關(guān)于用于在蛋白藥物綴合物中使用的接頭的材料和方法與流程
本發(fā)明涉及蛋白藥物綴合物和制備所述蛋白藥物綴合物的方法。更具體地，本發(fā)明涉及提供蛋白、接頭和藥物例如細(xì)胞毒素以產(chǎn)生蛋白藥物綴合物。另外，本發(fā)明提供了用于在蛋白藥物綴合物中使用的改進的接頭以及將所述接頭引入所述蛋白藥物綴合物中的方法。更具體地，蛋白藥物綴合物可以是抗體藥物綴合物(adc)或含白蛋白和接頭的藥物綴合物。
已知蛋白藥物綴合物，特別是抗體藥物綴合物，提供將高效藥物靶向遞送至特定組織用于治療。更特別地，已知adc被用于抗癌治療，所述adc通常由抗體組成，所述抗體經(jīng)由具有不穩(wěn)定鍵的化學(xué)接頭與生物活性的細(xì)胞毒性或藥物有效荷載(payload)連接。由此類蛋白藥物綴合物提供的靶向遞送由抗體或類似物在健康和患病組織之間靈敏地辨別、從而確保高效藥物的安全遞送的能力導(dǎo)致。
因此，抗體，特別是單克隆抗體(mab)在靶向研究、治療、診斷和其他生物技術(shù)應(yīng)用中是有用的。更特別地，mab在靶向治療和醫(yī)藥的領(lǐng)域中是有用的。mab可通過以下方式而被利用：通過抗體藥物綴合物(adc)的方式并入到治療中。如以上討論的，adc是除了其他以外，被認(rèn)為在癌癥的治療中具有特定效用的一類生物活性藥物，并且是相對新的技術(shù)。通常，(例如)用于治療癌癥的adc將包含連接至細(xì)胞毒性有效荷載或藥物的mab，所述細(xì)胞毒性有效荷載或藥物可提供細(xì)胞殺傷作用。mab和細(xì)胞毒性材料(細(xì)胞毒素)之間的連接通常將由化學(xué)上穩(wěn)定的接頭分子提供。在本領(lǐng)域已知兩種類型的adc接頭系統(tǒng)：可裂解的和不可裂解的。對于可裂解的adc接頭系統(tǒng)，存在優(yōu)選地酶促驅(qū)動的釋放機制，盡管化學(xué)上不穩(wěn)定的可選的可裂解系統(tǒng)是已知的，如在由humanapress出版的methodsinmolecularbiology,第1045卷,2013中詳細(xì)描述的。在不可裂解的adc接頭系統(tǒng)中，釋放途徑是由當(dāng)adc被使用時通過細(xì)胞機制(cellularmachinery)的mab降解引起的。
adcs
以下顯示的
以下示出的
盡管adc是本領(lǐng)域熟知的，但包含具有提供藥物有效荷載的靶向遞送的能力的球狀蛋白(globularprotein)的其他蛋白藥物綴合物并不被熟知。例如，白蛋白可對此類蛋白藥物綴合物中的抗體提供合適的替代方案。
白蛋白由三個結(jié)構(gòu)上同源、大部分螺旋狀的結(jié)構(gòu)域(i、ii和iii)組成，每個結(jié)構(gòu)域由兩個亞結(jié)構(gòu)域a和b組成。像其他的哺乳動物白蛋白，人白蛋白包含17個二硫橋(disulfidebridge)和在cys34處的游離硫醇，在cys34處的游離硫醇提供了血清中最大比例的游離硫醇。
白蛋白是負(fù)責(zé)血液的膠體滲透壓的主要蛋白并且作為長鏈脂肪酸、膽紅素、金屬離子諸如銅(ii)和鎳(ii)、鈣和鋅的轉(zhuǎn)運媒介物(transportvehicle)發(fā)揮作用。白蛋白具有20天的近似血清半衰期，這可歸因于蛋白的大小(約67kda)并且還是通過新生fc受體(fcrn)再循環(huán)的結(jié)果。fcrn以ph依賴性的非競爭性方式再循環(huán)白蛋白以及抗體(更特別地igg)，保護白蛋白以及抗體兩者免于在溶酶體中的蛋白降解。循環(huán)白蛋白被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化，在所述內(nèi)皮細(xì)胞中它在早期內(nèi)體的酸性環(huán)境(ph6)中與fcrn結(jié)合。這允許白蛋白被再循環(huán)至細(xì)胞的表面，并釋放回血液(生理ph)中。白蛋白可共價地綴合至細(xì)胞毒性藥物或可選地融合至基于蛋白的治療性藥物，以增加生物利用度并改善藥物藥代動力學(xué)。
實體腫瘤具有可滲透的脈管系統(tǒng)(vasculature)以及差的淋巴引流，這導(dǎo)致大分子(>40kda)在腫瘤間質(zhì)液內(nèi)的積累和滯留。研究已表明白蛋白在多種惡性實體腫瘤中的滯留。對于白蛋白通過多種受體的特異性結(jié)合，還存在新出現(xiàn)的證據(jù)，所述多種受體中的一些已示出被高度地表達(dá)在惡性腫瘤細(xì)胞上。相似地，已知白蛋白由于血液-關(guān)節(jié)屏障的滲透性的增加而在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的發(fā)炎的關(guān)節(jié)中積累。白蛋白在藥物遞送中的已知應(yīng)用為利用包含半乳糖殘基的白蛋白綴合物的肝靶向，所述白蛋白綴合物在與無唾液酸糖蛋白受體(asgp-r)相互作用后進入肝細(xì)胞，所述無唾液酸糖蛋白受體僅在這些細(xì)胞上以大的量和高的親和力存在。
因此，這些靶向特性以及其利用度、生物降解能力、缺乏毒性和免疫原性并連同其明顯長的半衰期，使白蛋白成為用于藥物遞送的合適候選物。因此，白蛋白代表對蛋白藥物綴合物系統(tǒng)中的抗體的合適的替代方案。
藥物或細(xì)胞毒性有效荷載向靶組織的成功遞送取決于接頭與蛋白和藥物結(jié)合并維持結(jié)合直到蛋白藥物綴合物到達(dá)靶組織的能力。因此，對提供用于提供成功遞送的此類蛋白藥物綴合物的替代性和/或改進的接頭存在需求。
另外，對提供用于細(xì)胞毒性藥物或治療性肽或多肽的安全和有效遞送的新的和/或改進的蛋白藥物綴合物諸如包含白蛋白的那些蛋白藥物綴合物存在需求。
在一個實施方案中，對提供可有效提供細(xì)胞凋亡性質(zhì)的替代性和改進的adc存在需求。更特別地，對提供改進的adc接頭分子以在所述adc的制備期間確保選擇性的和有效的綴合并在使用時提供有效的細(xì)胞毒素有效荷載存在需求。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的第一方面，提供了蛋白藥物綴合物，所述蛋白藥物綴合物包含球狀蛋白、接頭和藥物。更具體地，本發(fā)明提供了蛋白藥物綴合物，所述蛋白藥物綴合物包含：能夠經(jīng)由存在于蛋白上的賴氨酸或半胱氨酸基團提供位點特異性綴合的接頭，優(yōu)選地包含乙烯基取代基的含氮雜環(huán)芳環(huán)。
本發(fā)明提供了用于在蛋白藥物綴合物中使用的接頭，效用為連接蛋白和藥物例如抗體和細(xì)胞毒素來提供adc分子。接頭提供了藥物的改進的靶向有效荷載。另外地或可選地，接頭為蛋白藥物綴合物提供與目前已知的用于adc的接頭分子相比增加的穩(wěn)定性，從而提供具有改進的安全性性質(zhì)和因此增強的耐受性概況的蛋白藥物綴合物。更具體地，在adc中使用本文公開的接頭分子提供了在使用時增加的adc效力，超過并高于等量的未綴合的抗體。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“球狀蛋白”應(yīng)被解釋為覆蓋具有靶向能力并因此具有將藥物有效荷載遞送至特定的靶組織的能力的任何蛋白。因此，“球狀蛋白”包括抗體及其片段、白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，以及已知用于藥物綴合物的任何其他替代物。
“藥物”意指對人或動物具有已知生物效應(yīng)的任何化學(xué)物質(zhì)。特別地，藥物可以是用于治療、治愈、預(yù)防或診斷疾病或以其他方式用于增強身體或精神健康的藥物。如將被領(lǐng)會到的，藥物可以是已獲得必要的上市許可的已知藥物，或尚未經(jīng)歷測試或獲得上市許可的新藥物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了抗體藥物綴合物，所述抗體藥物綴合物包含抗體、接頭和細(xì)胞毒素。
優(yōu)選地，抗體是抗體或其片段、并且更優(yōu)選地單克隆抗體(mab)。mab可選自任何已知的mab。對用于本發(fā)明的mab的選擇的僅有的限制是，它必須有半胱氨酸或賴氨酸殘基存在以允許綴合反應(yīng)發(fā)生。特別優(yōu)選地，mab包含半胱氨酸殘基，因為本發(fā)明的接頭的一些特別優(yōu)選的實施方案顯示出對半胱氨酸殘基中存在的硫醇基團的增加的選擇性。然而，在mab被識別為其正常地不含優(yōu)選的半胱氨酸殘基的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知將半胱氨酸引入mab中的方法。
根據(jù)本發(fā)明的可選的實施方案(如以下進一步詳細(xì)描述的)，抗體可以被替代為白蛋白。
以下討論的可以是或可以不是關(guān)于含抗體的adc或白蛋白藥物綴合物描述的所有優(yōu)選實施方案可等同地被認(rèn)為是蛋白藥物綴合物、以及adc實施方案和白蛋白藥物綴合物實施方案的優(yōu)選實施方案。更具體地，以下藥物和接頭的描述應(yīng)被認(rèn)為等同地應(yīng)用至蛋白藥物綴合物的多種實施方案。
藥物可以是細(xì)胞毒性有效荷載或治療性肽或多肽。特別地，當(dāng)?shù)鞍资强贵w或其片段，并且蛋白藥物綴合物是adc時，藥物優(yōu)選地是細(xì)胞毒素?？蛇x地，當(dāng)?shù)鞍资前椎鞍讜r，藥物可以是細(xì)胞毒素或治療性肽或多肽。
優(yōu)選地，細(xì)胞毒素是生物活性的細(xì)胞毒性物質(zhì)。更優(yōu)選地，細(xì)胞毒素是抗癌藥物。細(xì)胞毒素可選自包括以下的組：奧瑞他汀、美登素、加利車霉素(calicheamicin)、蒽環(huán)霉素(anthracycline)和吡咯并苯并二氮雜
然而，另外地或可選地，細(xì)胞毒素還可選自包含蓖麻毒素亞基的其他已知細(xì)胞毒素和其他基于肽的細(xì)胞毒性材料，盡管此類材料較不常用于本技術(shù)領(lǐng)域。
當(dāng)藥物是治療性肽或多肽時，肽或多肽可以是具有治療性質(zhì)，例如抗傷害性(antinociceptive)、抗糖尿病、抗腫瘤或抗病毒活性的任何肽或多肽。
另外地或可選地，藥物優(yōu)選地包含胺基團、硫醇基團或羧酸基團，因為這些類型的基團提供用于綴合藥物與本發(fā)明的接頭的理想位點。
優(yōu)選地，接頭(在本文也被稱為接頭分子或接頭基團)經(jīng)由蛋白諸如抗體上存在的賴氨酸或半胱氨酸基團提供位點特異性綴合。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的接頭包含：包含乙烯基取代基的含氮雜環(huán)芳環(huán)。
非?；\統(tǒng)地說，接頭可被認(rèn)為包括三個部分：乙烯基、含氮雜環(huán)芳環(huán)、和接頭臂。接頭臂可被改變以導(dǎo)致不同的末端基團，以為藥物或蛋白例如adc的抗體提供反應(yīng)位點，以與接頭結(jié)合。
優(yōu)選地，含氮雜環(huán)芳環(huán)是吡啶、嘧啶、咪唑或氮丙啶環(huán)。更優(yōu)選地，含氮雜環(huán)芳環(huán)是吡啶環(huán)或嘧啶環(huán)，并且最優(yōu)選地，它是吡啶環(huán)。當(dāng)采用吡啶環(huán)或嘧啶環(huán)時，優(yōu)選地乙烯基在相對于氮雜原子的2位或4位中。4-乙烯基吡啶是特別優(yōu)選的，因為它們已被發(fā)現(xiàn)在某些環(huán)境中提供商業(yè)上可接受的反應(yīng)速率，如以下進一步討論的。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選接頭的實例包括：
在以上顯示的實例中，4-乙烯基吡啶結(jié)構(gòu)是特別優(yōu)選的，并且如[13]顯示的結(jié)構(gòu)是最特別地優(yōu)選的。4-乙烯基吡啶結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的，因為在某些條件中，它們顯示出增加的反應(yīng)性，超過并高于等量的2-乙烯基吡啶結(jié)構(gòu)。
