專利名稱：一種奧曲肽粗品的固相制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥多肽類原料藥的化學(xué)合成，尤其涉及ー種奧曲肽粗品的固相制備方法。
背景技術(shù)：
奧曲肽(octrotide)，它是由8個氨基酸組成的多肽，主要藥物作用有可抑制生長激素、促甲狀腺激素、胃腸道和胰腺內(nèi)分泌激素的病理性分泌過多；可選擇性地減少門靜脈及其側(cè)枝循環(huán)血流量和壓カ；降低食管胃底靜脈的壓カ；抑制胰高糖素的分泌和拮抗胰高糖素對內(nèi)臟血管的擴張作用，而對全身血液動力學(xué)影響小；可抑制膽囊的排空，抑制 膽囊收縮素，促胰液素的分泌，減少胰酶的損傷作用；對0(1ぉ括約肌具有松弛作用，有利于胰液的排泄?？梢种莆杆?胃蛋白酶和胃泌素的分泌，可改善胃粘膜血液供給；可抑制胃腸蠕動。用于門脈高壓所致的食管及胃底靜脈破壞出血；應(yīng)激性潰瘍及消化性潰瘍所致出血；預(yù)防和治療急性胰腺炎及其并發(fā)癥；治療胰瘺和胃腸道瘺管，以及其他突眼性甲狀腺腫、肢端肥大癥、特發(fā)性假性腸梗阻。目前奧曲肽的合成方法有固相法和固液相法如專利US. pat. no. 49354031983報道了一種液相制備奧曲肽的方法，該方法采用兩個片段，在液相中縮合，用三氟こ酸硼酸作為氧化劑環(huán)化支鏈肽。專利US6987167B2采用液相方法，采用Fmoc-Cys(AcM)-OH為某一原料，一步采用NaBH4方法脫除保護(hù)劑并環(huán)化，本步驟收率達(dá)80%以上。專利US6476186B1采用Fmoc-Thr (ol) (tBu) -2-CTC樹脂為原料，固相合成八肽。專利200510029221. 2采用了固相合成法，用2_氯-三苯甲基樹脂為原料，按照固相合成的方法一次連接保護(hù)氨基酸，獲得保護(hù)八肽樹脂，切割后，在PH7-11條件下用空氣氧化，得到粗品。專利200510024502. 9采用固相合成方法，使用氯甲基樹脂作載體，首先用氫化鈉溶液及2-羥甲基-3，4_ ニ氫吡喃在ニ甲こ酰胺中室溫與氯甲基樹脂反應(yīng)，得到3，4_ ニ氫吡喃羥甲基樹脂(DHP HM Resin)，再在對甲苯磺酸吡啶鹽作用下將芴甲氧羰基-(0-叔丁醚)蘇氨醇(Fmoc-Thr (tBu)-ol)連到DHP HMResin上去，然后按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法將氨基酸逐個連上，最后用三氟醋酸水苯甲硫醚こニ硫醇的混合溶液將肽從樹脂上切下，得到的粗品，粗品采用空氣氧化法氧化形成硫硫鍵，經(jīng)制備HPLC純化冷凍得到奧曲肽。專利20051002874. I采用固相合成方法，包括步驟如下1)用固相合成法合成具有D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr氨基酸殘基序列的直鏈八肽；2)氧化直鏈八肽，得到氧化型奧曲肽；3)將氧化型奧曲肽在醋酸鹽溶液中經(jīng)轉(zhuǎn)鹽和純化后，得到醋酸奧曲肽。本發(fā)明的醋酸奧曲肽的制備方法中，全部采用DMF，H0BT/HBTU和DIEA進(jìn)行接肽反應(yīng)?？梢姮F(xiàn)有技術(shù)中存在步驟繁瑣，收率低，成本高等缺陷。
因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種有效、簡便的固相合成奧曲肽粗品的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明g在提供一種固相合成奧曲肽粗品的制備方法。本發(fā)明提供了ー種奧曲肽粗品的固相制備方法，依次連接具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)的八肽樹脂，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得奧曲肽粗品，所述方法依次包括如下步驟(a)獲得 Fmoc-Thr-樹脂；(b)在上述的樹脂中，加入脫保護(hù)劑進(jìn)行處理后，將具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸、縮合劑和含有步驟(a)獲得的樹脂的溶液混合，進(jìn)行接肽反應(yīng)，然后再加入脫保護(hù)劑 處理，再將具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸、縮合劑和含有經(jīng)過接肽反應(yīng)獲得的多肽樹脂的溶液混合，進(jìn)行接肽反應(yīng)，如此重復(fù)，獲得Fmoc或Boc-D-Phe1-Cys2 (Trt) -Phe3-D-Trp4 (Boc) -Lys5 (Boc) -Thr6 (tBu) -Cys7 (Trt) -Thr8-OL-樹脂；所說的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，依次為(I) Fmoc-Thr-OL、(2)Fmoc-Cys(Trt)-OH 或 Fmoc-Cys(Acm)-OH>(3)Fmoc-Thr(tBu)-OH> (4)Fmoc-Lys(Boc)-OH 或 Fmoc-Lys(Dde) -OH>(5)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH>(6)Fmoc-Phe-OH、(7)Fmoc-Cys(Trt)-OH 或 Fmoc-Cys(Acm)-OH>(8) Fmoc 或 Boc-D-Phe-OH。