本申請(qǐng)要求2014年2月26日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/944988號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其通過引用完整地并入本文。

背景技術(shù)：

本發(fā)明一般涉及ph的操控，更具體地涉及硝基苯甲醛或其類似物作為用于疾病狀態(tài)治療的用途。

癌癥被定義為涉及不受約束的細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移至全身、回避細(xì)胞凋亡的惡性疾病。由于其快速進(jìn)化的性質(zhì)，在不同癌癥中很少發(fā)現(xiàn)相似之處。目前，本研究旨在檢測(cè)和區(qū)分癌癥獨(dú)特的具體特性、行為和突變。當(dāng)前的癌癥治療包括化學(xué)療法、輻射和生物療法。經(jīng)典的癌癥療法為了有效治療經(jīng)常需要外科手術(shù)或療法的組合。當(dāng)前使用的大多數(shù)治療依賴于由輻射損傷抑制細(xì)胞分裂或激活細(xì)胞凋亡路徑。較新的治療策略集中于靶向不受約束的蛋白質(zhì)，例如乳腺癌細(xì)胞中的her-2。癌癥治療當(dāng)前方法的限制包括對(duì)健康組織的損傷，其在一些情況下可以導(dǎo)致dna損傷，即癌癥的已知起因。盡管已有新的治療方法論，但仍未報(bào)道過在速發(fā)的細(xì)胞死亡中的顯著變化。在治療中存活的癌細(xì)胞是癌癥復(fù)發(fā)的原因，其通常對(duì)治療更有攻擊性和更加耐受（mccarty和whitaker，alternativemedicinereview，2010，15(3):264-72）。盡管本領(lǐng)域中有很多進(jìn)步，癌癥死亡率依然高（americancancersociety，cancertreatmentandsurvivorshipfacts&figures2012-2013，2012）。其他癌癥療法的需要依然存在。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

某些實(shí)施方案涉及用于操控細(xì)胞中ph的光活化的化合物。在某些方面，光活化的化合物是2-硝基苯甲醛（nba）。nba可以用于引起靶細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡，即基于靶細(xì)胞凋亡的療法。靶細(xì)胞凋亡的療法提供了（i）在生物系統(tǒng)中光活化的化合物（例如，nba）的擴(kuò)散和毒性，（ii）病灶酸中毒的誘導(dǎo)，（iii）響應(yīng)突然酸中毒的細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)，（iv）生物系統(tǒng)的細(xì)胞或組織的靶向。

某些實(shí)施方案涉及經(jīng)由誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酸中毒而治療某些疾病的方法。在某些方面，該方法包括將對(duì)患者、組織或細(xì)胞施用nba；將靶組織或靶細(xì)胞暴露于光的某些波長使化合物光活化，導(dǎo)致氫離子的釋放和酸中毒、細(xì)胞凋亡、和/或細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。在某些方面，使用“閃光模式”提供暴露于光?？梢蕴峁┟}沖的光或閃爍的光。在某些方面，在1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次閃光中提供光。閃光可以持續(xù)10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒、100秒或更多秒，包括它們之間的所有值和范圍。在某些方面，提供的閃光體系有20秒、40秒、60秒、80秒或100秒的第一閃光；10秒、20秒、30秒、40秒、50秒或60秒的第二閃光；20秒、40秒、60秒、80秒、100秒的第三閃光。閃光之間的間隔可以是1分鐘、1.5分鐘、2分鐘、2.5分鐘、3分鐘、3.5分鐘、4分鐘或更多分鐘，包括它們之間的所有值和范圍。在某些實(shí)施方案中，每次閃光之間有約2分鐘間隔。在其他方面，閃光體系可以是第一60秒閃光，然后2分鐘間隔，第二30秒閃光，然后2分鐘間隔，第三60秒閃光（60-30-60）。在有效的時(shí)間間隔和曝露的任何組合下，可以利用曝光時(shí)間的范圍和各種光源的能量來誘導(dǎo)多種量級(jí)的細(xì)胞內(nèi)酸化。

在某些方面，光是紫外（uv）光。在其他方面，uv光會(huì)具有200nm至400nm的波長。在某些方面，光會(huì)具有350nm的波長。光源可以是激光光源或非激光光源。

在某些實(shí)施方案中，光活化的化合物被全身施用結(jié)合靶向的曝光。在其他方面，光活化的化合物被局部施用。在某些方面，使用針、內(nèi)鏡、插管、導(dǎo)管或其他適用于靶位點(diǎn)的醫(yī)療裝置施用光活化的化合物。在其他方面，如果靶組織是皮膚，將光活化的化合物局部施用。在某些方面，光活化的化合物是nba或其功能類似物。

nba是具有穿透細(xì)胞膜和細(xì)菌膜的高可能性的小分子。通過uv活化的nba釋放氫離子通過在真核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞廣泛的酸中毒來引起損傷。與傳統(tǒng)抗生素相比，損傷廣泛的蛋白質(zhì)和破壞病原體例如細(xì)菌中酶催化過程的能力減少了抗藥性演變的機(jī)會(huì)。在一些實(shí)施方案中，nba被施用，光釋放經(jīng)由phi的調(diào)節(jié)通過使酶和蛋白質(zhì)活化或失活來操控細(xì)胞內(nèi)過程的活性和隨后的細(xì)胞功能，其未必會(huì)引起nba被施用且光捕獲或光活化的細(xì)胞或組織死亡。在一些實(shí)施方案中，會(huì)利用從nba或相似化合物中釋放的h⁺以獲得期望的細(xì)胞內(nèi)ph，用于激活干細(xì)胞系的細(xì)胞去分化（gao等人，cellularphysiologyandbiochemistry，2014，33(1):185-94）。

在內(nèi)部組織和癌癥局部治療的一些實(shí)施方案中，使用外部光源或內(nèi)部光源可將光靶向特定組織。在某些方面，可以將光聚焦或靶向確定的位置。內(nèi)部光源可包括內(nèi)鏡、纖維光學(xué)光源、可植入的照明器、或化學(xué)發(fā)光源，例如魯米諾。

在其他實(shí)施方案中，可以使用光活化的化合物殺死或阻止微生物生長，所述微生物包括但不限于細(xì)菌、真菌和變形蟲。用本文所描述的化合物和方法殺死微生物的能力具有作為清洗劑或殺菌劑的應(yīng)用，特別在例如損傷護(hù)理、集體事故管理和自然災(zāi)害狀況的應(yīng)用中。光活化的化合物可以接觸待殺菌的表面或?qū)ο蟆Ｈ缓髮⒔?jīng)接觸的表面或?qū)ο蟊┞队诤线m光源，所述合適光源包含活化或釋放化合物的波長。

本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及納米顆粒的用途。這些納米顆?？稍谙⊥两饘贀诫s的上轉(zhuǎn)換核、親水性生物相容的聚合物、化合物（例如，nba）負(fù)載濃度和硅負(fù)載時(shí)間上變化。在某些方面，納米顆粒包含與顆粒（例如，kyb2f7核）相結(jié)合（直接或經(jīng)由連接體）的化合物（例如，nba）。在某些方面，具有kyb2f7核的顆粒顯示了非常高的體外功效，和最小的末梢損傷。納米顆?？梢杂芍睆酱蠹s為50nm至100nm的各種核構(gòu)建。可基于上轉(zhuǎn)換光譜選擇納米顆粒，對(duì)每個(gè)核收集上轉(zhuǎn)換光譜以測(cè)試展示最大釋放的最佳紫外發(fā)射。光子上轉(zhuǎn)換或上轉(zhuǎn)換（uc）是其中兩個(gè)或更多個(gè)光子的連續(xù)吸收導(dǎo)致光在比激發(fā)波長較短的波長發(fā)射的過程。其是一種反stokes類型的發(fā)射。一個(gè)實(shí)例是紅外光轉(zhuǎn)換為可見光。可以發(fā)生上轉(zhuǎn)換的材料通常包含d區(qū)元素和f區(qū)元素的離子（例如，ti²⁺、ni²⁺、mo³⁺、re⁴⁺和os⁴⁺）。在某些方面，使用透射電子顯微鏡將納米顆粒成像，并測(cè)試其zeta電勢(shì)。

各種生物相容的聚合物，例如peg、聚乙烯吡咯烷酮和光連接體可以與納米顆粒結(jié)合以使得nba和/或其他釋放化合物例如鈣的最有效的負(fù)載和細(xì)胞攝取?？梢允褂枚趸柙诳烧T導(dǎo)細(xì)胞毒性和/或降解的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)相互作用中保護(hù)聚合物。也可以使用二氧化硅以進(jìn)一步減少用于增加細(xì)胞攝取的納米顆粒上的zeta電勢(shì)?？梢詫?duì)納米顆粒應(yīng)用各種表面活性劑、抗體或配體用于靶治療。對(duì)于納米顆粒在平板條件和在活體動(dòng)物中長效的整體效力，可以在體內(nèi)和體外測(cè)試先前提到的所有組合。

還可以應(yīng)用將納米顆粒靶向特定組織或癌癥的其他方法。靶向可以通過基于被動(dòng)靶向的現(xiàn)象例如增強(qiáng)的滲透和保留作用，所述現(xiàn)象由滲漏的新生血管和較差的淋巴引流引起，這已被用于解釋為何與正常組織相比在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的大分子與納米顆粒處于較高比例。靶向還可以通過主動(dòng)靶向完成，其中配體與納米顆粒結(jié)合，其對(duì)應(yīng)于僅在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的分子或在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)更豐富的分子。

以局部方式有效靶向特定細(xì)胞的能力是有前途的治療傳遞機(jī)理。癌細(xì)胞可以抑制能夠靶向治療劑的局部傳遞的各種特質(zhì)。設(shè)計(jì)為靶向特定癌細(xì)胞的傳遞機(jī)理提供了減少通常與化學(xué)療法相關(guān)的毒副作用的能力（gabizon等人，advanceddrugdeliveryreviews2004，56:1177-92）。癌癥廣泛的可能靶點(diǎn)包括表面受體，例如人表皮生長因子受體2（emde等人，critrevoncolhematol.2012，84suppl1：e49-57；colombo等人，pharmacolres2010，62(2):150-65）、葉酸受體（salazar等人，cancermetastasisreviews，2007，26:141-52）和雌激素受體（kleinsmith等人，“cancerscreening，diagnosis，andtreatment”，principlesofcancerbiology.pearsoneducation,inc.,2006；218-224）。用于治療劑傳遞機(jī)理的其他可能靶點(diǎn)包括細(xì)胞因子（przepiorka等人，blood.2002，95(1):83-89；kleinsmith等人，“cancerscreening，diagnosis，andtreatment”，principlesofcancerbiology.pearsoneducation，inc.，2006；218-224）和生長因子（debruin等人，cancerdiscov.2014；wang等人，cardiovascres2013，98(1):56-63）。在表1可以發(fā)現(xiàn)可能靶點(diǎn)的更全面列表。

表1-用于癌癥治療的潛在靶點(diǎn)

在本申請(qǐng)全文中討論本發(fā)明的其他實(shí)施方案。關(guān)于一個(gè)方面所討論的任何實(shí)施方案也適用于其他實(shí)施方案，反之亦然。本文所討論的每個(gè)實(shí)施方案理解為適用于本發(fā)明所有方面的實(shí)施方案。預(yù)期本文所討論的任何實(shí)施方案可以關(guān)于任何裝置、方法或組合物實(shí)施，反之亦然。此外，本發(fā)明的體系、組合物和試劑盒可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。

當(dāng)在權(quán)利要求和/或說明書中與術(shù)語“包含”一起使用時(shí)，要素前面不使用數(shù)量詞可以表示“一個(gè)”，但是其也符合“一個(gè)或更多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多于一個(gè)”的意思。

在本申請(qǐng)全文中，術(shù)語“約”用于表明數(shù)值包括確定數(shù)值所使用的裝置或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)差。

權(quán)利要求中術(shù)語“或”的使用用于表示“和/或”，除非明確說明僅指選擇或選擇相互排斥，盡管公開支持指僅選擇和“和/或”的定義。

如本說明書和權(quán)利要求所使用的，詞語“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括性的或開放式的，并且不排除附加的、未列舉的要素或方法步驟。

本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面的詳細(xì)描述會(huì)變得明顯。然而，因?yàn)樵诒景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改通過該詳細(xì)說明對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)變得明顯，應(yīng)該理解盡管表明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，詳細(xì)說明和具體實(shí)施例僅通過舉例說明給出。

附圖說明

以下附圖形成本說明書的一部分，并被包含以進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通過參照一個(gè)或更多個(gè)這些附圖結(jié)合本文所提供的說明書實(shí)施方案的詳細(xì)說明可以更好地理解本發(fā)明。

圖1是示出2-硝基苯甲醛（nba）轉(zhuǎn)化為2-亞硝基苯甲酸的圖。該圖還示出隨著nba暴露于350nm波長的紫外（uv）光的反應(yīng)機(jī)理。暴露于350nm的uv光的nba導(dǎo)致釋放質(zhì)子，并形成2-亞硝基苯甲酸。

