本發(fā)明涉及用在用于預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染或單獨(dú)細(xì)菌感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑。本發(fā)明還提供包含用在預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染或單獨(dú)細(xì)菌感染中的這類(lèi)抑制劑的組合物。此外，還提供一種體外測(cè)試系統(tǒng)，其中所述測(cè)試系統(tǒng)包含感染流感病毒和細(xì)菌或單獨(dú)感染細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

背景技術(shù)：

流感a病毒是導(dǎo)致顯著發(fā)病率和死亡率的嚴(yán)重呼吸道疾病的病原體。在感染流感病毒(iv)期間，大部分死亡案例實(shí)際上是由諸如金黃色葡萄球菌(s.aureus)、肺炎雙球菌和流感嗜血桿菌的不同細(xì)菌引起的繼發(fā)性肺炎所造成的(morens等人,2008,chertow等人,2013)。細(xì)菌合并感染最突出的問(wèn)題是突然增強(qiáng)的致病性(lwao等人,2012,paddock等人,2012,parker等人,2012)和對(duì)抗不同病原體的有效抗感染藥的有限的庫(kù)存(arsenal)。流感病毒的高變異性和新菌株的不斷出現(xiàn)(neumann等人,2009,taubenberger等人,2010,parry,2013)、菌株的具體特征(grundmann等人,2006,moran等人,2006,gillet等人,2007,shilo等人,2011)以及流感病毒(hayden等人,1992,bright等人,2006,pinto等人,2006,declercq等人,2007,pinto等人,2007)和細(xì)菌(grundmann等人,2006,moran等人,2006,shilo等人,2011)對(duì)可用的藥物/抗體迅速產(chǎn)生的耐受性是造成治療選擇貧瘠的主要原因。此外，偶發(fā)的情況是，迄今為止治療流感病毒和細(xì)菌合并感染不可能使用單一化合物。本發(fā)明解決這一問(wèn)題在于其提出了通過(guò)使用單一藥物對(duì)抗iv和金黃色葡萄球菌合并感染的新的抗感染策略。而且，本發(fā)明通過(guò)提供以細(xì)胞因子而非細(xì)菌本身為靶向的藥物而解決了細(xì)菌迅速產(chǎn)生耐受性的問(wèn)題。

發(fā)明概述

本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)在權(quán)利要求中所反映的、在說(shuō)明書(shū)中所描述的以及在實(shí)施例和附圖中所列舉的實(shí)施方案來(lái)解決。

如上所述，本發(fā)明涉及用在用于預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑。

此外，本發(fā)明涉及用在用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑。

盡管在上一世紀(jì)進(jìn)行了密集的研究，iv仍然表現(xiàn)出對(duì)人類(lèi)的嚴(yán)重威脅。對(duì)老年人和免疫功能低下的個(gè)體尤為危險(xiǎn)的季節(jié)性暴發(fā)是由于感染流感a或b病毒。

在過(guò)去幾十年內(nèi)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌發(fā)病率提高，造成嬰幼兒和兒童同時(shí)感染iv的問(wèn)題(iverson等人,2011,thorburn等人,2012)。在細(xì)菌合并感染中出現(xiàn)的一個(gè)主要問(wèn)題是可能由加速的細(xì)胞因子表達(dá)所引起的突然且高度增強(qiáng)的致病性，這導(dǎo)致組織損傷。特別地，在具有表達(dá)殺白細(xì)胞毒素(pvl)的金黃色葡萄球菌的合并感染中觀察到嚴(yán)重的肺上皮細(xì)胞破壞，這是由于pvl-介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞殺死后蛋白酶的失控性釋放所致(gillet等人,2007,niemann等人,2012)。細(xì)菌合并感染通常發(fā)生在感染iv的前六天之內(nèi)，這甚至?xí)l(fā)更多的爆發(fā)性疾病、肺炎以及更高的死亡率(iverson等人,2011,chertow等人,2013)。然而，在某些情況下，當(dāng)病毒感染似乎已被清除時(shí)，細(xì)菌合并感染才發(fā)生。對(duì)于病毒/細(xì)菌合并感染的治療，僅存在有限的可能性。

對(duì)抗流感的一種有前景的抗病毒策略基于以下事實(shí)：作為細(xì)胞內(nèi)病原體的iv高度依賴(lài)于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)構(gòu)(gong等人,2009,ludwig,2009)。iv獲得為其自身目的搶奪細(xì)胞因子的能力(ludwig等人,2003)。而且，iv能夠抑制其宿主的先天性免疫應(yīng)答。考慮到這些依賴(lài)性，細(xì)胞病毒支持性功能是新型抗病毒干擾最具前景的候選者(ludwig等人,2003,ludwig,2011,planz,2013)。在過(guò)去的幾年中，我們和其他人確定了raf/mek/erk促有絲分裂激酶級(jí)聯(lián)(pleschka等人,2001,ludwig等人,2004,olschlager等人,2004,marjuki等人,2006,ludwig,2009,droebner等人,2011)、ikk/nfκb模塊(pleschka等人,2001,wurzer等人,2004,marjuki等人,2006,mazur等人,2007,ludwig等人,2008,dudek等人,2010,droebner等人,2011,ehrhardt等人,2013,haasbach等人,2013)、p38-(borgeling等人,2014)以及pi3k-信號(hào)(ehrhardt等人,2006,ehrhardt等人,2007a,ehrhardt等人,2007b,ehrhardt等人,2009,eierhoff等人,2010)通路作為抗病毒方法的合適靶點(diǎn)。

以細(xì)胞而非病毒因子為靶向防止了耐受性問(wèn)題，這是因?yàn)椴≡w并不能夠替代丟失的細(xì)胞功能。對(duì)于一些細(xì)胞因子，化學(xué)化合物是有效的，盡管處于早期階段，這些化學(xué)化合物中的一些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)甚至已經(jīng)獲得許可。

與iv復(fù)制相反，金黃色葡萄球菌門(mén)是與宿主細(xì)胞相獨(dú)立的。新型抗菌替代品不以所述病原體產(chǎn)生的必需基因產(chǎn)品為靶點(diǎn)，而是在金黃色葡萄球菌感染期間不通過(guò)殺害細(xì)菌或增強(qiáng)宿主免疫力而抑制致病因子(park等人,2012)。其他策略防止金黃色葡萄球菌在人類(lèi)宿主中的移植(park等人,2012)。這些化合物還顯示出較低的引發(fā)耐受性的可能性。近期，越來(lái)越多的證據(jù)證明金黃色葡萄球菌在感染期間也會(huì)為其自身利益使用細(xì)胞信號(hào)(oviedo-boyso等人,2011)，但這樣的細(xì)菌-支持性細(xì)胞因子尚未被詳細(xì)表征為抗菌療法的靶點(diǎn)。

本發(fā)明驚奇地觀察到，以前示出的具有抗流感活性的對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)信號(hào)因子的藥物，諸如nfкb,mek或p38map激酶也表現(xiàn)出抗金黃色葡萄球菌活性，并且在合并感染情況下同時(shí)降低病毒和細(xì)菌的效價(jià)。因此，這些信號(hào)抑制劑是用于治療單獨(dú)的iv感染或金黃色葡萄球菌感染的最具前景的候選者，然而，最重要的是，其還對(duì)抗伴有細(xì)菌合并感染的嚴(yán)重流感。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染或細(xì)菌感染的方法中，其中，所述細(xì)菌感染由以下細(xì)菌調(diào)解：葡萄球菌科、鏈球菌科、人菌科、假單胞菌科、衣原體科、支原體科、腸桿菌科、假單胞菌目和/或巴斯德氏菌科。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染的方法中，其中，所述流感病毒感染由流感a病毒或流感b病毒介導(dǎo)，優(yōu)選地，所述流感a病毒為h1n1、h2n2、h3n2、h6n1、h7n7、h7n9、h9n2h10n7、h10n8或h5n1。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感a病毒是h1n1。在其他實(shí)施方案中，所述流感a病毒為h3n2、h5n1和h7n9。在另外的實(shí)施方案中，所述流感a病毒為h3n2、h5n1、h1n1和h7n9。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染或細(xì)菌感染的方法中，其中，所述mek抑制劑選自u(píng)0126、plx-4032、azd6244、azd8330、as-703026、gsk-1120212、rdea-119、ro-5126766、ro-4987655、ci-1040、pd-0325901、gdc-0973、tak-733、pd98059、arry-438162、pf-3644022和pd184352，優(yōu)選為azd8330、gsk-1120212、u0126、gdc-0973、ci-1040、pd0325901、arry-438162、pf-3644022和azd6244，最優(yōu)選為u0126、gdc-0973、ci-1040、azd8330和gsk-1120212。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染或細(xì)菌感染的方法中，其中，所述p38抑制劑選自sb202190、ly2228820、cay10571、sb203580、tie2激酶抑制劑、2-(4-氯苯基)-4-(氟苯基)-5-吡啶-4-基-1,2-二氫吡唑基-3-酮、cgh2466、sb220025、抗生素llz1640-2、tak715、sb202190鹽酸鹽、skf86002、amg548、cmpd-1、eo1428、jx401、ml3403、rwj67657、sb202190、sb203580、sb203580鹽酸鹽、sb239063、scio469、sx011、tak715、pamapimod、losmapimod(gw856553)、dilmapimod(sb681323)、vx702、vx745、doramapimod(birb796)、bms-582949、arry-797、ph797804，優(yōu)選為vx-702、sb202190、pamapimod、losmapimod(gw856553)、dilmapimod(sb681323)、doramapimod(birb796)、bms-582949、arry-797、ph797804和scio-469。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染或細(xì)菌感染的方法中，其中，所述nfкb抑制劑選自lasag(也叫l(wèi)g-asa)、sc75741、mg132、tpca-1、pctc、imd0354、木犀草素、咖啡酸苯乙酯、豆蔻明、pf184、ikk16、sc514、醉茄素a、牛蒡甙元、bay11-7085、psi、pr39、ro106-9920、bay11-7821、ml-130、南蛇藤醇、丹參酮iia、hu211、膠霉毒素、cid2858522、和厚樸酚、穿心蓮內(nèi)酯、10z-hymenialdisine、achp、扁塑藤素、柳氮磺胺吡啶、ml120b二鹽酸鹽、氨來(lái)占諾、9-甲基鏈霉戊二酰亞胺、n-硬脂?；参锴拾贝肌?-(1,8-二氮雜萘-2-基)-苯酚、5-氨基水楊酸、bay11-7085、3,4-二羥基肉桂酸乙酯、helanalin、nf-κb活化抑制劑ii、jsh-23、糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)器、cpda、ppm-18、阿司匹林(asa)、吡咯烷二硫代羧酸銨鹽、(r)-mg132、sc75741楝酰胺、水楊酸鈉、qnz、ps-1145、cay10512、硼替佐米、雙水楊酯、白藜蘆醇、脫氧精胍菌素、蘇靈大、薩力多胺、agro-100、chs828和/或姜黃素，優(yōu)選為硼替佐米、姜黃素、阿司匹林(asa)、雙水楊酯、白藜蘆醇、水楊酸鈉、lasag(也叫l(wèi)g-asa)、脫氧精胍菌素、蘇靈大、薩力多胺、agro-100、chs828，更優(yōu)選為sc75741、asa和lasag(也叫l(wèi)g-asa)，最優(yōu)選為lasag(也叫l(wèi)g-asa)。

在另外的實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染或細(xì)菌感染的方法中，其中，所述mek抑制劑與另外一種mek抑制劑、所述p38抑制劑和/或所述nfкb抑制劑聯(lián)合；所述p38抑制劑與另外一種p38抑制劑、所述mek抑制劑和/或所述nfкb抑制劑聯(lián)合；或者所述nfкb抑制劑與另外一種nfкb抑制劑、所述p38抑制劑和/或所述mek抑制劑聯(lián)合。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染的方法中，其中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑與針對(duì)所述流感病毒和/或所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑聯(lián)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑與針對(duì)所述流感病毒和/或所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑同時(shí)施用、在針對(duì)所述流感病毒和/或所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑之前或之后施用。這樣，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑可以與1、2、3、4、5、6、7或8種針對(duì)流感病毒的抑制劑聯(lián)合。類(lèi)似地，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑可以與1、2、3、4、5、6、7或8種針對(duì)細(xì)菌的抑制劑聯(lián)合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)所述流感病毒的一種或多種抑制劑為神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑，優(yōu)選為奧司他韋磷酸鹽、扎那米韋、奧司他韋或帕拉米韋。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)所述流感病毒的一種或多種抑制劑為針對(duì)離子通道蛋白(m2)的化合物，優(yōu)選為金剛烷胺和/或金剛烷乙胺。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述針對(duì)所述流感病毒的一種或多種抑制劑為經(jīng)由使用病毒聚合酶復(fù)合體成分、pb1、pb2、pa或np，優(yōu)選為np阻斷劑nucleozin或聚合酶抑制劑t-705干預(yù)聚合酶或核酸內(nèi)切酶活性的化合物。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的細(xì)菌感染的方法中，其中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑與針對(duì)所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑聯(lián)合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染或細(xì)菌感染的方法中，其中，所述針對(duì)所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑為抗生素，優(yōu)選為慶大霉素、利福平、溶葡萄球菌酶(lysosthaphin)、紅霉素、左氧氟沙星、替考拉寧、盤(pán)尼西林和苯甲異惡唑青霉素。

在另外的實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染或細(xì)菌感染的方法中，其用于患者，優(yōu)選用于脊椎動(dòng)物。

本發(fā)明還提供一種組合物，包含用在用于預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑。優(yōu)選地，所述組合物進(jìn)一步包含載體。

本發(fā)明還涉及一種組合物，包含用在用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑。優(yōu)選地，所述組合物進(jìn)一步包含載體。

