50％乙腈-水(0.1mhepes)溶解，加入奧曲肽20.3mg(0.021mmol，2×excess)，n-甲基嗎啉調(diào)節(jié)ph值為8.0左右，密封，室溫，磁力攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，過c8柱純化分離，洗脫程序?yàn)?0％乙腈-0.05％tfa水、20％乙腈-0.05％tfa水、40％乙腈-0.05％tfa水、50％乙腈-0.05％tfa、90％乙腈-0.05％tfa水依次洗脫。lc檢測(cè)收集液，合并相同出峰時(shí)間收集液，分別得oct(phe)-s-ppm、oct(lys)-s-ppm和oct-2s-2ppm。制備流程圖如圖2所示。

實(shí)施例3強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽偶聯(lián)物的表征

采用lc-ms、¹h-nmr和紅外對(duì)強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽偶聯(lián)物進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3和圖4所示。

實(shí)施例4.細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

(1)細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞株hepg2、人正常肝細(xì)胞l-02培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底80％～90％，用0.25％的胰蛋白酶消化細(xì)胞5min后加入含小牛血清的培養(yǎng)基終止；1000rpm離心5min后制成細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)瓶中加入4.5ml細(xì)胞懸液(1×10⁵個(gè)/ml)繼續(xù)培養(yǎng)。

(2)強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽偶聯(lián)物對(duì)人肝癌細(xì)胞株hepg2、人正常肝細(xì)胞l-02的毒性評(píng)價(jià)

分別將hepg2、l-02細(xì)胞株分別以2胞株l04個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24h。各孔依次加入含有受試藥物的培養(yǎng)基100μl，強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽偶聯(lián)物的濃度分別為0.005、0.05、0.5、1、2.5、5、50.0μm。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。72h后觀察細(xì)胞形態(tài)。

(3)mtt法測(cè)定細(xì)胞生存率

各孔加入濃度為5mg/ml的mtt20μl培養(yǎng)4h后棄上清，再加入150μldmso反應(yīng)10min，于570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值(od值)。按如下公式計(jì)算抑制率(inhibitionrateir)：ir(％)＝(1-受試藥物組吸光度/陰性組吸光度)×100％。采用curve-expert軟件計(jì)算樣品半數(shù)抑制濃度(ic50)。

結(jié)果如圖5、6所示，強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性明顯強(qiáng)于強(qiáng)心甾類固醇原型藥，而對(duì)正常細(xì)胞的毒性明顯弱于強(qiáng)心甾類固醇原型藥。

實(shí)施例5強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物在h22實(shí)體瘤小鼠中體內(nèi)組織分布研究

1、h22實(shí)體瘤模型建立

(1)昆明小鼠60只，標(biāo)重18-22g，均為雄性(購自江蘇大學(xué)動(dòng)物中心)。小鼠適應(yīng)環(huán)境2d后，從含h22腹水瘤小鼠抽取腹水，經(jīng)離心及紅細(xì)胞裂解液處理過，用適量pbs緩存液配置成1×107/ml單細(xì)胞懸液。

(2)小鼠右側(cè)腋下皮膚用碘伏棉球消毒。

(3)在小鼠右側(cè)腋下皮下用1ml注射器接種h22單細(xì)胞懸液0.1ml/只。

2、動(dòng)物及藥物準(zhǔn)備

接種1周后，小鼠右側(cè)腋下皮下瘤體積長(zhǎng)到約1cm3左右大小，成瘤率為100％，逐個(gè)稱取小鼠體重。60只雄性h22實(shí)體瘤昆明種小鼠隨機(jī)分組，每組5只小鼠，進(jìn)行組織分布實(shí)驗(yàn)，環(huán)境適應(yīng)期間正常進(jìn)水進(jìn)食，于實(shí)驗(yàn)前12小時(shí)禁食，自由飲水。分別制備濃度為2.05μm的ppg和oct(phe)-s-ppg注射液(乙醇/聚氧乙烯蓖麻油，v/v＝1︰1，加水20倍稀釋而成)，尾靜脈注射給藥，給藥劑量為20.5μmol/kg。體重為20g的小鼠注射體積為0.2ml，按小鼠實(shí)際體重調(diào)整注射體積。