圖2是在mcf-7細(xì)胞中建議的正反饋路徑的圖，其在響應(yīng)于uv閃光的nba帶來了細(xì)胞內(nèi)h⁺顯著增加后發(fā)生。2.1示出將細(xì)胞內(nèi)nba暴露于350nm波長uv閃光模式，誘導(dǎo)在細(xì)胞內(nèi)空間中光子濃度的突然增加。該細(xì)胞內(nèi)酸化導(dǎo)致了伴隨而來的滲透水損失或細(xì)胞體積的變化。細(xì)胞內(nèi)h⁺的增加使nhe1活化以擠出作為鈉離子交換的光子（2.2a）。鈉離子充當(dāng)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，吸引水至細(xì)胞內(nèi)高鈉濃度的區(qū)域。水向高na⁺區(qū)域或擠出水的移動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞壁變形和/或細(xì)胞收縮。細(xì)胞壁的變形導(dǎo)致酪氨酸激酶janus激酶ii（jak-2）的磷酸化和活化（garnovskaya等人，jbiolchem.2003，278(19)：16908-15）（2.2b）。響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)h⁺增加的nhe1持續(xù)活化增加了細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞膜向外突出，或氣泡（2.3）。nhe1的活性試圖補(bǔ)償細(xì)胞內(nèi)的病灶酸中毒，引起細(xì)胞內(nèi)na⁺水平上升，進(jìn)一步促進(jìn)其中的液體靜壓力和氣泡隨后的大小。響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)na⁺濃度的局部增加，鈉鈣交換體1（ncx1）倒轉(zhuǎn)交換活性（yi等人，j.biolchem.2012，287(13):10316-24)，導(dǎo)致na⁺的流出和ca²⁺的流入）（2.4a）。磷酸化的jak-2和鈣調(diào)蛋白（cam；2.4b）的絡(luò)合增加了cam的jak-2依賴的酪氨酸磷酸化。通過ncx1的逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞內(nèi)ca²⁺的增加促進(jìn)ca²⁺與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合，而不依賴于cam的磷酸化狀態(tài)。磷酸化的cam（garnovskaya等人，jbiolchem.2003，278(19):16908-15）和鈣化的cam（等人，jbiolchem.2011，286(47):40954-61）都增加了nhe1的活性，同時(shí)cam的磷酸化和鈣化的組合（2.5）賦予了cam與nhe1的最高親和力（等人，jbiolchem.2011，286(47):40954-61）（2.6a），從而促進(jìn)了nhe1的最大活化（等人，jbiolchem.2011，286(47):40954-61）。盡管na⁺經(jīng)由ncx1而擠出，通過磷酸化-鈣化的cam促進(jìn)維持nhe1的活性，導(dǎo)致ca²⁺的進(jìn)一步進(jìn)入（2.6b和2.6c）。由nba閃光光解誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)h⁺的超生理增加導(dǎo)致細(xì)胞收縮，然后是nhe1、jak-2和ncx1的隨之活化；創(chuàng)建了正反饋的新路徑。這最終導(dǎo)致增加的細(xì)胞內(nèi)滲透壓、細(xì)胞氣泡、和細(xì)胞膜的潛在破裂。

圖3示出響應(yīng)于高鉀/尼日利亞菌素溶液的浴應(yīng)用的pc12細(xì)胞的dcfda熒光（rfl）比例。該溶液被滴定至ph值為2.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。該dcfda校正曲線允許dcfda輻射熒光比例向細(xì)胞內(nèi)ph光學(xué)轉(zhuǎn)化。

圖4示出pc12細(xì)胞（40×）的dceda輻射熒光（10μm）。這些細(xì)胞還負(fù)載nba（1mm）。

圖5示出隨時(shí)間響應(yīng)于從nba（1mm）中釋放h⁺后病灶的phi減小，pc12細(xì)胞中（n=362）的細(xì)胞凋亡百分比。每組符號(hào)代表在暴露于多種uv閃光模式后的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。這些數(shù)據(jù)證明了本發(fā)明誘導(dǎo)暴露于phi誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞在125分鐘內(nèi)76%至100%細(xì)胞凋亡的能力。

圖6示出隨時(shí)間響應(yīng)于從nba（1mm）中釋放h⁺后病灶的phi減小，pc12細(xì)胞中（n=118）的壞死百分比。將pc12細(xì)胞（n=68）單獨(dú)暴露于60-30-60的uv閃光模式，不負(fù)載nba。將pc12細(xì)胞（n=68）暴露于uv閃光范式，不負(fù)載nba。將pc12細(xì)胞（n=75）還單獨(dú)暴露于時(shí)間，無uv或nba。

圖7示出隨時(shí)間響應(yīng)于從nba（1mm）中釋放h⁺后病灶的phi減小以及本發(fā)明的單獨(dú)響應(yīng)于uv（n=76）、單獨(dú)響應(yīng)于nba（n=47）和單獨(dú)響應(yīng)于時(shí)間（n=71）的對(duì)照條件下，pc12細(xì)胞中（n=362）細(xì)胞凋亡百分比的總結(jié)。在經(jīng)nba-uv處理的細(xì)胞和三種對(duì)照條件之間有顯著區(qū)別。在單獨(dú)響應(yīng)于uv、單獨(dú)響應(yīng)于nba和單獨(dú)響應(yīng)于時(shí)間之間無顯著區(qū)別。

圖8示出由閃光光解之前（7.55phi）和之后（6.37phi）負(fù)載10μm的dcfda和1mm的nba的pc12細(xì)胞的phi的平均光學(xué)記錄。本發(fā)明能夠誘導(dǎo)響應(yīng)于nba閃光光解的顯著酸中毒（p＜0.01）。phi（δphi）中的平均變化是1.18個(gè)ph單位。這些數(shù)據(jù)支持了本發(fā)明1）光學(xué)記錄有效的phi測(cè)量，2）量化與從nba中釋放h⁺相關(guān)的phi減少的能力。

圖9示出在用60-30-60的uv閃光模式誘導(dǎo)酸中毒的實(shí)驗(yàn)過程中，以40倍放大率的pc12細(xì)胞（n=68）的微分干涉差（dic）顯微鏡的代表性圖片。（a）在閃光光解前的pc12細(xì)胞。（b）在閃光光解后的pc12細(xì)胞，顯示了細(xì)胞大小的下降和細(xì)胞形態(tài)的變化。（c）在uv閃光前的pc12細(xì)胞與描繪細(xì)胞形狀的輪廓的重疊圖。（d）在uv閃光和釋放h⁺后的pc12細(xì)胞與在（c）中所示的預(yù)處理細(xì)胞的輪廓的重疊圖。（e）在nba的閃光光解后大約2小時(shí)的pc12細(xì)胞的dic圖像與熒光細(xì)胞凋亡標(biāo)記膜聯(lián)蛋白v的重疊圖。

圖10示出在用60-30-60uv閃光模式誘導(dǎo)酸中毒的實(shí)驗(yàn)過程中，以40倍放大率的mcf-7細(xì)胞的比率計(jì)熒光顯微的代表性圖片。（a）在閃光光解前負(fù)載10μmdcfda的mcf-7細(xì)胞。（b）在閃光光解后的mcf-7細(xì)胞，顯示了細(xì)胞大小的下降和細(xì)胞形態(tài)的變化。（c）在uv閃光前的mcf-7細(xì)胞與描繪細(xì)胞形狀輪廓的重疊圖。（d）在uv閃光（時(shí)間=79分鐘）后的mcf-7細(xì)胞與在（c）中所示的預(yù)處理細(xì)胞輪廓的重疊圖。（e）在nba的閃光光解后大約2小時(shí)的mcf-7細(xì)胞的dic。比例尺表明熒光比例測(cè)量低于2.00。

圖11示出在用60-30-60的uv閃光模式的nba閃光光解后負(fù)載dcfda的mcf-7細(xì)胞的發(fā)射熒光。在時(shí)間=50分鐘時(shí)獲得圖像。箭頭顯示代表細(xì)胞死亡的一些軀體氣泡的出現(xiàn)。比例尺表明熒光比例測(cè)量低于2.00。

圖12示出了來自閃光光解之前（7.38phi）和之后（6.22phi）負(fù)載10μmdcfda和1mmnba的mcf-7細(xì)胞（n=76）的phi的平均光學(xué)記錄。本發(fā)明能夠誘導(dǎo)響應(yīng)nba閃光光解的顯著酸中毒（p＜0.01）。phi（δphi）的平均變化是0.97個(gè)ph單位。mcf-7細(xì)胞的初始phi與pc12細(xì)胞的phi并非顯著不同（參見圖8）。此外，在mcf-7細(xì)胞中得到的酸中毒量級(jí)（0.97個(gè)ph單位）與在pc12細(xì)胞中得到的phi量級(jí)（1.18個(gè)ph單位）并非顯著不同。

圖13示出通過起泡或膜聯(lián)蛋白v熒光、條件表明的mcf-7細(xì)胞死亡的平均百分比。將mcf-7細(xì)胞（n=262）用1mmnba負(fù)載然后暴露于60-30-60的uv閃光模式。作為單獨(dú)對(duì)照，將mcf-7細(xì)胞單獨(dú)暴露于60-30-60的uv閃光模式（n=112）、單獨(dú)暴露于nba（n=47）或單獨(dú)暴露于時(shí)間（n=20）。線性回歸分析表明用nba和uv光處理的mcf-7細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡比本發(fā)明的對(duì)照顯著更高。

圖14示出了聚乙二醇化（pegylated）、用nba摻雜然后在介孔二氧化硅中涂覆的的kyb2f7和nayf4核納米顆粒的示意圖（a）。圖中的表包含每種顆粒的主要特性。（b）聚乙二醇化然后用nba摻雜的kyb2f7和nayf4核納米顆粒的示意圖。表包含每種顆粒的主要特性。

圖15示出隨時(shí)間響應(yīng)與nba閃光光解的pc12細(xì)胞（n=22）的平均phi的光學(xué)記錄。在每個(gè)向下箭頭處細(xì)胞接受60-30-60uv閃光模式。每次閃光后平均phi下降分別為0.72、0.36、0.36。

圖16示出隨時(shí)間響應(yīng)于nba閃光光解的mcf-7細(xì)胞（n=13）的平均phi的光學(xué)記錄。在每個(gè)向下箭頭處細(xì)胞接受60-30-60uv閃光模式。每次閃光后平均phi下降分別為0.68、0.35、0.59。

圖17示出隨時(shí)間響應(yīng)于kyb2f7上轉(zhuǎn)換納米顆粒體外活化的mcf-7乳腺癌細(xì)胞死亡的百分比。在通過980nm光光活化前用納米顆粒負(fù)載細(xì)胞。

圖18示出了在nba（放大率=40倍）的光活化前，響應(yīng)于ph敏感的熒光團(tuán)dcfda（a）和細(xì)胞凋亡標(biāo)記膜聯(lián)蛋白v（b）的激發(fā)的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞。在nba光活化一小時(shí)之后，這些相同的細(xì)胞證明了與較低的phi相一致的較低的dcfda發(fā)射的熒光（c），和細(xì)胞凋亡的顯著表達(dá)（d）。（圖像c和d的放大率=40倍）。

圖19說明了在注射0.1mlacsf的5天后的對(duì)照小鼠中（a）和在0.1ml的1mm的nba和光療3天后的nba光療小鼠（b）的三陰性乳腺癌mda-mb-231腫瘤。腫瘤邊緣的輪廓用黃色虛線描畫出。

圖20示出了當(dāng)相比于對(duì)照的acsf（con）處理的小鼠時(shí)，在nba光療（nba）處理的小鼠中腫瘤體積變化百分比的顯著下降。將腫瘤體積變化百分比歸一化為治療日的每個(gè)動(dòng)物中的腫瘤體積。nba的一次處理最高連續(xù)9天引起腫瘤體積中變化百分比的顯著下降。

圖21示出了當(dāng)相比于對(duì)照的acsf（con）處理的小鼠時(shí)，nba光療（nba）處理的小鼠中腫瘤體積（mm³）的顯著下降。nba的一次處理從治療后第二天起最高在治療后13天引起腫瘤體積的顯著下降。由于第14天代表的響應(yīng)到達(dá)人道終點(diǎn)將對(duì)照動(dòng)物安樂死的開始，nba處理的動(dòng)物中腫瘤體積與對(duì)照相比顯著減少在第14天結(jié)束。

圖22示出本發(fā)明的新nba光動(dòng)力學(xué)療法在體內(nèi)存活的顯著增加。在裸鼠中攻擊性三陰性mda-mb-231人乳腺癌腫瘤提供了對(duì)照的acsf（con）的一次治療或nba光動(dòng)力學(xué)療法（nba）的一次治療。當(dāng)相比于對(duì)照小鼠時(shí)，在nba處理的小鼠中平均存活天數(shù)（±1sem）顯著更大。

詳述

大多數(shù)癌癥可以以經(jīng)由被認(rèn)為是warburg效應(yīng)的有氧糖酵解的乳酸過量產(chǎn)生和擠出為特征。細(xì)胞內(nèi)酸的過量產(chǎn)生是通過癌細(xì)胞導(dǎo)致的酸性細(xì)胞外環(huán)境的有效擠出，其已經(jīng)直接與轉(zhuǎn)移潛能相聯(lián)系（mccarty和whitaker，alternativemedicinereview，2010，15(3):264-72）。細(xì)胞外酸中毒導(dǎo)致在腫瘤位點(diǎn)血管形成或血管生成的速率增加，還減少了大多數(shù)本質(zhì)為堿性的化學(xué)治療藥的功效。為了在該酸性環(huán)境中存活，癌細(xì)胞表達(dá)或上調(diào)質(zhì)子交換體，尤其是鈉/氫交換體1（nhe1），其擠出質(zhì)子和保持微堿性的細(xì)胞內(nèi)ph（phi）。

過量的酸產(chǎn)生和nhe1的上調(diào)有助于腫瘤攻擊性，同時(shí)相同的過量擠出還可以作為治療形式反制癌細(xì)胞。由于在癌細(xì)胞中僅選擇性治療nhe1的固有挑戰(zhàn)，從1931年發(fā)現(xiàn)warburg效應(yīng)后phi的直接破壞已經(jīng)是癌癥治療難以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。nhe1阻斷劑，例如基于阿米洛利的藥物，通過捕獲體內(nèi)質(zhì)子然后降低phi以引起細(xì)胞凋亡來殺死癌癥。實(shí)施ph操控的其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括用摻有碳酸氫鈉的飲用水堿性化細(xì)胞外空間，或?qū)δ[瘤腫塊本身增加氧灌輸（raghunand和gillies，britishjournalofcancer，1999，80(7):1005-11）。