本發(fā)明還提供一種組合物，包含用在用于預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑以及針對(duì)所述流感病毒和/或所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑。優(yōu)選地，所述組合物進(jìn)一步包含載體。

本發(fā)明還涉及一種組合物，包含用在用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑以及針對(duì)所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑的組合物。優(yōu)選地，所述組合物進(jìn)一步包含載體。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染的方法中，其中，與接觸前的體外測(cè)試系統(tǒng)相比，與體外測(cè)試系統(tǒng)相接觸時(shí)，所述mek抑制劑，所述p38抑制劑和/或所述nfкb抑制劑同時(shí)降低了病毒和細(xì)菌感染，其中，所述測(cè)試系統(tǒng)包含感染

a)流感病毒，和

b)細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒感染的降低是指血小板形成單位(pfu)/ml的降低，所述細(xì)菌感染的降低是指菌落形成單位(cfu)/ml的降低。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfкb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的細(xì)菌感染的方法中，其中，與接觸前的體外測(cè)試系統(tǒng)相比，與體外測(cè)試系統(tǒng)相接觸時(shí)，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑會(huì)降低細(xì)菌感染，其中所述測(cè)試系統(tǒng)包括感染細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

本發(fā)明還涉及一種體外測(cè)試系統(tǒng)，其中所述測(cè)試系統(tǒng)包含感染

a)流感病毒，和

b)細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

本發(fā)明還提供本發(fā)明的所述體外測(cè)試系統(tǒng)用于確定抑制劑有效降低包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒感染的降低是指血小板形成單位(pfu)/ml的降低，所述細(xì)菌感染的降低是指菌落形成單位(cfu)/ml的降低。

此外，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)有效預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的分子的方法，包括將感興趣的化合物與本發(fā)明的體外測(cè)試系統(tǒng)接觸，其中，與接觸前的體外測(cè)試系統(tǒng)相比，所述感興趣的化合物會(huì)同時(shí)降低病毒和細(xì)菌感染。

本發(fā)明還提供一種體外測(cè)試系統(tǒng)，其中所述體外測(cè)試系統(tǒng)包含感染細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的體外測(cè)試系統(tǒng)用于確定有效降低細(xì)菌感染的抑制劑的用途。

此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的體外測(cè)試系統(tǒng)用于檢查先天宿主細(xì)胞反應(yīng)的用途，所述檢查先天宿主細(xì)胞反應(yīng)任選地包括檢查信號(hào)傳導(dǎo)水平、產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)、細(xì)胞凋亡和壞死的誘導(dǎo)和/或調(diào)解健康和疾病的氧化還原止血作用。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)有效預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的分子的方法，包括將感興趣的化合物與本發(fā)明的體外測(cè)試系統(tǒng)接觸，其中，與接觸前的體外測(cè)試系統(tǒng)相比，所述感興趣的化合物會(huì)降低細(xì)菌感染。

此外，本發(fā)明涉及感染流感病毒和細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

本發(fā)明還提供感染細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

附圖顯示：

圖1：合并感染過(guò)程的時(shí)間標(biāo)度。細(xì)胞感染iv30分鐘。用金黃色葡萄球菌6850進(jìn)行合并感染或細(xì)胞經(jīng)空白處理(mock-treated)。細(xì)菌感染后3h細(xì)胞外細(xì)菌被溶解并通過(guò)抗生素處理移除。pbs清洗后，為細(xì)胞補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基(dmem/inv)，病毒感染培養(yǎng)達(dá)18小時(shí)。

圖2：mek抑制劑u0126降低iv效價(jià)(a/波多黎各/8/34)和金黃色葡萄球菌的負(fù)荷，即使在合并感染的情況下。在6孔培養(yǎng)板(8x10⁵細(xì)胞/孔)上2mldmem[10％fcs]中接種人肺上皮細(xì)胞。接種16-20小時(shí)后，沖洗細(xì)胞并在37℃、感染復(fù)數(shù)(moi＝0.1)下用pbs/ba[0.2％肽牛血清白蛋白(bsa)、1mmmgcl2、0.9mmcacl2、100u/ml盤(pán)尼西林、0.1mg/ml鏈霉素](每6孔500μl)或包含流感病毒a/波多黎各/8/34的pbs/ba進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30分鐘后，吸入病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞，并在50μmu0126或dmso存在下(溶劑對(duì)照)為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.5)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/ihepes](每6孔2ml)。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用抗生素處理細(xì)胞以移除細(xì)胞外細(xì)菌。因此，用pbs清洗細(xì)胞并隨后用mem/inv抗生素[2μg/ml溶葡球菌酶(sigma)](每6孔1ml)在37℃下培養(yǎng)20分鐘。用pbs另外再清洗之后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含50μmu0126或dmso以及0.333μg/ml胰蛋白酶(英杰公司)的dmem/inv。在37℃下進(jìn)一步培養(yǎng)14小時(shí)后，如(hrincius等人,2010,tuchscherr等人,2011)中所述的確定iv效價(jià)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。

iv效價(jià)描繪為血小板形成單位(pfu)/ml(a,c)，金黃色葡萄球菌效價(jià)描繪為菌落形成單位(cfu)/ml(b,d)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)。用雙側(cè)雙樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與用dmso處理的細(xì)菌相比，存在于50μmu0126中的金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)18小時(shí)時(shí)導(dǎo)致降低的效價(jià)(e)。將限定數(shù)量的金黃色葡萄球菌6850懸浮培養(yǎng)液在補(bǔ)充有50μmu0126或dmso的dmem/inv中稀釋?zhuān)⒃?7℃下孵化18小時(shí)。稀釋細(xì)菌，并通過(guò)在瓊脂板上的連續(xù)稀釋來(lái)確定細(xì)菌。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用雙側(cè)雙樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖3：mek抑制劑u0126降低iv效價(jià)(a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)/79)和金黃色葡萄球菌的負(fù)荷，即使在合并感染的情況下。在6孔培養(yǎng)板(8x10⁵細(xì)胞/孔)上2mldmem[10％fcs]中接種人肺上皮細(xì)胞。接種16-20小時(shí)后，沖洗細(xì)胞并在37℃、感染復(fù)數(shù)(moi＝0.001)下用pbs/ba[0.2％肽牛血清白蛋白(bsa)、1mmmgcl2、0.9mmcacl2、100u/ml盤(pán)尼西林、0.1mg/ml鏈霉素](每6孔500μl)或包含流感病毒a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)/79的pbs/ba進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30分鐘后，吸入病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞，并在50μmu0126或dmso存在下(溶劑對(duì)照)為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.5)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/ihepes](每6孔2ml)。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用抗生素處理細(xì)胞以移除細(xì)胞外細(xì)菌。因此，用pbs清洗細(xì)胞并隨后用mem/inv抗生素[2μg/ml溶葡球菌酶(sigma)](每6孔1ml)在37℃下培養(yǎng)20分鐘。用pbs另外再清洗之后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含50μmu0126或dmso的dmem/inv。在37℃下進(jìn)一步培養(yǎng)14小時(shí)后，如(hrincius等人,2010,tuchscherr等人,2011)中所述的確定iv效價(jià)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。

iv效價(jià)描繪為血小板形成單位(pfu)/ml(a,c)，金黃色葡萄球菌效價(jià)描繪為菌落形成單位(cfu)/ml(b,d)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)。用雙側(cè)雙樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖4：p38抑制劑sb202190降低iv的效價(jià)和金黃色葡萄球菌的負(fù)荷，即使在合并感染的情況下。在6孔培養(yǎng)板(8x10⁵細(xì)胞/孔)上2mldmem[10％fcs]中接種人肺上皮細(xì)胞。接種16-20小時(shí)后，沖洗細(xì)胞并在37℃、感染復(fù)數(shù)(moi＝0.1)下用pbs/ba[0.2％胎牛血清白蛋白(bsa)、1mmmgcl2、0.9mmcacl2、100u/ml盤(pán)尼西林、0.1mg/ml鏈霉素](每6孔500μl)或包含流感病毒a/波多黎各/8/34的pbs/ba進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30分鐘后，吸入病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞，并在10μmsb202190或dmso存在下(溶劑對(duì)照)為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.5)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/ihepes](每6孔2ml)。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用抗生素處理細(xì)胞以移除細(xì)胞外細(xì)菌。因此，用pbs清洗細(xì)胞并隨后用mem/inv抗生素[2μg/ml溶葡球菌酶(sigma)](每6孔1ml)在37℃下培養(yǎng)20分鐘。用pbs另外再清洗之后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含10μmsb202190或dmso以及0.333μg/ml胰蛋白酶(英杰公司)的dmem/inv。在37℃下進(jìn)一步培養(yǎng)14小時(shí)后，如(hrincius等人,2010,tuchscherr等人,2011)中所述的確定iv效價(jià)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。流感病毒效價(jià)描繪為血小板形成單位(pfu)/ml(a,c)，金黃色葡萄球菌效價(jià)描繪為菌落形成單位(cfu)/ml(b,d)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)。用雙側(cè)雙樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖5：nf-kappab(nfκb)抑制劑lg-asa降低iv的效價(jià)和金黃色葡萄球菌的負(fù)荷，即使在合并感染的情況下。在6孔培養(yǎng)板(8x10⁵細(xì)胞/孔)上2mldmem[10％fcs]中接種人肺上皮細(xì)胞。接種后16-20小時(shí)后，沖洗細(xì)胞并在37℃、感染復(fù)數(shù)(moi＝0.1)下用pbs/ba[0.2％胎牛血清白蛋白(bsa)、1mmmgcl2、0.9mmcacl2、100u/ml盤(pán)尼西林、0.1mg/ml鏈霉素](每6孔500μl)或包含流感病毒a/波多黎各/8/34的pbs/ba進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30分鐘后，吸入病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞，并在5mmlg-asa存在下(溶劑對(duì)照)為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.5)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/ihepes](每6孔2ml)。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用抗生素處理細(xì)胞以移除細(xì)胞外細(xì)菌。因此，用pbs清洗細(xì)胞并隨后用dmem/inv抗生素[10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶(sigma)](每6孔1ml)在37℃下培養(yǎng)20分鐘。用pbs另外再清洗之后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含5mmlg-asa或水以及0.333μg/ml胰蛋白酶(英杰公司)的dmem/inv。在37℃下進(jìn)一步培養(yǎng)14小時(shí)后，如(hrincius等人,2010,tuchscherr等人,2011)中所述的確定iv效價(jià)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。流感病毒效價(jià)描繪為血小板形成單位(pfu)/ml(a,c)，金黃色葡萄球菌效價(jià)描繪為菌落形成單位(cfu)/ml(b,d)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)。用雙側(cè)雙樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖6：病毒性神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑達(dá)菲降低iv的復(fù)制但加強(qiáng)金黃色葡萄球菌的負(fù)荷。在6孔培養(yǎng)板(8x10⁵細(xì)胞/孔)上2mldmem[10％fcs]中接種人肺上皮細(xì)胞。接種后16-20小時(shí)，沖洗細(xì)胞并在37℃、感染復(fù)數(shù)(moi＝0.001)下用pbs/ba[0.2％胎牛血清白蛋白(bsa)、1mmmgcl2、0.9mmcacl2、100u/ml盤(pán)尼西林、0.1mg/ml鏈霉素](每6孔500μl)或包含流感病毒a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)/79的pbs/ba進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30分鐘后，吸入病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞，并在2μm達(dá)菲或羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)存在下(溶劑對(duì)照)為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.5)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/ihepes](每6孔2ml)。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用抗生素處理細(xì)胞以移除細(xì)胞外細(xì)菌。因此，用pbs清洗細(xì)胞并隨后用dmem/inv抗生素[2μg/ml溶葡球菌酶(sigma)](每6孔1ml)在37℃下培養(yǎng)20分鐘。用pbs另外再清洗之后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含2μm達(dá)菲或hepes的dmem/inv。在37℃下進(jìn)一步培養(yǎng)14小時(shí)后，如(hrincius等人,2010,tuchscherr等人,2011)中所述的確定iv效價(jià)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。

圖7：經(jīng)lg-asa處理會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌6850的效價(jià)。在指定數(shù)量的lg-asa存在(a，c)和不存在(b，d)的情況下，用0.5moi金黃色葡萄球菌6850dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/ihepes]感染人肺上皮細(xì)胞(a549)3小時(shí)。感染后3小時(shí)，用dmem/inv抗生素[2μg/ml溶葡球菌酶(sigma)]進(jìn)行抗生素清洗以移除非內(nèi)化細(xì)菌，隨后為細(xì)胞補(bǔ)充包含指定數(shù)量的lg-asa的dmem/inv。感染后18小時(shí)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(a，b)，通過(guò)在瓊脂板上的連續(xù)稀釋確定內(nèi)化細(xì)菌的數(shù)量(c，d)。

圖8：表2：p38抑制劑

圖9：表3：nfκb抑制劑

圖10：表4：nfκb抑制劑

圖11：表5：抗生素

圖12：體外合并感染過(guò)程的時(shí)間標(biāo)度。在指定感染復(fù)數(shù)(moi)下用流感a病毒(iav)感染人肺上皮細(xì)胞(a549)30分鐘，37℃下在pbs/ba[0.2％牛血清蛋白(bsa)、1mmmgcl2、0.9mmcacl2、100u/ml盤(pán)尼西林、0.1mg/ml鏈霉素]中溶解。培養(yǎng)30分鐘后，吸入病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞。然后，用金黃色葡萄球菌6850進(jìn)行細(xì)菌感染或?qū)⒓?xì)胞進(jìn)行空白處理。因此，除了指定數(shù)量的抑制劑(u0126或cl-1040)或溶劑對(duì)照以外，還為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/ihepes]。細(xì)菌感染后3小時(shí)，引入抗生素清洗[dmem，10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶或100μg/ml慶大霉素，20分鐘]以移除非內(nèi)化細(xì)菌。另外進(jìn)行pbs清洗后，在存在或不存在所述抗體的情況下為細(xì)胞補(bǔ)充感染培養(yǎng)基dmem(0.2％ba，1mmmgcl2，0.9mmcacl2,100u/ml盤(pán)尼西林,0.1mg/ml鏈霉素)，37℃下病毒感染后培養(yǎng)達(dá)18小時(shí)。

