發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及gdf15的新的綴合物及其制備方法和使用方法，所述綴合物具有改善的半衰期和作用持續(xù)時(shí)間。本發(fā)明還涉及新的脂肪酸及其經(jīng)由綴合在延長生物分子的半衰期中的用途。發(fā)明背景肽和蛋白質(zhì)被廣泛用于醫(yī)藥實(shí)施中，由于它們可以通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生，所以可以預(yù)期，它們的重要性在未來數(shù)年將會增加。同樣作為正在進(jìn)行的人基因組研究的結(jié)果，已知的具有令人感興趣的生物活性的內(nèi)源性肽和蛋白質(zhì)的數(shù)量正在快速增加。由于它們的生物活性，這些多肽和蛋白質(zhì)中有許多原則上可用作治療劑。然而，內(nèi)源性肽或蛋白質(zhì)不是總是適宜用作候選藥物，因?yàn)樗鼈兘?jīng)常由于被肽酶快速降解和/或由于腎過濾和尿排泄而具有數(shù)分鐘的半衰期。多肽或蛋白質(zhì)在人血漿中的半衰期的變化是非常大的(從數(shù)分鐘至多于一周)。治療劑的高清除率在希望歷經(jīng)延長時(shí)間段維持其高血液水平的情況中是不便的。目前已經(jīng)用于克服這種缺陷的一種方式是給患者施用大劑量的感興趣的治療性肽或蛋白質(zhì)，以便即使一些治療性肽或蛋白質(zhì)被降解，仍然有足夠的治療性肽或蛋白質(zhì)保持為治療活性的。但是，這種方法對于患者是不舒適的。由于大多數(shù)治療性肽或蛋白質(zhì)不能口服施用，治療性肽或蛋白質(zhì)將必須被連續(xù)輸注，經(jīng)常通過靜脈內(nèi)注射來輸注，或者經(jīng)常通過不方便的皮下注射途徑來施用。經(jīng)常施用的需求還導(dǎo)致很多潛在的肽或蛋白質(zhì)治療劑具有不可接受的高的預(yù)計(jì)治療成分。存在大量降解的肽或蛋白質(zhì)還可以產(chǎn)生不期望的副作用。施用不適和高成本是大多數(shù)具有吸引人的生物活性性質(zhì)的治療性肽或蛋白質(zhì)不能被開發(fā)為候選藥物的兩個(gè)原因。因此，延長肽或蛋白質(zhì)的半衰期的一種途徑是以延緩其降解而仍然保持其生物學(xué)活性的方式修飾治療性肽或蛋白質(zhì)。血清白蛋白具有多于一周的半衰期，增加肽或蛋白質(zhì)的血漿半衰期的一種途徑已經(jīng)用結(jié)合血清白蛋白或其它血漿蛋白質(zhì)的化學(xué)實(shí)體將它們進(jìn)行衍生化。然而，仍然需要鑒別出新的半衰期延長部分來修飾治療性生物分子如肽和蛋白質(zhì)以提供較長的體內(nèi)作用持續(xù)時(shí)間并同時(shí)維持低毒性和治療益處。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及包含經(jīng)由連接基與脂肪酸連接的生物分子的綴合物，其中所述脂肪酸具有如下的式a1、a2或a3：r1是co2h或h；r2、r3和r4相互獨(dú)立地是h、oh、co2h、-ch＝ch2或-c＝ch；ak是支鏈c6-c30亞烷基；n、m和p相互獨(dú)立地是6至30的整數(shù)；或其酰胺、酯或可藥用鹽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，式a1、a2和a3脂肪酸當(dāng)經(jīng)由連接基與感興趣的生物分子綴合時(shí)增加所述生物分子的半衰期的程度比更常用的脂肪酸殘基高得多。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含與式a1脂肪酸連接的生物分子的綴合物，其中r2和r3中至少一個(gè)是co2h。在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，感興趣的生物分子是治療性肽、治療性蛋白質(zhì)或rna。在該實(shí)施方案的另一方面，感興趣的生物分子是肽或多肽。在該實(shí)施方案的還一個(gè)方面，肽或多肽是apj激動(dòng)劑肽、催產(chǎn)素受體激動(dòng)劑肽、serelaxin、npff、pip肽、fgf23肽、agrp肽或生長分化因子15(gdf15)蛋白質(zhì)及其同系物、變體、片段和其它修飾形式。在另一項(xiàng)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的綴合物和一種或多種可藥用載體的藥物組合物。在另一項(xiàng)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的綴合物和一種或多種治療活性劑的藥物組合的組合產(chǎn)品。