正如許多化學(xué)治療方法，nhe1阻斷劑不是局部限制于腫瘤位點(diǎn)，由于nhe1在所有活細(xì)胞上的普遍存在分布，引起對(duì)外周組織的全身損傷。細(xì)胞內(nèi)酸化的替代形式，例如nh4cl前脈沖（zamora等人，theopenzoologyjournal，2013,6:8-17）不是局部的，難以實(shí)施、有細(xì)胞毒素并且耗費(fèi)時(shí)間。

2-硝基苯甲醛（“nba”）是一旦暴露于350nm的紫外（uv）光能夠立即釋放質(zhì)子的光活化分子（ravindran等人，cellularsignaling2012，24(5):981-90）。nba經(jīng)由細(xì)胞膜被動(dòng)擴(kuò)散，由于分子上弱正電荷被捕獲。一旦在細(xì)胞內(nèi)，nba能夠保持非活性和完整直到被uv光激發(fā)（200nm至410nm，diaspro等人，qrevbiophys.2005，38(2):97-166）。nba已經(jīng)用于誘導(dǎo)局部的、迅速的細(xì)胞內(nèi)酸中毒，導(dǎo)致靶細(xì)胞的固有細(xì)胞凋亡。由于容易進(jìn)入細(xì)胞、分子傾向于保持在細(xì)胞內(nèi)、分子的非毒性本質(zhì)和一旦暴露于uv光的立即酸化，nba是用于破壞phi的理想機(jī)理。在癌細(xì)胞中phi調(diào)節(jié)的快速、局部的破壞是治療癌癥的未使用方法，其擁有作為化學(xué)療法和輻射替代的巨大潛力。此外，治療不是“癌癥特異性的”，可以用于治療大量癌癥，例如多重耐藥（mdr）的癌癥。

i.納米顆粒

光動(dòng)力學(xué)療法（pdt）是用于治療許多類型癌癥的最快發(fā)展形式之一。該技術(shù)處于其初始階段，目前并非足夠有效而使得能夠取消對(duì)更有效治療例如外科手術(shù)或化學(xué)療法的需要。已經(jīng)利用pdt作為其他疾病例如脈圖的治療以限制手術(shù)后內(nèi)膜增生（lamuraglia等人，journalofvascularsurgery，1995，21(6):882-90）、牛皮癬（almutawa等人，photodermatolphotoimmunolphotomed.2013）和息肉狀脈絡(luò)膜血管病變（sliwinska等人，progretineyeres.2013，37:182-99）。然而，pdt最有前景的應(yīng)用是其在腫瘤學(xué)中的用途。在體內(nèi)和體外將pdt應(yīng)用于細(xì)胞已經(jīng)顯示了高達(dá)60%的細(xì)胞死亡（idris等人，naturemedicine,2012,18(10):1580-85）。目前，pdt最有效的用途之一采用納米顆粒的光活化以引起活性氧（ros）的細(xì)胞內(nèi)釋放用于癌細(xì)胞治療（idris等人，naturemedicine，2012，18(10):1580-85）。

不像他們更穩(wěn)定的元素氧對(duì)應(yīng)物，由自由基和非自由基氧物質(zhì)構(gòu)成的ros能夠通過氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)（bartosz等人，biochemicalpharmacology，2009，77(8):1303-15；circu等人，freeradicalbiology&medicine，2010，48(6)：749-62）。由線粒體內(nèi)源性產(chǎn)生，ros涉及廣泛的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的調(diào)節(jié)，從細(xì)胞增殖和基因調(diào)節(jié)至線粒體氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡（ray等人，cellularsignaling2012，24(5)：981-90）。通過打開滲透性轉(zhuǎn)變氣孔復(fù)合物以使例如細(xì)胞色素c和胱天蛋白酶的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子激活，ros可以有助于激活細(xì)胞凋亡爆發(fā)（martindale等人，journalofcellularphysiology，2002，192(1):1–15；gupta等人，antioxidants&redoxsignaling，2012，16(11):1295-1322）。

通過利用雙光敏感納米顆粒以增強(qiáng)由ros光活化的細(xì)胞死亡，構(gòu)建納米顆粒以改善b16-0黑素瘤癌細(xì)胞中的pdt（idris等人，naturemedicine，2012，18(10):1580-85）。該特定納米顆粒具有在用于體外實(shí)驗(yàn)的介孔二氧化硅中均勻涂敷的nayf4晶體核。每個(gè)納米顆粒負(fù)載部花青540（mc540）和酞菁鋅（ii）（znpc），其都為僅當(dāng)引入可見光時(shí)被活化的光敏感藥物。一旦將980nm的近紅外光（nir）上轉(zhuǎn)換為可見光，mc540和znpc釋放ros并引起隨后的細(xì)胞損傷（idris等人，naturemedicine，2012，18(10):1580-85）。為了測(cè)試ros治療的療效，將涂覆的納米顆粒與葉酸和聚乙二醇（peg）結(jié)合以促進(jìn)穿過細(xì)胞膜移動(dòng)。將納米顆粒與培養(yǎng)的黑素瘤癌細(xì)胞結(jié)合以促使內(nèi)吞作用，然后將其注射入c57bl/6小鼠中。pdt和ros的隨后釋放在減少腫瘤大小和增加體內(nèi)細(xì)胞凋亡是成功的。

idris等人報(bào)道的癌細(xì)胞死亡（63%）和腫瘤大小減少不足以認(rèn)為是成功的臨床治療。該細(xì)胞死亡百分比不夠高以阻止不可控制的細(xì)胞增殖和避免額外的治療，例如外科手術(shù)和化學(xué)療法，以移除剩余的癌細(xì)胞。該特定納米顆粒在腫塊形成后未裝載到腫瘤中。而是，癌細(xì)胞在體外生長并在引入小鼠之前負(fù)載納米顆粒。盡管是適度成功的，但在將它們引入體內(nèi)前，培養(yǎng)具有pdt納米顆粒的癌細(xì)胞不是類似于人體治療的用于治療的現(xiàn)實(shí)方法。

質(zhì)子供體nba會(huì)穿過細(xì)胞膜擴(kuò)散并停留在細(xì)胞內(nèi)空間。促進(jìn)nba的細(xì)胞進(jìn)入是基于細(xì)胞外梯度的創(chuàng)建，從而允許nba經(jīng)由細(xì)胞膜被動(dòng)擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)空間中。氧的較大電負(fù)性創(chuàng)建了極性的羰基和相對(duì)大的分子偶極矩。氧的非鍵電子對(duì)制造了醛氫鍵受體，從而增加其水溶性。從細(xì)胞外空間移除nba不會(huì)導(dǎo)致nba流出，主要由于nba增加的細(xì)胞內(nèi)溶解性。

細(xì)胞內(nèi)nba的有效濃度沒有細(xì)胞毒素并且不破壞細(xì)胞功能。kohse等人（jamchemsoc.2013，135(25):9407-11）使用nba的閃光光解激活酸性磷酸酶通過ph跳躍從ph8.0變至ph6.0，并且未報(bào)道作為暴露于nba的結(jié)果的酶功能任何降低。為減小鼠心室肌細(xì)胞phi的nba閃光光解（swietach等人，biophysj，2007，92(2):641-53）不改變這些細(xì)胞的h⁺緩沖能力。更重要的是，在沒有uv曝光時(shí)，nba（1mm）不改變心臟舒張的ca²⁺、細(xì)胞收縮、或“空間phi調(diào)節(jié)機(jī)理”。目前發(fā)明人將10μmnba負(fù)載到整個(gè)體外蝌蚪腦干并觀察到在自發(fā)的、虛構(gòu)的呼吸運(yùn)動(dòng)輸出或中央呼吸化學(xué)感受器響應(yīng)中沒有破壞，這表明在該濃度，nba對(duì)組成呼吸神經(jīng)回路的細(xì)胞不發(fā)揮毒素效應(yīng)（ravindran等人，journalofhealthcareforthepoorandunderserved，201122(4):174-86）。

ii.細(xì)胞通路和細(xì)胞凋亡機(jī)理

以局部方式有效靶向特定細(xì)胞的能力是有前途的治療傳遞機(jī)理。癌細(xì)胞可以抑制能夠靶向治療劑局部傳遞的各種特質(zhì)。設(shè)計(jì)為靶向特定癌細(xì)胞的遞送機(jī)理提供了減少通常與化學(xué)療法相關(guān)的毒副作用的能力（gabizon等人，cancerchemotherpharmacol.2010，66(1):43-52）。癌癥的廣泛的可能靶點(diǎn)包括表面受體，例如人表皮生長因子受體2（emde等人，criticalreviewsinoncology/hematology2012，84:49-57；colombo等人，pharmacolres2010，62(2):150-65）、葉酸受體（salazar等人，cancermetastasisreviews，2007，26:141-52）和雌激素受體（kleinsmith等人，principlesofcancerbiology.pearsoneducation，inc.,2006，218-24）。用于治療劑傳遞機(jī)理的其他可能靶點(diǎn)包括細(xì)胞因子（przepiorka等人，blood.2002，95(1):83-89；kleinsmith等人，principlesofcancerbiology.pearsoneducation，inc.,2006；218-24）、生長因子（debruin等人，cancerdiscov.2014；wang等人，cardiovascres2013，98(1):56-63）和其他細(xì)胞通路和細(xì)胞機(jī)理。

a.鈉氫交換體1（nhe1）

鈉氫交換體1（nhe1）是普遍表達(dá)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，其在基因方面高度保守。nhe1促進(jìn)細(xì)胞外na⁺與細(xì)胞內(nèi)h⁺交換，促進(jìn)低滲透壓和增加細(xì)胞體積。nhe1以高度可變的細(xì)胞內(nèi)c端為特征，其可以被調(diào)控以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為包括黏附、形態(tài)、遷移和增殖（putney等人，annualreviews.2002，(42):527-52）。nhe1是對(duì)于細(xì)胞存活至關(guān)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體。

nhe1通過細(xì)胞中許多媒介調(diào)節(jié)。鈣調(diào)蛋白（cam）是信使蛋白，其一旦與鈣結(jié)合或磷酸化，則通過細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)域活化nhe1（koster等人，jbiolchem.2011，286(47):40954-961）。一旦結(jié)合，nhe1會(huì)被組成性激活直到非結(jié)合cam。一旦細(xì)胞體積損失，磷酸化的janus激酶ii會(huì)使cam磷酸化，然后激活nhe1。nhe1的激活會(huì)引起鈉流入，并伴隨水進(jìn)入細(xì)胞中以試圖恢復(fù)細(xì)胞體積。nhe1經(jīng)常與鈉鈣交換體（ncx1）二聚，所述鈉鈣交換體通常將na⁺運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中并將ca²⁺運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的na⁺水平上升，ncx1逆轉(zhuǎn)離子運(yùn)輸方向以防止細(xì)胞內(nèi)的na⁺進(jìn)一步增加。通常利用nhe1和ncx1的二聚以調(diào)節(jié)滲透壓。在癌細(xì)胞中將nhe1上調(diào)，有助于phi控制、腫瘤侵入、和避免phi誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的效力（cardone等人，naturereviewcancer.2005，5(10):786-95）。

b.磷酯酰絲氨酸

磷酯酰絲氨酸（ps）是磷脂化膜，其通常匯集至細(xì)胞磷脂雙層的內(nèi)部隔葉。ps在細(xì)胞膜外層上的表達(dá)具有兩個(gè)原因，缺少由三磷酸腺苷依賴的氨磷脂移位酶維持的膜不對(duì)稱，和使ps快速翻轉(zhuǎn)至另一個(gè)膜表面的脂促翻轉(zhuǎn)酶的激活（verhoven等人，journalofexperimentalmedicine，1995，182(5):1597-601）。

還未識(shí)別促翻轉(zhuǎn)酶，其可以是通過至少兩種途徑被激活的一種或幾種蛋白質(zhì)。所有成核人類細(xì)胞具有導(dǎo)致ps在外膜表面表達(dá)的凋亡通路。造血細(xì)胞也具有可逆的、鈣依賴的通路用于表達(dá)ps；無核的紅細(xì)胞僅具有該鈣依賴的路徑（bevers和williamson，federationofeuropeanbiochemicalsocietiesletters，2010，584(13):2724–30）。凋亡通路利用脂質(zhì)不對(duì)稱的崩塌以將ps暴露于細(xì)胞外空間作為非炎性吞噬作用移除的信號(hào)。

在凋亡通路早期，氨磷脂移位酶被下調(diào)（verhoven等人，journalofexperimentalmedicine，1995，182(5):1597-601）。然后，一旦線粒體外膜透化作用（momp）發(fā)生，翻轉(zhuǎn)酶會(huì)進(jìn)行以將ps運(yùn)送至外膜隔葉。在momp發(fā)生之前，細(xì)胞凋亡抑制劑作用于通路可以阻止ps表達(dá)。相反地，在momp之后作用的抑制劑會(huì)阻止下游的細(xì)胞凋亡活動(dòng)，但是ps表達(dá)仍舊會(huì)發(fā)生（bevers和williamson，federationofeuropeanbiochemicalsocietiesletters，2010，584(13):2724–30）。

在非造血細(xì)胞中的ps表達(dá)是細(xì)胞死亡的確定抑制劑并且可以通過用熒光結(jié)合的膜聯(lián)蛋白v標(biāo)記來標(biāo)記，所述膜聯(lián)蛋白v是對(duì)ps具有高親和力的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞膜失去完整性時(shí)還可以暴露ps，因此可以使用在膜中被捕獲的第二染料證實(shí)ps暴露僅由于凋亡途徑（schutters和reutelingsperger，springer，2010，(15):1072–82）。

c.p53和bcl-2

tp53是涉及復(fù)雜但普通通路的多層面基因。研究p53的調(diào)控網(wǎng)路是用于其普遍出現(xiàn)在病理學(xué)條件，例如神經(jīng)病學(xué)退化、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥中（amaral等人，discoverymedicine，2010，9(45):145-52）。癌癥的最常見起因是由于tp53基因的破壞或刪除（olivier等人，coldspringharborperspectivesinbiology，2010，2:1-17）。該基因的突變是超過50%的現(xiàn)在所見癌癥的起因（kleinsmith，“cancerscreening，diagnosis，andtreatment”，principlesofcancerbiology.pearsoneducation，inc.,2006，218-24）。