圖13：mek/erk信號(hào)傳導(dǎo)的抑制會(huì)增強(qiáng)單一感染或合并感染后的細(xì)胞生存。

在37℃，感染復(fù)數(shù)(moi＝0.01)(h7n7)或(moi＝0.5)(h3n2)下，使人肺上皮細(xì)胞(a549)感染禽流感病毒株a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)(bratislava)/79(h7n7)(fpv)或人流感病毒株a/威斯康星州(wisconsin)/67/2005(h3n2)。30分鐘后，將病毒稀釋物移除，用pbs清洗細(xì)胞，并在50μmu0126或溶劑對(duì)照存在下為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.1)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[包含1％人血清白蛋白，25nmhepes]。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用包含10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶的dmem/fbs處理細(xì)胞20分鐘以移除非內(nèi)化細(xì)菌。用pbs另外再清洗后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含50μmu0126或溶劑的感染培養(yǎng)基dmem/ba(0.2％ba，1mmmgcl2，0.9mmcacl2,100u/ml盤(pán)尼西林,0.1mg/ml鏈霉素)，37℃下培養(yǎng)18小時(shí)后，用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

圖14：mek/erk信號(hào)傳導(dǎo)的抑制會(huì)引起單一感染或合并感染期間病毒效價(jià)的降低。

在37℃，感染復(fù)數(shù)(moi＝0.01)(a，c)，(moi＝0.5)(b，d)下，使人肺上皮細(xì)胞(a549)感染禽流感病毒株a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)/79(h7n7)(a，c)或人流感病毒株a/威斯康星州/67/2005(h3n2)(b，d)。30分鐘后，將病毒稀釋物移除，用pbs清洗細(xì)胞，并在50μmu0126或溶劑對(duì)照存在下為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.1)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[包含1％人血清白蛋白，25nmhepes]。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用包含10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶的dmem/fbs處理細(xì)胞20分鐘以移除細(xì)胞外細(xì)菌。另外進(jìn)行pbs清洗后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含50μmu0126或溶劑的感染培養(yǎng)基dmem/ba(0.2％ba，1mmmgcl2，0.9mmcacl2,100u/ml盤(pán)尼西林,0.1mg/ml鏈霉素)。37℃下培養(yǎng)18小時(shí)后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)確定病毒效價(jià)。病毒效價(jià)以線性(a，b)或?qū)?shù)刻度(c，d)描繪為血小板形成單位/ml(pfu/ml)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)。用雙側(cè)單樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖15：通過(guò)施用u0126的mek抑制引起細(xì)菌生長(zhǎng)的降低

在37℃，感染復(fù)數(shù)(moi＝0.01)(h7n7)或(moi＝0.5)(/h3n2)下，使人肺上皮細(xì)胞(a549)感染禽流感病毒株a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)/79(h7n7)或人流感病毒a/威斯康星州/67/2005(h3n2)(a，c)。30分鐘后，將病毒稀釋物移除，用pbs清洗細(xì)胞，并在50μmu0126或溶劑對(duì)照存在下為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.1)(a)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv(包含1％人血清白蛋白，25nmhepes)。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用包含10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶的dmem/fbs處理細(xì)胞20分鐘(a，c)以移除非內(nèi)化細(xì)菌。另外進(jìn)行pbs清洗后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含50μmu0126或溶劑的感染培養(yǎng)基dmem/ba(0.2％ba，1mmmgcl2，0.9mmcacl2,100u/ml盤(pán)尼西林,0.1mg/ml鏈霉素)，感染18小時(shí)后，通過(guò)在瓊脂板上對(duì)溶菌產(chǎn)物的連續(xù)稀釋確定大量?jī)?nèi)化細(xì)菌(a，c)。如隔夜培養(yǎng)金黃色葡萄球菌6850(100cfu/ml)所示，通過(guò)施用u0126來(lái)分析u0126對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。16小時(shí)后，將連續(xù)稀釋物在bhi瓊脂上(b，d)平板培養(yǎng)。細(xì)菌效價(jià)以線性(a，b)或?qū)?shù)刻度(c，d)描繪為菌落形成單位/ml(cfu/ml)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品四個(gè)(a，c)或三個(gè)(b，d)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)。用雙側(cè)雙樣本t檢驗(yàn)(***p<0.001)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖16：mek/erk信號(hào)傳導(dǎo)的抑制引起病毒蛋白和促炎趨化因子的減少

在37℃，感染復(fù)數(shù)(moi＝5)下，使人肺上皮細(xì)胞(a549)感染人流感病毒株a/威斯康星州/67/2005(h3n2)。30分鐘后，將病毒稀釋物移除，用pbs清洗細(xì)胞，并在50μmu0126或溶劑對(duì)照存在下為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝50)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv(包含1％人血清白蛋白，25nmhepes)。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用包含10％fbs，100μg/ml慶大霉素的dmem/fbs處理細(xì)胞30分鐘以移除細(xì)胞外細(xì)菌。另外進(jìn)行pbs清洗后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含50μmu0126或溶劑的感染培養(yǎng)基dmem/ba(0.2％ba，1mmmgcl2，0.9mmcacl2,100u/ml盤(pán)尼西林,0.1mg/ml鏈霉素)。37℃下培養(yǎng)8小時(shí)后，通過(guò)具有特異性引物的qrt-pcr來(lái)分析ccl3和ccl5的mrna水平(a，b)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析確定病毒蛋白表達(dá)(pb-1)、erk-1/2磷酸化水平以及細(xì)菌細(xì)胞壁成分(pgn)(c)。數(shù)據(jù)代表一次實(shí)驗(yàn)中三個(gè)生物樣本和兩次技術(shù)重復(fù)的初步結(jié)果。

圖17：u0126的施用引起獨(dú)立于病毒效價(jià)的體內(nèi)細(xì)菌效價(jià)降低

使12周大的balb/c小鼠在第0天感染50pfu流感病毒株a/波多黎各/8/34(pr8，h1n1)(用異氟烷麻醉)。從第一天開(kāi)始每天對(duì)小鼠腹腔注射30mg/kg/dayu0126或溶劑對(duì)照(10％dmso,30％聚氧乙烯蓖麻油,60％pbs)。第三天，在異氟烷麻醉下使小鼠感染5*10⁷cfu的金黃色釀膿葡萄球菌6850，并直接用u0126或溶劑對(duì)照處理。第四天，移除肺部并在pbs中均質(zhì)化(0.1g/1000μlpbs)。將均質(zhì)化物的連續(xù)稀釋物在bhi瓊脂上平板培養(yǎng)以計(jì)算細(xì)菌效價(jià)。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)以確定病毒效價(jià)。用曼-惠特尼u檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(*p<0.05)

圖18：特定的mek抑制劑ci-1040降低單一和合并感染中的病毒效價(jià)

在37℃，感染復(fù)數(shù)(moi＝0.01)下，使人肺上皮細(xì)胞(a549)感染禽流感病毒株a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)/79(h7n7)(a，c)或人流感病毒a/波多黎各/8/34(h1n1)(b，d)。30分鐘后，將病毒稀釋物移除，用pbs清洗細(xì)胞，并在10μmci-1040或溶劑對(duì)照存在下為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌6850(moi＝0.1)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv(包含1％人血清白蛋白，25nmhepes)。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用包含10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶的dmem/fbs處理細(xì)胞20分鐘以移除細(xì)胞外細(xì)菌。另外進(jìn)行pbs清洗后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含10μmci-1040或溶劑的感染培養(yǎng)基dmem/ba(0.2％ba，1mmmgcl2，0.9mmcacl2,100u/ml盤(pán)尼西林,0.1mg/ml鏈霉素)。37℃下培養(yǎng)18小時(shí)后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)確定病毒效價(jià)。病毒效價(jià)以線性(a，b)或?qū)?shù)刻度(c，d)描繪為血小板形成單位/ml(pfu/ml)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖19：ci-1040的施用對(duì)細(xì)菌的體外生長(zhǎng)具有抑制效果

通過(guò)向隔夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌6850(100cfu/ml)施用不同濃度的ci-1040(如所示的)來(lái)分析ci-1040對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。16小時(shí)后，將連續(xù)稀釋物在bhi瓊脂上(a，b)平板培養(yǎng)。細(xì)菌效價(jià)以線性(a)或?qū)?shù)刻度(b)描繪為菌落形成單位/ml(cfu/ml)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品的初步數(shù)據(jù)。

圖20：用特定mek抑制劑考比替尼(gdc-0973)處理會(huì)降低體內(nèi)病原體負(fù)荷

使8周大的balb/c小鼠(每組5只)在第0天感染50pfu的流感病毒株a/波多黎各/8/34(pr8，h1n1)(用異氟烷麻醉)。病毒感染6小時(shí)后，對(duì)小鼠進(jìn)行口服施用10mg/kg/day考比替尼或溶劑對(duì)照進(jìn)行治療(10％dmso，5％吐溫20，85％pbs)。然后每天進(jìn)行治療。第三天，在異氟烷麻醉下使小鼠感染5*10⁷cfu的金黃色釀膿葡萄球菌6850，6小時(shí)后，用考比替尼或溶劑對(duì)照進(jìn)行治療。第四天，移除肺部并在pbs中均質(zhì)化(0.1g/1000μlpbs)。將均質(zhì)化物的連續(xù)稀釋物在bhi瓊脂上平板培養(yǎng)以計(jì)算細(xì)菌效價(jià)。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)以確定病毒效價(jià)。用曼-惠特尼u檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖21：lg-asa改善感染流感a病毒(iav)和/或金黃色釀膿葡萄球菌(金黃色葡萄球菌)的細(xì)胞形態(tài)

在37℃，感染復(fù)數(shù)(moi＝0.1)下，使人肺上皮細(xì)胞(a549)溶解于pbs/ba[0.2％胎牛血清白蛋白，1mmmgcl2，0.9mmcacl2,100u/ml盤(pán)尼西林，0.1mg/ml鏈霉素]感染流感病毒a/波多黎各/8/34(h1n1)。培養(yǎng)30分鐘后，吸入病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞，并在50mmlg-asa或溶劑對(duì)照存在下為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌sh1000(moi＝0.1)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/lhepes]。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用抗生素[dmem，10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶，20分鐘]處理細(xì)胞以移除細(xì)胞外細(xì)菌。另外進(jìn)行pbs清洗后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含50mmlg-asa或溶劑的dmem/inv。37℃下培養(yǎng)8小時(shí)后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

圖22：nfκb抑制劑lg-asa降低流感病毒效價(jià)和金黃色葡萄球菌負(fù)荷

在37℃，感染復(fù)數(shù)(moi＝0.1)下，使人肺上皮細(xì)胞(a549)溶解于pbs/ba[0.2％胎牛血清白蛋白，1mmmgcl2，0.9mmcacl2,100u/ml盤(pán)尼西林，0.1mg/ml鏈霉素]感染流感病毒a/波多黎各/8/34(h1n1)(a-h)。培養(yǎng)30分鐘后，吸入所述病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞，并在5mmlg-asa或溶劑對(duì)照存在下為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含金黃色葡萄球菌sh1000(moi＝50)(a，b)，(moi＝0.01)(c-d)，金黃色葡萄球菌6850(moi＝50)(e,f)，(moi＝0.1)(g,f)的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/ihepes]。細(xì)菌感染后3小時(shí)，用抗生素[dmem，10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶，20分鐘]處理細(xì)胞以移除細(xì)胞外細(xì)菌。另外進(jìn)行pbs清洗后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含5mmlg-asa或溶劑的dmem/inv。37℃下培養(yǎng)8小時(shí)(a，b，e，f)或18小時(shí)(c，d，g，h)后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)噬斑試驗(yàn)來(lái)測(cè)定iav效價(jià)(a，c，e，g)。通過(guò)低滲休克溶解細(xì)胞，并通過(guò)在瓊脂板上連續(xù)稀釋來(lái)確定內(nèi)化細(xì)菌的數(shù)量(b，d，f，h)。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣本三組(a-h)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用雙側(cè)單樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖23：nfκb抑制劑lg-asa降低流感病毒效價(jià)和金黃色葡萄球菌負(fù)荷

本圖以不同的方式顯示圖22所得到的數(shù)據(jù)。特別地，任意設(shè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)未經(jīng)處理的對(duì)照組為100％，然后計(jì)算平均值。用雙側(cè)單樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖24：nfκb信號(hào)傳導(dǎo)的抑制引起細(xì)菌內(nèi)化降低

用5mm(a-d)和10mm(c,d)lg-asa預(yù)培養(yǎng)人肺上皮細(xì)胞(a549)4小時(shí)，然后在含有或不含溶解于dmem/inv[1％人血清蛋白，25nmol/lhepes]的指定數(shù)量的lg-asa下，使其感染金黃色葡萄球菌6850(moi＝50)30-120分鐘(a，b)，感染usa300(moi＝5)(c，d)120分鐘。感染30-120分鐘后，引入抗生素清洗[dmem，10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶，20分鐘]以移除非內(nèi)化細(xì)菌。用pbs清洗細(xì)胞三次并通過(guò)低滲休克溶解細(xì)胞。通過(guò)在瓊脂板上連續(xù)稀釋來(lái)確定內(nèi)化細(xì)菌的數(shù)量(a-d)。數(shù)據(jù)(a，c)代表兩種生物樣本三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。在圖24b，d中，任意設(shè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)所述未經(jīng)處理的對(duì)照組為100％，然后計(jì)算所述平均值。用雙側(cè)單樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖25：nfκb信號(hào)傳導(dǎo)的刺激引起細(xì)菌內(nèi)化的增強(qiáng)