如技術(shù)人員將領(lǐng)會到的，以上示例的結(jié)構(gòu)中的每種主要地在接頭臂上設(shè)有末端羧酸基團。然而，這些結(jié)構(gòu)可優(yōu)選地以被取代的形式提供，以使得優(yōu)選的乙烯基吡啶結(jié)構(gòu)包含優(yōu)選的聚(亞烷基二醇)基團、最優(yōu)選地peg分子。當(dāng)尋求獲得蛋白藥物綴合物制備方法中所需的藥物與蛋白的比率時，已發(fā)現(xiàn)在接頭分子臂上存在peg基團是最優(yōu)選的，因為它增強了反應(yīng)效率。
此類優(yōu)選的接頭分子包括以下實例：
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，接頭包括具有以下通式的分子：
其中：
-x和y獨立地選自ch或n。
-r1選自：
■(ch2)n-c(o)-r，或，
■(ch2)m–z–r，或，
■(ch2)m–z-c(o)-r，或，
■(ch2)n–c(o)–z-r，或，
■(ch2)m–z–(ch2)n–c(o)–r，或，
■(ch2)m–z–(ch2)n–c(o)–z–r，或，
■(ch2)m-z–c(o)–(ch2)n–z–(ch2)n–c(o)–z–r，或
■(ch2)n–ch(co2r)2，或
■(ch2)m–z–(ch2)2ch(co2r)2，或
■(ch2)n–z1。
-r2和/或r3可選自與r1相同的分子基團(groupofmolecules)。然而，優(yōu)選地r2和/或r3選自氫或吸電子基團，諸如鹵素(f、cl、或br)、-no2、-co2h、-co2r4、cor4、-cho、-cn、-cf3、-so2nr4r5，其中r4和r5獨立地選自氫或c1-10烷基；或，
-r2和/或r3可選自氫、烷基或苯基，當(dāng)接頭分子包含吡啶環(huán)時這是特別優(yōu)選的，因為替代性吸電子基團可對接頭的反應(yīng)性具有負(fù)面影響；或
-r2和r3一起形成稠合(雜)芳環(huán)取代基，所述稠合(雜)芳環(huán)取代基可包括但不限于吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、異喹啉、氮丙啶或嘌呤。
當(dāng)r2和/或r3選自烷基時，甲基(ch3)或叔丁基((ch3)3c)是優(yōu)選的。在接頭分子上存在烷基是優(yōu)選的，因為此類基團的存在增加環(huán)結(jié)構(gòu)中存在的氮的堿性并導(dǎo)致接頭結(jié)構(gòu)具有超過并高于等量的接頭分子的增加的反應(yīng)性。
當(dāng)r2和/或r3選自吸電子基團時，cf3是優(yōu)選的。cf3的存在增加接頭分子中存在的乙烯基的反應(yīng)性，并且在生理條件下是穩(wěn)定的。
可選地，預(yù)期的是，在一些實施方案中，采用更擴展的稠合雜環(huán)芳環(huán)體系諸如吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、異喹啉、氮丙啶或嘌呤是可能的。
在以上給出的式中，
-z可獨立地選自nh、o或s，
-z1是n3基團或oh基團
-n可以是從0至10的任何整數(shù)。在一些優(yōu)選的實施方案中，n是從0至5的值。
-m可以是從0至10的任何整數(shù)。優(yōu)選地，m是從0至5，并且最優(yōu)選地m是從0至3，如以上給出的實例中示出的。另外地或可選地，在接頭分子中，當(dāng)在(ch2)m基團后的z基團是o基團并且r1(以及當(dāng)它們選自相同分子基團時的r2和/或r3)在環(huán)結(jié)構(gòu)上的2或6位時，則m優(yōu)選地為至少3，因為o基團應(yīng)與環(huán)結(jié)構(gòu)的氮間隔開。這是由于已發(fā)現(xiàn)氧基團對接頭分子結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性具有降低效應(yīng)。當(dāng)氧基團被進一步與環(huán)結(jié)構(gòu)間隔開時，該效應(yīng)不被察覺。這種情況被反映在以上的示例性結(jié)構(gòu)中。
-r可以是氫(h)、氫氧化物(oh)、胺或聚(亞烷基二醇)基團。優(yōu)選地，r是聚(亞烷基二醇)，并且最優(yōu)選地它是peg。如技術(shù)人員將領(lǐng)會到的，當(dāng)r基團是peg時，它可優(yōu)選地在以nh形式的z基團后面，這是由于peg的加成的反應(yīng)產(chǎn)物。該選擇在以上給出的r1的通式中詳細(xì)描述。通常，聚(亞烷基二醇)分子與r1和/或r2基團直接共價結(jié)合，如以上的式中示出的。接頭基團臂可具有不同的長度以保持聚(亞烷基二醇)分子更靠近或進一步遠(yuǎn)離蛋白，例如抗體。
優(yōu)選地，藥物例如細(xì)胞毒性的藥物，與接頭r1基團結(jié)合。在其中如以上描述的r2和/或r3選自與r1相同的分子基團的情況下，可能的是，這些基團還將與藥物諸如細(xì)胞毒素結(jié)合以提供在其結(jié)構(gòu)中具有多個藥物存在的蛋白藥物綴合物諸如adc。該類型的一些實施方案可被稱為將藥物對稱地裝載在蛋白藥物綴合物中。
另外地或可選地，當(dāng)r1以及任選地r2和/或r3選自(ch2)n–ch(co2r)2、或(ch2)m–z–(ch2)2ch(co2r)2時，即當(dāng)接頭臂是支化的時，則藥物與接頭臂的每個末端基團結(jié)合是可能的。因此，多個藥物存在于蛋白藥物綴合物中并可被描述為非對稱地裝載藥物。
優(yōu)選地，含氮雜環(huán)芳環(huán)為被取代的吡啶環(huán)(x和y兩者均為ch)或被取代的嘧啶環(huán)(x和y之一為ch并且另一個為n)。最優(yōu)選地，含氮雜環(huán)芳環(huán)是吡啶環(huán)。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，r1為：
(ch2)n–c(o)–r，或，
(ch2)n–c(o)–z-r，或，
(ch2)m–z–(ch2)n–c(o)–r，或
(ch2)m–z–(ch2)n–c(o)–z–r。
在本發(fā)明的另外的實施方案中，在以上描述的接頭分子內(nèi)包含延伸物接頭(extenderlinker)可以是合意的。此類延伸物接頭可以是必需的，以改變官能化基團的溶解度或免疫原性性質(zhì)。更特別地，在將在以下更詳細(xì)描述的可裂解adc接頭系統(tǒng)中，此類延伸物接頭將是有用的。用于在本發(fā)明中使用的合適的延伸物接頭對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，并且在美國專利號7,659,241和美國專利號5,609,105中描述了特別優(yōu)選的延伸物接頭。最優(yōu)選地，延伸物接頭是酶可裂解的延伸物接頭，所述酶可裂解的延伸物接頭包含可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶裂解的氨基酸的集合。
在本發(fā)明的另外的實施方案中，提供修飾形式的接頭，以使得其包含酯基團以利于接頭與蛋白藥物綴合物的蛋白的結(jié)合可以是合意的。以下將進一步描述該方面。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的接頭可被表示為下式，
其中：
r1選自：
■(ch2)n-c(o)-r，或
■(ch2)m–z–r，或
■(ch2)m–z-c(o)-r，或
■(ch2)n–c(o)–z-r，或
■(ch2)m–z–(ch2)n–c(o)–r，或
■(ch2)m–z–(ch2)n–c(o)–z–r，或
■(ch2)m-z–c(o)–(ch2)n–z–(ch2)n–c(o)–z–r，或
■(ch2)n–ch(co2r)2，或
■(ch2)m–z–(ch2)2ch(co2r)2，或
■(ch2)n–z1
-r2可選自與r1相同的分子基團。然而，優(yōu)選地r2選自氫或吸電子基團，諸如鹵素(f、cl、或br)、-no2、-co2h、-co2r4、cor4、-cho、-cn、-cf3、-so2nr4r5，其中r4和r5獨立地選自氫或c1-10烷基；或，
-r2可選自氫、烷基或苯基，這是特別優(yōu)選的，因為替代性吸電子基團可對接頭的反應(yīng)性具有負(fù)面影響。
當(dāng)r2選自烷基時，甲基(ch3)或叔丁基((ch3)3c)是優(yōu)選的。在接頭分子上存在烷基是優(yōu)選的，因為此類基團的存在增加環(huán)結(jié)構(gòu)中存在的氮的堿性并導(dǎo)致接頭結(jié)構(gòu)具有超過并高于等量的接頭分子的增加的反應(yīng)性。
當(dāng)r2選自吸電子基團時，cf3是優(yōu)選的。cf3的存在增加接頭分子中存在的乙烯基的反應(yīng)性，并且在生理條件下是穩(wěn)定的。
在以上給出的式中，
-z可獨立地選自nh、o或s，
-z1獨立地選自n3或oh，
-n可以是從0至10的任何整數(shù)。在一些優(yōu)選的實施方案中，n是從0至5的值。
-m可以是從0至10的任何整數(shù)。優(yōu)選地，m是從0至5，并且最優(yōu)選地m是從0至3，如以上給出的實例中示出的。另外地或可選地，在式(iii)的接頭分子中，當(dāng)在(ch2)m基團后的z基團是o基團時，則m優(yōu)選地為至少3，因為o基團應(yīng)與環(huán)結(jié)構(gòu)的氮間隔開。這是由于已發(fā)現(xiàn)氧基團對接頭分子結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性具有降低效應(yīng)。當(dāng)氧基團被進一步與環(huán)結(jié)構(gòu)間隔開時，該效應(yīng)不被察覺。這種情況被反映在以上的示例性結(jié)構(gòu)中。
-r是氫(h)、氫氧化物(oh)、胺或聚(亞烷基二醇)基團。優(yōu)選地，r是聚(亞烷基二醇)，并且最優(yōu)選地它是peg。如技術(shù)人員將領(lǐng)會到的，當(dāng)r基團是peg時，它可優(yōu)選地在以nh形式的z基團后面，這是由于peg的加成的反應(yīng)產(chǎn)物。該選擇在以上給出的r1的通式中詳細(xì)描述。通常，聚(亞烷基二醇)分子與r1和/或r2基團直接共價結(jié)合，如以上的式中示出的。接頭基團臂可具有不同的長度以保持聚(亞烷基二醇)分子更靠近或進一步遠(yuǎn)離蛋白，例如抗體。
優(yōu)選地，藥物例如細(xì)胞毒性的藥物，與接頭r1基團結(jié)合。在其中如以上描述的r2選自與r1相同的分子基團的情況下，可能的是，這些基團還將與藥物諸如細(xì)胞毒素結(jié)合以提供在其結(jié)構(gòu)中具有多個藥物存在的蛋白藥物綴合物諸如adc。該類型的一些實施方案可被稱為將藥物對稱地裝載在蛋白藥物綴合物中。
另外地或可選地，當(dāng)r1以及任選地r2選自(ch2)n–ch(co2r)2、或(ch2)m–z–(ch2)2ch(co2r)2時，即當(dāng)接頭臂是支化的時，則藥物與接頭臂的每個末端基團結(jié)合是可能的。因此，多個藥物存在于蛋白藥物綴合物中并可被描述為非對稱地裝載藥物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，接頭被表示為式(iii)。
另外地或可選地，當(dāng)存在聚(亞烷基二醇)基團時，基本的聚(亞烷基二醇)結(jié)構(gòu)可設(shè)有一個或更多個反應(yīng)性官能團，諸如羥基、胺、羧酸、烷基鹵、疊氮化物、琥珀酰亞氨基或硫醇基團，以利于聚(亞烷基二醇)分子與藥物或蛋白的反應(yīng)。特別優(yōu)選的聚(亞烷基二醇)分子包括在一個或更多個羥基位置處用化學(xué)基團諸如具有在一個和四個碳原子之間的烷基取代的那些聚(亞烷基二醇)分子。如以上提到的，根據(jù)本發(fā)明的用于使用的最優(yōu)選的聚(亞烷基二醇)分子是聚乙二醇(“peg”)分子，盡管技術(shù)人員將能夠結(jié)合其他聚(亞烷基二醇)分子諸如聚丙二醇或聚乙烯-聚丙二醇共聚物來使用本文公開的技術(shù)。聚(亞烷基二醇)分子包括peg，通常具有在約200da和約80kda之間的分子量。優(yōu)選的聚(亞烷基二醇)分子具有在約200da和1kda之間的分子量。根據(jù)本發(fā)明可使用的聚(亞烷基二醇)分子是本領(lǐng)域所熟知的并且是例如從商業(yè)上可得的來源諸如sigmaaldrich公眾可得的。
在本發(fā)明的另外的方面中，提供了不可裂解的和/或可裂解的蛋白藥物綴合物(例如adc)接頭系統(tǒng)。