位于人染色體17上的tp53基因?qū)τ诩?xì)胞周期的調(diào)控至關(guān)重要。由于tp53在防止損傷的或突變的dna失去控制復(fù)制引發(fā)癌癥中的作用，其已經(jīng)被描述為腫瘤抑制基因。當(dāng)細(xì)胞檢測(cè)到dna損傷、缺氧條件、或細(xì)胞周期不規(guī)則時(shí)，將p53上調(diào)。在正常條件下，p53可以暫停細(xì)胞周期和允許dna修復(fù)機(jī)理以修理損傷和當(dāng)修復(fù)時(shí)恢復(fù)細(xì)胞周期，或引起細(xì)胞立即進(jìn)入細(xì)胞凋亡。p53存在引起線粒體細(xì)胞凋亡的許多路徑，但是最直接的途徑之一是引起bax，促凋亡蛋白。bax直接與線粒體結(jié)合，引起細(xì)胞色素c的釋放。當(dāng)p53突變或刪除時(shí)，反凋亡蛋白bcl-2可以隔離且進(jìn)一步阻止p53的功能性。p53行為的該阻斷使得癌癥進(jìn)展而不管dna損傷或細(xì)胞周期故障。用于癌癥進(jìn)展的另一種路線是bcl-2的過度表達(dá)，導(dǎo)致正在轉(zhuǎn)錄的所有p53的隔離和最終阻止細(xì)胞凋亡爆發(fā)（olivier等人，coldspringharborperspectivesinbiology，2010，2:1-17）。

d.jak-2和cam

當(dāng)將mcf-7細(xì)胞引入本發(fā)明的獨(dú)特治療時(shí)，早在進(jìn)入治療3分鐘時(shí)觀察到細(xì)胞體積的損失。在細(xì)胞凋亡的第一階段已經(jīng)觀察到細(xì)胞體積減少（orlov等人，amjphysiolcellphysiol.2013，305(4):c361-372），這是由于水可滲透通道的增強(qiáng)激活（remillard等人，amjphysiollungcellmolphysiol.2004，286(1):l49-67）。此外，當(dāng)在h⁺本發(fā)明的新治療期間被釋放時(shí)，nba經(jīng)歷光化學(xué)重排為2-硝基苯甲酸（diaspro等人，qrevbiophys.2005，38(2):97-166）。h⁺的增加與細(xì)胞內(nèi)h⁺緩沖成分的減少的組合也會(huì)有助于減少細(xì)胞體積（fraser等人，journalofphysiology，2005，563(3):745-64）。該細(xì)胞內(nèi)水流出引起許多細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白響應(yīng)機(jī)理并激活機(jī)理以逆轉(zhuǎn)水的損失。通過水損失和隨后細(xì)胞體積減少而快速激活的本發(fā)明的調(diào)節(jié)途徑是jak/stat途徑，特別是janus激酶ii（jak2）。

響應(yīng)細(xì)胞體積損失，經(jīng)由磷酸化作用將jak2激活。jak-2激活可以引起鈣調(diào)蛋白（cam）的磷酸化（benaim和villalobo，eurjbiochem.2002，269(15):3619-31），其與nhe1的細(xì)胞內(nèi)c端相結(jié)合以使其組成性激活。nhe1的該激活迅速增加細(xì)胞內(nèi)na⁺的濃度，通過補(bǔ)充水至胞液引起細(xì)胞體積恢復(fù)。

鈣調(diào)蛋白是在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第二信使蛋白。cam涉及各種過程，包括在激活nhe1中的機(jī)械增加（garnovskaya等人，jbiolchem.2003，278(19):16908-15）?？梢酝ㄟ^cam的磷酸化作用或鈣化作用增加cam與nhe1的c端的親和力（garnovskaya等人，jbiolchem.2003，278(19):16908-15；等人，jbiolchem.2011，286(47):40954-61）。

e.微生物

對(duì)抗生素的細(xì)菌耐藥性顯示了對(duì)醫(yī)療保健的持續(xù)挑戰(zhàn)。大多數(shù)耐藥性是由于酶的適應(yīng)，其使得細(xì)菌能夠在抗生素影響靶點(diǎn)之前降解抗生素（benveniste等人，annualreviews，1973，42:471-506)。一旦該酶促作用發(fā)生，其可以快速地經(jīng)由轉(zhuǎn)化從一種生物體轉(zhuǎn)移至另一種，戰(zhàn)勝藥物的效力。耐藥性的其他方法包括：細(xì)菌阻礙抗生素如四環(huán)素和磺酰胺攝取的能力，或靶點(diǎn)如金黃色葡萄球菌適應(yīng)于核糖體的改變以賦予紅霉素耐藥性（daviesanddavies，microbiologyandmolecularbiologyreviews，2010，74(3):417-33）。在抗生素中的簡(jiǎn)單的、單一靶向和單一結(jié)構(gòu)的改進(jìn)需要相似地簡(jiǎn)單的防御型適應(yīng)，從而實(shí)施于這些生物體中以展現(xiàn)抗藥性。

細(xì)菌是多樣組的生物體，其可以在廣泛的環(huán)境包括ph的極端范圍中生存。嗜堿菌可在7.5至10.6的細(xì)胞外ph中成長，嗜酸菌可在1.0至8.0的ph輕易生長；然而，即使這些極端微生物，其內(nèi)部ph更靠近中性，分別具有7.5至8.3和6.0至7.0的內(nèi)部ph（slonczewski等人，advancesinmicrobialphysiology，2009，55:1-79）。為了維持ph中這些異常的差異，膜脂使得細(xì)菌物種能夠?qū)|(zhì)子移動(dòng)有不同的不可滲透性?？刂苾?nèi)部ph的其他方法包括將順梯度的離子交換與反梯度的質(zhì)子交換結(jié)合，例如大腸桿菌（escherichiacoli）的na⁺/h⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)；產(chǎn)生中性產(chǎn)物或酸性產(chǎn)物的代謝作用切換；各種緩沖系統(tǒng)（slonczewski等人，advancesinmicrobialphysiology，2009，55:1-79）。例如，與加工食物相關(guān)的致命傳染（shabala等人，internationaljournaloffoodmicrobiology，2002，75:89-97)、腦炎（armstrongandfung，clin.infect.dis.1993，16(5):689–702)、肺炎（whitelock-jones等人，southafricanmedicaljournal，1989，75(4):188–89)、敗血癥（gray和killinger，bacteriol.rev.1966，30:309-82)、腦膜炎（gray和killinger，bacteriol.rev.1966，30:309-82)、可導(dǎo)致自發(fā)流產(chǎn)的孕婦中的子宮內(nèi)和子宮頸感染的原因的細(xì)菌，單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌（listeriamonocytogenes），維持其phi為7.6至8.0，“不能維持phi體內(nèi)平衡導(dǎo)致細(xì)胞活性的損失，因此可以用作在細(xì)胞水平的細(xì)菌死亡的敏感性指示劑”（shabala等人，internationaljournaloffoodmicrobiology，2002，75:89-97）。通過h⁺/ca²⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，細(xì)菌和真菌中空泡型的h⁺-atp酶（v-atp酶）維持細(xì)胞器例如在運(yùn)行鈣攝取中重要的核內(nèi)體和溶酶體中重要的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子梯度。極有可能的是，通過本發(fā)明的nba治療，顯著的細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞器內(nèi)的酸中毒不僅會(huì)嚴(yán)重地破壞酸性，還會(huì)嚴(yán)重地破壞對(duì)發(fā)病機(jī)理所必需的重要過程。

f.酶活性

代謝紊亂已經(jīng)困擾社會(huì)幾個(gè)世紀(jì)。最近在科學(xué)上的進(jìn)步已經(jīng)顯示了過度活性的酶是這些疾病的許多原因中的一個(gè)；然而，代謝紊亂的病理生理學(xué)并未被充分理解（mairet-coello等人，neuron,2013，78(1):94-108）。阿茲海默癥是影響美國超過5百萬人的癡呆的最普遍形式之一，其是由細(xì)胞酶的過度活性引起的（mairet-coello等人，neuron，2013，78(1):94-108）。體內(nèi)研究已經(jīng)顯示了微管相關(guān)的蛋白質(zhì)tau通過amp活化的激酶（ampk）的過度磷酸化導(dǎo)致用于興奮突觸傳導(dǎo)的神經(jīng)棘的損失（mairet-coello等人，neuron，2013，78(1):94-108)。藥理學(xué)上或經(jīng)由基因刪除而減少該激酶的活性，顯示了神經(jīng)棘未經(jīng)受tau的突觸毒性的過度磷酸化和對(duì)海馬神經(jīng)元具有保護(hù)性作用（mairet-coello等人，neuron，2013，78(1):94-108）。

酶動(dòng)力學(xué)是充分研究的科學(xué)領(lǐng)域且已經(jīng)發(fā)展了許多在各種條件下關(guān)于酶功能性的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。這些模型之一被用于描述和預(yù)測(cè)根據(jù)ph的酶的活性（tijskens等人，biotechnolbioeng，2001，72(3):323-30）。大多數(shù)酶在生物學(xué)范圍6至8的ph內(nèi)作用，并且其具有在它們功能為最大時(shí)的理想的ph。然而，當(dāng)ph改變時(shí)，這些功能相互作用減少。隨著phi的顯著降低，由于官能團(tuán)的質(zhì)子化和氫鍵的離解，酶開始解折疊，這降低了其活性（tijskens等人，biotechnolbioeng，2001，72(3):323-30）。donten和hamm（chemicalphysics，2013，422:124-30）通過將uv光的飛秒脈沖施用至nba以改變l-聚谷氨酸折疊的速率和量級(jí)來應(yīng)用ph“跳躍”。而donten和hamm（2013）成功地誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)折疊，他們?cè)趐h低至4.0的測(cè)試池中制備了酸性溶液，該ph下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)損傷和/或細(xì)胞凋亡。使用本文所描述的釋放技術(shù)以降低細(xì)胞的phi會(huì)允許許多蛋白質(zhì)例如ampk的活性改變。ampk活性的降低會(huì)減少過度磷酸化的tau的突觸的毒性作用，并延緩阿茲海默癥的進(jìn)展和其他由于過度活性酶的代謝疾病。使用nba納米顆粒會(huì)使得體內(nèi)phi的非常局部的和逐漸的減少。

組蛋白去乙?；福╤dac）是從組蛋白上的氨基酸賴氨酸上移除乙?；鶊F(tuán)從而增加組蛋白尾端電荷的一類酶。在組蛋白尾端的該電荷增加促使組蛋白和dna之間的高親和力結(jié)合，導(dǎo)致更濃縮的dna和轉(zhuǎn)錄的阻礙。目前，已經(jīng)描述了11種hdac基因（shultz等人，biochemistry，2004，43:11083-91)，其活性已經(jīng)與例如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（als）（miskiewicz等人，cellreports，2014，8:94-102）、胃癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮頸癌和胃癌的病癥聯(lián)系起來（ropero和estellar，molecularoncology，2007，19-25）。相反，組蛋白乙酰化中和了組蛋白電荷，并減少了組蛋白與dna結(jié)合的能力。在組蛋白結(jié)合中的該減少促進(jìn)了染色質(zhì)擴(kuò)張和基因轉(zhuǎn)錄，例如腫瘤抑制基因p53的活化（phiel等人，journalofbiologicalchemistry，2001，276(39):36734-41）。盡管通過丙戊酸和曲古抑菌素（tsa）抑制hdac在癲癇的治療中是有效的，但作用的明確機(jī)理是未知的（phiel等人，journalofbiologicalchemistry，2001，276(39):36734-41）。shultz等人（2004）報(bào)道了用于hdac1、hdac2、hdac3、hdac6、hdac8和hdac10的最大催化效力的理想的phi范圍。這些hdac的每一個(gè)都證明了用于脫乙酰反應(yīng)的最大速率的phi依賴。此外，對(duì)于hdac同工酶的最大催化效率的ph曲線“是鐘型的，最大值為ph7.6至8.3”（shultz等人，2004）。如本文所描述的nba閃光光解能夠引起phi的離散下降，該下降可以維持很長時(shí)間（圖15至圖16）。降低phi使催化速率遠(yuǎn)離最大催化效率；phi的顯著下降可以起到hdac的新抑制劑和減少與hdac的過度活性有關(guān)的大量疾病的發(fā)病原的作用。

g.干細(xì)胞多能性

干細(xì)胞是生物學(xué)中高度研究的領(lǐng)域；然而，制造干細(xì)胞的過程產(chǎn)生非常少可存活的去分化的細(xì)胞。目前技術(shù)旨在通過將分化細(xì)胞回復(fù)或去分化為胚胎狀態(tài)來改編最終分化細(xì)胞。體內(nèi)的許多細(xì)胞仍舊處于受控的分化狀態(tài)，并通常位于需要細(xì)胞更替或細(xì)胞分化的穩(wěn)定源的身體區(qū)域中，例如皮膚細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。gao等人（cellularphysiologyandbiochemistry，2014，33(1):185-94）最近報(bào)道了來自人的間葉細(xì)胞臍帶細(xì)胞（huc-mscs）僅響應(yīng)于持續(xù)的phi下降而分化為成骨細(xì)胞。gao等人（cellularphysiologyandbiochemistry，2014，33(1):185-94）光學(xué)地測(cè)量phi同時(shí)通過將huc-msc暴露至氯化銨前置脈沖技術(shù)而誘導(dǎo)phi下降，同時(shí)地用卡立泊來德阻隔nhe1。本文所描述的方法使得在較長的、持續(xù)的間隔中誘導(dǎo)僅僅phi精確的、逐漸的減少，以實(shí)現(xiàn)從某些干細(xì)胞系分化（gao等人，cellularphysiologyandbiochemistry，2014，33(1):185-94）。