用5mmlg-asa和2.5ng/mltnf-α預(yù)培養(yǎng)人肺上皮細(xì)胞(a549)4小時(shí)，然后在含有或不含溶解于dmem/inv[1％人血清蛋白，25nmol/lhepes]的指定數(shù)量的lg-asa和tnf-α下，使其感染(a)金黃色葡萄球菌6850或(b)金黃色葡萄球菌usa300(moi＝5)120分鐘(a)。感染后120分鐘，引入抗生素清洗[dmem，10％fbs，2μg/ml溶葡球菌酶，20分鐘]以移除非內(nèi)化細(xì)菌。用pbs清洗細(xì)胞三次并通過(guò)低滲休克溶解細(xì)胞。感染后120分鐘，通過(guò)在瓊脂板上連續(xù)稀釋來(lái)確定內(nèi)化細(xì)菌的數(shù)量(a)。(a)數(shù)據(jù)代表兩種生物樣本四組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。先通過(guò)單因素方差分析隨后通過(guò)多項(xiàng)比較試驗(yàn)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。(b)數(shù)據(jù)代表三種生物樣本三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，通過(guò)任意設(shè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)未經(jīng)處理的對(duì)照組為100％，然后計(jì)算平均值。

圖26：用lg-asa治療iav/金黃色葡萄球菌合并感染小鼠引起存活率增強(qiáng)、體重?fù)p失降低

(a)使balb/c小鼠(每組4只)在第0天感染50pfu的流感病毒a/波多黎各/8/34。流感病毒感染后第六天，再使小鼠感染10⁸cfu金黃色葡萄球菌6850。流感病毒感染后第七天，每天通過(guò)吸入劑用lg-asa(1m，10分鐘)治療合并感染小鼠一次。觀察14天的存活率。

而(4/4)(黑線)未經(jīng)處理的合并感染小鼠在合并感染后一天死亡，(2/4)lg-asa治療的合并感染小鼠存活(灰線)。

(b)描繪兩組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。使9周大的balb/c小鼠(每組4只)在第0天上午感染50pfu的流感病毒a/波多黎各/8/34(用異氟烷麻醉)。病毒感染后6小時(shí)，給小鼠稱(chēng)重并在吸入室中用霧化水或1mlg-asa治療小鼠10分鐘。在第一天、第二天和第三天與第0天的同一時(shí)間進(jìn)行該治療。在第三天上午，在異氟烷麻醉下，使小鼠感染5*10⁷cfu的金黃色釀膿葡萄球菌6850。在第四天最后一次給小鼠稱(chēng)重。用曼-惠特尼u檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

發(fā)明詳述

以下描述包括可用于理解本發(fā)明的信息。并不承認(rèn)本文所提供的的任何信息為現(xiàn)有技術(shù)或與請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明相關(guān)，或者任何明確或隱含引用的出版物為現(xiàn)有技術(shù)。

如上所述，本發(fā)明涉及用在用于預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑。

此外，本發(fā)明涉及用在用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑。

本文所用“mek抑制劑”也可以被指定為絲裂原活化蛋白激酶(mapk)激酶抑制劑。眾所周知，在mapk路徑中，mapk激酶激酶(mapkkk)激活mapk激酶(mapkk)，其轉(zhuǎn)而激活mapk，mapk將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至例如轉(zhuǎn)錄因子或其他激酶或效應(yīng)器/信號(hào)轉(zhuǎn)換蛋白；例如，參見(jiàn)fremin和meloche的圖1(fremin和meloche(2010),j.hematol.oncol.11；3:8)。本發(fā)明的mek抑制劑優(yōu)選抑制主體，諸如本文所述的哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)的mek1/2。然而，可能本發(fā)明的mek抑制劑不僅抑制mek，優(yōu)選抑制mek1/2，而且還抑制其上游激酶(即mapkkk)，進(jìn)而發(fā)揮雙重抑制作用。不受理論的束縛，plx-4032可以是這樣一種雙重抑制劑。因此，在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的mek抑制劑可以是一種雙重抑制劑，進(jìn)而抑制mek，優(yōu)選抑制mek1/2及其對(duì)應(yīng)的上游mapkkk。mek1/2是ras/raf路徑中的mapkk，ras/raf充當(dāng)mapkkk，erk1/2充當(dāng)mapk。

mek抑制劑可以是小分子、大分子、肽、寡核苷酸等等。所述mek抑制劑可以是蛋白質(zhì)或其片段或核酸分子。所述術(shù)語(yǔ)mek抑制劑還包括所述mek抑制劑的藥學(xué)上可接受的鹽。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定一種化合物是否是mek抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑選自表1所列的化合物/抑制劑。

本發(fā)明的mek抑制劑優(yōu)選地選自u(píng)0126、plx-4032、azd6244、azd8330、as-703026、gsk-1120212、rdea-119、ro-5126766、ro-4987655、ci-1040、pd-0325901、gdc-0973、tak-733、pd98059、pd184352arry-438162和pf-3644022，優(yōu)選地為azd8330、gsk-1120212、u0126、gdc-0973、ci-1040、pd0325901、arry-438162、pf-3644022和azd6244，最優(yōu)選地為u0126、ci-1040、gdc-0973(考比替尼)、azd8330、gsk-1120212，最優(yōu)選為u0126、gdc-0973、ci-1040、azd8330和gsk-1120212。

這些抑制劑中的一些在下表中做了進(jìn)一步描述。

表1：mek抑制劑

還優(yōu)選地選自plx-4032、azd6244、azd8330、gdc-0973、rdea119、gsk1120212、ro51267766、ro4987655、tak-733和as703026。更優(yōu)選地選自azd6244、azd8330、gsk1120212和plx-4032或者選自pd-0325901、azd-6244、azd-8330和rdea-119。這些mek抑制劑為本領(lǐng)域?yàn)楣娝?，例如，如?所述(fremin和meloche(2010),j.hematol.oncol.11；3:8)。

也能夠從arthur和ley(2013)先天免疫中的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinasesininnateimmunity)，naturereviewsimmunology13,679–692(2013)中獲得這些抑制劑的更多信息。

的確，如所附實(shí)施例所示，本文所述的mek抑制劑u0126和ci-1040在合并感染以及單獨(dú)細(xì)菌感染情況下表現(xiàn)出一定的效果。

本發(fā)明還提供了用在用于預(yù)防和/或治療合并感染或細(xì)菌感染的方法中的p38抑制劑。“p38map激酶抑制劑”為本領(lǐng)域所知。所述術(shù)語(yǔ)“p38抑制劑”、“p38激酶抑制劑”和“p38map激酶抑制劑”在本文中可交換使用。在本發(fā)明的上下文中，p38map激酶抑制劑抑制p38map激酶。優(yōu)選地，p38map激酶抑制劑抑制p38map激酶的一種亞型，優(yōu)選地抑制p38map激酶的四種亞型(α、β、γ或δ)中的一種，其中優(yōu)選地抑制α亞型，更優(yōu)選地抑制p38map激酶的兩種亞型的任意組合，更加優(yōu)選地抑制p38map激酶的三種亞型的任意組合，最優(yōu)選地抑制p38map激酶的全部亞型或p38map激酶的α、β、γ和δ亞型。在一些實(shí)施方案中，所述p38map激酶抑制劑抑制參與炎性疾病、自身免疫性疾病、破壞性骨疾病、增生性疾病、傳染性疾病、病毒性疾病或神經(jīng)退行性疾病的p38的亞型。據(jù)報(bào)道，所述p38map激酶的α亞型參與炎癥、增殖、分化和細(xì)胞凋亡，然而，p38β、p38δ和p38γ的生物功能尚未被完全理解。因此，本文優(yōu)選p38map激酶抑制劑抑制α亞型。

所述p38map激酶抑制劑可以是小分子、大分子、肽、寡核苷酸等等。所述p38map激酶可以是蛋白質(zhì)或其片段或者核酸分子。術(shù)語(yǔ)p38抑制劑還包括p38抑制劑的藥學(xué)上可接受的鹽。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定一種化合物是否是p38抑制劑。

本領(lǐng)域內(nèi)有很多p38抑制劑的例子。美國(guó)專(zhuān)利5,965,583、6,040,320、6,147,096、6,214,830、6,469,174、6,521,655公開(kāi)了作為p38抑制劑的化合物。美國(guó)專(zhuān)利6,410,540、6,476,031和6,448,257也公開(kāi)了作為p38抑制劑的化合物。類(lèi)似地，美國(guó)專(zhuān)利6,410,540、6,479,507和6,509,361公開(kāi)了被稱(chēng)為p38抑制劑的化合物。美國(guó)公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)20020198214和20020132843公開(kāi)了被稱(chēng)為p38抑制劑的化合物。另外的p38map激酶抑制劑是birb796bs(1-(5-叔丁基-2-p-甲苯基-2h-吡唑-3-基)-3-[4-(2-嗎啉-4-基-乙氧基)-萘-1-基]-脲)；進(jìn)一步的p38map激酶抑制劑參見(jiàn)branger(2002),j.immunol.168:4070-4077或us6,319,921。

其他的p38map激酶抑制劑是amg548(amgen)、birb796(boehringeringelheim)、vx702(vertex/kissei)、scio469、scio323(sciosinc.)、sb681323(glaxosmithkline)、ph-797804(pfizer)和org-48762-0(organonnv)；例如，參見(jiàn)lee和dominguez在currmedchem.2005；12(25):2979-2994中以及dominguez在curropindrugdiscovdevel.2005jul；8(4):421-430中所述的。

根據(jù)本發(fā)明，所述抑制劑可以表現(xiàn)出對(duì)p38map激酶上游或下游或者直接對(duì)p38map激酶的調(diào)節(jié)作用，其中優(yōu)選后一種作用方式。調(diào)節(jié)p38map激酶活性的抑制劑的例子包括可降低p38map激酶的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯、可減少或抑制p38map激酶的翻譯后修飾和/或細(xì)胞運(yùn)輸，或者可縮短p38map激酶的半衰期的抑制劑。所述抑制劑還可以與p38map激酶可逆或不可逆結(jié)合，抑制其活化作用，使其酶活性失活，否則會(huì)干擾其與下游底物的相互作用。

p38map激酶的四種亞型具有高水平的序列同源性。p38map激酶的α和β亞型緊密相關(guān)，而γ和δ亞型更相異?？紤]到高度的結(jié)構(gòu)相似性，具有抑制p38map激酶的一種亞型的某種化合物通常能抑制所述map激酶的其他亞型也就不足為奇了。因此，在一些實(shí)施方案中，對(duì)p38map激酶的α亞型特異性的p38map激酶抑制劑具有至少三類(lèi)結(jié)構(gòu)特征，其理論上允許亞型特異性抑制。

能夠通過(guò)多種方法確定候選的p38map激酶抑制劑的選擇性結(jié)合。p38map激酶的各種亞型的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域所知。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易地復(fù)制和表達(dá)激酶的各種亞型，將其純化，并進(jìn)行與候選化合物進(jìn)行結(jié)合研究以確定亞型結(jié)合特征。對(duì)p38map激酶的α亞型進(jìn)行了該系列實(shí)驗(yàn)并由美國(guó)專(zhuān)利6,617,324b1提供。

mihara(2008),br.j.pharmacol.154(1):153-164中描述了另一種酶選擇性試驗(yàn)。在本文的一些實(shí)施方案中，p38map激酶抑制劑抑制p38map激酶四種亞型中的一種，更優(yōu)選地，其抑制p38map激酶的兩種亞型的任意組合，更優(yōu)選地，其抑制p38map激酶的三種亞型的任意組合，例如p38-α(mapk14)、-β(mapk11)、-γ(mapk12或erk6)?？蛇x擇的，但是也是優(yōu)選的，其抑制p38map激酶的全部四種亞型。

在一個(gè)實(shí)施方案中，p38抑制劑選自表2(圖8)所列的抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，p38抑制劑選自sb202190、ly2228820、cay10571、sb203580、tie2激酶抑制劑、2-(4-氯苯基)-4-(氟苯基)-5-吡啶-4-基-1,2-二氫吡唑基-3-酮、cgh2466、sb220025、抗生素llz1640-2、tak715、sb202190鹽酸鹽、skf86002、amg548、cmpd-1、eo1428、jx401、ml3403、rwj67657、sb202190、sb203580、sb203580鹽酸鹽、sb239063、scio469、sx011、tak715、pamapimod、losmapimod(gw856553)、dilmapimod(sb681323)、vx702、vx745、doramapimod(birb796)、bms-582949、arry-797、ph797804、scio-469，優(yōu)選vx-702、sb202190、pamapimod、losmapimod(gw856553)、dilmapimod(sb681323)、doramapimod(birb796)、bms-582949、arry-797、ph797804和scio-469。

也能夠從arthur和ley(2013)先天免疫中的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinasesininnateimmunity)，naturereviewsimmunology13,679–692(2013)中獲得這些抑制劑的更多信息。