可提供不可裂解的蛋白藥物綴合物(例如adc)接頭系統(tǒng)，所述接頭系統(tǒng)包含蛋白(例如抗體)、接頭和藥物(例如細(xì)胞毒素)。在該類型的一個系統(tǒng)中，抗體上的胺基團的綴合經(jīng)由接頭上存在的活化的酯完成，然后所述接頭轉(zhuǎn)而經(jīng)由乙烯基與細(xì)胞毒素結(jié)合。在該不可裂解的系統(tǒng)中，抗體優(yōu)選地為mab。另外地，接頭優(yōu)選地包含聚(亞烷基二醇)分子、最優(yōu)選地聚乙二醇(peg)分子，并且細(xì)胞毒素包含硫醇。如將被領(lǐng)會到的，在以上描述的系統(tǒng)中，抗體被作為蛋白的實例提供，并且可被替代為白蛋白，并且細(xì)胞毒素被作為藥物的實例提供并且可被替代為治療性肽或多肽。
在該類型的可選系統(tǒng)中，抗體上的硫醇基團的綴合經(jīng)由接頭的乙烯基完成，所述接頭轉(zhuǎn)而經(jīng)由接頭臂上存在的聚(亞烷基二醇)基團與藥物結(jié)合。
在可選的實施方案中，提供了可裂解的蛋白藥物綴合物(例如adc)接頭系統(tǒng)，所述接頭系統(tǒng)包含蛋白(例如抗體)、接頭、延伸物接頭和藥物(例如細(xì)胞毒素)。
在可裂解的adc接頭系統(tǒng)中，接頭分子的乙烯基取代基特別地適合于與天然存在的或已被引入到抗體中的一個或更多個硫醇基團(例如通過采用存在于抗體上的一個或更多個半胱氨酸殘基的硫醇基團)反應(yīng)。然后將接頭側(cè)臂連接至延伸物接頭，優(yōu)選地經(jīng)由聚(亞烷基二醇)分子；延伸物接頭對該實施方案中的adc提供“可裂解”功能。然后細(xì)胞毒素經(jīng)由延伸物接頭與接頭結(jié)合。優(yōu)選地，抗體是mab。更優(yōu)選地，接頭包含聚(亞烷基二醇)分子、最優(yōu)選地聚乙二醇(peg)分子。如在以上更詳細(xì)描述的，優(yōu)選的是，延伸物接頭是酶可裂解的。如將被領(lǐng)會到的，在以上描述的系統(tǒng)中，抗體被作為蛋白的實例提供，并且可被替代為白蛋白，并且細(xì)胞毒素被作為藥物的實例提供并且可被替代為治療性肽或多肽。
應(yīng)理解，在本申請中，術(shù)語“可裂解的”被用于包括能夠自我破壞(selfimmolate)或可被操作以釋放其藥物(例如細(xì)胞毒性的)有效荷載的蛋白藥物綴合物(例如adc)。該術(shù)語的使用意圖將此類蛋白藥物綴合物(例如adc)與那些“不可裂解的”蛋白藥物綴合物(例如adc)區(qū)分開，“不可裂解的”蛋白藥物綴合物被理解為僅在存在于靶細(xì)胞中后釋放其藥物(例如細(xì)胞毒性的)有效荷載。
應(yīng)理解，在本發(fā)明的該方面中使用的蛋白(例如抗體)、接頭和藥物(例如細(xì)胞毒素)的優(yōu)選特征如以上關(guān)于第一方面描述的。更具體地，接頭分子以及其優(yōu)選特征的描述特別地適合用于所述可裂解系統(tǒng)和不可裂解系統(tǒng)。
盡管優(yōu)選的是，本發(fā)明中使用的蛋白(例如抗體)包含至少一個或更多個含硫醇的半胱氨酸基團，但還預(yù)期的是，蛋白(例如抗體)可包含一個或更多個賴氨酸基團。在這種情況時，預(yù)期的是，技術(shù)人員可優(yōu)選將本發(fā)明的接頭附接至作為半胱氨酸基團的替代物的賴氨酸基團。在該情況中，優(yōu)選修飾接頭分子以使得其為活化酯形式的接頭。在該實施方案中，修飾的接頭的酯基團能夠經(jīng)由接頭臂與蛋白(例如抗體)上存在的賴氨酸結(jié)合。在該實施方案中，蛋白(例如抗體)將經(jīng)由賴氨酸基團與酯修飾的接頭結(jié)合，并且該酯修飾的接頭將轉(zhuǎn)而經(jīng)由乙烯基與藥物(即細(xì)胞毒素)結(jié)合。該修飾的接頭可包含聚(亞烷基二醇)分子、最優(yōu)選地聚乙二醇(peg)分子。
在本發(fā)明的第三方面中，提供了產(chǎn)生蛋白藥物綴合物的方法，所述方法包括使蛋白與接頭接觸，所述接頭能夠提供經(jīng)由存在于蛋白上的賴氨酸或半胱氨酸基團的位點特異性綴合，所述接頭優(yōu)選地包含含有乙烯基取代基的含氮芳雜環(huán)，其中接頭被結(jié)合至藥物。在可選的方面中，提供了產(chǎn)生蛋白藥物綴合物的方法，所述方法包括使蛋白與接頭接觸，所述接頭能夠提供經(jīng)由存在于蛋白上的賴氨酸或半胱氨酸基團的位點特異性綴合，所述接頭優(yōu)選地包含含有乙烯基取代基的含氮芳雜環(huán)，以及隨后使接頭與藥物結(jié)合。
優(yōu)選地該方法包括使具有至少一個反應(yīng)性硫醇基團的蛋白(例如抗體)與接頭接觸，所述接頭包含官能化試劑，所述官能化試劑包含具有乙烯基取代基的含氮雜環(huán)芳環(huán)，所述乙烯基取代基能夠與蛋白(例如抗體)的至少一個硫醇基團反應(yīng)，其中接頭官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子共價連接，以使得接頭官能化試劑的乙烯基取代基與蛋白(例如抗體)的硫醇基團反應(yīng)，從而使接頭聚(亞烷基二醇)分子與蛋白(例如抗體)共價連接。
另外，本發(fā)明的方法可包括除了使官能化試劑和蛋白(例如抗體)反應(yīng)以將它們連接在一起的步驟之外的一個或更多個步驟。例如，該方法可包括使前體官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子反應(yīng)以產(chǎn)生官能化試劑的初始步驟，所述前體官能化試劑包含具有乙烯基取代基的含氮雜環(huán)芳環(huán)。
在本發(fā)明的其中蛋白(例如抗體)不包含合適的硫醇基團或在其多肽鏈的期望的位置中不包含合適的硫醇基團的實施方案中，本發(fā)明可包括例如通過化學(xué)反應(yīng)或定點誘變(sitedirectedmutagenesis)修飾蛋白(例如抗體)以產(chǎn)生在多肽的一個或更多個期望的位置處具有硫醇基團的變體多肽的初始步驟。優(yōu)選地，這通過用半胱氨酸殘基替代蛋白(例如抗體)的多肽鏈中的一個或更多個氨基酸完成。
優(yōu)選地，反應(yīng)性硫醇基團是半胱氨酸氨基酸殘基的一部分，不管它是天然地存在于蛋白(例如抗體)中還是已被引入。
另外地或可選地，本發(fā)明提供了與接頭組合的白蛋白，其中接頭如以上關(guān)于本發(fā)明的第一實施方案描述的。
如將被領(lǐng)會到的，被意圖用于本發(fā)明的白蛋白是血清白蛋白，所述血清白蛋白是在肝臟中產(chǎn)生的血漿蛋白。優(yōu)選地，白蛋白是人白蛋白。
優(yōu)選地，接頭包含聚(亞烷基二醇)分子、最優(yōu)選地包含聚乙二醇(peg)分子。
另外地或可選地，本發(fā)明提供了蛋白藥物綴合物，所述蛋白藥物綴合物包含白蛋白、接頭和藥物(例如細(xì)胞毒素)，其中接頭和藥物(例如細(xì)胞毒素)如以上關(guān)于蛋白藥物綴合物和/或adc發(fā)明描述的。特別地，優(yōu)選的是，接頭包含與藥物(例如細(xì)胞毒素)結(jié)合的聚(亞烷基二醇)分子，最優(yōu)選地聚乙二醇(peg)分子。
本發(fā)明還提供了蛋白藥物綴合物，所述蛋白藥物綴合物包含白蛋白、接頭和治療性肽或多肽。接頭和治療性肽或多肽如以上描述的，并且優(yōu)選的是，接頭包含與治療性肽或多肽結(jié)合的聚(亞烷基二醇)分子，最優(yōu)選地聚乙二醇(peg)分子。
另外地或可選地，如以上描述的，基本的聚(亞烷基二醇)結(jié)構(gòu)可設(shè)有一個或更多個反應(yīng)性官能團，諸如羥基、胺、羧酸、烷基鹵、疊氮化物、琥珀酰亞氨基或硫醇基團，以利于聚(亞烷基二醇)分子與藥物即細(xì)胞毒性或治療性肽或多肽的反應(yīng)。
另外地，接頭聚(亞烷基二醇)結(jié)構(gòu)還可經(jīng)由接頭臂與第二接頭反應(yīng)以提供同型雙官能接頭(homobifunctionallinker)，以使得一個接頭的乙烯基可與藥物即細(xì)胞毒性或治療性肽或多肽的硫醇基團反應(yīng)，并且另一個接頭的乙烯基可被綴合至蛋白例如白蛋白的硫醇基團。在該實施方案中，蛋白藥物綴合物例如白蛋白藥物綴合物將包含兩個接頭分子，所述兩個接頭分子將利于白蛋白與含硫醇的細(xì)胞毒素、治療性肽或治療性多肽的連接。
在本發(fā)明的另外的實施方案中，提供了方法，所述方法包括使白蛋白與接頭接觸，所述接頭包含官能化試劑，所述官能化試劑包含具有乙烯基取代基的含氮雜環(huán)芳環(huán)，所述乙烯基取代基能夠與白蛋白的游離硫醇基團反應(yīng)，其中接頭官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子共價連接，以使得接頭官能化試劑的乙烯基取代基與白蛋白的硫醇基團反應(yīng)，從而使接頭聚(亞烷基二醇)分子與白蛋白共價連接。
該另外的方法可包括例如通過化學(xué)反應(yīng)或定點誘變修飾白蛋白以產(chǎn)生在多肽的一個或更多個期望的位置處具有硫醇基團的變體、例如以引入溶劑暴露的半胱氨酸殘基的初始步驟。優(yōu)選地，這通過用半胱氨酸殘基替代白蛋白的多肽鏈中的一個或更多個氨基酸完成。
在另外的方面中，本發(fā)明提供了如以上定義的蛋白藥物綴合物，用于在療法中使用。
在一個實施方案中，提供了如以上定義的adc，用于在療法中使用。優(yōu)選地，adc被意圖用于在抗癌療法中使用。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了如以上定義的白蛋白藥物綴合物，用于在療法中使用。優(yōu)選地，白蛋白藥物綴合物被意圖用于在抗癌、抗傷害性、抗糖尿病、抗腫瘤或抗病毒療法中使用。
本發(fā)明的實施方案現(xiàn)將參照附圖，以實例而非限制的方式被描述。
附圖簡述
圖1.根據(jù)本發(fā)明的示例接頭與谷胱甘肽的相對反應(yīng)速率。
圖2.在三種不同的ph(7.0、7.5和8.0)下在24小時后，pl13游離酸與n-乙?；腚装彼?nac)的反應(yīng)性的rp-hplc分析。
圖3.表明在ph7.0下pl-13-nac加合物的形成的ms數(shù)據(jù)。
圖4.表明在ph8.0下pl-13-nac加合物的形成的ms數(shù)據(jù)。
圖5.在ph8.0下pl13游離酸與nac反應(yīng)性的rp-hplc分析。
圖6.在ph7.0下pl13游離酸與氨基酸的混合物(tyr/lys/his/nac)的反應(yīng)性的rp-hplc分析。
圖7.表明在ph7.0下與氨基酸混合物的反應(yīng)中pl13-nac的形成的ms數(shù)據(jù)。
圖8.在ph7.0下pl13游離酸與10當(dāng)量的賴氨酸的反應(yīng)性的rp-hplc分析。
圖9.pl13游離酸與10當(dāng)量的天冬氨酸的反應(yīng)性的rp-hplc分析。
圖10.pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的結(jié)構(gòu)。
圖11.pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae的ms分析。
圖12.在1小時的反應(yīng)后曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae的hic和uv-vis譜。
圖13.在與超過硫醇1.25摩爾過量的藥物-接頭一起孵育1小時、8小時和16小時時，曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物的hic和uv-vis譜。
圖14.在與超過硫醇5摩爾過量的藥物-接頭一起孵育16小時時，曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物的hic譜。
圖15.在16小時的孵育后，經(jīng)由10摩爾過量的pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae的綴合獲得的曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的hic譜。
圖16.在16小時的孵育后，以10摩爾過量的pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae綴合的曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的plrp譜。