h.神經(jīng)活性

通過游離h⁺的電離可以改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。許多研究支持了ph對(duì)涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳信的蛋白質(zhì)的重要作用。wemmie等人在海馬神經(jīng)元中所描述的經(jīng)酸激活的電流（neuron,2002,34(3):463-77)對(duì)于長時(shí)程增強(qiáng)作用是必需的，隨著這些酸性傳感離子通道（asic）在缺陷性小鼠中的損失，導(dǎo)致受損的海馬長時(shí)程增強(qiáng)作用和有缺陷的眨眼調(diào)節(jié)和空間學(xué)習(xí)。asicla起到海馬神經(jīng)元的樹突棘上質(zhì)子受體的作用，并影響細(xì)胞內(nèi)的鈣傳信（zha等人，procnatlacadsciusa，2006，103(44):16556-61）。在細(xì)胞外游離h⁺的濃度增加影響了許多配體門控離子通道；通過酸性的細(xì)胞外ph和堿性的細(xì)胞外ph抑制乙酰膽堿和nmda受體（delcastillo等人，1962,j.cellcompphysiol59:35–44；giffard等人，brainres，1990，506:339-42；palma等人，1991，jmembrbiol，120:67-73；traynelis和cull-candy，1990，nature，345:347-50）。gaba受體的活性通過酸性的細(xì)胞外ph被增強(qiáng)，通過堿性的細(xì)胞外ph被抑制。（kaila和ransom，1994，phandbrainfunction(newyork:wiley-liss)；smart和constanti，1982，procrsoclondbbiolsci，215:327-41；takeuchi和takeuchi，1967，jphysiol，1967，191:575-90）。本發(fā)明的技術(shù)在與上面列舉的配體門控離子通道相連的細(xì)胞外空間中引起局部酸中毒的能力，和實(shí)際上受質(zhì)子化影響的所有配體門控離子通道，會(huì)提供改變神經(jīng)回路的神經(jīng)元輸入和功能性輸出的獨(dú)特機(jī)理。

iii.靶向劑

靶向劑可以與本文所描述的化合物或顆粒相連，以引導(dǎo)或靶向結(jié)合體至體內(nèi)靶區(qū)域。體內(nèi)靶向輸送增強(qiáng)了這些化合物或顆粒的細(xì)胞攝取以增強(qiáng)治療效力。在某些方面，可以將抗體或細(xì)胞滲透肽用于靶向輸送至腫瘤位點(diǎn)。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，靶向部分是單鏈抗體（sca）或單鏈抗原結(jié)合的抗體、單克隆抗體、細(xì)胞黏合肽例如rgd肽和selectin、細(xì)胞滲透肽（cpp）例如tat、penetratin和(arg)9、受體配體、靶向碳水化合物分子或凝集素、寡核苷酸、寡核苷酸衍生物例如鎖核酸（lna）和適配體等。

靶向部分可以被標(biāo)記，例如生物素化的化合物、熒光化合物、放射性同位素標(biāo)記的化合物。通過鏈接任何合適的部分，例如氨基酸殘基至任何本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的放射性同位素、射線不透明的標(biāo)簽、磁共振標(biāo)簽、或其他用于磁共振成像合適的非放射性同位素標(biāo)簽、熒光類型標(biāo)簽、展示可見顏色和/或能夠在紫外線、紅外線或電化學(xué)刺激下發(fā)熒光的標(biāo)簽來制備合適的標(biāo)簽，以使得在施用、治療等期間用于成像或檢測(cè)。任選地，將診斷的標(biāo)簽包含在結(jié)合的光激活的部分中和/或與其相連，允許監(jiān)測(cè)治療的生物學(xué)活性材料在動(dòng)物或人類患者中的分布。

術(shù)語“單鏈抗體”（sca）、“單鏈抗原結(jié)合的分子或抗體”或“單鏈fv”（sfv）可以相互交換使用。單鏈抗體具有抗原的結(jié)合親和力。單鏈抗體（sca）或單鏈fv可以且已經(jīng)以幾種方式構(gòu)建。通常在指定的美國專利申請(qǐng)第10/915069和美國專利第6824782號(hào)中發(fā)現(xiàn)單鏈抗原結(jié)合蛋白的理論和制備的描述，其每個(gè)的內(nèi)容通過引用并入本文。

iv.永久連接體和可釋放連接體

在本發(fā)明的全文中使用的連接體可以包括雙官能連接體。雙官能可以是永久連接體和可釋放連接體。雙官能連接體包括氨基酸、氨基酸衍生物、或化學(xué)的連接體。氨基酸可以是天然出現(xiàn)的氨基酸和非天然出現(xiàn)的氨基酸。預(yù)期了天然出現(xiàn)的氨基酸衍生物和類似物和各種本領(lǐng)域已知的非天然出現(xiàn)的氨基酸（d或l）、疏水的或非疏水的在本發(fā)明的范圍中。非天然出現(xiàn)的氨基酸的合適非限制性列表包括2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-氨基丁酸、鎖鏈素、2,2-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、n-乙甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、n-甲基甘氨酸、肌氨酸、n-甲基-異亮氨酸、6-n-甲基-賴氨酸、n-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、和鳥氨酸。一些優(yōu)選的氨基酸殘基選自甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸和肌氨酸，更優(yōu)選為甘氨酸。

a.可釋放連接體

在某些方面，本文所描述的化合物或顆粒包含與可釋放連接體相連的光活化的部分。光活化的部分可以以可控的方式釋放。

可釋放連接體可以是基于芐基消除的連接體、基于三烷基鎖的連接體（或基于三烷基鎖內(nèi)酯化的接體）、基于二甘氨酸的連接體、酸不穩(wěn)定的連接體、溶酶體可分解的肽和組織蛋白酶b可分解的肽。酸不穩(wěn)定的連接體可以是二包含硫鍵、腙的連接體和包含硫代丙酸酯的連接體。

或者，可釋放連接體是細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定連接體、細(xì)胞外連接體和酸性不穩(wěn)定連接體。酸性不穩(wěn)定連接體，例如腙連接體，可以在酸性溶酶體環(huán)境中被水解。一些合適的可釋放連接體是寡肽包括例如val-cit、ala-leu-ala-leu、gly-phe-leu-gly和phe-lys。一個(gè)優(yōu)選的可釋放連接體是肽基連接體（val-cit），其可以通過組織蛋白酶b被特異性降解。

例如通常在指定的美國專利第6180095號(hào)、第6720306號(hào)、第5965119號(hào)、第6624142號(hào)和第6303569號(hào)中描述了基于芐基消除的或基于三烷基鎖的多種可釋放連接體，其每個(gè)的內(nèi)容通過引用并入本文。通常在指定的美國專利第7122189號(hào)和第7087229號(hào)和美國專利申請(qǐng)第10/557522號(hào)、第11/502108號(hào)和第11/011818號(hào)中還描述基于二甘氨酸的連接體，其每一個(gè)的內(nèi)容通過引用并入本文。

b.永久連接體

在某些方面，經(jīng)由永久連接體將靶向部分例如sca與多官能連接體連接。永久連接體能夠結(jié)合靶向部分和多官能連接體。一個(gè)優(yōu)選的永久連接體可以是如可以提供硫醚鍵的包含馬來酰亞胺基分子的分子。

c.藥物制劑和施用

在某些實(shí)施方案中，組合物包含1種、2種、3種或更多種治療劑與一種或更多種以下成分：藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑、和/或佐劑。這些組合物可以包含有效量的至少一種抗癌劑。因此，在制備藥劑的藥學(xué)組合物中還包括使用本文提供的一種或更多種抗癌劑。這些組合物可以用于各種癌癥或其他疾病或病癥的治療。

可以將本文描述的試劑可以以各種劑型例如但不限于，液體溶液或混懸劑、片劑、丸劑、粉劑、栓劑、聚合物微囊或微泡、脂質(zhì)體和可注射的或難溶的溶液被配制成治療組合物。優(yōu)選的形式取決于施用的方式和靶向的具體疾病。組合物還優(yōu)選地包含本領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)可接受的介質(zhì)、載體或佐劑。

用于藥物制備可接受的制劑成分在施用的劑量和濃度下對(duì)接受者是無毒的。除了提供的治療劑外，組合物可包含用于調(diào)整、維持、或保留例如組合物的的ph、滲量、黏度、清晰度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放、吸附、或滲透的速率的成分。

制劑成分以對(duì)給藥位點(diǎn)可接受的濃度存在。有利地使用緩沖劑以維持組合物處于生理ph或略低的ph，通常ph為約4.0至約8.5，或者為約5.0至8.0。藥物組合物可以包含ph約為6.5至8.5的tris緩沖劑，或ph約為4.0至5.5的乙酸鹽緩沖劑，其還可以包含山梨醇或合適的代替物。

用于體內(nèi)給藥的藥物組合物通常是無菌的。通過無菌過濾膜過濾可以實(shí)現(xiàn)無菌。如果組合物是凍干的，可以在凍干和重組合之前或之后進(jìn)行無菌。用于非消化道給藥的組合物可以以凍干形式或在溶液中儲(chǔ)存。在某些實(shí)施方案中，將非消化道的組合物放置在具有無菌入口的容器中，例如靜脈溶液袋或具有通過皮下注射針可刺破塞子的小瓶，或可用于注射的無菌載藥注射器。

以上組合物可以使用傳統(tǒng)的輸送方式給藥，其包括但不限于：靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口腔、淋巴管內(nèi)、皮下給藥、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸膜內(nèi)、囊內(nèi)、和經(jīng)由區(qū)域性導(dǎo)管灌注。通過本發(fā)明還預(yù)期了對(duì)腫瘤局部給藥。當(dāng)通過注射給藥組合物時(shí)，可通過連續(xù)灌注或通過單個(gè)或多個(gè)丸劑給藥。對(duì)于非消化道給藥，可以用無熱原、非消化道可接受的、包含在藥物可接受的介質(zhì)中所需要的抗癌劑的水溶液給藥治療劑。用于腸外注射的特別合適介質(zhì)是無菌蒸餾水，其中將一種或更多種治療劑配制成無菌的適當(dāng)保存的等滲溶液，。

一旦本發(fā)明的藥物組合物配制完成，可將其以溶液、混懸劑、凝膠劑、乳劑、固體、或脫水粉末或凍干粉末形式儲(chǔ)存在無菌小瓶中。這些制劑可以以即用的形式或在施用前重組合的形式（例如，凍干的）儲(chǔ)存。

對(duì)于本發(fā)明的化合物，單獨(dú)的或作為藥物組合物的一部分，劑量為約0.001mg/kg體重至1mg/kg體重，優(yōu)選為約1μg/kg體重至100μg/kg體重，最優(yōu)選為1μg/kg體重至10μg/kg體重。治療性組合物或療法可以給藥1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、或更多次，且可以將其每1小時(shí)、每2小時(shí)、每3小時(shí)、每4小時(shí)、每5小時(shí)、每6小時(shí)、每7小時(shí)、每8小時(shí)、每9小時(shí)、每10小時(shí)、每11小時(shí)、每12小時(shí)、每13小時(shí)、每14小時(shí)、每15小時(shí)、每16小時(shí)、每17小時(shí)、每18小時(shí)、每19小時(shí)、每20小時(shí)、每21小時(shí)、每22小時(shí)、每23小時(shí)、每24小時(shí)，或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、或1周、2周、3周、4周、5周、或1月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、12月給藥。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)輕易確定治療有效劑量，并且會(huì)取決于疾病的嚴(yán)重性和病程、患者的健康和對(duì)治療的響應(yīng)、患者的年齡、體重、身高、性別、先前的病史和治療醫(yī)生的判斷。

在本發(fā)明的一些方法中，靶組織或靶細(xì)胞是癌癥或癌細(xì)胞。癌細(xì)胞可在患者中?；颊呖删哂袑?shí)體腫瘤。在這種情況下，實(shí)施方案還可以涉及對(duì)患者實(shí)施外科手術(shù)，例如通過切除全部或部分腫瘤。在外科手術(shù)之前、之后或同時(shí)可以將組合物給藥至患者。在另外的實(shí)施方案中，還可以直接地、經(jīng)內(nèi)鏡、經(jīng)氣管、經(jīng)瘤內(nèi)、經(jīng)靜脈內(nèi)、病灶內(nèi)、經(jīng)肌內(nèi)、經(jīng)腹膜內(nèi)、經(jīng)顱內(nèi)、區(qū)域性地、經(jīng)由皮膚、局部地、經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)膀胱或經(jīng)皮下對(duì)患者給藥。

治療癌癥或其他疾病或病癥的方法還可以包括對(duì)患者施用化學(xué)療法或放射療法，可以將其施用超過一次。化學(xué)療法包括但不限于，順鉑（cddp）、卡鉑、甲基芐肼、二氯甲基二乙胺、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、bisulfan、亞硝基脲、放線菌素d、道諾霉素、阿霉素、博來霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊苷（vp16）、它莫西芬、泰素帝、紫杉醇、反鉑、5-氟二氧嘧啶、新長春堿、長春堿、氨甲葉酸、吉西他濱、奧沙利鉑、伊立替康、拓?fù)涮婵?、或其任意類似物或衍生物變體。放射療法包括但不限于，x射線放射、uv放射、γ放射、電子束輻射、或微波。此外，可對(duì)細(xì)胞或患者給藥蛋白酶或肽酶以增加來自細(xì)胞的病毒的傳染eev形式的產(chǎn)量。另外，作為本發(fā)明方法的一部分，可以對(duì)細(xì)胞或患者給藥微管穩(wěn)定劑包括但不限于紫杉烷。特別預(yù)期的是，任意的化合物或衍生物或類似物均可以與這些聯(lián)合療法一起使用。

實(shí)施例

包括以下實(shí)施例和附圖以證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)領(lǐng)會(huì)的是，在實(shí)施例或附圖中公開的技術(shù)表明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術(shù)在本發(fā)明的實(shí)踐中運(yùn)行良好，從而可以認(rèn)為其構(gòu)成了用于其實(shí)踐的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在所公開的具體實(shí)施方案中可以做出許多改變，仍然獲得相同或相似的結(jié)果，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。