除了mek抑制劑和p38抑制劑，本發(fā)明還涉及用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染或細(xì)菌感染的方法中的nfκb(nfkb/nfkappab)抑制劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定一種化合物是否是nfκb抑制劑。

nfκb(活化的b細(xì)胞的核因子κ-輕鏈增強(qiáng)子)是一種控制dna轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)復(fù)合體。幾乎在所有動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型中都可發(fā)現(xiàn)nf-κb，并且其參與細(xì)胞對(duì)諸如壓力、細(xì)胞因子、自由基、紫外線照射、氧化的ldl和細(xì)菌或病毒抗原的刺激的反應(yīng)。脊椎動(dòng)物nfκb轉(zhuǎn)錄復(fù)合體可以是任意由子單位p50(nfκb1)、p52(nfκb2)、c-rel、rela(p65)和relb形成的各種同源或異源二聚體(gilmoretd.(2006)oncogene25:6680–6684)。這些復(fù)合體結(jié)合至稱(chēng)之為κb位點(diǎn)的dna調(diào)節(jié)位點(diǎn)，通常激活特定的靶基因表達(dá)。在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中，nf-κb二聚物通過(guò)與任何幾種iκb抑制劑蛋白(iκbα，β，ε，γ,p105和p100)聯(lián)合而以非活化形式位于細(xì)胞質(zhì)中。為對(duì)大量刺激物響應(yīng)，iκb迅速被磷酸化、泛素化并被蛋白酶體降解。然后釋放的nf-κb二聚物轉(zhuǎn)位至其能夠調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)的細(xì)胞核。

iκb的磷酸化和降解對(duì)nfκb復(fù)合體的調(diào)節(jié)很重要，該nfκb復(fù)合體由包含兩種激酶子單位ikkα和ikkβ及其有關(guān)的叫做nemo(akaikkγ)的支架式調(diào)節(jié)蛋白的所述iκb激酶(ikk)復(fù)合物調(diào)節(jié)的(gilmore和herscovich(2006)，nf-κb信號(hào)：785和計(jì)數(shù)癌基因的抑制劑，25,6887–6899)。尤其是如本發(fā)明的實(shí)施例3中所示，nf-κb信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)細(xì)菌(比如金黃色葡萄球菌)向細(xì)胞的內(nèi)化作用也很重要。

根據(jù)本發(fā)明，抑制劑可以表現(xiàn)出對(duì)nfκb的上游或下游或者直接對(duì)nfκb的調(diào)節(jié)作用，其中優(yōu)選所述后一種作用模式。調(diào)節(jié)nfκb活性的抑制劑的例子包括可以降低nfκb轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，或可以縮短nfκb半衰期的抑制劑。所述抑制劑還可以可逆或不可逆地結(jié)合nfκb、抑制其活化作用、使其喪失活性，否則會(huì)干擾其與下游目標(biāo)，諸如目標(biāo)基因的相互作用。nfκb抑制劑還可以抑制蛋白激酶，諸如通過(guò)如ikk抑制來(lái)抑制ikba磷酸化的分子。具有這樣活性的化合物為sc-893、bms-345541，其可以作為參照化合物。nfκb抑制劑還可以抑制蛋白磷酸酶或抑制蛋白酶體或泛素化。同樣可作為參照化合物的這樣的nfκb抑制劑的例子包括蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶抑制劑、硼酸鹽、硼替佐米、npi-0052?？蛇x擇地，nfκb抑制劑可以阻止nfκb的核轉(zhuǎn)位或其結(jié)合至dna。同樣可作為參照化合物的這樣的抑制劑的例子包括sn50、脫氫環(huán)氧甲基醌霉素和nfκb誘騙寡核苷酸(decoyodns)?？梢詮膅upta等人(2010)(gupta等人，(2010)通過(guò)小分子作為治療策略抑制nfκb的活化作用，biochimbiophysacta，1799(10-12):775-787)獲取nfκb抑制劑的進(jìn)一步信息。

nfκb抑制劑可以是小分子、大分子、肽、寡核苷酸等等。nfκb抑制劑可以是蛋白質(zhì)或其片段或核酸分子。術(shù)語(yǔ)nfκb抑制劑還包括nfκb抑制劑的藥學(xué)上可接受的鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，nfκb抑制劑選自圖9和圖10中的表3和表4所列的抑制劑/分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，nfκb抑制劑選自圖9中的表3所列的抑制劑/分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，nfκb抑制劑選自圖10中的表4所列的抑制劑/分子。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，nfκb抑制劑選自lasag、sc75741(及其衍生物)、mg132、tpca-1、pctc、imd0354、木犀草素、咖啡酸苯乙酯、豆蔻明、pf184、ikk16、sc514、醉茄素a、牛蒡甙元、bay11-7085、psi、pr39、ro106-9920、bay11-7821、ml-130、南蛇藤醇、丹參酮iia、hu211、膠霉毒素、cid2858522、和厚樸酚、穿心蓮內(nèi)酯、10z-hymenialdisine、achp、扁塑藤素、柳氮磺胺吡啶、ml120b二鹽酸鹽、氨來(lái)占諾、9-甲基鏈霉戊二酰亞胺、n-硬脂酰植物鞘氨醇、2-(1,8-萘-2-基)-苯酚、5-氨基水楊酸、bay11-7085、3,4-二羥基肉桂酸乙酯、helanalin、nf-κb活化抑制劑ii、jsh-23、糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)劑、cpda、ppm-18、阿司匹林(asa)、吡咯烷二硫代羧酸銨鹽、(r)-mg132、sc75741(及其衍生物)、楝酰胺、水楊酸鈉、qnz、ps-1145、cay10512、硼替佐米、雙水楊酯、白藜蘆醇、lasag、脫氧精胍菌素、蘇靈大、薩力多胺、agro-100、chs828和/或姜黃素，優(yōu)選為硼替佐米、姜黃素、雙水楊酯、白藜蘆醇、水楊酸鈉、lasag、asa、脫氧精胍菌素、蘇靈大、薩力多胺、agro-100、chs828，更優(yōu)選為sc75741(及其衍生物)、asa和lasag，最優(yōu)選為lasag。

除sc75741外，術(shù)語(yǔ)“sc75741”或“sc75741(及其衍生物)”為sc75741的衍生物也被本發(fā)明涵蓋。

通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何發(fā)現(xiàn)一種化合物是否是mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑。關(guān)于如何確定一種化合物是否是mek抑制劑和/或p38抑制劑的進(jìn)一步的例子是分離所述mek和/或p38nfκb蛋白。所述蛋白可以從以下細(xì)胞中分離出來(lái)：mek和/或p38蛋白自然表達(dá)的細(xì)胞，或其已經(jīng)通過(guò)寡核苷酸轉(zhuǎn)染或以直接引導(dǎo)mek和/或p38蛋白表達(dá)的病毒感染過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞。此外，mek和/或p38蛋白還可以重組表達(dá)。在分離所述蛋白時(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠在存在或不存在潛在的mek和/或p38抑制劑的情況下測(cè)量激酶的活性。如果激酶在存在所述抑制劑下的活性低于不存在所述抑制劑下的活性，該抑制劑則分別為mek和/或p38。

如果直接作用在mek和/或p38上，抑制劑應(yīng)表現(xiàn)出約5μm或更少，優(yōu)選500nm或更少，更優(yōu)選100nm或更少的ic50值。在相關(guān)的實(shí)施方案中，相對(duì)于p38-α亞型而言，所述抑制劑應(yīng)表現(xiàn)出優(yōu)選比用相同或可比較的試驗(yàn)對(duì)相同抑制劑對(duì)抗其他p38map激酶亞型測(cè)試所觀察到的結(jié)果至少少10倍的ic50值。應(yīng)當(dāng)注意的是，ic50值為檢測(cè)依賴(lài)性，根據(jù)測(cè)定的不同可以改變。考慮化合物的ic50值的相對(duì)關(guān)系比考慮其確切的值本身更加重要。

ic50是抑制酶的活性達(dá)到不存在抑制劑時(shí)所測(cè)量的活性的50％時(shí)的化合物的濃度。

使用與對(duì)照組相比引起50％降低的抑制劑的濃度計(jì)算ic50值。ic50值為檢測(cè)依賴(lài)性，根據(jù)測(cè)定的不同可以改變。因此，ic50值是相對(duì)值。賦予特定抑制劑的值將有一般可比性并非基于絕對(duì)的基礎(chǔ)。

將包含map和/或mapk激酶并用潛在的活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理的樣品或試樣與不含所述抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照組樣品進(jìn)行比較以觀察抑制程度。能夠賦予對(duì)照組樣品(未經(jīng)抑制劑處理)100％的相對(duì)map和/或mapk激酶活性值。當(dāng)所述map和/或mapk激酶活性值相對(duì)于所述對(duì)照組大約為80％，可選地為50％或25-0％時(shí)，會(huì)抑制map和/或mapk激酶。當(dāng)所述map和/或mapk激酶活性值相對(duì)于所述對(duì)照組為110％，可選地為150％，可選地為200-500％或1000-3000％更高時(shí)，會(huì)活化map和/或mapk激酶的活化。本發(fā)明的示例性的map激酶結(jié)合活性試驗(yàn)為：map和/或mapk激酶配體污點(diǎn)試驗(yàn)(aymerich等人,investopthalmolvissci.42:3287-93,2001)；map和/或mapk激酶親和柱層析試驗(yàn)(alberdi等人,jbiolchem.274:31605-12,1999)和map和/或mapk激酶配體結(jié)合試驗(yàn)(alberdi等人，jbiolchem.274:31605-12,1999)。各自整體通過(guò)引用方式并入。

所述抑制劑的選擇性還可以通過(guò)mihara(2008),br.j.pharmacol.154(1):153-164中所述的激酶選擇性試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量

關(guān)于nfκb抑制劑，人們能夠測(cè)量例如未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞中nfκb的靶基因的基因產(chǎn)品(蛋白質(zhì))，并將這些靶基因產(chǎn)品的表達(dá)與已經(jīng)以nfκb抑制劑處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。一些靶基因在oeckinghaus和ghosh(2009)的轉(zhuǎn)錄因子的nf-κb家族及其調(diào)節(jié)(thenf-κbfamilyoftranscriptionfactorsanditsregulation)，coldspringharbperspectbiol.oct2009；1(4):a000034中有論述。

當(dāng)用抑制劑處理細(xì)胞時(shí)，表達(dá)水平降低。其他的策略可以是通過(guò)免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)ikba的降解以及p-p65積累和nfκb的核轉(zhuǎn)位。還可以通過(guò)使用電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(emsa)分析與經(jīng)抑制劑處理的細(xì)胞相比，nfκb與未經(jīng)處理的細(xì)胞的dna的相互作用。

還可以通過(guò)與參照化合物比較作用來(lái)分析分子的抑制性質(zhì)。本文所提及的“參照化合物”意指可用作確定一種分子是否具有mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑性質(zhì)的陽(yáng)性對(duì)照。因此，本文所列的任何所述抑制劑也可以用作這樣的參照化合物?？赡艿臏y(cè)試可以是這樣的測(cè)試：用參照化合物處理例如受到刺激以活化所述mek、p38和或nfκb路徑的細(xì)胞，并與感興趣的化合物平行地放置在不同的孔中。

本發(fā)明所述的抑制劑可用在用于治療和/或預(yù)防的方法中。因此，所述術(shù)語(yǔ)“治療(treating)”或“治療(treatment)”包括為了減輕或改善病癥的目的向患有包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的患者優(yōu)選地以藥劑的形式施用mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑。類(lèi)似地，包括為了減輕或改善病癥的目的向患有細(xì)菌感染的患者優(yōu)選地以藥劑的形式施用mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑。

此外，本文所用術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”是指以防止疾病為目的的任何醫(yī)療或公共健康程序。本文所用術(shù)語(yǔ)“預(yù)防(prevent)”、“預(yù)防(prevention)”和“預(yù)防(preventing)”是指降低獲得或發(fā)展給定病癥的風(fēng)險(xiǎn)，給定病癥即包含流感病毒感染和細(xì)菌感染的合并感染或者單獨(dú)的細(xì)菌感染。“預(yù)防”還意指降低或抑制患者的包含流感病毒感染和細(xì)菌感染的合并感染或者單獨(dú)的細(xì)菌感染的再發(fā)生。

本發(fā)明所述抑制劑在治療合并感染中有效。本文所用“合并感染”包含流感病毒感染和細(xì)菌感染。這樣的合并感染可通過(guò)宿主(例如患者和/或單個(gè)細(xì)胞)同時(shí)感染細(xì)菌和流感病毒而發(fā)生。還可以是宿主(例如患者和/或單個(gè)細(xì)胞)同時(shí)感染一種或多種病毒顆粒和一種或多種細(xì)菌。然而，這樣的合并感染還可以連續(xù)發(fā)生。在這種情形下，是宿主和/或細(xì)胞首先感染一種或多種病毒顆粒，然后所述相同的宿主和/或細(xì)胞感染一種或多種細(xì)菌，反之亦然。所述兩種感染之間的時(shí)間段可以是最多14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小時(shí)、6小時(shí)、3小時(shí)、1.5小時(shí)或最少30分鐘。

這樣的情況還可以是重復(fù)感染，其中二次感染疊加在較早的感染上，特別是通過(guò)對(duì)首次感染所用的治療劑具有耐受性的外源或內(nèi)源的不同菌劑。

在所述合并感染中，所述流感病毒感染可由流感a病毒或流感b病毒介導(dǎo)，優(yōu)選地所述流感a病毒為h1n1、h2n2、h3n2、h6n1、h7n7、h7n9、h9n2h10n7、h10n8或h5n1。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感a病毒為h1n1。在其他實(shí)施方案中，所述流感a病毒為h3n2、h5n1和h7n9。在另外的實(shí)施方案中，所述流感a病毒為h3n2、h5n1、h1n1和h7n9。

本發(fā)明還涉及“細(xì)菌感染”，其可在上述合并感染的環(huán)境下發(fā)生或可在僅有的感染存在于宿主(例如患者和/或細(xì)胞)中時(shí)發(fā)生。所述細(xì)菌感染可由任何細(xì)菌介導(dǎo)，優(yōu)選地由以下細(xì)菌介導(dǎo)：葡萄球菌科、鏈球菌科、人菌科、假單胞菌科、衣原體科、支原體科、腸桿菌科、假單胞菌目和/或巴斯德氏菌科。