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式a1、a2或a3脂肪酸。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)注了本文所述的綴合物及其組合物用于治療和/或阻止各種疾病、障礙和病癥和/或其癥狀的用途。例如，本發(fā)明涉及在需要其的受治療者中激活apj受體的方法，該方法包括：給所述受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物，其中生物分子是apj激動(dòng)劑。經(jīng)由激活apj受體，本發(fā)明的綴合物可用于治療急性失代償性心力衰竭(adhf)、慢性心力衰竭、肺動(dòng)脈高壓、心房纖維性顫動(dòng)、brugada綜合征、室性心動(dòng)過速、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維變性、心律失常、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周動(dòng)脈疾病、腦血管意外、短暫性缺血發(fā)作、創(chuàng)傷性腦損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、灼傷(包括曬傷)和先兆子癇。在該實(shí)施方案的優(yōu)選方面，本發(fā)明的綴合物可用于治療急性失代償性心力衰竭(adhf)或慢性心力衰竭。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在需要其的受治療者中激活催產(chǎn)素受體的方法，該方法包括：給所述受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物，其中生物分子是催產(chǎn)素受體激動(dòng)劑肽。經(jīng)由激活催產(chǎn)素受體，本發(fā)明的綴合物可用于治療孤獨(dú)癥(治療性或預(yù)防性)、偏頭痛、注意缺陷多動(dòng)癥(adhd)、對立違抗性障礙(odd)、應(yīng)激、包括創(chuàng)傷后應(yīng)激性障礙、焦慮、包括焦慮障礙和抑郁、精神分裂癥、精神病學(xué)障礙和記憶喪失、酒精戒斷、藥物成癮、prader-willi綜合征、代謝性障礙或疾病、2型糖尿病、肥胖、血脂異常癥、升高的血糖水平、升高的胰島素水平和糖尿病性腎病、纖維肌痛、睡眠障礙、睡眠呼吸暫停、舒張期心力衰竭、尿失禁、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、勃起功能障礙、前列腺肥大綜合征、非酒精性脂肪肝、泌乳功能受損病癥(compromisedlactationconditions)、引產(chǎn)病損、子宮張力缺乏病癥、過量流血、炎癥、疼痛、腹痛、背痛、男性和女性性功能障礙、腸易激惹綜合征(ibs)、便秘、胃腸梗阻、外科手術(shù)失血、產(chǎn)后出血、創(chuàng)傷愈合、感染、乳腺炎、胎盤娩出損害、骨質(zhì)疏松癥；用于診斷癌癥和胎盤功能不全。在該實(shí)施方案的優(yōu)選方面，本發(fā)明的綴合物可用于治療孤獨(dú)癥、焦慮、包括焦慮障礙和抑郁、偏頭痛、adhd、對立違抗性障礙、精神分裂癥、精神病學(xué)障礙、肥胖、泌乳功能受損病癥、引產(chǎn)病損、子宮張力缺乏病癥、過量流血、產(chǎn)后出血。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物可用于治療prader-willi綜合征。在另一項(xiàng)實(shí)施方案、本發(fā)明涉及治療cushing’s綜合征、皮質(zhì)醇增多癥、異位acth綜合征、腎上腺皮質(zhì)質(zhì)量變化、原發(fā)性色素結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)病(ppnad)、carney綜合征(cnc)、皮質(zhì)醇誘導(dǎo)的鹽皮質(zhì)激素過量、與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙相關(guān)的病癥、多毛癥、薄皮膚、肌病、骨質(zhì)疏松癥、組織脆性增加、創(chuàng)傷愈合不佳、高血壓、糖尿病、低血清鉀、低嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞減少的方法，該方法包括：給所述受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物，其中生物分子是agrp肽。