圖17.雙脫鹽的曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae的plrp譜。
圖18.在0、24和48小時，在nac的存在下曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物的hic分析。
圖19.在0、24和48小時，在nac的存在下曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物的plrp譜。
圖20.在0、24和48小時，在nac的存在下曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物的hic分析。
圖21.曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae(a)綴合物和曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(b)綴合物通過sec色譜法的分析。
圖22.曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae的非還原sds-page分析。
圖23.pl13-nh-peg4-osu接頭的結(jié)構(gòu)。
圖24.pl13-nh-peg4-cooh接頭中間體的esi-ms分析。
圖25.通過還原sds-page分析曲妥珠單抗經(jīng)由smcc或pl13-nh-peg4-osu接頭的交聯(lián)。
圖26.pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae接頭的結(jié)構(gòu)。
圖27.曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(a)和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(b)的hic譜。
圖28.曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(a)和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(b)的plrp譜。
圖29.曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-mmae和曲妥珠單抗-mal-val-cit-mmae的基于圖28的plrp洗脫譜的dar計算。
圖30.曲妥珠單抗-mal-val-cit-mmae(a)和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-mmae(b)的sec分析。
圖31.在1mg規(guī)格的工藝優(yōu)化后，得到的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的代表性hic(a)和plrp(b)譜。
圖32.以150mg規(guī)格獲得的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(a)和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(b)的hic譜。
圖33.以150mg規(guī)格獲得的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-氨基苯甲酰基-mmae(a)和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-氨基苯甲?；?mmae(b)的sec譜。
圖34.在ph7.0(實線)和ph7.5(虛線)下，thiomab-pl13-nh-peg4-val-cit-mmae的hic譜。
圖35.表明曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae的脫藥物化(de-drugging)的plrp譜。
圖36.表明具有3.8的dar的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的脫藥物化的plrp譜。
圖37.以下adc的體外穩(wěn)定性：曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae，mal-adc(a)相對于曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae，pl13-adc(b)。
圖38.以下adc的體內(nèi)穩(wěn)定性：pl13-adc相對于mal-adc
圖39.skbr3細(xì)胞系(a)、bt474細(xì)胞系(b)和jimt-1細(xì)胞系(c)的細(xì)胞殺傷數(shù)據(jù)。
圖40.表明adc毒性的多劑量異種移植物數(shù)據(jù)。
圖41.顯示adc對腫瘤生長的影響的多劑量異種移植物數(shù)據(jù)。
圖42.腫瘤成熟度組織病理學(xué)數(shù)據(jù)
圖43.在ph7.4下20kdapeg-pl12和peg-pl13相對于20kdapeg-馬來酰亞胺的與還原的白蛋白的綴合的比較數(shù)據(jù)。
圖44.pl11(a)、pl12(b)和pl13(c)與白蛋白的綴合的優(yōu)化
圖45.通過esi-ms分析pl11(a)、pl12(b)和pl13(c)與白蛋白的綴合。
圖46.通過esi-ms表明的白蛋白-pl-12綴合物在1mmgsh的存在下的穩(wěn)定性。
圖47.pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?多柔比星接頭的結(jié)構(gòu)。
圖48.pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?多柔比星接頭與白蛋白、硫代白蛋白(單突變體)和硫代白蛋白(雙突變體)綴合的比較數(shù)據(jù)。
圖49.白蛋白-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-多柔比星綴合物的非還原sds-page分析。(1)硫代白蛋白-雙突變體-dox；(2)硫代白蛋白-單突變體-dox；(3)白蛋白-dox；(m)-蛋白標(biāo)志物。
圖50.白蛋白-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?多柔比星綴合物的sec分析：白蛋白(a)和白蛋白-dox綴合物(b)；硫代白蛋白(單突變體)(c)和硫代白蛋白-dox(單突變體)(d)；硫代白蛋白(雙突變體)(e)和硫代白蛋白-dox(雙突變體)(f)。
本發(fā)明的方法能夠提供根據(jù)本發(fā)明的蛋白藥物綴合物，諸如adc或白蛋白藥物綴合物，所述蛋白藥物綴合物包含與接頭結(jié)合的抗體或白蛋白，所述接頭轉(zhuǎn)而與藥物諸如細(xì)胞毒素或治療性肽或多肽結(jié)合。
在本發(fā)明中，提及的抗體，包括免疫球蛋白，不管是天然的還是部分或全部合成產(chǎn)生的。該術(shù)語還覆蓋包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽或蛋白。還預(yù)期包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段，所述抗體片段包括fab片段、scfv片段、fv片段、dab片段、fd片段、雙體(diabodies)、三體(triabodies)或納米抗體(nanobodies)。采用單克隆抗體和其他抗體并利用重組dna技術(shù)的技術(shù)以產(chǎn)生保留初始抗體的特異性的其他抗體或嵌合分子是可能的。此類技術(shù)可包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補決定區(qū)(cdr)的dna引入到不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見，例如ep0184187a、gb2,188,638a或ep0239400a?？梢砸院芏喾N方式來修飾抗體，并且該術(shù)語應(yīng)被解釋為覆蓋具有帶有期望的特異性的抗體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何特異性結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語覆蓋抗體片段和衍生物，所述抗體片段和衍生物包括包含不管是天然的還是全部或部分合成的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。包含融合至另一種多肽的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等效物的嵌合分子因此被包括。嵌合抗體的克隆和表達(dá)被描述于ep0120694a和ep0125023a中。
在現(xiàn)有技術(shù)中，已示出的是，完整抗體的片段可進行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實例為(i)由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fab片段；(ii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iii)由單個抗體的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(iv)由vh結(jié)構(gòu)域組成的dab片段(ward,e.s.等,nature341,544-546(1989))；(v)分離的cdr區(qū)；(vi)f(ab')2片段，包含兩個連接的fab片段的二價片段；(vii)單鏈fv分子(scfv)，其中vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域通過肽接頭連接，所述接頭允許兩個結(jié)構(gòu)域締合以形成抗原結(jié)合位點(bird等人,science,242；423-426,1988；huston等人,pnasusa,85:5879-5883,1988)；(viii)雙特異性單鏈fv二聚體(pct/us92/09965)和(ix)“雙體”，通過基因融合構(gòu)建的多價或多特異性片段(wo94/13804；holliger等人,p.n.a.s.usa,90:6444-6448,1993)。fv、scfv或雙體分子可通過并入連接vh和vl結(jié)構(gòu)域的二硫橋而穩(wěn)定化(reiter等人,naturebiotech,14:1239-1245,1996)。還可制備包含連接至ch3結(jié)構(gòu)域的scfv的微抗體(minibodies)(hu等人,cancerres.,56:3055-3061,1996)。因此，此類結(jié)合片段被本發(fā)明所預(yù)期。
在優(yōu)選的實施方案中，本文公開的方法采用良好地適合于使蛋白諸如抗體經(jīng)由接頭與藥物諸如細(xì)胞毒素結(jié)合的試劑和條件。特別地，在本方法中使用的反應(yīng)條件有助于避免當(dāng)使用現(xiàn)有技術(shù)的試劑諸如馬來酰亞胺時易于發(fā)生的問題，所述現(xiàn)有技術(shù)的試劑具有產(chǎn)生具有一系列不同特性的不同產(chǎn)物的混合物的傾向。更特別地，如可從以下實驗數(shù)據(jù)看出的，使用根據(jù)本發(fā)明的接頭產(chǎn)生蛋白藥物綴合物諸如adc的方法避免了與馬來酰亞胺交聯(lián)有關(guān)的問題。
如以上提到的，用于蛋白藥物綴合物(例如adc)組合物的感興趣的蛋白(例如抗體)可利用存在的硫醇基團，或通過在該方法的初始步驟中引入硫醇基團例如通過使蛋白(例如抗體)的一個或更多個官能團反應(yīng)以產(chǎn)生硫醇基團，或通過將硫醇基團或其前體引入到蛋白(例如抗體)中，來與接頭結(jié)合。例如，這可包括在期望使接頭與蛋白(例如抗體)結(jié)合的位點處將半胱氨酸殘基引入到蛋白(在該實例中，抗體)中的步驟。在其中在起始或野生型多肽/蛋白中不存在用于根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)的便利的半胱氨酸殘基的情況中，這可以是有用的。方便地，這可利用蛋白諸如抗體多肽的定點誘變來完成，蛋白的定點誘變的利用在本領(lǐng)域是被良好地確立的。