在其他實(shí)施方案中，所述細(xì)菌感染由以下細(xì)菌介導(dǎo)：葡萄球菌，優(yōu)選為金黃色釀膿葡萄球菌；甲氧西林敏感性和抗甲氧西林耐受性金黃色葡萄球菌；殺白細(xì)胞素(pvl)-表達(dá)金黃色釀膿葡萄球菌和/或鏈球菌，優(yōu)選為緩癥鏈球菌、釀膿鏈球菌或肺炎鏈球菌；軍團(tuán)菌，優(yōu)選為嗜肺軍團(tuán)菌；假單胞菌，優(yōu)選為綠膿桿菌；衣原體，優(yōu)選為肺炎衣原體；支原體，優(yōu)選為肺炎支原體；克雷伯氏菌，優(yōu)選為肺炎克雷伯氏菌；莫拉克斯氏菌，優(yōu)選為卡他莫拉菌和/或嗜血桿菌，優(yōu)選為流感嗜血桿菌。優(yōu)選地，所述細(xì)菌選自金黃色釀膿葡萄球菌、肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌。最優(yōu)選地，所述細(xì)菌為金黃色釀膿葡萄球菌。

本發(fā)明還涵蓋抑制劑能夠彼此聯(lián)合。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，mek抑制劑與另一種mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑聯(lián)合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，p38抑制劑與另一種p38抑制劑、mek抑制劑和/或nfκb抑制劑聯(lián)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，nfκb抑制劑與另一種nfκb抑制劑、p38抑制劑和/或mek抑制劑聯(lián)合。關(guān)于上述，術(shù)語(yǔ)“另一種抑制劑”用于闡明例如一種mek抑制劑還可與另外一種mek抑制劑聯(lián)合，而這兩種mek抑制劑是不同的。例如，mek抑制劑ci-1040可與mek抑制劑gdc-0973聯(lián)合。這同樣適用于p38和nfκb抑制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑與一種或多種針對(duì)流感病毒和細(xì)菌的另外的抑制劑同時(shí)施用、在前施用或在后施用。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明的合并感染的方法中，其中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑與針對(duì)所述流感病毒和/或所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑聯(lián)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑與針對(duì)所述流感病毒和/或所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑同時(shí)施用、在前施用或在后施用。

通常，針對(duì)所述流感病毒的抑制劑是在流感治療中有效的任何抑制劑或藥劑。已知不同物質(zhì)對(duì)降低流感感染有效。其中例如神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑、針對(duì)離子通道蛋白(m)的化合物和針對(duì)聚合酶或通過(guò)干擾所述病毒聚合酶復(fù)合體、pb1、pb2、pa或np組分的內(nèi)切酶活動(dòng)的化合物。本發(fā)明還涵蓋了這些抑制劑藥學(xué)上可接受的鹽。

“神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑”是一種針對(duì)流感病毒的抗病毒藥，其通過(guò)封鎖病毒神經(jīng)氨酸苷酶蛋白的功能，進(jìn)而防止病毒結(jié)合到其意欲感染的細(xì)胞上和/或者防止病毒通過(guò)在宿主細(xì)胞發(fā)芽而繁殖來(lái)發(fā)揮作用，這是因?yàn)樾律《静荒茉谄溥M(jìn)行復(fù)制的細(xì)胞中發(fā)芽成長(zhǎng)。優(yōu)選的神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑是奧司他韋、扎那米韋、帕拉米韋或這些物質(zhì)中任何一個(gè)的藥學(xué)上可接受的鹽，比如奧司他韋磷酸鹽、奧司他韋羧酸鹽等。最優(yōu)選的神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑為奧司他韋磷酸鹽、扎那米韋、奧司他韋或帕拉米韋。

針對(duì)離子通道蛋白(m2)的化合物例如金剛烷胺和/或金剛烷乙胺，而針對(duì)聚合酶或通過(guò)干擾所述病毒聚合酶復(fù)合體、pb1、pb2、pa或np組分的內(nèi)切酶活動(dòng)的化合物例如np阻斷劑nucleozin或聚合酶抑制劑t-705。

可選地或另外地，mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑可與一種或多種針對(duì)細(xì)菌的抑制劑聯(lián)合。針對(duì)所述細(xì)菌的抑制劑可以是對(duì)降低細(xì)菌感染有效的任何抑制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的優(yōu)選的抑制劑為抗生素。可以從表5(圖11)獲得優(yōu)選的抗生素。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗生素選自表5(圖11)所列的抗生素。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗生素選自表5(圖11)所列類(lèi)別的抗生素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗生素選自表5(圖11)所列通用名的抗生素。更優(yōu)選地，所述抗生素選自慶大霉素、利福平、lysosthaphin、紅霉素、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素、替考拉寧、盤(pán)尼西林和苯甲異惡唑青霉素。

可經(jīng)本發(fā)明所述抑制劑或抑制劑的組合治療的“主體”優(yōu)選為脊椎動(dòng)物。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“主體”意指需要進(jìn)行合并感染或單一細(xì)菌感染治療的個(gè)體。優(yōu)選地，所述主體是患有合并感染或單一細(xì)菌感染或存在感染風(fēng)險(xiǎn)的患者。優(yōu)選地，所述患者為脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于家畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、寵物、靈長(zhǎng)類(lèi)、小鼠和大鼠。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物為人、狗、貓、母牛、豬、老鼠、大鼠等等，特別優(yōu)選為人類(lèi)。在一些實(shí)施方案中，所述主體為人類(lèi)患者，其可選地為1歲以上14歲以下；50-65歲之間或者大于65歲。在其他實(shí)施方案中，所述主體為人類(lèi)患者，其選自至少50歲的患者，處在長(zhǎng)期護(hù)理設(shè)施下的患者，有肺或心血管慢性疾病的患者，在過(guò)去一年中因?yàn)槁孕玛惔x疾病、腎功能不全、血紅蛋白病或免疫抑制需要定期醫(yī)療隨訪或住院治療的患者，小于14歲的患者，正在接受長(zhǎng)期阿司匹林治療的6-18個(gè)月大的患者，以及在流感季將處于妊娠期第二個(gè)或第三個(gè)三個(gè)月期間的女性。

在本發(fā)明所述的方法中，所述mek抑制劑、p38抑制劑或nfκb抑制劑以及針對(duì)所述流感病毒的所述抑制劑和針對(duì)所述細(xì)菌的所述抑制劑可以口服施用、靜脈注射、胸腔內(nèi)給藥、肌內(nèi)注射、局部給藥或吸入給藥。優(yōu)選地，所述mek抑制劑通過(guò)鼻吸入或口服施用。

本發(fā)明還涵蓋不同的組合物。本發(fā)明涉及包含用在用于預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑的組合物。同樣地，本發(fā)明涉及包含用在用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑的組合物。本發(fā)明還提供包含用在用于預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑以及針對(duì)所述流感病毒和/或所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑的組合物。此外，本發(fā)明涉及包含用在用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的方法中的mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑以及針對(duì)所述流感病毒和/或所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑的組合物。

包含所述mek抑制劑，p38抑制劑和/或nfκb抑制劑以及另外的針對(duì)所述細(xì)菌的一種或多種抑制劑和/或針對(duì)所述流感病毒的一種或多種抑制劑的所述組合物可以是一種藥物組合物。優(yōu)選地，這樣的組合物進(jìn)一步包含載體，優(yōu)選地為藥學(xué)上可接受的載體。所述組合物可以是口服施用的混懸劑或片劑形式；鼻用噴霧劑，無(wú)菌注射劑(靜脈注射、胸腔內(nèi)給藥、肌內(nèi)注射)，例如無(wú)菌注射水性或油性混懸劑或栓劑。在以混懸劑口服施用時(shí)，根據(jù)藥劑領(lǐng)域可用的技術(shù)制備這些組合物并且可以包含用于擴(kuò)容的微晶纖維素、作為助懸劑的海藻酸或海藻酸鈉、作為黏度增強(qiáng)劑的甲基纖維素以及本領(lǐng)域所知的甜味劑/調(diào)味劑。作為直接釋放的片劑，這些組合物可以包含微晶纖維素、磷酸氫鈣、淀粉、硬脂酸鎂和乳糖和/或其他本領(lǐng)域所知的賦形劑、粘結(jié)劑、填充劑、崩解劑、稀釋劑和潤(rùn)滑劑。

所述可注射溶液劑或混懸劑可以根據(jù)已知技術(shù)使用適宜的無(wú)毒、不經(jīng)腸道可接受的諸如甘露醇、1,3-丁二醇、水、格林氏溶液或等滲氯化鈉溶液的稀釋劑或溶劑，或者適宜的諸如包括合成的單甘脂或雙甘酯的無(wú)菌溫和不揮發(fā)油以及包括油酸的脂肪酸的分散劑或潤(rùn)濕劑或混懸劑進(jìn)行制備。

所述抑制劑優(yōu)選地以治療有效量進(jìn)行施用。用于本發(fā)明的并且包含mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfkb抑制劑以及可選地一種或多種針對(duì)流感病毒的抑制劑和/或一種或多種針對(duì)細(xì)菌的抑制劑的藥物組合物施用于哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)患者。合適的哺乳動(dòng)物的實(shí)例，包括但不限于，小鼠、大鼠、奶牛、山羊、綿羊、豬、狗(dog)、貓、馬、豚鼠、犬(canine)、倉(cāng)鼠、貂、海豹、鯨、駱駝、黑猩猩、獼猴和人，優(yōu)選為人。合適的鳥(niǎo)的例子，包括但不限于，火雞、雞、鵝、鴨子、水鴨、野鴨、八哥、北方針尾鴨、鷗、天鵝、珍珠雞或水鳥(niǎo)，僅舉幾例。人類(lèi)患者是本發(fā)明的具體的實(shí)施方式。

各活性化合物/抑制劑的“治療有效量”隨著但不限于以下因素而變化：所用化合物的活性、該活性化合物在患者體內(nèi)的穩(wěn)定性、待緩解的癥狀的嚴(yán)重程度、被治療患者的總重量、給藥途徑、該活性化合物在體內(nèi)吸收、分布、排泄的容易程度、被治療患者的年齡和敏感性、不良反應(yīng)等，這些對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言都是顯而易見(jiàn)的。給藥量可以隨時(shí)間依照這些因素進(jìn)行調(diào)整。

本文所述抑制劑、方法及其用途既適用于人類(lèi)治療又適用于獸醫(yī)應(yīng)用。本文所述化合物，特別是具有理想的治療活性的mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfkb抑制劑以及可選地一種或多種針對(duì)流感病毒的抑制劑和/或一種或多種針對(duì)細(xì)菌的抑制劑可以如本文所述在生理上可接受的載體中向患者施用。根據(jù)引入方式，可以通過(guò)如下所述的多種方式制備所述化合物。制劑中治療活性化合物的濃度可在約0.1-100wt％之間變化。試劑可單獨(dú)施用或與其他治療劑聯(lián)合施用。

本發(fā)明方法中使用的藥物化合物能夠以任何合適的單位劑量形式給藥。合適的口服劑型可以是片劑、膠囊劑、混懸液、糖漿劑、口香糖、薄片(wafer)、酏劑等。該口服藥物組合物中可以包括藥學(xué)上可接受的載體，如粘結(jié)劑、賦形劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑和矯味劑。如果需要，還可以包括常規(guī)的改良特殊形式的味道、顏色及形狀的制劑。

對(duì)于可注射類(lèi)制劑，所述藥物組合物可以是凍干粉混合有適當(dāng)?shù)馁x形劑置于適宜的藥瓶或管中。臨床使用前，該藥物可通過(guò)將凍干粉溶解在適宜的溶劑體系中進(jìn)行重建，以形成適宜靜脈注射或肌內(nèi)注射的組合物。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的mek抑制劑以及選自?shī)W司他韋、奧司他韋磷酸鹽、扎那米韋和帕拉米韋的治療有效量的神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，如前所述，所述組合物可以是可口服給藥的形式(如片劑、膠囊劑或糖漿劑)，包含治療有效量(如0.1mg-2000mg、0.1mg-1000mg、0.1mg-500mg、0.1mg-200mg、30mg-300mg、0.1mg-75mg、0.1mg-30mg)的mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfkb抑制劑以及治療有效量(如0.1mg-2000mg、0.1mg-1000mg、0.1mg-500mg、0.1mg-200mg、30mg-300mg、0.1mg-75mg、0.1mg-30mg)的神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明所述合并感染的方法中，其中，與接觸前的體外測(cè)試系統(tǒng)相比，所述mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑在與體外測(cè)試系統(tǒng)接觸時(shí)降低所述病毒和細(xì)菌感染，其中所述試驗(yàn)系統(tǒng)包含感染

a)流感病毒，和

b)細(xì)菌

的培養(yǎng)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑用在用于預(yù)防和/或治療本發(fā)明所述細(xì)菌感染的方法中，其中，與接觸前的所述體外測(cè)試系統(tǒng)相比，所述mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑在與體外測(cè)試系統(tǒng)接觸時(shí)降低所述細(xì)菌感染，其中所述試驗(yàn)系統(tǒng)包含感染細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

因此，本發(fā)明還涉及一種體外測(cè)試系統(tǒng)，其中所述試驗(yàn)系統(tǒng)包含感染

a)流感病毒，和

b)細(xì)菌

的培養(yǎng)細(xì)胞。沿著這樣的思路，本發(fā)明還提供一種體外測(cè)試系統(tǒng)，其中所述試驗(yàn)系統(tǒng)包含感染細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