在該實(shí)施方案的優(yōu)選方面，本發(fā)明的綴合物可用于治療cushing’s綜合征、皮質(zhì)醇增多癥、異位acth綜合征、骨質(zhì)疏松癥。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防fgf23-相關(guān)性疾病如年齡相關(guān)性病癥(選自少肌癥(sarcopenia)、皮膚萎縮、肌萎縮、腦萎縮、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、免疫無活性、高血壓、癡呆、亨廷頓病、阿爾茨海默病、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、前列腺癌、中風(fēng)、預(yù)期壽命減少、記憶喪失、皺紋、腎功能受損和年齡相關(guān)性聽力損失)、代謝障礙(選自ii型糖尿病、代謝綜合征、高血糖和肥胖)、高磷酸鹽血(腫瘤樣鈣質(zhì)沉著、高磷酸鹽血骨肥厚綜合征)、慢性腎病、慢性腎衰、癌癥、乳癌和/或肌萎縮的方法，該方法包括：給所述受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物，其中生物分子是fgf23肽。在另一項(xiàng)實(shí)施方案、本發(fā)明涉及治療急性心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)降低的慢性心力衰竭(hfref)、射血分?jǐn)?shù)正常的慢性心力衰竭(hfpef)、舒張期功能障礙、心肌梗塞后重塑(postmyocardialremodeling)、絞痛、高血壓、肺高壓、肺動(dòng)脈高壓、纖維變性(彌散性纖維變性、心纖維變性、腎纖維變性、肺纖維變性、肝纖維變性)、硬皮病、創(chuàng)傷愈合、臨界性肢體缺血、外周血管病、間歇性跛行、腎功能不全和慢性腎病的方法，該方法包括：給受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物，其中生物分子是serelaxin肽。在該實(shí)施方案的優(yōu)選方面，本發(fā)明的serelaxin綴合物可用于治療急性心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)降低的慢性心力衰竭(hfref)、射血分?jǐn)?shù)正常的慢性心力衰竭(hfpef)、舒張期功能障礙、心肌梗塞后重塑、絞痛、高血壓、肺高壓或肺動(dòng)脈高壓。在另一項(xiàng)實(shí)施方案、本發(fā)明涉及治療或預(yù)防代謝障礙如2型糖尿病(t2dm)、胰臟β細(xì)胞受損、葡糖耐受不良、高血糖、抗胰島素性、肥胖、血脂異常癥、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、代謝綜合征和其它代謝障礙的方法，該方法包括：給受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物，其中生物分子是pip肽。在另一項(xiàng)實(shí)施方案、本發(fā)明涉及治療或預(yù)防代謝障礙或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂異常癥、非酒精性脂肪性肝炎、抗胰島素性、高胰島素血、葡糖耐受不良、高血糖、代謝綜合征、高血壓、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈疾病、中風(fēng)、心力衰竭、冠心病、糖尿病并發(fā)癥(包括但不限于慢性腎病)、神經(jīng)病、胃輕癱、欲望性尿失禁、鎮(zhèn)靜、神經(jīng)性和炎性痛、記憶喪失和其它代謝障礙的方法，該方法包括：給受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物，其中生物分子是npff肽。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及在需要其的受治療者中治療代謝障礙或疾病、糖尿病、2型糖尿病、肥胖、酒精和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它發(fā)展性肝疾病、胰腺炎、血脂異常癥、抗胰島素性、高胰島素血、葡糖耐受不良、高血糖、代謝綜合征、高血壓、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈疾病、中風(fēng)、心力衰竭、冠心病、糖尿病并發(fā)癥(包括但不限于慢性腎病)、神經(jīng)病、胃輕癱和其它代謝障礙的方法，該方法包括：給所述受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物，其中生物分子是人生長分化因子15(gdf15)、其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式。