實(shí)施例1

材料：dulbecco改性eagle培養(yǎng)基（dmem）、rpmi1640（roswellparkmemorialinstitute1640）、牛胎血清（fbs）、馬血清、慶大霉素、胰蛋白酶-edta、carboxy-dcfda（5-（和-6）-羧基-2',7'-二氯熒光黃二醋酸鹽）和膜聯(lián)蛋白valexafluor568購自lifetechnologies。nacl、kcl、mgcl2、cacl2、hepes和葡萄糖全部購自fisherscientific。2-硝基苯甲醛（nba）、阿米洛利、尼日利亞菌素、ngf-7s、具有排氣蓋的75cm²矩形傾斜頸細(xì)胞培養(yǎng)瓶全部購自sigmaaldrich。小鼠嗜鉻細(xì)胞瘤（pc12）細(xì)胞和人乳腺癌（mcf-7）細(xì)胞購自americantypeculturecollection。35mm培養(yǎng)皿購自santacruzbiotechnology。納米顆粒由德克薩斯大學(xué)圣安東尼奧分校的brianyust博士和franciscopedraza合成。在37℃下、5%co2和95%空氣的氣氛中，在用5%fbs、10%馬血清和500μl慶大霉素補(bǔ)充的rpmi1640（1×）中培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)pc12細(xì)胞。將細(xì)胞以適當(dāng)范圍在35mm培養(yǎng)皿上涂板和培養(yǎng)直到80%至90%匯合。在37℃下、5%co2和95%空氣的氣氛中，在用5%fbs和500μl的慶大霉素補(bǔ)充的dmem（1×）中培養(yǎng)mcf-7細(xì)胞。將細(xì)胞在75cm²的corning瓶中涂板使得細(xì)胞生長至適當(dāng)密度，傳代至35mm培養(yǎng)皿，然后生長直到80%至90%匯合用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)pc12或mcf-7細(xì)胞傳代時(shí)，使用1ml的0.25%的胰蛋白酶-edta（1×）使細(xì)胞懸浮以傳代。將1mg的dcfda儲(chǔ)備溶液carboxy-dcfda（5-（和-6）-羧基-2’,7’-二氟熒光黃二乙酸鹽溶解在201μl的二甲基亞砜（dmso）中以制備9.4mm的儲(chǔ)備溶液。將儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在黑暗的生物安全柜中以保護(hù)光敏化合物。

用dcfda校準(zhǔn)和測(cè)量ph：為了比率計(jì)的phi測(cè)量，將pc12細(xì)胞用ph敏感的染料carboxy-dcfda（小鼠acsf中10μm）負(fù)載。將尼日利亞菌素滴定至ph為2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。從每個(gè)滴定ph溶液的細(xì)胞記錄dcfda的放射熒光。在30秒間隔的495nm/440nm激發(fā)下觀察比率計(jì)的放射的熒光強(qiáng)度，直到放射的熒光（504/530nm）達(dá)到穩(wěn)定態(tài)。對(duì)于每個(gè)ph記錄個(gè)體細(xì)胞（n=421）的每個(gè)比例。建立最佳匹配的曲線（r²=93.02）并用于轉(zhuǎn)換熒光至phi。

nba負(fù)載：將nba（3.0224g）溶于500ml甲醇中以制備40mm的儲(chǔ)備溶液。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將75μl的儲(chǔ)備溶液與3ml的小鼠acsf組合用于細(xì)胞浴應(yīng)用。1mm的nba-小鼠acsf的最終稀釋足夠低于細(xì)胞毒素允許的5mm限制（sweitach等人，biophysj，2007，92(2):641-53）。pc12細(xì)胞的nba負(fù)載過程是與mcf-7細(xì)胞的過程相同。

細(xì)胞凋亡指示劑：將細(xì)胞凋亡指示劑膜聯(lián)蛋白valexafluor568儲(chǔ)存在包含25mm的hepes、140mm的nacl、1mm的edta，ph7.4加上0.1%牛血清白蛋白（bsa）的溶液中。將10μl的儲(chǔ)備膜聯(lián)蛋白valexafluor568稀釋于2ml的結(jié)合緩沖劑中。結(jié)合緩沖劑由10mm的hepes、140mm的nacl和2.5mmcacl2構(gòu)成，ph7.4。

阿米洛利過程：將阿米洛利（n-脒基-3,5-二氨基-6-氯吡嗪酰胺鹽酸鹽水合物）（266.09mg）添加至20ml的dmso中以制備50mm的最終儲(chǔ)備溶液。在浴應(yīng)用至培養(yǎng)細(xì)胞之前將該儲(chǔ)備溶液進(jìn)一步稀釋至1mm。

小鼠acsf儲(chǔ)備溶液：在實(shí)驗(yàn)過程期間，將pc12和mcf-7細(xì)胞灌注于2ml的小鼠acsf溶液中（150mm的nacl、5mm的kcl、1mm的mgcl2、5mm的hepes、5mm的葡萄糖，ph7.4）。

pc12的phi的光學(xué)記錄：將dcfda儲(chǔ)備溶液稀釋于3ml的小鼠acsf溶液中至10μm的濃度。每30秒，pc12細(xì)胞在40倍放大率下分別被495nm/440nm持續(xù)閃爍900/700ms時(shí)間，在10倍放大率下每個(gè)波長下被持續(xù)閃爍2秒。在記錄熒光以監(jiān)測(cè)穩(wěn)定態(tài)之后10分鐘和之前，將細(xì)胞用小鼠acsf清洗三次。

mcf-7的phi的光學(xué)記錄：將dcfda儲(chǔ)備溶液稀釋于3ml小鼠acsf溶液中至10μm的濃度。每30秒，mcf-7細(xì)胞分別在40倍放大率下分別被495nm/440nm持續(xù)閃爍900/700ms時(shí)間，在10倍放大率下每個(gè)波長下被持續(xù)閃爍2秒。在觀察到熒光的穩(wěn)定態(tài)后，將細(xì)胞用小鼠acsf清洗三次，這表明自癌細(xì)胞更堿性之后熒光達(dá)到其最大熒光。最少監(jiān)測(cè)10分鐘的phi的光學(xué)記錄以代表穩(wěn)定態(tài)。

mda-mb-231的phi的光學(xué)記錄：將dcfda儲(chǔ)備溶液稀釋于3ml小鼠acsf溶液中至10μm的濃度。每30秒，mba-md-231細(xì)胞分別在40倍放大率下分別被495nm/440nm持續(xù)閃爍900/700ms時(shí)間，在10倍放大率下每個(gè)波長下被持續(xù)閃爍2秒。在觀察熒光的穩(wěn)定態(tài)后，將細(xì)胞用小鼠acsf清洗三次，這表明自癌細(xì)胞更堿性之后熒光達(dá)到其最大熒光。最少監(jiān)測(cè)10分鐘的phi的光學(xué)記錄以代表穩(wěn)定態(tài)。

用于pc12的局部酸化的nba負(fù)載：將75μl的nba儲(chǔ)備溶液與3ml的小鼠acsf混合，并對(duì)pc12細(xì)胞使用浴10分鐘。在使用浴后，將細(xì)胞用小鼠acsf至少清洗3次。將pc12細(xì)胞使用各種閃光模式暴露于uv光。在每次暴露后，監(jiān)測(cè)ph2分鐘以量化phi酸化。

用于mcf-7的局部酸化的nba負(fù)載：將75μl的nba儲(chǔ)備溶液與3ml的小鼠acsf混合，并對(duì)mcf-7細(xì)胞使用浴10分鐘。在使用浴后，將細(xì)胞用小鼠acsf至少清洗3次。將mcf-7細(xì)胞暴露于60-30-60的uv光模式。在每次暴露后，監(jiān)測(cè)ph2分鐘以量化phi酸化。

用于mda-mb-231的局部酸化的nba負(fù)載：將75μl的nba儲(chǔ)備溶液與3ml的小鼠acsf混合，并對(duì)mda-mb-231細(xì)胞使用浴10分鐘。在使用浴后，將細(xì)胞用小鼠acsf至少清洗3次。將mda-mb-231細(xì)胞暴露于60-30-60的uv光模式。在每次暴露后，監(jiān)測(cè)ph2分鐘以量化phi酸化。

pc12的細(xì)胞死亡量化：在uv閃光模式誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酸中毒后一小時(shí)，將細(xì)胞輕輕清洗，用磷脂酰絲氨酸指示劑膜聯(lián)蛋白valexafluor568替換介質(zhì)。使用10μl的儲(chǔ)備溶液制備該溶液并在2ml的小鼠acsf中稀釋。使得膜結(jié)合15分鐘，然后在之后一小時(shí)監(jiān)測(cè)熒光，或直到所有細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞凋亡。

mcf-7的細(xì)胞死亡量化：在uv閃光模式后，觀察到氣泡存在，使用dcfda熒光隨著其擴(kuò)張獲得氣泡內(nèi)膨脹空間（phb）中ph的記錄。使用dcfda熒光看到的氣泡顯示了連續(xù)的擴(kuò)張且尺寸從未減少?；诿枋銎鹋菔遣豢赡嫠劳鲞^程的先前公開的發(fā)現(xiàn)（andrade等人，biologyofthecell，2010，102(1):25-35），本發(fā)明量化了作為細(xì)胞死亡的氣泡。

mda-mb-231的細(xì)胞死亡量化：在uv閃光模式誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酸中毒一小時(shí)后，將細(xì)胞輕輕清洗，用磷脂酰絲氨酸指示劑膜聯(lián)蛋白valexafluor568替換介質(zhì)。使用10μl的儲(chǔ)備溶液制備該溶液并在2ml的小鼠acsf中稀釋。使得膜結(jié)合15分鐘，然后在之后的一小時(shí)監(jiān)測(cè)熒光，或直到所有細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞凋亡。如mcf-7細(xì)胞，基于描述起泡是不可逆死亡過程的先前公開的發(fā)現(xiàn)（andrade等人，biologyofthecell，2010，102(1):25-35），本發(fā)明量化了作為細(xì)胞死亡的氣泡。

阿米洛利應(yīng)用：在ph7.4下，nhe1阻隔劑阿米洛利被浴使用于濃度為1μm至1mm的mcf-7細(xì)胞。細(xì)胞用dcfda、nba負(fù)載后，分別清洗，暴露于uv模式，記錄phb。

納米顆粒應(yīng)用：多種稀土元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換核的納米顆粒用各種親水性生物相容的聚合物例如聚乙二醇（peg）涂覆，合成細(xì)胞膜介導(dǎo)的聚合物并將其引入至mcf-7癌細(xì)胞。測(cè)試的兩種顆粒由kyb2f7或nayf4構(gòu)成。將這些癌細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中與納米顆粒一起培養(yǎng)10分鐘至1周。當(dāng)準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)時(shí)，用小鼠acsf清洗癌細(xì)胞五次并放置在顯微鏡下，然后如先前提到的相同過程負(fù)載dcfda。將980nm二極管激光器的連續(xù)波對(duì)準(zhǔn)記錄phi的細(xì)胞區(qū)域并設(shè)置到400或700mw。手動(dòng)控制激光快門暴露10分鐘或20分鐘。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)：通過移動(dòng)10mm或更多而遠(yuǎn)離uv或980nm暴露區(qū)域來實(shí)施每個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。進(jìn)行phi的記錄以檢測(cè)nba或納米顆粒是否影響了細(xì)胞或平板外圍是否非有意地釋放氫。使用膜聯(lián)蛋白valexafluor568和dcfda光學(xué)記錄進(jìn)行細(xì)胞凋亡和/或氣泡的檢測(cè)。在以下條件下進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)：?jiǎn)为?dú)響應(yīng)于uv、單獨(dú)響應(yīng)于時(shí)間、和單獨(dú)響應(yīng)于nba。每個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最少3小時(shí)。

結(jié)果

dcfda校準(zhǔn)：將暴露于ph特異性的尼日利亞菌素溶液的細(xì)胞的放射熒光用于構(gòu)建dcfda校準(zhǔn)曲線。在2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、或8.0的ph下記錄單種細(xì)胞的比率計(jì)熒光。當(dāng)暴露于ph特異性的尼日利亞菌素溶液時(shí)，每個(gè)ph單位代表樂光學(xué)記錄一些細(xì)胞并監(jiān)測(cè)穩(wěn)定態(tài)的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)（圖3a）。將數(shù)據(jù)制圖并用r平方值揭示最佳擬合的線（y=-0.1356x2+2.62x–3.6204）（r²=0.93），允許放射熒光未來向phi轉(zhuǎn)化。在完成校準(zhǔn)后，應(yīng)用于每個(gè)實(shí)驗(yàn)的公式顯示了平均初始phi為7.7。