在所述體外測(cè)試系統(tǒng)包括病毒感染和細(xì)菌感染的情況下，同樣，這些感染可先后發(fā)生或同時(shí)發(fā)生。

“培養(yǎng)細(xì)胞”(culturedcell)或“培養(yǎng)細(xì)胞“(culturedcells)是不存在于其自然環(huán)境(例如在植物或動(dòng)物體內(nèi))中的細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞可以是包含與其自然環(huán)境分離的細(xì)胞或細(xì)胞系的原代細(xì)胞培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)細(xì)胞為人肺上皮細(xì)胞。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)細(xì)胞以0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml諸如dmem的培養(yǎng)基中約1x10⁵、2x10⁵、3x10⁵、4x10⁵、5x10⁵、6x10⁵、7x10⁵、8x10⁵、9x10⁵、10x10⁵、11x10⁵、優(yōu)選地8x10⁵個(gè)細(xì)胞的密度接種。最優(yōu)選地以2mldmem中8x10⁵個(gè)細(xì)胞的密度接種。

使這樣的培養(yǎng)細(xì)胞感染病毒和細(xì)菌或者在其他實(shí)施方案中使其只感染細(xì)菌。如上所述，合并感染可以先后或同時(shí)發(fā)生。例如，可以首先使所述培養(yǎng)細(xì)胞感染所述流感病毒，30分鐘后使其感染細(xì)菌。3小時(shí)后，還可以另外向培養(yǎng)基中加入抗生素以移除細(xì)胞外細(xì)菌。在這樣的情況下，要對(duì)所述抗生素再次進(jìn)行清洗。在其他實(shí)施方案中，使所述細(xì)胞只感染細(xì)菌。

本文所述術(shù)語(yǔ)“接觸”是指使包含流感病毒和細(xì)菌的細(xì)胞與mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑在空間上極為貼近。例如，這可以意指經(jīng)由注射器將抑制劑應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞處于其中的培養(yǎng)基。

然后，一旦接觸，如果所述抑制劑具有活性，那么所述病毒感染以及所述細(xì)菌感染都會(huì)被降低。在一些實(shí)施方案中，在不存在病毒感染時(shí)本發(fā)明所述抑制劑用于降低細(xì)菌感染。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒感染的降低是指血小板形成單位(pfu)/ml的降低，所述細(xì)菌感染的降低是指菌落形成單位(cfu)/ml的降低。所述血小板形成單位(pfu)/ml是指測(cè)量的每單位體積的能夠形成血小板的顆粒(諸如病毒顆粒)的數(shù)量。它是一種功能性的測(cè)量而非顆粒絕對(duì)數(shù)量的測(cè)量：有缺陷的或未能感染其靶細(xì)胞的病毒顆粒不會(huì)產(chǎn)生血小板因而也不會(huì)計(jì)數(shù)。例如，濃度為1000pfu/μl的流感病毒溶液表明1μl的所述溶液包含足以在細(xì)胞單分子層產(chǎn)生1000個(gè)傳染性血小板的病毒顆粒。在本發(fā)明的情況下，與用本發(fā)明所述的抑制劑處理前的培養(yǎng)基相比，用抑制劑處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)顯示出經(jīng)處理后培養(yǎng)基中血小板形成單位的數(shù)量降低。

通過(guò)以下方式分析可能的“血小板形成單位(pfu)/ml的降低”。首先，通過(guò)例如從培養(yǎng)皿吸入一些細(xì)胞并平板培養(yǎng)以計(jì)算形成的細(xì)菌血小板的數(shù)量來(lái)分析合并感染了流感病毒和細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生血小板形成單位(pfu)/ml的能力。然后將這一結(jié)果與應(yīng)用了抑制劑后的相同培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)生的血小板形成單位(pfu)/ml的數(shù)量進(jìn)行比較。如果與應(yīng)用所述抑制劑之前產(chǎn)生的數(shù)量相比，在用抑制劑處理后所述血小板形成單位(pfu)/ml的數(shù)量降低，那么血小板形成單位(pfu)/ml降低。

“菌落形成單位(cfu)/ml”估算樣本中的活菌數(shù)量。存在不同的方法。例如，為了產(chǎn)生菌落形成單位，將樣本(例如，少體積的培養(yǎng)細(xì)胞)沿營(yíng)養(yǎng)瓊脂板的表面鋪開(kāi)并允許其在孵化前干燥以便計(jì)數(shù)?；罹唤缍樵谑芸貤l件下經(jīng)由二分裂進(jìn)行繁殖的能力。當(dāng)數(shù)菌落時(shí)不確定菌落是源自一個(gè)細(xì)胞或是1000個(gè)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)基中菌落的可見(jiàn)外觀要求顯著增長(zhǎng)。因此，對(duì)于液體，結(jié)果報(bào)告為cfu/ml(每毫升菌落形成單位)，對(duì)于固體，結(jié)果報(bào)告為cfu/g(每克菌落形成單位)，從而反映這種不確定性(而不是細(xì)胞數(shù)/ml或細(xì)胞數(shù)/g)。

以下面的方式分析“菌落形成單位(cfu)/ml”。首先，通過(guò)例如從培養(yǎng)皿吸入一些細(xì)胞并平板培養(yǎng)以便計(jì)數(shù)來(lái)分析合并感染了流感病毒和細(xì)菌的所述培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生菌落形成單位(cfu)/ml的能力。然后將這一結(jié)果與應(yīng)用所述抑制劑后的相同培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)生的菌落形成單位(cfu)/ml的數(shù)量進(jìn)行比較。如果與應(yīng)用所述抑制劑之前相比，在用抑制劑處理后所述菌落形成單位(cfu)/ml的數(shù)量降低，那么存在降低。

通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉這些分析細(xì)菌和病毒感染的周知技術(shù)。文獻(xiàn)中進(jìn)一步描述了怎樣能夠測(cè)量所述血小板形成單位(pfu)/ml和所述菌落形成單位(cfu)/ml(tuchscherr,l.等人(2011)，金黃色葡萄球菌菌相轉(zhuǎn)換：一種逃離宿主免疫反應(yīng)并建立慢性感染的有效的細(xì)菌策略，embo分子醫(yī)學(xué)3,129-141和hrincius，e.r等人(2010)，crk銜接蛋白表達(dá)對(duì)于禽流感a病毒的有效復(fù)制是必需的并且會(huì)控制jnk介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，細(xì)胞微生物學(xué)12,831-843)。

此外，本發(fā)明涉及以下項(xiàng)目：

第1項(xiàng)、本發(fā)明還提供所述的體外測(cè)試系統(tǒng)用于確定抑制劑有效降低包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒感染的降低是指血小板形成單位(pfu)/ml的降低，所述細(xì)菌感染的降低是指菌落形成單位(cfu)/ml的降低。

第2項(xiàng)、此外，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)有效預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的分子的方法，包含將感興趣的化合物與本發(fā)明所述的體外測(cè)試系統(tǒng)接觸，其中，與接觸前的體外測(cè)試系統(tǒng)相比，所述感興趣的化合物同時(shí)降低所述病毒和細(xì)菌感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒感染的降低是指血小板形成單位(pfu)/ml的降低，所述細(xì)菌感染的降低是指菌落形成單位(cfu)/ml的降低。

第3項(xiàng)、此外，本發(fā)明涉及所述體外測(cè)試系統(tǒng)用于確定抑制劑有效降低細(xì)菌感染的用途。

第4項(xiàng)、另外，本發(fā)明涉及所述體外測(cè)試系統(tǒng)用于檢查先天宿主細(xì)胞反應(yīng)的用途，其任選地包括檢查信號(hào)傳導(dǎo)水平、產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)、細(xì)胞凋亡和壞死的誘導(dǎo)和/或調(diào)解健康和疾病的氧化還原止血作用。

第5項(xiàng)、本發(fā)明還提供一種檢測(cè)有效預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的分子的方法，包含將感興趣的化合物與本發(fā)明所述的體外測(cè)試系統(tǒng)接觸，其中，與接觸前的體外測(cè)試系統(tǒng)相比，所述感興趣的化合物降低了所述細(xì)菌感染。

第6項(xiàng)、本發(fā)明進(jìn)一步涉及感染流感病毒和細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

第7項(xiàng)、還提供了感染細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。

第8項(xiàng)、本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)防和/或治療主體中包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的方法，包含向所述主體施用治療有效量的本發(fā)明所述的mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑或本發(fā)明所述的藥物組合物。

第9項(xiàng)、本發(fā)明還提供所述的mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑或所述藥物組合物用于制備藥劑的用途。

第10項(xiàng)、此外，本發(fā)明涉及所述的mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑或所述藥物組合物用于預(yù)防和/或治療包含細(xì)菌感染和流感病毒感染的合并感染的用途。

第11項(xiàng)、類(lèi)似地，本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防和/或治療主體中細(xì)菌感染的方法，包含向所述主體施用治療有效量的本發(fā)明所述的mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑或本發(fā)明所述的藥物組合物。

第12項(xiàng)、此外，本發(fā)明涉及所述的mek抑制劑、p38抑制劑和/或nfκb抑制劑或所述藥物組合物用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的用途。

***

須注意，如本文所用的單數(shù)形式“一種”、“一個(gè)”和“所述/該”包括復(fù)數(shù)指代，除非文中另有明確聲明。因此，例如，提及“一種試劑”包括一種或多種這樣的不同試劑，而提及“該方法”包括指代本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的可以被修改或替代本文所述方法的等同步驟和方法。

本文所引用的所有出版物和專(zhuān)利都將通過(guò)整體引用并入本文。當(dāng)通過(guò)引用并入的材料與本說(shuō)明書(shū)存在矛盾或不一致時(shí)，本說(shuō)明書(shū)將優(yōu)先于任何此類(lèi)材料

除非另有聲明，否則一系列元素之前的術(shù)語(yǔ)“至少”理解為指代該系列中的每個(gè)元素。本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就將得知或能夠確定本文所述本發(fā)明的具體實(shí)施方式的許多等同物。這樣的等同物意在被本發(fā)明涵蓋。

縱觀本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及接下來(lái)的權(quán)利要求書(shū)，除非語(yǔ)境需要，詞語(yǔ)“包括(comprise)”及其變形“包括(comprises)”、“包括(comprising)”都將被理解為意指內(nèi)含所述整體或步驟或整體或步驟的組，但是不排除任何其他整體或步驟或整體或步驟的組。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”可以用“包含(containing)”替換，或者有時(shí)可以用“具有(having)”替換。

本文所使用的“由…組成(consistingof)”排除了未在權(quán)利要求部分(claimelement)中指定的任何元素、步驟或成分。本文所使用的“基本上由…組成(consistingessentiallyof)”未排除對(duì)權(quán)利要求的基本特征和新穎性特征沒(méi)有實(shí)質(zhì)影響的材料或步驟。在本文的各實(shí)施方式中，“包括(comprising)”、“由…組成(consistingof)”、“基本上由…組成(consistingessentiallyof)”中的任何一個(gè)可用另外兩個(gè)術(shù)語(yǔ)中的一個(gè)替換。

貫穿本說(shuō)明書(shū)的文本引用了若干文件。本文中所引用的每個(gè)文件(包括所有的專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、科學(xué)出版物、生產(chǎn)廠家的說(shuō)明書(shū)、使用指南等)，無(wú)論上文還是下文，都特此通過(guò)引用整體并入本文。本文中的任何表述都不能解釋為承認(rèn)本發(fā)明無(wú)權(quán)優(yōu)先于在先發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明。然而這些實(shí)施例不能解讀為限制本發(fā)明的范圍。所述實(shí)施例限于說(shuō)明性目的，本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求書(shū)限定。

實(shí)施例1

在過(guò)去幾年中，對(duì)除了接種疫苗或用常規(guī)的抗病毒藥物對(duì)抗iv(神經(jīng)氨酸苷酶和m2阻斷劑)以及用常規(guī)的抗生素對(duì)抗金黃色葡萄球菌以外的額外的和替代的治療策略的需求穩(wěn)步增加。同時(shí)，一些用于抗病毒干預(yù)的細(xì)胞因素已被認(rèn)定為潛在靶點(diǎn)。完全相反，關(guān)于在細(xì)菌感染期間細(xì)胞因子的路徑，以及其特別是通過(guò)降低細(xì)菌數(shù)量和/或啟動(dòng)加快細(xì)胞因子表達(dá)用于抗菌治療的靶點(diǎn)的知識(shí)很少被理解，甚至更多是在iv合并感染出現(xiàn)的情況下。

我們建立了一種感染方案，其允許確定在iv和金黃色葡萄球菌合并感染時(shí)存在或不存在潛在抗病毒藥物下：(1)子代病毒效價(jià)和(2)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌效價(jià)以及(3)宿主防御機(jī)制的變化。在最初的方法中，我們研究了與溶劑對(duì)照相比較，在單一感染或合并感染情況下，mek抑制劑(u0126＝50μm)、p38抑制劑(sb202190＝10μm)和nfκb抑制劑(lasag＝5mm)對(duì)抗iv和金黃色葡萄球菌的作用。作為對(duì)照，用病毒神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑奧司他韋(達(dá)菲)(2μm)與hepes相比較。對(duì)于病毒感染，我們使用人流感病毒a/波多黎各(puertorico)/8134(h1n1)或禽流感病毒a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)(bratislava)/79(h7n7)，而對(duì)于細(xì)菌感染，我們使用金黃色葡萄球菌菌株6850。感染過(guò)程(圖1)：