在隨后的發(fā)明詳述中將闡述本發(fā)明的這些和其它方面。附圖簡述圖1顯示，實(shí)施例24比參比實(shí)施例3更有效地降低了血漿apoc3水平。發(fā)明詳述定義：為了解釋本說明書，將采用以下定義，另有說明除外，并且無論何時(shí)適合時(shí)，以單數(shù)形式使用的術(shù)語也將包括復(fù)數(shù)形式，反之亦然。必須指出，除非上下文另外清楚地指出，否則如本文和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式的實(shí)體、“該”和類似術(shù)語包括復(fù)數(shù)形式。因此，例如，稱謂“綴合物”指一種或多種綴合物；稱謂“多肽”包括一種或多種多肽的稱謂；以此類推。術(shù)語烷基指包含1-30個(gè)碳原子的完全飽和的支鏈或非支鏈(例如直鏈或線性)烴部分。優(yōu)選地，烷基包含5-20個(gè)碳原子、更優(yōu)選10-15個(gè)碳原子。c10-15烷基指包含10-15個(gè)碳的烷基鏈。術(shù)語“亞烷基”指二價(jià)的如上文定義的烷基。術(shù)語“鏈烯基”指具有至少一條碳碳雙鍵的支鏈或非支鏈烴。術(shù)語“c2-30-炔基”指具有2-7個(gè)碳原子并且包含至少一條碳碳三鍵的烴。術(shù)語“炔基”指具有至少一條碳碳三鍵的支鏈或非支鏈烴。術(shù)語“c2-30-炔基”指具有2-7個(gè)碳原子并且包含至少一條碳碳三鍵的烴。術(shù)語“芳基”指在環(huán)部分中具有6-10個(gè)碳原子的單環(huán)或雙環(huán)芳族烴基。芳基的代表性實(shí)例有苯基或萘基。術(shù)語雜芳基包括單環(huán)或雙環(huán)雜芳基，含有5-10個(gè)選自碳原子和1-5個(gè)雜原子的環(huán)成員，每個(gè)雜原子獨(dú)立地選自o、n或s，其中s和n可以被氧化為各種氧化態(tài)。對于雙環(huán)雜芳基系統(tǒng)，該系統(tǒng)為完全芳香性的(即，所有環(huán)為芳香性的)。術(shù)語環(huán)烴基指具有3-12個(gè)碳原子、優(yōu)選3-8個(gè)或3-7個(gè)碳原子的飽和或不飽和、但是是非芳香性的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)烴基團(tuán)。對于雙環(huán)和三環(huán)環(huán)烴基系統(tǒng)，所有環(huán)是非芳香性的。例如，環(huán)烴基包括環(huán)烯基和環(huán)炔基。術(shù)語“環(huán)烯基”指具有至少一條碳碳雙鍵的3-12個(gè)碳原子的雙環(huán)或三環(huán)烴基團(tuán)。術(shù)語“環(huán)炔基”指具有至少一條碳碳三鍵的3-12個(gè)碳原子的雙環(huán)或三環(huán)烴基團(tuán)。術(shù)語雜環(huán)基指含有至少一個(gè)選自o、s和n的雜原子的飽和或不飽和非芳族(部分不飽和，但是是非芳香性的)單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)環(huán)系，其中n和s可以任選被氧化為各種氧化態(tài)。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，雜環(huán)基部分表示含有5-7個(gè)環(huán)原子和任選含有選自o、s和n的另外雜原子的飽和單環(huán)。雜環(huán)可以被烷基、鹵素、氧代基、烷氧基、鹵代烷基、鹵代烷氧基取代。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，雜環(huán)是雙環(huán)或三環(huán)。對于多環(huán)系統(tǒng)，某個(gè)環(huán)可以是芳族的和與一個(gè)或多個(gè)飽和或部分飽和的環(huán)稠合。整個(gè)稠合系統(tǒng)不是完全芳香性的。例如，雜環(huán)系統(tǒng)可以是與飽和或部分飽和環(huán)烴基環(huán)系稠合的芳族雜環(huán)。術(shù)語“綴合物”意欲指生物分子與脂肪酸部分經(jīng)由連接基共價(jià)連接形成的實(shí)體。術(shù)語“綴合”指產(chǎn)生生物分子和脂肪酸部分的共價(jià)連接的化學(xué)反應(yīng)。