可選地或另外地，當(dāng)?shù)鞍资巧唐芳壈椎鞍讜r，可以需要初始還原步驟，因為存在的大部分半胱氨酸硫醇被加帽，如以下進一步詳細(xì)討論的。
實驗數(shù)據(jù)和討論
以下實驗數(shù)據(jù)主要使用被識別為并在此被稱為如以下示出的以其游離酸或nh-聚乙二醇化形式的pl13的接頭分子產(chǎn)生。
1.表明pl11、pl12和pl13接頭與谷胱甘肽的反應(yīng)性
谷胱甘肽包含對于綴合容易地可用的硫醇基團，并且可提供對于蛋白的好的模型以評價用于本發(fā)明的接頭在蛋白藥物綴合物諸如adc中的效用的合適性。圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的三種接頭基團實例并表明了其與谷胱甘肽中存在的硫醇基團綴合的能力。圖1中的實例為pl11、pl12和pl13，并且以下示出了其結(jié)構(gòu)。
2.pl13游離酸選擇性的確定
以下給出的數(shù)據(jù)表明，根據(jù)本發(fā)明的接頭示出對半胱氨酸基團的特異性。pl13游離酸被識別為：
在ph7.0、7.5和8.0下，pl13游離酸與n-乙酰基半胱氨酸的反應(yīng)性
使pl13游離酸在以下三種單獨的ph下與2摩爾當(dāng)量的n-乙?；腚装彼?nac)反應(yīng)：7.0、7.5和8.0。在室溫(rt)下在緩沖至適當(dāng)?shù)膒h的甲醇/磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)溶液(9:1的比率)中進行反應(yīng)。進行以在15分鐘內(nèi)1％至50％b(具有0.1％tfa的乙腈)的梯度并在254nm檢測的rp-hplc分析，以監(jiān)測游離硫醇隨時間向pl13的乙烯基的加成。
方法：
將210μl的甲醇中的2.61mmpl13游離酸與22μl的緩沖液中的50mmnac混合，以給出2.37mmpl13游離酸和4.74mmnac的最終濃度。
結(jié)果：
在24小時后，在所有ph下以5.1分鐘的保留時間洗脫pl13-nac加合物(參見圖2)。在ph7.0和8.0下，產(chǎn)物(pl13-nac加合物)的量相似。在ph7.5下，pl13游離酸的反應(yīng)性較慢。另外，在4分鐘，未被識別的峰被洗脫出。
esi-ms分析證實了在所有分析的ph下，pl13-nac加合物的存在。在此包括了ms跟蹤數(shù)據(jù)(mstracedata)以示出在ph7.0(圖3)和ph8.0(圖4)下進行的該分析。
在ph8.0下，pl13游離酸與n-乙?；腚装彼岬姆磻?yīng)性
使pl13游離酸在甲醇/pbs溶液(9:1)，ph8.0中與2摩爾當(dāng)量nac反應(yīng)。反應(yīng)的進程通過rp-hplc利用在15分鐘內(nèi)1％到50％b的梯度以在254nm處檢測來監(jiān)測。在rt下在孵育的0、1、4和72小時分析樣品(參見圖5)。
方法：
將100μl的甲醇中的2.61mmpl13游離酸與11μl的以ph8.0的緩沖液中的50mmnac混合，以給出2.35mmpl13游離酸和5mmnac的最終濃度。
結(jié)果：
在前4小時內(nèi)，pl13游離酸與nac的加成是緩慢的。在孵育的72小時后，在ph8.0下，～70％的pl13游離酸被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物(pl13-nac加合物)。
在ph7.0下，pl13游離酸與10當(dāng)量的酪氨酸、組氨酸、賴氨酸和n-乙?；腚装彼岬姆磻?yīng)性
在ph7.0下，用10當(dāng)量的每種氨基酸(酪氨酸(tyr)、組氨酸(his)、賴氨酸(lys)和n-乙?；腚装彼?nac))挑戰(zhàn)pl13游離酸。通過rp-hplc利用在15分鐘內(nèi)1％到50％b的梯度以設(shè)置在254nm處的檢測來分析反應(yīng)。
方法：
將50μl的甲醇中的2.61mmpl13與260μl的緩沖液中的20mmtyr/his/lys和nac混合，以給出0.42mmpl13以及tyr、his、lys和nac各自4.2mm的最終濃度。
結(jié)果：
在ph7.0下，在tyr、his和lys的存在下pl13游離酸與nac選擇性地反應(yīng)(參見圖6)。圖7示出了ms數(shù)據(jù)以表明僅形成了pl13nac加合物。
在10摩爾過量的氨基酸下，pl13和nac之間的加成反應(yīng)顯著地增加。pl13游離酸向期望的pl13-nac加合物的轉(zhuǎn)化在室溫(rt)下在4小時后完成90％，并且在<18小時內(nèi)完全完成。
得到的結(jié)果表明根據(jù)本發(fā)明的接頭分子的游離酸形式經(jīng)由接頭分子的乙烯基對半胱氨酸反應(yīng)性的選擇性。
pl13游離酸與賴氨酸反應(yīng)性的rp-hplc分析
在rt下用ph7.4的pbs緩沖液中的10當(dāng)量賴氨酸挑戰(zhàn)pl13游離酸。通過rp-hplc利用在30分鐘內(nèi)水中的12％到50％乙腈的梯度以設(shè)置在270nm處的檢測來分析反應(yīng)。
方法：
將10μl的甲醇中的4mmpl13與50μl的8mmlys溶液和40μl的ph7.4的pbs緩沖液混合，以給出0.4mmpl13和4.0mmlys的最終濃度。通過rp-hplc利用在30分鐘內(nèi)水中的12％到50％乙腈的梯度以設(shè)置在270nm處的檢測來分析反應(yīng)。
結(jié)果：
在ph7.4下，pl13游離酸不與lys反應(yīng)，因為在rp-hplc分析中未觀察到對應(yīng)于pl13-lys加合物的峰(參見圖8)。
得到的結(jié)果表明通過使pl13游離酸與lys一起孵育，無加合物形成。該數(shù)據(jù)支持本發(fā)明的接頭的游離酸形式的半胱氨酸基團選擇性。應(yīng)領(lǐng)會到，馬來酰亞胺不呈現(xiàn)出此類半胱氨酸特異性，并且因此本發(fā)明的接頭在這一點上展現(xiàn)益處。
雖然以上數(shù)據(jù)示出了由本發(fā)明的接頭呈現(xiàn)的半胱氨酸特異性，但容易地領(lǐng)會到，如果接頭通過本領(lǐng)域所熟知的方法而被修飾，則可選地可實現(xiàn)賴氨酸特異性。
pl13游離酸與天冬氨酸的反應(yīng)性
在ph7.0下并在rt下，用10當(dāng)量的天冬氨酸(asp)處理pl13游離酸。通過rp-hplc以在15分鐘內(nèi)1％到50％b的梯度以在254nm處的檢測來進行分析。
方法：
將50μl的甲醇中的2.61mmpl13游離酸與280μl的緩沖液中的50mmasp混合，以給出0.42mmpl13游離酸和4.2mmasp的最終濃度。
結(jié)果：
在rt下在ph7.0下，在asp的存在下pl13游離酸在18小時內(nèi)是穩(wěn)定的(參見圖9)。
ms光譜證實通過使pl13游離酸與asp一起孵育，無加合物形成(數(shù)據(jù)未示出)。再次，該數(shù)據(jù)支持本發(fā)明的接頭的半胱氨酸基團選擇性。應(yīng)領(lǐng)會到，馬來酰亞胺不呈現(xiàn)出此類半胱氨酸特異性，并且因此本發(fā)明的接頭展現(xiàn)優(yōu)于其的益處。
3.合成pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae細(xì)胞毒性藥物接頭
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉的片段化方法合成pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae。
方法：
將pl13游離酸經(jīng)由hobt活性酯方法偶聯(lián)至示例性細(xì)胞毒素h-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的游離氨基末端。
結(jié)果：
合成了3.1mg的pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(參見圖10)。將材料溶解在二甲基乙酰胺(dma)中以提供50mm的濃度的藥物接頭溶液。
rp-hplc證實了pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae接頭的純度(數(shù)據(jù)未示出)。
esi-ms分析證實了細(xì)胞毒性藥物接頭的身份(預(yù)期的mw為1296.67da，實驗結(jié)果給出1296.5da的mw)(參見圖11)。
4.生成曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae
產(chǎn)生20mg的本發(fā)明的示例性adc曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物和20mg的包含已知的馬來酰亞胺接頭的adc曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae綴合物。
pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae與曲妥珠單抗的綴合
方法：
還原曲妥珠單抗以允許每個曲妥珠單抗分子綴合3-4個藥物。未提供用于還原曲妥珠單抗的詳細(xì)方法，因為這應(yīng)該是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
在ph7.0下使馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae以超過游離硫醇1.25摩爾過量與曲妥珠單抗綴合。使反應(yīng)在rt下進行1小時。通過過量的nac猝滅綴合反應(yīng)。通過疏水作用色譜法(hic)使用tosohbutyl-npr(4.6x3.5,2.5μm)柱并通過uv-vis光譜學(xué)完成曲妥珠單抗綴合物的分析。mmae在248nm處具有特有的uv吸收度(ε248＝1500m-1cm，ε280＝15900m-1cm)。
使pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae以超過游離硫醇1.25、2.5、5和10摩爾過量與曲妥珠單抗偶聯(lián)。在ph7.0下進行反應(yīng)持續(xù)16小時。通過hic(在tosohbutyl-npr柱上的分離)和plrp色譜法(在plrp柱-2.1mmx5cm,5μm上的分離)兩者來分析綴合反應(yīng)。通過uv-vis光譜學(xué)檢查曲妥珠單抗綴合物。mmae細(xì)胞毒性藥物和pl13接頭兩者均對在248nm處的uv吸收度有貢獻。
結(jié)果：
利用藥物相對于游離硫醇的1.25的比率使馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae與曲妥珠單抗的反應(yīng)在1小時內(nèi)完成(參見圖12)。圖12中的數(shù)字標(biāo)示與全長抗體綴合的藥物的量。入口是uv-vis譜，所述uv-vis譜代表由馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae與曲妥珠單抗的綴合引起的在248nm處的吸收度的增加。獲得了10mg的曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物(藥物與抗體比率(dar)2.2)并留出用于體外研究，如以下進一步討論的。