3、組織分布實(shí)驗(yàn)方法

各組小鼠以20.5μmol/kg的劑量尾靜脈注射ppg和oct(phe)-s-ppg注射液。于給藥后0.16、0.50、1、2、3和4小時(shí)處死，取血、心、肝、脾、肺、腎、瘤，小鼠血放入加適量肝素鈉的2ml塑料離心管中靜置半小時(shí)以后4000rpm離心10min取血漿，-20℃保存直至樣品測(cè)定；精密稱取一定量小鼠各臟器，按0.1g·ml-1加入生理鹽水，高速剪切機(jī)搗碎組織樣品后取適量至2ml塑料離心管，-20℃保存直至樣品測(cè)定。

4、oct(phe)-s-ppm在h22實(shí)體瘤小鼠中體內(nèi)組織分布研究

各組小鼠分別以4mg/kg和12.23mg/kg的劑量尾靜脈注射ppm和oct(phe)-s-ppm注射液。其他步驟如上所述。

結(jié)果如圖7、8所示，強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物顯著提高了強(qiáng)心甾類固醇在腫瘤組織中的分布，而降低了在心臟和肝臟組織中的分布。表明強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物具有腫瘤靶向性

實(shí)施例6.強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物在h22實(shí)體瘤小鼠中藥效學(xué)研究

1、oct(phe)-s-ppg的分組及藥物處理

接種1周后，小鼠右側(cè)腋下皮下瘤直徑長(zhǎng)到約0.5cm左右大小，成瘤率為100％，逐個(gè)稱取小鼠體重，用隨機(jī)數(shù)字表法將其分成4組，每組6只。

(1)空白模型組：小鼠尾靜脈注射空白注射液0.1ml，每2天給藥1次。

(2)oct組：小鼠尾靜脈注射20.5μmol/kg，每2天給藥1次。

(3)ppg組：小鼠尾靜脈注射20.5μmol/kg，每2天給藥1次。

(4)oct(phe)-s-ppg組：小鼠尾靜脈注射20.5μmol/kg，每2天給藥1次。

2、oct(phe)-s-ppm的分組及藥物處理

(1)空白模型組:小鼠尾靜脈注射空白注射液5ml/kg，每2天給藥1次。

(2)oct組:小鼠尾靜脈注射7.62mg/kg，每2天給藥1次。

(3)ppm組:小鼠尾靜脈注射4mg/kg，每2天給藥1次。

(4)oct(phe)-s-ppm組:小鼠尾靜脈注射12.23mg/kg，每2天給藥1次。

3、觀察指標(biāo)與取材

(1)腫瘤生長(zhǎng)的觀察

每隔2天觀察小鼠h22移植瘤的生長(zhǎng)情況。用毫米游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠h22移植瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)的長(zhǎng)度，并記錄。腫瘤體積公式：v＝0.52×a×b2。

(2)每2天電子天平稱量小鼠體重，并記錄。

(3)計(jì)算抑瘤率：各組藥物分別給藥11d后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，用心電圖測(cè)定儀測(cè)定心跳頻率，頸椎脫臼法處死小鼠。摘取小鼠腋下皮下h22移植瘤及其心臟和肝臟組織，電子天秤稱量腫瘤重量。

抑瘤率＝(對(duì)照組平均瘤重量-用藥組平均瘤重量)/對(duì)照組平均瘤重量×100％。

(4)采用蘇木精-伊紅(h&e)染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察心臟和肝臟組織病變情況。

結(jié)果如圖9、10所示，強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物抑制h22肝癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)的作用強(qiáng)于強(qiáng)心甾類固醇原型藥，可用于治療肝癌。如圖11、12所示，強(qiáng)心甾類固醇-奧曲肽(丙氨酸)偶聯(lián)物能降低強(qiáng)心甾類固醇原型藥的肝臟和心臟毒性。