在pc12細(xì)胞中誘導(dǎo)的酸中毒：通過光學(xué)記錄從nba釋放質(zhì)子之前和之后來自體外單獨(dú)pc12細(xì)胞（n=423）的phi，本發(fā)明評(píng)價(jià)了光活性nba在局部引起顯著的細(xì)胞內(nèi)酸中毒的能力。在用dcfda負(fù)載之后，在將細(xì)胞暴露于350nm波長uv光的變化閃光時(shí)間模式之前，記錄放射的熒光比例。在施用nba之后和光解之前的pc12細(xì)胞的平均phi（7.55±0.025）與用uv暴露的nba光解之后的平均phi（6.37±0.03；p＜0.001）顯著不同。經(jīng)處理的phi的變化（δphi）被歸一化為從處理之前的phi的變化（δphi=1.18）。

pc12細(xì)胞死亡的量化。在pc12細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)局部酸化后，將膜聯(lián)蛋白valexafluor568浴應(yīng)用以標(biāo)記產(chǎn)生于細(xì)胞凋亡的磷脂酰絲氨酸膜轉(zhuǎn)化，并指示細(xì)胞凋亡。為了表明細(xì)胞凋亡的熒光，在nba存在下在閃光光解后監(jiān)測(cè)細(xì)胞至少一小時(shí)。本發(fā)明觀察到了酸中毒跨度為76%至100%（n=362；r2=0.98），平均酸中毒為84.0%±1.33%。這些數(shù)據(jù)隨著時(shí)間的線性回歸分析表明響應(yīng)于來自nba閃光光解的酸中毒的2小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡（p＜0.01）。用nba處理的平均細(xì)胞凋亡百分比（84.0±1.33%）顯著大于將pc12細(xì)胞暴露于uv光而無nba的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（n=76；r2=-0.54；p＜0.001）。顯示了單獨(dú)響應(yīng)于uv暴露的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比為2.3%至10.3%，平均百分比為6.4%±1.0%。用nba和uv處理的細(xì)胞凋亡百分比（p＜0.01）也顯著大于將細(xì)胞暴露于既無nba又無uv光（即，單獨(dú)響應(yīng)于時(shí)間作用；n=71；r2=0.92）的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。顯示了單獨(dú)響應(yīng)于時(shí)間的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比為3.1%至4.5%，平均百分比為3.8%±0.4%。顯示了單獨(dú)響應(yīng)于nba的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞百分比為2.1%（n=47）。線性回歸分析表明單獨(dú)響應(yīng)于uv暴露、單獨(dú)響應(yīng)于時(shí)間、單獨(dú)響應(yīng)于nba的細(xì)胞凋亡的百分比顯著低于響應(yīng)于nba和uv處理的細(xì)胞凋亡百分比（p＜0.01）。對(duì)照實(shí)驗(yàn)彼此無顯著區(qū)別（p＜0.01）。

在mcf-7細(xì)胞中引起的酸中毒：在評(píng)價(jià)nba局部降低pc12細(xì)胞中phi的能力之后，對(duì)mcf-7乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)過程。在nba閃光光解之前和之后獲取放射的熒光比例以監(jiān)測(cè)phi。在用nba負(fù)載細(xì)胞之后和60-30-60的uv閃光模式之前，mcf-7細(xì)胞的平均phi（7.38±0.13；n=76）與在nba存在下的閃光模式之后細(xì)胞的平均phi（6.22±0.15）顯著不同。將處理的phi的變化歸一化為處理前phi的變化。后處理平均δphi（1.16個(gè)ph單位）與處理前平均phi顯著不同（p＜0.001）。

mcf-7細(xì)胞死亡的量化：在mcf-7細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)局部酸化后，將膜聯(lián)蛋白valexafluor568浴應(yīng)用以標(biāo)記來自細(xì)胞凋亡的磷酯酰絲氨酸膜反轉(zhuǎn)，并指示細(xì)胞凋亡。為了表明細(xì)胞凋亡得熒光，在存在nba的閃光光解之后監(jiān)測(cè)細(xì)胞至少一小時(shí)。還觀察到mcf-7細(xì)胞一旦局部細(xì)胞內(nèi)酸化則顯示細(xì)胞起泡，在無膜聯(lián)蛋白valexafluor568存在下不顯示熒光，直到氣泡從細(xì)胞完全分離或在處理后幾個(gè)小時(shí)（1至6小時(shí)）。如先前所討論的，研究表明起泡是細(xì)胞凋亡的指示。一旦形成，以時(shí)間為函數(shù)，計(jì)數(shù)氣泡數(shù)量作為細(xì)胞死亡的另一個(gè)指示。雖然先前的研究表明一旦ncx1活化，通常存在氣泡尺寸的減?。▂i等人，2012），但是本發(fā)明未觀察到響應(yīng)于本發(fā)明的nba-uv治療的隨時(shí)間氣泡的出現(xiàn)或尺寸的任何減少。響應(yīng)于nba閃光光解，本發(fā)明觀察到細(xì)胞凋亡的范圍，正如經(jīng)由細(xì)胞起泡表明的和/或經(jīng)由膜聯(lián)蛋白v熒光表明的細(xì)胞凋亡，跨度為94.9%至100%（n=262；r2=0.92），隨時(shí)間平均凋亡為98.3%±0.3%。線性回歸分析揭示了單獨(dú)暴露于uv光的mcf-7細(xì)胞在2小時(shí)的細(xì)胞凋亡百分比（7.1%）的顯著減少（p＜0.01）。單獨(dú)暴露于nba的mcf-7細(xì)胞中觀察到的細(xì)胞凋亡百分比（2.3%，n=236，r2=0.87）顯著低于（p＜0.0001）用nba和uv光處理的mcf-7細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的百分比。本發(fā)明的評(píng)估單獨(dú)響應(yīng)于時(shí)間的細(xì)胞凋亡百分比的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（n=20）揭示了2小時(shí)無細(xì)胞凋亡。因?yàn)楸景l(fā)明的結(jié)果完全未產(chǎn)生細(xì)胞死亡，因此未進(jìn)行線性回歸。

在mda-mb-231細(xì)胞中引起的酸中毒：在評(píng)估nba局部降低pc12細(xì)胞和mcf-7細(xì)胞兩者中的phi的能力之后，對(duì)高度攻擊性、三陰性的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)過程。在nba閃光光解之前和之后獲取放射的熒光比例以監(jiān)測(cè)phi。在用nba負(fù)載細(xì)胞之后和60-30-60的uv閃光模式之前，mda-mb-231細(xì)胞的平均phi（6.47±0.06；n=38）與在nba存在下的閃光模式之后細(xì)胞的平均phi（2.78±0.23）顯著不同（p<0.001）。處理后平均δphi（3.68±0.18個(gè)ph單位）與處理前平均phi顯著不同（p＜0.001）。

mda-mb-231細(xì)胞死亡的量化：在mda-mb-231細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)局部酸化后，將膜聯(lián)蛋白valexafluor568浴應(yīng)用以標(biāo)記來自細(xì)胞凋亡的磷脂酰絲氨酸膜反轉(zhuǎn)，并指示細(xì)胞凋亡。為了表明細(xì)胞凋亡的熒光，在nba存在下的閃光光解后監(jiān)測(cè)細(xì)胞至少1小時(shí)。還觀察到一旦局部細(xì)胞內(nèi)酸化后mda-mb-231細(xì)胞顯示了細(xì)胞起泡，在膜聯(lián)蛋白valexafluor568存在下未顯示熒光，直到氣泡完全從細(xì)胞分離或處理之后幾小時(shí)后（1至6小時(shí)）。如先前所討論的，研究表明起泡是細(xì)胞凋亡的指示。類似于本發(fā)明的mcf-7結(jié)果，正如通過細(xì)胞起泡和/或經(jīng)由響應(yīng)于nba的閃光光解的膜聯(lián)蛋白v的熒光的細(xì)胞凋亡所表明的，mba-mb-231細(xì)胞證實(shí)了細(xì)胞凋亡的范圍（圖18）。在nba閃光光解后不到3小時(shí)，本發(fā)明觀察到55.3%的mda-mb-231細(xì)胞死亡。

實(shí)施例2

在mcf-7細(xì)胞死亡中納米顆粒誘導(dǎo)的酸中毒：合成幾種上轉(zhuǎn)換納米顆粒并用nba負(fù)載以輸送至mcf-7癌細(xì)胞。選擇的納米顆粒由用于nba負(fù)載的peg涂覆的kyb2f7核構(gòu)成（圖14a）。在將mcf-7細(xì)胞用dcfda負(fù)載后，將納米顆粒超聲處理并浴應(yīng)用至細(xì)胞（n=618）10分鐘。然后將980nm二極管激光器對(duì)準(zhǔn)顯微鏡視野范圍內(nèi)的細(xì)胞。收集30分鐘的phi記錄以監(jiān)測(cè)納米顆粒是否影響ph或是否有細(xì)胞毒性；在時(shí)間框內(nèi)結(jié)果未產(chǎn)生細(xì)胞毒性。然后在400mw的用于轉(zhuǎn)移至nba的熒光共振能下，將細(xì)胞暴露于的980nm波長10分鐘，該熒光共振能充分低于人細(xì)胞可忍受的強(qiáng)度（idris等人，naturemedicine，2012，18(10):1580-85）。然后在接下來172分鐘，監(jiān)測(cè)mcf-7細(xì)胞的phi的變化和表明細(xì)胞死亡的細(xì)胞氣泡的形成。在記錄和應(yīng)用膜聯(lián)蛋白valexafluor568之后，記錄95.1%的細(xì)胞死亡。在圖17中示出的了響應(yīng)于kyb2f7納米顆粒的光上轉(zhuǎn)換的mcf-7乳腺癌細(xì)胞死亡百分比的量化。

測(cè)試的第二納米顆粒使用了介孔二氧化硅涂覆的kyb2f7核。將這些納米顆粒添加到mcf-7細(xì)胞并監(jiān)測(cè)細(xì)胞毒性四天時(shí)間。細(xì)胞增殖非常好并顯示了最小的細(xì)胞死亡。然后將暴露于nba納米顆粒的mcf-7細(xì)胞用dcfda負(fù)載并監(jiān)測(cè)10分鐘。將細(xì)胞暴露于700mw設(shè)置下的980nm激光10分鐘。然后本發(fā)明記錄了10分鐘時(shí)間段沒有激光暴露的phi。然后本發(fā)明將mcf-7細(xì)胞暴露于980nm第二個(gè)10分鐘。然后在最后一個(gè)激光激發(fā)后監(jiān)測(cè)細(xì)胞3小時(shí)，記錄每30秒的dcfda熒光。使用該納米顆粒的nba的光上轉(zhuǎn)換通過膜完整性的損失（膜聯(lián)蛋白v熒光）或起泡得到98.7%的細(xì)胞死亡（n=326）。該實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照區(qū)域大約遠(yuǎn)離激光暴露的細(xì)胞10mm。將該對(duì)照區(qū)域中的mcf-7細(xì)胞暴露于納米顆粒4天，但不暴露于980nm激光。膜聯(lián)蛋白v表達(dá)或細(xì)胞起泡表明在這些對(duì)照細(xì)胞中5.78%的細(xì)胞死亡（n=190）。

實(shí)施例3

在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，將2-硝基苯甲醛用于局部誘導(dǎo)體系中的酸中毒。證明nba釋放質(zhì)子用于體系例如細(xì)胞內(nèi)空間酸化的能力是有必要的。進(jìn)行構(gòu)思驗(yàn)證試驗(yàn)，其顯示：

通過使用比率計(jì)ph敏感的熒光染料，本發(fā)明可以證明nba可以釋放質(zhì)子并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的酸中毒。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，用比率計(jì)熒光染料dcfda負(fù)載pc12細(xì)胞。dcfda用于在2.0至7.0的寬ph范圍下測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)ph（phi）的變化（圖3a，圖3b）。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，在室溫下將nba（1mm）浴應(yīng)用至pc12細(xì)胞，并使其被動(dòng)擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜。在用閃光光解模式的nba光活化前，獲取放射的熒光比例（圖15）。在將nba暴露于350nm波長的uv光后，也記錄放射的熒光比例。使用熒光顯微法，本發(fā)明可以光學(xué)記錄和量化phi的變化。

如先前所描述的，將nba浴應(yīng)用至pc12細(xì)胞10分鐘，以使其穿過細(xì)胞膜而充分?jǐn)U散。然后將細(xì)胞暴露于350nm的uv光的不同時(shí)間模式。觀察nba閃光光解以誘導(dǎo)1.18個(gè)ph單位的平均酸中毒（n=421；圖8）。細(xì)胞內(nèi)酸化的量級(jí)可以與將nba暴露于uv光的時(shí)間量有關(guān)，其提供本發(fā)明控制誘導(dǎo)酸中毒程度的能力（kohse，jamchemsoc.2013，135(25):9407-11）（圖15）。nba的單一制備可以誘導(dǎo)在uv閃光光解之后的多次酸中毒。進(jìn)行觀察pc12細(xì)胞經(jīng)受生理學(xué)范圍7.5至3.5的phi變化的試驗(yàn)（圖15）。細(xì)胞內(nèi)酸中毒的量級(jí)與閃光光解模式有關(guān)。本發(fā)明具有誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酸中毒遠(yuǎn)離細(xì)胞活性和最優(yōu)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能的生物學(xué)范圍的能力。用uv光的nba質(zhì)子釋放是誘導(dǎo)體系內(nèi)酸中毒的可重現(xiàn)的和一致性的方法。

實(shí)施例4

在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，本發(fā)明證明了暴露于閃光光解的細(xì)胞內(nèi)nba導(dǎo)致局部地細(xì)胞損傷和死亡。使nba被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入pc12細(xì)胞并暴露于閃光光解模式，其導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子的局部釋放。dcfda被用于光學(xué)地記錄響應(yīng)于在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的nba質(zhì)子釋放的比率計(jì)熒光。閃光光解之前的平均phi到閃光光解之后的平均phi顯著減少了1.18個(gè)ph單位（圖8）。由phi中顯著下降導(dǎo)致的細(xì)胞死亡通過用膜聯(lián)蛋白valexafluor568和乙啡啶同源二聚體iii兩種染料的熒光標(biāo)記而量化，所述兩種染料分別響應(yīng)細(xì)胞凋亡和壞死發(fā)出可識(shí)別的熒光。在經(jīng)歷酸中毒后，以時(shí)間為函數(shù)記錄由于細(xì)胞凋亡的熒光量（圖5）。相似地，在經(jīng)歷酸中毒后，以時(shí)間為函數(shù)記錄由于細(xì)胞壞死的熒光量（圖6）。在nba的閃光光解之后，由于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡平均百分比與將細(xì)胞單獨(dú)暴露于dcfda、單獨(dú)暴露于nba或單獨(dú)暴露于時(shí)間的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中由于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡平均百分比顯著不同（圖7）。