由于接頭的低溶解度，pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae反應(yīng)的速率和效率比馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae慢得多(參見圖13)。以超過硫醇的1.25摩爾過量的藥物-接頭進行綴合。入口是uv-vis譜，所述uv-vis譜示出了由pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae與曲妥珠單抗在16小時內(nèi)的偶聯(lián)引起的在248nm處的吸收度的增加。通過應(yīng)用超過硫醇基團的5摩爾過量的藥物-接頭，觀察到pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae與曲妥珠單抗綴合的速率的緩慢增加(參見圖14)。在圖14中，數(shù)字標(biāo)示了與全長抗體綴合的藥物的量。dl指示未綴合的藥物。
以10摩爾過量并在50％丙二醇的存在下，pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae與曲妥珠單抗的綴合導(dǎo)致在4小時內(nèi)90％的收率(參見圖15和圖16)。在圖15中，數(shù)字標(biāo)示與全長抗體綴合的藥物的量。dl指示未綴合的藥物。在圖16中，數(shù)字標(biāo)示與抗體的輕鏈(l)或重鏈(h)綴合的藥物的量。獲得了7.2mg的曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物(dar3.03)，并留出用于體外研究，如以下進一步討論的。
確定曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的藥物抗體比(dar)。
常常應(yīng)用hic和plrp色譜法來表征半胱氨酸連接的adc的平均藥物荷載和藥物荷載分布。平均藥物荷載和藥物荷載分布的確定是關(guān)鍵屬性，因為它影響adc的效力和藥代動力學(xué)。
結(jié)果：
曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae的hic表征得到2.2的dar計算值、以及1.8％未綴合的曲妥珠單抗(參見圖12)。來自hic譜的dar計算值通過本領(lǐng)域所熟知的方法來確定，如以下針對圖27討論的。
曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae的hic分析得到峰，所述峰無法足夠良好地分辨出以支持dar確定(參見圖15)。但是，為了完整性，該數(shù)據(jù)被包括在此。hic被用于計算曲妥珠單抗的量，dar0被計算為～8.4％。
二硫蘇糖醇(dtt)還原的曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae經(jīng)由plrp柱的分離提供了良好地分辨的峰(圖16)，所述峰對應(yīng)于未綴合的或藥物綴合的抗體輕鏈和重鏈。對于曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae，計算出3.0的dar(參見圖17)。圖17中的表格示出了基于未綴合的和藥物荷載的輕鏈和重鏈的面積百分比，曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的dar計算。
5.曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的穩(wěn)定性研究
在pbs緩沖液中的nac的存在下，評價了曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae綴合物的藥物-接頭的穩(wěn)定性。
方法：
在37℃下，將每種adc(以1-2mg/ml的濃度)與1mmpbs緩沖液中的nac一起孵育持續(xù)24小時。
結(jié)果：
曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae綴合物不受緩沖液中nac的存在的影響(參見圖18和19)。曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae在nac的存在下示出降低的穩(wěn)定性(參見圖20)。在圖18中，數(shù)字標(biāo)示與全長抗體綴合的藥物的量。dl指示未綴合的藥物。
圖19特別地表明對于從被游離硫醇挑戰(zhàn)得到的含pl13的adc，不存在譜的改變，表明了構(gòu)造的穩(wěn)定性。
6.曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的sds-page和sec分析
通過sec色譜法和非還原sds-page來評價曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae。
結(jié)果：
曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae作為99.5％單體存在(參見圖21(a))。曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae作為93.5％單體存在(參見圖21(b))。
在非還原條件下的sds-page分析示出，由于在用接頭-藥物部分使半胱氨酸殘基烷基化期間在抗體中的鏈間二硫鍵的破壞，在曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae樣品和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae樣品兩者中均存在多個條帶(參見圖22)。在圖22中，泳道1代表以1.8mg/ml的濃度裝載到凝膠上的5μl的曲妥珠單抗-pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae樣品的分析，并且泳道2代表以5mg/ml的濃度裝載到凝膠上的5μl的曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae樣品的分析。由于重鏈和輕鏈之間的強的非共價相互作用，全長抗體的完整性仍被保持，這被sec分析所證實。
7.合成pl13-nh-peg4-osu異型雙官能接頭
將親水性peg(peg4)引入到接頭分子接頭臂部分，以提供pl13-nh-peg4-osu，以改善接頭溶解度超過在以上第1部分下給出的實例(參見圖23)。
方法：
將pl13游離酸(如以上描述的)偶聯(lián)至1-氨基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸。將羧基活化到期望的琥珀酰亞氨基酯使用在無水二氯甲烷(dcm)中偶聯(lián)的n,n-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)2.5當(dāng)量/hosu來進行。經(jīng)由過濾從冷的dcm去除未反應(yīng)的dcc和二異丙基脲副產(chǎn)物。
結(jié)果：
pl13-nh-peg4-cooh的esi-ms(參見圖24)證實了接頭身份。
pl13-nh-peg4-osu和smcc接頭的交叉反應(yīng)性的比較
曲妥珠單抗經(jīng)由已知的接頭反式-4-(馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞氨基酯(smcc)和pl13-nh-peg4-osu的交聯(lián)的程度通過還原sds-page來評價。
方法：
將2mg/ml的最終濃度的曲妥珠單抗與10倍過量的smcc或pl13-nh-peg4-osu一起孵育。在rt下孵育樣品。
結(jié)果：
從sds-page明顯的是，pl13-nh-peg4-osu示出相比于smcc接頭不那么高的分子量條帶(參見圖25，泳道5-9)。在pl13-nh-peg4-osusds-page上存在一些較高分子量的條帶，但是這些條帶在一定程度上也存在于起始曲妥珠單抗泳道中(參見圖25，泳道5)。
與本發(fā)明的接頭相比，smcc接頭由于馬來酰亞胺基團特別地朝向賴氨酸殘基的胺側(cè)鏈的非特異性反應(yīng)性而誘發(fā)曲妥珠單抗交聯(lián)。
8.合成pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae
為了進一步改進之前合成的pl13-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae細(xì)胞毒性藥物接頭的溶解度，將短的親水性peg單元引入到分子(參見圖26)。peg單元還將‘間隔物’引入到了adc接頭臂，將mmae細(xì)胞毒性有效荷載和pl13的抗體附接點的間隔增加了大約39個原子(相對于之前在pl13-vcmmae中的22個原子)。認(rèn)為該“間隔物”將增加pl13單元的旋轉(zhuǎn)柔性，所述旋轉(zhuǎn)柔性可影響與游離硫醇的邁克爾加成的動力學(xué)。
方法：
純化40mg粗制fmoc-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae。然后通過氨解移除n-fmoc基團，并純化胺官能化的細(xì)胞毒性化合物以提供24mg材料。這被用于經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)hobt活性酯化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)pl13-nh-peg4-cooh。
結(jié)果：
合成了pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae。該分子代表了根據(jù)本發(fā)明的可裂解的adc系統(tǒng)的實例。
9.pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae與曲妥珠單抗的綴合
方法：
在rt下在乙二胺四乙酸(edta)的存在下用2.4倍過量的三(2-羧基乙基)膦(tcep)還原曲妥珠單抗，持續(xù)1小時。將抗體再緩沖(re-buffered)到pbs中。在rt在5％v/vdma的存在下，使20mg/ml的濃度的曲妥珠單抗與20倍過量的pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae綴合，持續(xù)16小時。另外地，在rt以6摩爾過量使馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae接頭偶聯(lián)至曲妥珠單抗(20mg/ml)，持續(xù)1小時。通過hic、plrp和sec色譜法來分析獲得的adc。
結(jié)果：
曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的hic表征得到4.29的dar計算值(參見圖27a)。
曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的hic表征得到3.15的dar計算值(參見圖27b)。
在圖27a和27b中，數(shù)字標(biāo)示與全長抗體綴合的藥物的量。表格展示了來自hic洗脫譜的每個峰面積的相對百分比。通過將峰面積百分比乘以對應(yīng)的藥物荷載以得到加權(quán)的峰面積來計算平均dar。加權(quán)的峰面積被合計并除以100以給出最終的dar值。
通過plrp對dtt還原的曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的dar分析證實平均藥物荷載為4.3(參見圖28a和圖29)。
通過plrp對dtt還原的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的分析證實平均藥物荷載為3.8(參見圖28b和圖29)。
在圖28a和28b中，數(shù)字標(biāo)示綴合至抗體的輕鏈(l)或重鏈(h)的藥物的量。
曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae(her-mal-mmea)和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(her-pl-13-mmea)兩者基于sec色譜法的分析示出兩種樣品均表現(xiàn)為單體物質(zhì)(參見圖30a和b)。圖30a和30b下方的表格示出了高分子量物質(zhì)(hmw)、單體和低分子量物質(zhì)(lmw)的計算值。