在6孔培養(yǎng)板(8x10⁵個(gè)細(xì)胞/孔)中，將人肺上皮細(xì)胞接種于2mldmem[10％fcs]中。接種16-20小時(shí)后，沖洗細(xì)胞，并在37℃、指定的感染復(fù)數(shù)下用pbs/ba[0.2％胎牛血清白蛋白(bsa)、1mmmgcl2、0.9mmcacl2、100u/ml盤(pán)尼西林、0.1mg/ml鏈霉素](每6個(gè)孔500μl)或包含所述病毒的pbs/ba進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30分鐘后，吸入所述病毒稀釋物，用pbs清洗細(xì)胞，并在存在或不存在所述測(cè)試化合物情況下在所指定的moi下為細(xì)胞補(bǔ)充含有或不含細(xì)菌的侵染培養(yǎng)基dmem/inv[1％人血清白蛋白，25nmol/lhepes](每6孔2ml)。細(xì)菌感染3小時(shí)后，用抗生素處理細(xì)胞以移除細(xì)胞外細(xì)菌。因此，用pbs清洗細(xì)胞并隨后在37℃下用mem/inv抗生素[2μg/ml溶葡球菌酶(sigma)](1ml每6孔)培養(yǎng)20分鐘。用pbs另外再清洗之后，為細(xì)胞補(bǔ)充包含所述測(cè)試物質(zhì)的dmem/inv，并在37℃下培養(yǎng)指定次數(shù)。a/波多黎各(puertorico)/8/34dmem/inv再另外補(bǔ)充0.333μg/ml胰蛋白酶(英杰公司)。如(hrincius等人，2010,tuchscherr等人，2011)所述測(cè)定iv效價(jià)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。

iv效價(jià)描繪為血小板形成單位(pfu)/ml，金黃色葡萄球菌效價(jià)描繪為菌落形成單位(cfu)/ml。數(shù)據(jù)代表兩種生物樣品二至三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用雙側(cè)雙樣本t檢驗(yàn)(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

在合并感染情況下，由于先天性免疫反應(yīng)以及自噬和細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制的變化，金黃色葡萄球菌的存在會(huì)影響iv復(fù)制，而iv的存在會(huì)影響所述金黃色葡萄球菌的細(xì)胞內(nèi)數(shù)量。然而，正如所料，我們觀察到u0126(圖2、3)、sb202190(圖4)和lg-asa(圖5)對(duì)iv復(fù)制的抑制作用。有趣的是，在存在金黃色葡萄球菌下經(jīng)這些抑制劑處理，也降低了病毒效價(jià)。而且令我們驚喜的是，與存在或不存在iv無(wú)關(guān)，在存在u0126、sb202190或lg-asa時(shí)，金黃色葡萄球菌的細(xì)胞內(nèi)數(shù)量降低。另外一個(gè)令人驚訝的觀察與u0126(50μm)存在下的細(xì)菌復(fù)制有關(guān)。在37℃下，于不含活細(xì)胞的dmem/inv中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌時(shí)，細(xì)菌效價(jià)已經(jīng)降低，但降低到與細(xì)胞感染期間相同的程度，這表明細(xì)菌對(duì)細(xì)胞因素的依賴(lài)(圖2e)。

作為對(duì)照，我們研究了應(yīng)用所述病毒神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑奧司他韋(達(dá)菲)(圖6)時(shí)的病毒效價(jià)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。盡管在缺少或存在金黃色葡萄球菌情況下，病毒效價(jià)顯著降低，但是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量增加。

該結(jié)果表明針對(duì)細(xì)胞因子的物質(zhì)而非對(duì)抗病原體本身的物質(zhì)作為對(duì)抗iv和金黃色葡萄球菌的合并感染的抗感染藥物的巨大潛能。

實(shí)施例2

在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，研究了在單一感染或合并感染情況下與溶劑對(duì)照相比較，mek抑制劑u0126、ci-1040和考比替尼(gdc-0973)對(duì)抗流感a病毒(iav)和金黃色葡萄球菌6850感染的作用。

合并感染過(guò)程描繪為圖12。為檢驗(yàn)我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中人肺上皮細(xì)胞的生存能力，用光學(xué)顯微鏡觀察感染18小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)(圖13)，這時(shí)確定病原體負(fù)荷(圖14)。

如圖13所示，以金黃色葡萄球菌6850(6850)、流感病毒株a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)(bratislava)/79(h7n7)(fpv)或a/威斯康星州(wisconsin)/67/2005(h3n2)單一感染以及合并感染會(huì)引起輕微但可清晰檢測(cè)的細(xì)胞損傷。在u0126(50μm)存在下，細(xì)胞層出現(xiàn)更少的損傷。

在人肺上皮細(xì)胞中確定單一感染或合并感染情況下，與溶劑對(duì)照相比較，mek抑制劑u0126(50μm)對(duì)抗流感病毒復(fù)制a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)(bratislava)/79(h7n7)(fpv)或a/威斯康星州(wisconsin)/67/2005(h3n2)的作用(圖14)。

mek/erk信號(hào)傳導(dǎo)的抑制導(dǎo)致單一感染情況下經(jīng)iav亞型h7n7和h3n2感染的病毒效價(jià)顯著降低(圖14)。在存在u0126的合并感染情況下，病毒效價(jià)在合并感染的情況下也降低，在h7n7/金黃色葡萄球菌合并感染的細(xì)胞中達(dá)到顯著水平(圖14)。

此外，分析了mek抑制劑u0126(50μm)對(duì)抗內(nèi)化金黃色葡萄球菌6850的作用(圖15a，c)。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，在存在抑制劑時(shí)細(xì)菌效價(jià)僅略有降低。

為進(jìn)一步研究通常情況下u0126對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，向金黃色葡萄球菌6850的無(wú)細(xì)胞隔夜培養(yǎng)基補(bǔ)充不同數(shù)量的u0126(10μm和50μm)或溶劑(圖15b，d)。與溶劑對(duì)照相比，在u0126存在下細(xì)菌生長(zhǎng)以濃度依賴(lài)的方式被抑制(圖15b，d)。

由于促炎性細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)促成嚴(yán)重的炎癥和組織損傷，在存在或不存在u0126(50μm)的感染實(shí)驗(yàn)中通過(guò)qrt-pcr分析各自的趨化因子，諸如ccl3，也叫巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α(mip1α)，以及ccl5，也叫rantes的mrna合成(圖16a，b)。iav-誘導(dǎo)的ccl3mrna合成在存在金黃色葡萄球菌6850時(shí)增強(qiáng)而在存在u0126時(shí)降低。類(lèi)似地，iav-誘導(dǎo)的ccl5mrna合成在存在金黃色葡萄球菌6850時(shí)降低，在存在u0126時(shí)進(jìn)一步降低。

在蛋白質(zhì)印跡分析中，通過(guò)使用特異性磷酸化erk1/2抗體來(lái)驗(yàn)證u0126對(duì)mek/erk信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用(圖16c)。此外，在存在mek/erk信號(hào)傳導(dǎo)抑制情況下，觀察到病毒蛋白合成(pb1)降低。

為在體內(nèi)小鼠模型中驗(yàn)證u0126的抗病原體潛能。對(duì)感染流感病毒的小鼠不經(jīng)處理或每天用u0126處理并以金黃色葡萄球菌6850重復(fù)感染(圖17)。施用u0126導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)菌效價(jià)降低而與病毒效價(jià)無(wú)關(guān)。病毒效價(jià)沒(méi)有降低可以解釋為施用u0126較晚，當(dāng)時(shí)病毒效價(jià)已經(jīng)在感染過(guò)程中降低。前面的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，在流感病毒感染前給予，抑制劑具有更高的抑制作用。然而，在應(yīng)用u0126時(shí)，細(xì)菌效價(jià)顯著降低。

在其他方法中，在人肺上皮細(xì)胞中測(cè)定單一感染或合并感染情況下，與溶劑對(duì)照相比，mek抑制劑ci-1040(10μm)對(duì)抗流感病毒復(fù)制a/fpv/布拉迪斯拉發(fā)(bratislava)/79(h7n7)(fpv)或a/波多黎各(puertorico)/8/34(h1n1)的作用(圖18)。

通過(guò)ci-1040抑制mek/erk信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致單一感染和合并感染的情況下一旦感染iav亞型h7n7和h1n1會(huì)降低病毒效價(jià)(圖18)。

為進(jìn)一步研究通常情況下ci-1040對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，向金黃色葡萄球菌6850的無(wú)細(xì)胞隔夜培養(yǎng)基補(bǔ)充不同數(shù)量的ci-1040(1μm和10μm)或溶劑(圖19a，b)。與溶劑對(duì)照相比，在存在ci-1040下細(xì)菌生長(zhǎng)以濃度依賴(lài)的方式被輕微抑制(圖19a，b)。

為驗(yàn)證另一種mek抑制劑的抗病原體潛能，在體內(nèi)小鼠模型中測(cè)試考比替尼(cobimetinib)，對(duì)感染流感病毒的小鼠不經(jīng)處理或每天用考比替尼處理并以金黃色葡萄球菌6850重復(fù)感染(圖20)。施用考比替尼導(dǎo)致體內(nèi)病毒和細(xì)菌效價(jià)輕微但可清晰檢測(cè)的降低。由于最近已經(jīng)表明考比替尼的最大耐受劑量為30mg/kg/天。因此，通過(guò)使用比本實(shí)驗(yàn)所用的(10mg/kg/天)遠(yuǎn)低于最大耐受劑量的更高劑量可以改善抑制作用。

綜上所述，結(jié)果表明不同mek抑制劑作為潛在的抗-iav/金黃色葡萄球菌物質(zhì)。

實(shí)施例3

在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，研究了在單一感染或合并感染情況下nfκb-抑制劑lg-asa(lasag)對(duì)抗流感a病毒(iav)和金黃色葡萄球菌6850感染的作用。

合并感染描繪為圖21(上半部分)。為檢驗(yàn)人肺上皮細(xì)胞在缺少或存在lg-asa(5mm)下經(jīng)感染的生存能力，用光學(xué)顯微鏡觀察感染18小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)(圖21)。在缺少lg-asa的情況下(左面)，以iav和/或金黃色葡萄球菌感染時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而在存在lg-asa的情況下(右面)，細(xì)胞形態(tài)得到改善。

在人肺上皮細(xì)胞中確定單一感染或合并感染情況下(圖22/23)感染后8小時(shí)(圖22/23a，b，e，f)和18小時(shí)(圖22/23c，d，g，h)，nfκb-抑制劑lg-asa(5mm)對(duì)抗流感病毒復(fù)制a/波多黎各(puertorico)/8/34(h1n1)的作用。兩種不同的金黃色葡萄球菌株用于感染：(a)金黃色葡萄球菌sh1000(圖22/23a-d)和(b)金黃色葡萄球菌6850(圖22/23e-h)。

在存在lg-asa情況下，感染后8小時(shí)和18小時(shí)iav復(fù)制降低，而細(xì)菌效價(jià)的降低僅在感染后18小時(shí)可以看到。在圖22中，結(jié)果以線性標(biāo)度描繪。為使lg-asa的病原體抑制作用更加直觀，將三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的未經(jīng)處理的對(duì)照組人為設(shè)定為100％，并體現(xiàn)其平均值(圖23)。

由于在細(xì)菌感染期間直接加入lg-asa，這些結(jié)果表明對(duì)細(xì)菌內(nèi)化非常早的作用，其在持續(xù)釋放和新的細(xì)菌內(nèi)化過(guò)程中增強(qiáng)。

最近研究已經(jīng)表明，nfκb是單核細(xì)胞金黃色葡萄球菌的吞噬作用所必需的(zhu等人，2014；exp.cellres.1；327(2):256-63)?；谶@些發(fā)現(xiàn)以及我們自己的觀察，我們想得知lg-asa是否會(huì)阻止細(xì)菌的攝取。我們?cè)诩?xì)菌感染前4小時(shí)對(duì)人肺上皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理并在感染后高達(dá)2小時(shí)確定內(nèi)化細(xì)菌。為確保只檢測(cè)內(nèi)化細(xì)菌，在細(xì)胞溶解前通過(guò)抗生素清洗移除非內(nèi)化細(xì)菌。該數(shù)據(jù)表明金黃色葡萄球菌6850的時(shí)間依賴(lài)性攝取，其在存在lg-asa時(shí)被阻斷(圖24a，b)。進(jìn)一步顯示出lg-asa對(duì)細(xì)菌菌株金黃色葡萄球菌usa300的濃度依賴(lài)性抑制作用(圖24c,d)。為使lg-asa的病原體抑制作用更加直觀，這在圖24a，c中可見(jiàn)，將三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的未經(jīng)處理的對(duì)照組人為設(shè)定為100％，并體現(xiàn)其平均值(圖24b,d)。

為驗(yàn)證nfκb介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)金黃色葡萄球菌內(nèi)化的重要性，在細(xì)菌感染前4小時(shí)，通過(guò)tnf-α刺激來(lái)誘導(dǎo)nfκb。nfκb的激活導(dǎo)致金黃色葡萄球菌6850和金黃色葡萄球菌usa300的攝取增強(qiáng)。作為對(duì)照，同時(shí)通過(guò)lg-asa阻斷tnf-α誘發(fā)的激活，結(jié)果正如所料，其導(dǎo)致tnf-α所促進(jìn)的細(xì)菌攝取得到抑制(圖25)。

為驗(yàn)證體內(nèi)小鼠模型中l(wèi)g-asa的抗病原體潛能，對(duì)存在和缺少lg-asa情況下不同的合并感染設(shè)置進(jìn)行測(cè)試。

如圖26所見(jiàn)，用lg-asa處理iav/金黃色葡萄球菌合并感染的小鼠導(dǎo)致增強(qiáng)的存活率(圖26a)并降低的體重?fù)p失(圖26b)。

綜上所述，我們的結(jié)果表明，諸如lg-asa的nfκb抑制劑在體外和體內(nèi)作為抗-iav/金黃色葡萄球菌物質(zhì)。

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