在另ー優(yōu)選例中，連接7位殘基的Fmoc-Cys (Trt) -OH前進(jìn)行的脫保護(hù)處理次數(shù)是連接其它氨基酸殘基前的1-2倍。在另ー優(yōu)選例中，連接7位或2位殘基的Fmoc-Cys(Trt)-OH時，縮合劑包括HOBt和 DIC0在另ー優(yōu)選例中，1-5倍量的Fmoc-Cys (Trt)-OH, 1-5倍量的HOBt, 1-5倍量的DIC試劑，溶解在4-8ml/g樹脂的DMF溶劑中的混合溶液，在0 — 40°C反應(yīng)30-60分鐘后，再次加入1-5倍量的DIC試劑，在15 — 30°C反應(yīng)3-10個小時。在另ー優(yōu)選例中，依次連接6至3位殘基的Fmoc-Thr (tBu)-0H、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-D-Trp (Boc)-OH 和 Fmoc-Phe-OH 時，或連接 I 位殘基的 Fmoc 或Boc-D-Phe-OH 時，縮合劑包括 HOBt、DIEA 和 HBTU。在另ー優(yōu)選例中，1-5倍量的Fmoc或Boc保護(hù)氨基酸，1_5倍量的HOBt，1-5倍量的DIEA試劑，溶解在4-8ml/g樹脂的DMF溶劑中，然后再加入1_5倍量的HBTU，15 一 30°C反應(yīng)3-10個小時。在另ー優(yōu)選例中，所述步驟(a)為1-5倍量的Fmoc-Thr, 1-5倍量的四叔丁基硝酸銨，1-5倍量的無水吡啶，溶解在4-8ml/g樹脂的無水DCM溶劑中；加入到裝有固相合成樹月旨(替代率0. 3-1. OmmoI/g)的反應(yīng)釜中，15_30°C反應(yīng)3-5小時。在另ー優(yōu)選例中，所述步驟(a)為1-5倍量的Fmoc-Cys (Trt)-Thr-Ol, 1_5倍量的四叔丁基硝酸銨，1-5倍量的無水吡啶，溶解在4-8ml/g樹脂的無水DCM溶劑中；加入到裝有固相合成樹脂(替代率0. 3-1. OmmoI/g)的反應(yīng)釜中，15_30°C反應(yīng)3_5小吋。在另ー優(yōu)選例中，所述固相合成樹脂選自三苯甲基氯樹脂，4-甲基三苯甲基氯樹脂或氨基-2-氯三苯甲基樹脂；更佳地，所述固相合成樹脂是2-CTC樹脂。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種有效、簡便的固相合成奧曲肽粗品的制備方法。


圖I顯示了實施例I制備獲得的奧曲肽粗品I的質(zhì)譜圖。圖2顯示了實施例I制備獲得的奧曲肽粗品I的高效液相色譜圖。圖3顯示了實施例2制備獲得的奧曲肽粗品2的質(zhì)譜圖。
圖4顯示了實施例2制備獲得的奧曲肽粗品2的高效液相色譜圖。圖5顯示了實施例3制備獲得的奧曲肽粗品3的質(zhì)譜圖。圖6顯示了實施例3制備獲得的奧曲肽粗品3的高效液相色譜圖。
具體實施例方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)采用Fmoc-Thr-01為原料直接合成第一個氨基酸，或采用ニ肽進(jìn)行樹脂裝載，減少了采用蘇氨酸為原料的還原過程，或保護(hù)蘇氨酸的去保護(hù)基的過程，步驟簡単，收率提高。另外，如果對個別氨基酸采用特殊的合成方法，減少了単一合成方法對個別氨基酸產(chǎn)生過多副反應(yīng)的影響。I.具體地,7#Cys的合成延長脫保護(hù)的時間，避免Fmoc脫去不完全,造成最終粗品序列少ー個Cys。2#Cys的合成采用DIC作為縮合劑，可以避免Cys縮合過程中消旋。本發(fā)明中所使用的縮寫或英文全稱的含義列于下表
Fmoc 9荷甲氧裁基 DMFN，N-二甲基甲酰胺
DCMニ氯甲烷
HOBtI 一羥基苯并三唑
IffiTU 苯并三唑四甲基脲四氟硼酸^
DICN，N' -ニ異丙基碳ニ亞胺
DIEA ニ異丙基乙胺 TFA三氟乙酸
Boc叔丁氧羰基
tBu叔]基，-C(CH3)權(quán)利要求
1.一種奧曲肽粗品的固相制備方法，依次連接具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)的八肽樹脂，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得奧曲肽粗品，其特征在于，依次包括如下步驟 (a)獲得Fmoc-Thr-樹脂； (b)在上述的樹脂中，加入脫保護(hù)劑進(jìn)行處理后，將具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸、縮合劑和含有步驟(a)獲得的樹脂的溶液混合，進(jìn)行接肽反應(yīng)，然后再加入脫保護(hù)劑處理，再將具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸、縮合劑和含有經(jīng)過接肽反應(yīng)獲得的多肽樹脂的溶液混合，進(jìn)行接肽反應(yīng)，如此重復(fù)，獲得Fmoc或Boc-D-Phe1-Cys2 (Trt) -Phe3-D-Trp4 (Boc) -Lys5 (Boc) -Thr6 (tBu) -Cys7 (Trt) -Thr8-OL-樹脂； 所說的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，依次為(1)Fmoc-Thr-OL、(2)Fmoc-Cys(Trt)-OH或 Fmoc-Cys(Acm)-OH>(3)Fmoc-Thr(tBu)-OH>(4)Fmoc-Lys(Boc)-OH 或 Fmoc-Lys(Dde) -OH>(5)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH>(6)Fmoc-Phe-OH、(7)Fmoc-Cys(Trt)-OH 或 Fmoc-Cys(Acm)-OH>(8)Fmoc或 Boc-D-Phe-OH。