10.pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的綴合物的優(yōu)化條件
方法：
在rt下用2.4當(dāng)量的tcep還原曲妥珠單抗(23.5mg/ml)，持續(xù)2小時，以得到平均4.5個游離硫醇。在30℃下在10％v/vdma的存在下，使還原的曲妥珠單抗與20倍過量的pl13-nh-peg4-val-cit-mmae綴合，持續(xù)18小時。通過hic和plrp色譜法來分析綴合物(參見圖31a和b)。
結(jié)果：
hic和plrp數(shù)據(jù)示出綴合效率的實質(zhì)性改進。較高水平的綴合效率還已導(dǎo)致‘異常的(odd)’dar物質(zhì)的水平的顯著降低，和未綴合的抗體的水平的降低。
11.150mg規(guī)格的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-氨基苯甲?；?mmae(a)和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-氨基苯甲?；?mmae(b)的綴合，表明方法的可擴縮性(scalability)
方法：
在rt下用2.1當(dāng)量的tcep還原曲妥珠單抗(24.53mg/ml)，持續(xù)2小時。在30℃下在10％v/vdma的存在下，使還原的曲妥珠單抗與20倍過量的pl13-nh-peg4-val-cit-mmae綴合，持續(xù)18小時。
在rt下用1.95當(dāng)量的tcep還原25.68mg/ml的濃度的曲妥珠單抗，持續(xù)2小時。在rt下在10％v/vdma的存在下，使還原的曲妥珠單抗與6倍過量的馬來酰亞胺-val-cit-mmae綴合，持續(xù)1小時。
通過hic和sec色譜法來分析綴合物(參見圖32和33)。
結(jié)果：
對于曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-氨基苯甲酰基-mmae(圖32a)和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-氨基苯甲?；?mmae(圖32b)，hic譜示出相似的綴合效率。sec(圖33a和33b)證實，兩種綴合物均為單體，僅存在少量的高分子量物質(zhì)(1.4-2.4％)。這表明利用本發(fā)明的接頭開發(fā)的綴合方法的可擴縮性。
12.pl13-nh-peg4-val-cit-氨基苯甲?；?mmae與thiomab的綴合，表明與工程化的曲妥珠單抗(thiomab)的成功綴合
方法：
在ph7.4的緩沖液中在10％dma的存在下，具有被引入抗體輕鏈中的半胱氨酸突變(v205c)的曲妥珠單抗以10mg/ml的濃度與40倍過量的pl13-nh-peg4-val-cit-mmae綴合。將綴合反應(yīng)在35℃下孵育持續(xù)48小時。
結(jié)果：
曲妥珠單抗(v2015c)-pl13-nh-peg4-val-cit-mmae的hic譜表明，pl13可在兩種ph下成功地與具有工程化的cys殘基的抗體綴合(圖34)。綴合反應(yīng)的速率和程度表現(xiàn)為受硫醇微環(huán)境的影響。
13.根據(jù)本發(fā)明的adc作為adc的效用
使如以上在第8部分描述的adc綴合產(chǎn)物進一步經(jīng)受體內(nèi)和體外測試，以表明其作為商業(yè)adc的效用。
在nac的存在下，曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的體外穩(wěn)定性
方法：
在pbs緩沖液中在nac的存在下，評價曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物的藥物-接頭的穩(wěn)定性。
結(jié)果：
曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物不受緩沖液中nac的存在的影響(圖36)。在nac的存在下，曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae示出降低的穩(wěn)定性(參見圖35)。圖36特別地表明對于從被游離硫醇挑戰(zhàn)得到的含pl13的adc，不存在譜改變，表明了構(gòu)造的穩(wěn)定性。
曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae在小鼠血漿中的體外穩(wěn)定性
比較小鼠血漿中adc曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-氨基苯甲?；?mmae的體外血清穩(wěn)定性。
方法：
將曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-氨基苯甲酰基-mmae和曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-氨基苯甲?；?mmae分別加入(spiked)到過濾的無胸腺裸鼠血漿中至0.2mg/ml的濃度。將該溶液混合，并取一式三份的50μl等份并在液氮中驟冷(時間點-0h)。在37℃下孵育adc的血漿溶液，持續(xù)7天。在以下每個時間點以一式三份抽出50μl等份：1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天，并在-80℃下貯存直至分析。
結(jié)果：
通過lc-esi/ms分析監(jiān)測adc穩(wěn)定性。在ms分析之前，將血漿樣品預(yù)純化并用胰蛋白酶/cnbr消化。選擇四種未綴合的肽(來自重鏈的兩種和來自輕鏈的兩種)和兩種綴合的肽(來自重鏈的一種和來自輕鏈的一種)來監(jiān)測adc的穩(wěn)定性。來自未綴合的肽的平均數(shù)據(jù)對應(yīng)于小鼠血漿中的抗體組分(總ab)的穩(wěn)定性，并且來自綴合的肽的數(shù)據(jù)示出adc綴合物的穩(wěn)定性(lc綴合的肽、hc綴合的肽)
該體外數(shù)據(jù)揭示了，曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-氨基苯甲?；?mmae在輕鏈和重鏈兩者處均經(jīng)歷脫藥物化，而抗體組分是穩(wěn)定的(圖37a)。當(dāng)與輕鏈肽相比時，從重鏈肽丟失藥物更快速，這表明藥物丟失的速率受綴合位點的影響。
曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-氨基苯甲酰基-mmae綴合物貫穿7天的孵育時期保留mmae藥物，這示出pl13對兩種綴合位點均給予穩(wěn)定性(圖37b)。對兩種綴合物觀察到的變化性是由于用于樣品分析的esi-ms方法的樣品回收效率。
曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae在小鼠中的體內(nèi)穩(wěn)定性
方法：
在以5mg/kg的曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae綴合物注射的小鼠中，評價體內(nèi)穩(wěn)定性。在lc-ms分析之前，將血漿樣品預(yù)純化并用胰蛋白酶/cnbr消化。選擇兩種綴合的肽(來自重鏈的一種和來自輕鏈的一種)來監(jiān)測adc的穩(wěn)定性。
結(jié)果：
綴合的肽的穩(wěn)定性是以下兩種事件的結(jié)果：1)adc的分解代謝降解和2)由于接頭的不穩(wěn)定性造成的藥物丟失。源自曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的綴合的肽在小鼠血漿中在第1天示出比源自曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的綴合的肽更好的穩(wěn)定性。觀察到的差異似乎是由于從源自曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的綴合的肽比從源自曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的綴合的肽更快速的藥物釋放，這與體外小鼠血漿數(shù)據(jù)一致，示出為在孵育的前四天內(nèi)曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的快速脫藥物化(圖38)；在前兩天內(nèi)，約70％的附接至輕鏈的藥物和90％的重鏈上的藥物丟失。相比之下，曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae由于接頭的穩(wěn)定性而在較長的時間段內(nèi)保留了較多的藥物。
曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae在多種細(xì)胞系中的體外穩(wěn)定性
在圖39a至39c中，示出了以上描述的adc的skbr3、bt747和jimt-1細(xì)胞殺傷數(shù)據(jù)。在該測試中選擇skbr3、bt747和jimt-1細(xì)胞系，因為已知它們表達(dá)her2受體。另外地，已知jimt-1細(xì)胞系對曲妥珠單抗具有耐受性。在圖39a至39c中，“adcmal”涉及曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae，并且“adc-pl13”涉及曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae。測試的綴合物針對三種細(xì)胞系的相對體外活性表明曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae的數(shù)據(jù)比得上曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae。因此，該數(shù)據(jù)示出，本發(fā)明的adc是有活性的，并且因此pl13的存在對細(xì)胞殺傷不具有負(fù)面影響。
曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae在呈現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞腫瘤的小鼠中的體內(nèi)穩(wěn)定性
在圖40、41和42中，示出了關(guān)于adc對呈現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞腫瘤的小鼠的影響的異種移植物數(shù)據(jù)。使用的乳腺癌細(xì)胞系是bt474(her2表達(dá)者，對曲妥珠單抗具有高的敏感度)。
利用小鼠重量(如圖40中示出的)來測量adc的體內(nèi)毒性。從獲得的數(shù)據(jù)可看出，在療法時期的進程內(nèi)，曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae(adc-mal)(圖40a)和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(adc-pl13)(圖40b)對小鼠重量具有可忽略的影響。這表明，本發(fā)明的adc對于商業(yè)使用具有合適的毒性水平。
圖41示出了在21天的療法時期內(nèi)三種劑量(0.1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg)的測試的adc對腫瘤生長的效力。通過腫瘤體積的改變確定腫瘤生長。用兩種化合物以0.1mg/kg處理的小鼠相對于未處理組均經(jīng)歷腫瘤生長延遲。相比之下，用曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(adc-mal)和曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(adc-pl13)以5mg/kg和10mg/kg給藥的所有動物在療法時期內(nèi)示出完全響應(yīng)。
圖42示出了在10天的療法時期內(nèi)三種劑量(0.1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg)的測試的adc對腫瘤成熟度組織學(xué)表型的效力。在蘇木精和曙紅染色后，用顯微鏡檢查腫瘤組織并且如下分級：