生物分子:如本文所用的術(shù)語生物分子包括但不限于抗體(例如單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、納米抗體及其片段等)、膽固醇、激素、肽、蛋白質(zhì)、化學(xué)治療劑和其它類型的抗腫瘤劑、低分子量藥物、維生素、輔因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反義核酸、三鏈形成寡核苷酸、反義dna或rna組合物、嵌合dna:rna組合物、等位酶、適體、核酶、誘殺劑及其類似物、質(zhì)粒和其它類型的表達(dá)載體和小核酸分子、rnai劑、短干擾核酸(sina)、信使核糖核酸”(信使rna、mrna)、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微小-rna(mirna)和短發(fā)夾rna(shrna)分子、肽核酸(pna)、鎖定核酸核苷酸(lna)、嗎啉代核苷酸、蘇糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、sisirna(小內(nèi)部節(jié)段干擾rna)、airna(不對稱干擾rna)和在正義鏈和反義鏈之間具有1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)錯(cuò)配的sirna(相關(guān)細(xì)胞和/或組織的那些，例如在細(xì)胞組織、受治療者或生物體中)。這類化合物可以被純化或部分純化，可以是天然存在的或合成的，并且可以是化學(xué)修飾的。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，生物分子是多肽、肽、蛋白質(zhì)或rnai劑、短干擾核酸(sina)、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微小-rna(mirna)或短發(fā)夾rna(shrna)分子。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，生物分子是多肽(或蛋白質(zhì))或肽。多肽或肽的實(shí)例有apj激動(dòng)劑肽、催產(chǎn)素肽、serelaxin、npff、pip肽、fgf23肽、agrp肽和gdf15肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物分子是gdf15多肽及其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式。“核糖核酸”(rna)是通過磷酸二酯鍵連接的核苷酸聚合物，其中每個(gè)核苷酸含有核糖或其修飾形式作為糖組分。核苷酸各自含有腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)或其修飾形式作為堿。mrna分子中的遺傳信息以mrna分子的核苷酸堿基序列進(jìn)行編碼，其被安排為各自由三個(gè)核苷酸堿基組成的密碼子。除了結(jié)束翻譯(蛋白質(zhì)合成)的終止密碼子，每個(gè)密碼子編碼多肽的特定氨基酸。在活細(xì)胞內(nèi)，mrna被運(yùn)輸至核糖體(合成蛋白質(zhì)的位置)，在那里其提供了蛋白質(zhì)合成(翻譯)的遺傳信息。對于更完整的描述，參見albertsb等人(2007)molecularbiologyofcell,第5版,garlandscience。如本文所用的術(shù)語“rnai劑”、“短干擾rna”、“sirna”、“短干擾核酸”、“sina”等指能夠通過以序列特異性方式介導(dǎo)rna干擾(rnai)或基因沉默來抑制或下調(diào)基因表達(dá)或病毒復(fù)制的任意核酸分子。該術(shù)語包括短干擾rna(sirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、微小rna(mirna)、短干擾寡核苷酸、化學(xué)修飾的短干擾核酸分子、sisirna(小內(nèi)部節(jié)段干擾rna)、airna(非對稱感染rna)、在正義鏈和反義鏈之間具有1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)錯(cuò)配的sirna(相關(guān)細(xì)胞和/或組織的那些)、其中在正義鏈和反義鏈之間存在一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的rnai劑、其中正義鏈相對于反義鏈而言非常短和/或具有一個(gè)或多個(gè)單鏈切口的rnai劑或者能夠介導(dǎo)rna干擾的任意其它分子。