從phi局部減少直接導(dǎo)致的功能性的最佳生物學(xué)范圍之外的點(diǎn)，pc12細(xì)胞在閃光光解的1至4小時(shí)內(nèi)顯示了細(xì)胞損傷和死亡（圖7）。該細(xì)胞死亡和損傷可以是對(duì)細(xì)胞器的ph誘導(dǎo)損傷和/或通過ph誘導(dǎo)的酶功能或蛋白質(zhì)相互作用的改變的結(jié)果。未暴露于閃光光解的對(duì)照區(qū)域中的pc12細(xì)胞未顯示顯著量的細(xì)胞死亡（圖7）。這些數(shù)據(jù)表明由uv光暴露產(chǎn)生的nba質(zhì)子釋放是終結(jié)細(xì)胞作用機(jī)理的快速和局部的方法。

實(shí)施例5

用nba的本發(fā)明治療引起了細(xì)胞內(nèi)ph（phi）的下降（圖12），其引起了在mcf-7乳腺癌細(xì)胞中局部的和顯著的細(xì)胞死亡。一旦細(xì)胞用nba處理，phi的這種改變是通過其暴露于uv光的時(shí)間量確定的，并且可以產(chǎn)生在生物學(xué)ph范圍內(nèi)的輕微酸中毒?？梢哉T導(dǎo)酸中毒使得細(xì)胞內(nèi)ph不再處于正常的生物學(xué)范圍內(nèi)（ravindran，journalofhealthcareforthepoorandunderserved，2011.22(4):174-186）。進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)以測(cè)試在mcf-7細(xì)胞中nba的毒性和擴(kuò)散。用熒光染料dcfda監(jiān)測(cè)細(xì)胞的phi，對(duì)照試驗(yàn)測(cè)試單獨(dú)dcfda、單獨(dú)nba、單獨(dú)uv閃光的毒性。還進(jìn)行時(shí)間的對(duì)照實(shí)驗(yàn)以確定在其他對(duì)照中所見的死亡是否歸因于所培養(yǎng)的細(xì)胞不在培養(yǎng)皿中的時(shí)間。在將細(xì)胞暴露于實(shí)驗(yàn)條件和獲取大約2小時(shí)的記錄后，使用膜聯(lián)蛋白valexafluor568和光學(xué)氣泡監(jiān)測(cè)以觀察細(xì)胞凋亡。在僅暴露于條件之一的細(xì)胞中，觀察到的細(xì)胞凋亡相比于用nba和uv兩者處理的細(xì)胞中細(xì)胞死亡或經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的百分比是最小的（圖13）。

本發(fā)明的新技術(shù)會(huì)引起phi的快速和局部減少以誘導(dǎo)細(xì)胞中的細(xì)胞死亡，所述細(xì)胞擅長回避正常的細(xì)胞凋亡機(jī)理例如癌癥。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以顯示局部的細(xì)胞內(nèi)酸化足夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，是至今癌癥研究者回避的功績(jī)。在暴露于處理的mcf-7細(xì)胞中，其細(xì)胞膜不經(jīng)歷會(huì)導(dǎo)致膜反轉(zhuǎn)的正常細(xì)胞凋亡機(jī)理，使得用膜聯(lián)蛋白v能夠檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在癌細(xì)胞的情況下，膜在不同各種區(qū)域膨脹和顯示細(xì)胞起泡，這是未在pc12實(shí)驗(yàn)中看見的現(xiàn)象。關(guān)于氣泡形成機(jī)理的文獻(xiàn)是有限的，然而，已經(jīng)報(bào)道了細(xì)胞起泡是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的不可逆過程的信號(hào)（andrade等人，biologyofthecell，2010，102(1):25-35）。因此在許多mcf-7實(shí)驗(yàn)中，將氣泡的出現(xiàn)與膜聯(lián)蛋白v一起用于確定細(xì)胞死亡的百分比。

本發(fā)明的結(jié)果顯示了局部的、受控的和極快的死亡過程（圖13）。一旦將在nba中培養(yǎng)的細(xì)胞暴露于uv，在幾分鐘內(nèi)看見phi顯著降低至生物學(xué)范圍外、細(xì)胞起泡和形態(tài)的變化，在2小時(shí)內(nèi)的死亡百分比高于90%。暴露于nba但未暴露于uv閃光的細(xì)胞（對(duì)照區(qū)域）具有正常生物學(xué)范圍內(nèi)的phi值，而暴露于uv的鄰近細(xì)胞經(jīng)歷了細(xì)胞起泡，并當(dāng)用膜聯(lián)蛋白v成像時(shí)顯示了細(xì)胞死亡。該細(xì)胞死亡和損傷可以是ph誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞器的損傷的結(jié)果和/或經(jīng)由ph誘導(dǎo)的酶功能或蛋白質(zhì)相互作用的改變的結(jié)果。如經(jīng)治療的細(xì)胞，在相同的35mm培養(yǎng)皿中評(píng)估大約離治療區(qū)域10mm的對(duì)照區(qū)域。盡管接近治療區(qū)域，對(duì)照區(qū)域并未顯示出在治療區(qū)域中所見的細(xì)胞凋亡水平（圖13），顯示了這些治療的局部性質(zhì)。

實(shí)施例6

本發(fā)明用nba治療引起了細(xì)胞內(nèi)ph（phi）的降低，其引起了在高度攻擊性的三陰性mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞中局部的和顯著的細(xì)胞死亡。phi的這種改變是通過一旦將細(xì)胞用nba處理，將其暴露于uv光的時(shí)間量確定的，并且可以產(chǎn)生在生物學(xué)ph范圍內(nèi)的輕微酸中毒，或在生物學(xué)范圍外的嚴(yán)重酸中毒。本發(fā)明證明了在暴露于nba和閃光光解模式的攻擊性的三陰性乳腺癌細(xì)胞中引起55.3%的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡的能力，暴露于nba和閃光光解模式引起3.68±0.18個(gè)ph單位的phi顯著降低（p＜0.001）。

實(shí)施例7

本發(fā)明描述了引起新的正反饋系統(tǒng)的細(xì)胞的發(fā)明治療，其促進(jìn)細(xì)胞死亡，該正反饋路徑可以起到在顯示對(duì)普通療法耐藥性的任意細(xì)胞例如多藥耐藥性癌癥和抗生素抵抗細(xì)菌中引起細(xì)胞死亡的有利機(jī)理的作用。

在mcf-7細(xì)胞中所描述的正反饋路徑，其在響應(yīng)于uv閃光的nba的細(xì)胞內(nèi)h⁺顯著增加后發(fā)生。圖2.1示出了將細(xì)胞內(nèi)nba暴露于350nm波長uv閃光模式，引起在細(xì)胞內(nèi)空間中質(zhì)子濃度的突然增加和伴隨的滲透水損失或細(xì)胞體積變化。細(xì)胞內(nèi)h⁺的增加活化nhe1以擠出質(zhì)子交換鈉離子（圖2.2a）。鈉離子充當(dāng)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，吸引水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)高鈉濃度的區(qū)域。水移動(dòng)至高na⁺區(qū)域，或水的擠出導(dǎo)致細(xì)胞壁的變形和/或細(xì)胞收縮。細(xì)胞壁的變形導(dǎo)致酪氨酸激酶jak-2的磷酸化和活化（garnovskaya等人，jbiolchem.2003，278(19)：16908-15）（圖2.2b）。響應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)h⁺的nhe1持續(xù)活化造成了細(xì)胞內(nèi)滲透壓增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜向外突出，或氣泡（圖2.3）nhe1的活性試圖補(bǔ)償細(xì)胞內(nèi)的聚集酸中毒，引起細(xì)胞內(nèi)na⁺水平上升，進(jìn)一步促進(jìn)其中的液體靜壓力和隨后的氣泡大小。響應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)na⁺濃度的局部增加，鈉鈣交換體1（ncx1）逆轉(zhuǎn)交換活性（yi等人，j.biolchem.2012，287(13):10316-24)，leadingtotheeffluxofna⁺andinfluxofca²⁺）（圖2.4a）。經(jīng)磷酸化的jak-2和鈣調(diào)蛋白（cam；圖2.4b）的絡(luò)合增加jak-2依賴的cam的酪氨酸磷酸化。經(jīng)磷酸化的cam與nhe1的c末端結(jié)合，組成性地激活nhe1（garnovskaya等人，jbiolchem.2003，278(19):16908-15）。通過ncx1逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞內(nèi)ca²⁺增加促進(jìn)了ca²⁺與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合，不取決于cam的磷酸化狀態(tài)。磷酸化的cam（garnovskaya等人，jbiolchem.2003，278(19):16908-15）和鈣化的cam（等人，jbiolchem.2011，286(47):40954-61）都增加了nhe1的活性，同時(shí)cam的磷酸化和鈣化的組合（圖2.5）賦予了cam與nhe1的最高親和力（等人，jbiolchem.2011，286(47):40954-61）（圖2.6a），從而促進(jìn)了nhe1的最大活化（等人，jbiolchem.2011，286(47):40954-61）。盡管經(jīng)由ncx1擠出na⁺，通過磷酸化-鈣化的cam促進(jìn)了維持nhe1的活性，導(dǎo)致ca²⁺的進(jìn)一步進(jìn)入（圖2.6b和2.6c）。本發(fā)明提出由nba閃光光解誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)h⁺的超生物學(xué)增加導(dǎo)致nhe1、jak-2和ncx1的細(xì)胞收縮，隨之激活；創(chuàng)建正反饋的新路徑，這最終導(dǎo)致增加的細(xì)胞內(nèi)滲透壓、細(xì)胞氣泡和細(xì)胞膜的潛在破裂。本發(fā)明提出該正反饋路徑還會(huì)在殺死多藥耐藥性癌癥中有效，特別考慮到多藥耐藥性癌癥中nhe1的增加表達(dá)（hoffmanandlambert，philosophicaltransactionsoftheroyalsocietylondonbiologicalsciences，2014，369(1638):20130109）。

實(shí)施例8

本發(fā)明描述了發(fā)明治療會(huì)使本發(fā)明產(chǎn)生單獨(dú)phi的適度、逐漸和精確降低，使phi的變化量級(jí)與改編小鼠脾cd45+細(xì)胞至可塑狀態(tài)的產(chǎn)量百分比有關(guān)。

實(shí)施例9

本發(fā)明的發(fā)明技術(shù)對(duì)顯著減少體內(nèi)癌腫瘤的生長是有效的。本發(fā)明將攻擊性的三陰性乳腺癌mda-mb-231-gfp（2×10⁶個(gè)細(xì)胞）注射到5周齡雌性裸鼠的乳腺脂肪墊中。在注射后大約一周之后出現(xiàn)腫瘤。一旦腫瘤達(dá)到并維持5mm的長度連續(xù)兩天則開始治療。小鼠接受將0.1ml的acsf注射至腫瘤的對(duì)照治療或在注射0.1ml的nba（1mm）后光活化的一次治療。如下進(jìn)行nba/光活化治療：在nba注射一小時(shí)后，將動(dòng)物麻醉（1.5%至4%的異氟烷），然后將200μm光纖套管插入腫瘤塊。使用在體外有效的相同照射模式，特別是60秒照射、60秒無照射、30秒照射、60秒無照射和60秒照射，將腫瘤內(nèi)部通過陶瓷套管用405nm光（80mw至85mw）照射。該模式被稱作“60-30-60”照射模式。

每日測(cè)量腫瘤以使用以下公式計(jì)算腫瘤體積變化：

腫瘤體積（tv）=長度×寬度²/2。

將腫瘤體積的變化百分比通過歸一化變化百分比為在治療當(dāng)天記錄的腫瘤體積來計(jì)算。使用數(shù)碼游標(biāo)卡尺對(duì)對(duì)照的和nba光治療的小鼠進(jìn)行每日的腫瘤測(cè)量。本發(fā)明觀察到在nba治療的小鼠中腫瘤生長的顯著減少（圖19）。統(tǒng)計(jì)分析表明通過nba光治療的腫瘤的一次治療產(chǎn)生了腫瘤生長（圖20）和腫瘤體積（圖21）變化百分比的顯著減少。當(dāng)與對(duì)照的經(jīng)acsf治療的小鼠中腫瘤生長變化的平均百分比相比時(shí)，一次nba光治療產(chǎn)生了從治療日腫瘤生長變化百分比的顯著減少（圖20）。腫瘤體積變化平均百分比減少的這種“完全響應(yīng)”在最多九天內(nèi)顯著減少（p＜0.05）。

當(dāng)與在對(duì)照的經(jīng)acsf治療的小鼠腫瘤體積相比時(shí)，一次nba光治療產(chǎn)生了腫瘤體積從治療日的顯著減少（圖21）。平均腫瘤體積減少的這種“完全響應(yīng)”在最多13天內(nèi)顯著減少（p＜0.05）。

實(shí)施例10

所描述的發(fā)明技術(shù)對(duì)增加體內(nèi)具有癌癥的動(dòng)物的存活持續(xù)時(shí)間是有效的。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，本發(fā)明證明了在癌癥腫瘤中施用技術(shù)以光活化nba導(dǎo)致動(dòng)物存活的顯著增加。將nba注射到6周齡裸鼠的移植生長的三陰性乳腺癌mda-mb-231腫瘤中。允許1小時(shí)以使nba充分?jǐn)U散到癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)空間。在該1小時(shí)擴(kuò)散時(shí)間段之后，將腫瘤暴露于60-30-60激發(fā)模式（先前所描述的）的405nm光活化的光（85mw）。

在小鼠用nba和光活化的或?qū)φ盏慕?jīng)acsf的一次治療之后，監(jiān)測(cè)其并根據(jù)德克薩斯大學(xué)圣安東尼奧分校的機(jī)構(gòu)動(dòng)物照料和使用委員會(huì)（iacuc）批準(zhǔn)的人道端點(diǎn)將其安樂死。對(duì)照的經(jīng)acsf治療的小鼠（n=4）從治療天起存活平均16.5天±1.66天，從治療的存活天為14至19天。相反的，一次nba治療的小鼠從治療天起存活35.2天±5.70天（圖22）。nba治療的小鼠從治療存活18天至50天。該存活的增加代表由于本發(fā)明的nba治療的結(jié)果，存活能力有113.3%的顯著（p=0.012）增加。