0：無異種移植物團塊；皮下組織或脂肪組織中偶爾地有孤立的腫瘤細(xì)胞
1：小的不完整團塊；不完全的上皮發(fā)育順序
2：示出顯著的細(xì)胞丟失的異種移植物
3：帶狀細(xì)胞丟失，具有成熟腫瘤區(qū)域
4：完整的異種移植物團塊，示出完全的上皮發(fā)育順序和相關(guān)病理
對于以0.1mg/kg給藥的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae(adc-pl13)或曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae(adc-mal)，未觀察到腫瘤成熟度的降低，在兩種adc之間未觀察到顯著差異。然而，以5mg/kg和10mg/kg給藥的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae從第3天起表現(xiàn)出顯著降低的腫瘤成熟度(分別3級和3/2級)。該效果在第10天更顯著(對于5mg/kg1級，以及對于10mg/kg1/0級)，一些樣品示出無腫瘤團塊。以5mg/kg和10mg/kg給藥的曲妥珠單抗-馬來酰亞胺-val-cit-4-氨基苯甲?；?mmae從第3天起降低腫瘤成熟度(分別4/3級和4/3/2級)，但是與以相應(yīng)劑量的曲妥珠單抗-pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-mmae給藥的動物在第3天時相比，效果較不顯著。此外，在第10天，對于5mg/kg和10mg/kg劑量，對于adc-mal具有比對于adc-pl13觀察到的顯著更大的腫瘤異質(zhì)性。
14.表明pl11-peg20kda、pl12-peg20kda和pl13-peg20kda接頭與白蛋白的反應(yīng)性
如以上表明的，商品級白蛋白中存在的大部分半胱氨酸硫醇被加帽，并且因此在與接頭分子綴合之前，還原步驟是必需的。
方法：
在室溫(rt)下用含有乙二胺四乙酸(edta)(1mm)的ph7.0磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中的二硫蘇糖醇(dtt)(1mm)還原白蛋白(221μm)持續(xù)1小時，然后在nap-5柱上脫鹽，并通過uv測量定量。在rt下在pbs,ph7.4、1mmedta中進行20kdapeg-pl-12(10摩爾過量)或20kdapeg-pl-13(10摩爾過量)與還原的白蛋白(20μm)的綴合，持續(xù)1天。相似地，在rt下在含有1mmedta的ph7.4的pbs中進行20kdapeg-馬來酰亞胺(1.1摩爾過量)與還原的白蛋白(20μm)的綴合，持續(xù)1天。在sds-page凝膠上分析反應(yīng)，并通過利用imagelab軟件(biorad)分析sds-page凝膠上的蛋白條帶密度進行定量。
結(jié)果：
1天后，用還原的商品級白蛋白僅觀察到適中的綴合收率。pl13的綴合以比得上馬來酰亞胺對照的收率進行，而pl12在相同的時間段內(nèi)給出了稍微較低的收率。這在圖43中示出。
15.優(yōu)化pl11、pl12和pl13與白蛋白的綴合
對于pl-11在ph5.5下并且對于pl-12和pl-13在ph5.5、6.5、7.5、8.0和8.5下確定接頭與白蛋白的綴合。
方法：
在37℃下在ph5.5的50mm乙酸na中進行pl-11(10摩爾過量)與白蛋白(50μm)的綴合，持續(xù)24小時。在以下緩沖液中進行pl-12和pl-13(10摩爾過量)與白蛋白(50μm)的綴合：50mm乙酸naph5.5；pbs1mmedtaph6.5；pbs1mmedtaph7.5；100mm磷酸鹽；1mmedtaph8.0；和100mm碳酸na、1mmedtaph8.5；在37℃下持續(xù)24小時。
完成之后，將所有的白蛋白樣品在nap-5柱上脫鹽到pbs緩沖液(ph7.4)中。通過ellman測定定量綴合效率。ellman測定通過使5,5'-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)與游離硫醇基團反應(yīng)檢測并定量游離半胱氨酸殘基。與未綴合的白蛋白對照相比，接頭分子與白蛋白中的34cys的游離硫醇基團的綴合阻斷了這些基團通過ellman試劑的檢測?？蓹z測的游離硫醇的濃度的降低被用于定量與白蛋白綴合的接頭分子的量。
結(jié)果：
pl-11與白蛋白在ph5.5下的綴合以82％的收率進行。用于pl-12(91％)和pl-13(94％)的綴合的最佳ph被確定為ph7.5。這些結(jié)果示于圖44中。
16.通過esi-ms表明接頭-白蛋白綴合物的穩(wěn)定性
另外，通過esi-ms分析白蛋白-pl11、白蛋白-pl12和白蛋白-pl13綴合物。
方法：
在37℃下在ph6.5下在含有edta(1mm)的pbs中進行pl-11(20摩爾過量)與白蛋白(50μm)的綴合，持續(xù)24小時。在37℃下在ph7.5下在含有edta(1mm)的pbs中進行pl-12和pl-13(10摩爾過量)與白蛋白(50μm)的綴合，持續(xù)24小時。通過esi-ms分析白蛋白-接頭綴合物。
結(jié)果：
圖45示出了針對白蛋白-pl-11綴合(a)、白蛋白-pl-12綴合(b)和白蛋白-pl-13綴合(c)獲得的esi-ms結(jié)果。
基于ms信號強度檢測并定量以下白蛋白物質(zhì)(注意，mw代表分子量)：
白蛋白-pl11
·未綴合的白蛋白–6％
未綴合的白蛋白的預(yù)期的mw-66440(檢測的mw＝66445da)
·白蛋白-pl11綴合物–90％
白蛋白-pl11的預(yù)期的mw–66649da(檢測的mw＝66650da)
·綴合至兩個pl11的白蛋白～4％
白蛋白-2-pl11的預(yù)期的mw–66858da(檢測的mw＝66858da)
白蛋白-pl12
·未綴合的白蛋白–1％
未綴合的白蛋白的預(yù)期的mw-66440(檢測的mw＝66441da)
·白蛋白-pl12–92％
白蛋白-pl12的預(yù)期的mw–66663da(檢測的mw＝66664da)
·綴合至兩個pl12的白蛋白-7％
白蛋白-2-pl12的預(yù)期的mw–66886da(檢測的mw＝66886da)
白蛋白-pl13
·未綴合的白蛋白–5％
未綴合的白蛋白的預(yù)期的mw-66440(檢測的mw＝66441da)
·白蛋白-pl13–94％
白蛋白-pl13的預(yù)期的mw–66631da(檢測的mw＝66632da)
·綴合至兩個pl13的白蛋白-1％
白蛋白-2-pl13的預(yù)期的mw–66822da(檢測的mw＝66822da)
特別地，參考圖45，峰(4501)、(4504)和(4507)對應(yīng)于未反應(yīng)的和氧化的白蛋白，峰(4502)、(4505)和(4508)對應(yīng)于單綴合白蛋白，并且峰(4503)、(4506)和(4509)對應(yīng)于雙綴合白蛋白。
17.表明白蛋白-接頭綴合物在谷胱甘肽中的穩(wěn)定性
在7天的時期內(nèi)，在過量谷胱甘肽的存在下確定白蛋白-接頭分子綴合物的穩(wěn)定性并通過esi-ms分析。
方法：
在37℃下將白蛋白-pl-12綴合物(0.5mg/ml)的樣品與pbs(ph7.4)中的還原的谷胱甘肽(1mm)一起孵育，持續(xù)7天。在esi-ms上分析樣品。
結(jié)果：
圖46示出了對于作為代表性實例的白蛋白-pl-12綴合物獲得的結(jié)果。對于白蛋白-pl-11綴合物和白蛋白-pl-13綴合物觀察到相似的趨勢。
圖46示出了在第0天、1天、4天和7天的esi-ms結(jié)果。在圖46中，峰(4601)、(4603)、(4605)和(4608)對應(yīng)于白蛋白，峰(4602)、(4604)、(4606)和(4609)對應(yīng)于白蛋白-pl12綴合物并且峰(4607)和(4610)對應(yīng)于gsh-白蛋白。因此，示出以下：
·存在的大部分物質(zhì)是白蛋白-pl12綴合物(mw＝～66664da)
·與1mm谷胱甘肽一起孵育后，從與谷胱甘肽一起孵育的第4天起，白蛋白-gsh信號(～8％，mw＝66752da)存在很緩慢的增加，并在孵育的第7天達(dá)到～13％。
可總結(jié)出，本發(fā)明的白蛋白-接頭綴合物在競爭性環(huán)境中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。
18.使用根據(jù)本發(fā)明的接頭生成白蛋白-多柔比星綴合物
方法：
使白蛋白、硫代白蛋白(單半胱氨酸突變體)和硫代白蛋白(雙半胱氨酸突變體)分別與14、20和30倍過量的pl13-nh-peg4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-多柔比星接頭綴合(圖47)。在黑暗中，在37℃，在10％v/vdma和0.6mmedta的存在下，在ph7.5的147mm磷酸鈉中進行反應(yīng)，持續(xù)2天。在這之后，將反應(yīng)在于ph7.4的pbs緩沖液中平衡的pd-10柱上脫鹽。
通過uv-vis光譜學(xué)使用在495nm處的多柔比星吸收度和消光系數(shù)(ε＝8030m-1,cm-1)以及在280nm處的白蛋白吸收度和消光系數(shù)(ε＝34445m-1,cm-1)確定綴合效力，根據(jù)以下等式校正在280nm處的多柔比星吸收度：
白蛋白-多柔比星綴合物聚集的程度通過在非還原sds-page和sec色譜法上的分析確定。
將10μl的sds-page裝載緩沖液中的每種白蛋白-多柔比星綴合物裝載到nupage4-12％bis-tris凝膠上并在200v運行持續(xù)45分鐘。利用多柔比星的天然熒光特性使白蛋白-多柔比星綴合物可視化，然后針對蛋白物質(zhì)用考馬斯染料(coomassiedye)對凝膠染色。
將5μl的每種綴合物裝載到用ph7.0的150mm磷酸鈉緩沖液平衡的sechplc柱上，并以1ml/min的流速洗脫，并在280nm處檢測。
結(jié)果：
多柔比星與野生型白蛋白和白蛋白突變體的綴合得到對于白蛋白55％的收率，對于硫代白蛋白單突變體32％的收率，以及對于硫代白蛋白雙突變體14％的收率(參見圖48)。
sds-page分析表明了少量的高分子量物質(zhì)(hmws)在所有白蛋白-多柔比星樣品中的存在(參見圖49)。該數(shù)據(jù)與通過sec分析觀察到的數(shù)據(jù)一致(參見圖50)。另外，sds-page分析證實了通過uv-vis光譜學(xué)觀察到的多柔比星與白蛋白的綴合(參見圖49，dox熒光)。
白蛋白-多柔比星綴合物和硫代白蛋白-多柔比星綴合物連同未綴合的白蛋白和未綴合的硫代白蛋白對照一起通過sec色譜法而被分析。多柔比星綴合物的分析示出，對于白蛋白-dox單體含量為約97.6％，對于白蛋白-dox(單突變體)單體含量為86.8％，并且對于白蛋白-dox(雙突變體)單體含量為88.2％(參見圖50b、d和f)。未綴合的白蛋白和硫代白蛋白對照(參見圖50a、c和e)示出與多柔比星綴合物質(zhì)相似的單體和高分子量物質(zhì)含量。特別地，圖50示出在(5001)、(5003)、(5005)、(5007)、(5009)和(5011)處對應(yīng)于hmws的存在的峰，以及在(5002)、(5004)、(5006)、(5008)、(5010)和(5012)處對應(yīng)于單體含量的峰。
兩種硫代白蛋白突變體均示出比野生型白蛋白高的聚集趨勢：與天然白蛋白的2.4-2.6％相比，對于硫代白蛋白(單突變體)13.2-14.5％，以及對于硫代白蛋白(雙突變體)11.8-16.6％。這些樣品的分析證實了，多柔比星經(jīng)由pl13-peg4-val-cit-4-氨基苯甲?；木Y合被良好地耐受并且不產(chǎn)生另外的聚集(參見圖50a、c和f)。
因此，已示出的是，本發(fā)明的蛋白藥物綴合物提供了對已知蛋白藥物綴合物的合適替代物。此外，摻入本發(fā)明的蛋白藥物綴合物的接頭通過將藥物成功地與蛋白結(jié)合并保留藥物直到到達(dá)靶組織而使安全且有效的藥物遞送成為可能。
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