rnai劑可包含核糖核苷酸，或者在一個(gè)或多個(gè)糖、堿和/或磷酸基上被修飾或取代。作為非限制性的實(shí)例，rnai劑可以在2’位置上被選自如下的2'-修飾所修飾：2'-脫氧基、2'-脫氧基-2'-氟、2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、2’-o-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-o-dmaeoe)和2’-o-n-甲基乙酰氨基(2’-o-nma)。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所有嘧啶(尿苷和胞苷)為2'-o-甲基-修飾的核苷。在各種實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)磷酸基可以被選自如下的經(jīng)修飾的核苷酸間連接基取代：硫代硫酸酯基、二硫代硫酸酯基、氨基磷酸酯基、硼烷膦酸酯基(boranophosphonoate)和酰胺連接基。在各種實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸可以被dna、肽核酸(pna)、鎖定核酸(lna)、嗎啉代核苷酸、蘇糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、阿拉伯糖核酸(ana)、2′-氟阿拉伯糖核酸(fana)、環(huán)己烯核酸(cena)、失水己糖醇核酸(hna)、解鎖定核酸(una)修飾或取代。rnai劑的各種修飾和取代是本領(lǐng)域已知的，可用于本公開文本的內(nèi)容中。sirnas負(fù)責(zé)rna干擾，后者為動(dòng)物和植物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程。sirna通過核糖核酸酶iii裂解由較長的雙鏈rna(dsrna)而天然產(chǎn)生，所述雙鏈rna(dsrna)與沉默的基因靶標(biāo)同源或?qū)ζ涮禺?；人工rnai劑可以通過本領(lǐng)域已知的任意方法產(chǎn)生。如本文所用的術(shù)語"多肽"指通過肽鍵連接的氨基酸的聚合物，無論是天然的還是合成的。少于約10個(gè)氨基酸殘基的多肽通常稱為“肽”。術(shù)語“肽”意欲表示通過肽鍵連接的2個(gè)或更多個(gè)氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然的或非天然的。該術(shù)語囊括術(shù)語多肽和蛋白質(zhì)，它們可以由兩個(gè)或更多個(gè)通過共價(jià)相互作用如半胱氨酸橋或非共價(jià)相互作用結(jié)合在一起的肽組成。本領(lǐng)域公認(rèn)的三字母縮寫或一字母縮寫用于表示構(gòu)成本發(fā)明的肽或多肽的氨基酸殘基。除了當(dāng)以“d”開頭時(shí)，氨基酸是l-氨基酸。當(dāng)所述一字母縮寫為大寫字母時(shí)，其指d-氨基酸。當(dāng)所述一字母縮寫為小寫字母時(shí)，其指l-氨基酸?；鶊F(tuán)或字符串或氨基酸縮寫用于表示肽。應(yīng)指出肽的左側(cè)為n-末端，且序列從n-末端至c-末端書寫。本發(fā)明的肽含有非天然氨基酸(即在自然界中不存在的化合物)，可以供選地采用本領(lǐng)域已知的其它氨基酸類似物。某些非天然氨基酸可以通過如下文獻(xiàn)中記載的技術(shù)引入：deiters等人,jamchemsoc125:11782-11783,2003；wang和schultz,science301:964-967,2003；wang等人,science292:498-500,2001；zhang等人,science303:371-373,2004或美國專利7,083,970。簡言之，這些表達(dá)系統(tǒng)中的一些涉及位置特異性誘變以將無義密碼子如琥珀型tag引入編碼本發(fā)明的多肽的可讀框中。然后，這些表達(dá)載體被引入可利用對所引入無義密碼子特異的trna的宿主中，并加載所選擇的非天然氨基酸。有益于將部分與本發(fā)明的多肽綴合的具體非天然氨基酸包括具有乙炔和疊氮基側(cè)鏈的那些。"蛋白質(zhì)"是包含一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的大分子。那些多肽鏈的每一個(gè)可以與式a1、a2或a3脂肪酸分子綴合。蛋白質(zhì)還可以包含非肽組分，例如碳水化合物基團(tuán)。