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，連接7位殘基的Fmoc-Cys(Trt) -OH前進(jìn)行的脫保護(hù)處理次數(shù)是連接其它氨基酸殘基前的1-2倍。
3.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，連接7位或2位殘基的Fmoc-Cys (Trt) -OH 時，縮合劑包括 HOBt 和 DIC。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，1-5倍量的Fmoc-Cys(Trt) -OH, 1-5倍量的HOBt，1-5倍量的DIC試劑，溶解在4-8ml/g樹脂的DMF溶劑中的混合溶液，在O — 40°C反應(yīng)30-60分鐘后，再次加入1-5倍量的DIC試劑，在15 — 30°C反應(yīng)3_10個小時。
5.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，依次連接6至3位殘基的Fmoc-Thr (tBu) -OH> Fmoc-Lys (Boc) -OH> Fmoc-D-Trp (Boc) -OH 和 Fmoc-Phe-ΟΗ 時，或連接 I位殘基的Fmoc或Boc-D-Phe-OH時，縮合劑包括HOBt、DIEA和HBTU。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，1-5倍量的Fmoc或Boc保護(hù)氨基酸，1-5倍量的HOBt，1-5倍量的DIEA試劑，溶解在4_8ml/g樹脂的DMF溶劑中，然后再加入1_5倍量的HBTU，15 - 30°C反應(yīng)3-10個小時。
7.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(a)為1-5倍量的Fmoc-Thr, 1-5倍量的四叔丁基硝酸銨，1_5倍量的無水吡啶，溶解在4_8ml/g樹脂的無水DCM溶劑中；加入到裝有固相合成樹脂(替代率O. 3-1. Ommol/g)的反應(yīng)釜中，15_30°C反應(yīng)3-5小時。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(a)為1-5倍量的Fmoc-Cys (Trt) -Thr-Ol, 1-5倍量的四叔丁基硝酸銨，1-5倍量的無水吡啶，溶解在4_8ml/g樹脂的無水DCM溶劑中；加入到裝有固相合成樹脂(替代率O. 3-1. Ommol/g)的反應(yīng)釜中，15-30°C反應(yīng)3-5小時。
9.如權(quán)利要求1-8任一項所述的制備方法，其特征在于，所述固相合成樹脂選自三苯甲基氯樹脂，4-甲基三苯甲基氯樹脂或氨基-2-氯三苯甲基樹脂。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述固相合成樹脂是2-CTC樹脂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奧曲肽粗品的固相制備方法。所述方法依次連接具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)的八肽樹脂，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得奧曲肽粗品，依次包括如下步驟(a)獲得Fmoc-Thr-樹脂；(b)在上述的樹脂中，加入脫保護(hù)劑進(jìn)行處理后，將具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸、縮合劑和含有步驟(a)獲得的樹脂的溶液混合，進(jìn)行接肽反應(yīng)，然后再加入脫保護(hù)劑處理，再將具有Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸、縮合劑和含有經(jīng)過接肽反應(yīng)獲得的多肽樹脂的溶液混合，進(jìn)行接肽反應(yīng)，如此重復(fù)，獲得Fmoc或Boc-D-Phe1-Cys2(Trt)-Phe3-D-Trp4(Boc)-Lys5(Boc)-Thr6(tBu)-Cys7(Trt)-Thr8-OL-樹脂。
文檔編號C07K7/06GK102850438SQ201210352668
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者白俊才, 張若平, 張國慶 申請人:上海昂博生物技術(shù)有限公司