碳水化合物和其它非肽取代基可以通過產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞而加入蛋白質(zhì)中，并且隨細(xì)胞類型而異。本文根據(jù)它們的氨基酸骨架結(jié)構(gòu)定義蛋白質(zhì)；通常不具體指明取代基如碳水化合物基團(tuán)，但是它們可以存在。非宿主dna分子編碼的蛋白質(zhì)或多肽是"異源性"蛋白質(zhì)或多肽。"分離多肽或分離蛋白質(zhì)"是基本上不含細(xì)胞組分如碳水化合物、脂質(zhì)或其它與天然多肽相關(guān)的蛋白質(zhì)性質(zhì)的雜質(zhì)的多肽或蛋白質(zhì)(例如gdf15)。通常，分離多肽或蛋白質(zhì)的制備物含有高純形式、即至少約80％純、至少約90％純、至少約95％純、高于95％純、例如96％、97％或98％或更純或高于99％純的多肽或蛋白質(zhì)。一種顯示特定蛋白質(zhì)制備物含有分離多肽或蛋白質(zhì)的方式是在蛋白質(zhì)制備物的十二烷基硫酸鈉(sds)-聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色后出現(xiàn)單條。但是，術(shù)語"分離"不排除供選的物理形式如二聚體或供選的糖基化或衍生化形式的相同多肽或蛋白質(zhì)的存在。優(yōu)選地，分離多肽基本上不含在其自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的將干擾其治療、診斷、預(yù)防或研究用途的任意其它污染的多肽或其它污染物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在本文所述的任意多肽或蛋白質(zhì)的序列中進(jìn)行各種氨基酸替換、例如保守氨基酸替換，并且沒有必然地降低其活性。如本文所用的“常用作其取代基的氨基酸”包括保守替換(即用具有相當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)特性的氨基酸替換)。對于保守替換的目的，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性(親水性)天然氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天門冬氨酸和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。氨基酸替換的實(shí)例包括用相應(yīng)的d-氨基酸替換l-氨基酸、用高半胱氨酸或其它具有含硫醇側(cè)鏈的非天然氨基酸替換半胱氨酸、用高賴氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鳥氨酸或其它具有含氨基側(cè)鏈的非天然氨基酸替換賴氨酸或用正纈氨酸替換丙氨酸等。如本文所用的術(shù)語“氨基酸”指天然存在的氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸類似物和以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能的氨基酸模擬物，均為它們的d和l立體異構(gòu)體形式，如果它們的結(jié)構(gòu)允許這樣的立體異構(gòu)形式的話。氨基酸在本文中通過它們的名稱、公知的三字母符號或iupac-iubbiochemicalnomenclaturecommission(生物化學(xué)命名委員會)推薦的一字母符號來稱呼。術(shù)語“天然存在”指在自然界中發(fā)現(xiàn)的和未經(jīng)過人處理的材料。類似地，如本文所用的“非天然存在”、“非天然”等指沒有在自然界中發(fā)現(xiàn)和已經(jīng)被人類進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或合成的材料。當(dāng)用于與氨基酸聯(lián)系時(shí)，術(shù)語“天然存在”指20種常規(guī)氨基酸(即丙氨酸(a或ala)、半胱氨酸(c或cys)、天門冬氨酸(d或asp)、谷氨酸(e或glu)、苯丙氨酸(f或phe)、甘氨酸(g或gly)、組氨酸(h或his)、異亮氨酸(i或ile)、賴氨酸(k或lys)、亮氨酸(l或leu)、甲硫氨酸(m或met)、天冬酰胺(n或asn)、脯氨酸(p或pro)、谷氨酰胺(q或gln)、精氨酸(r或arg)、絲氨酸(s或ser)、蘇氨酸(t或thr)、纈氨酸(v或val)、色氨酸(w或trp)和酪氨酸(y或tyr)。如本文所用的術(shù)語“非天然氨基酸”和“非天然的氨基酸”可互換使用，表示無法使用來自任意生物體的未經(jīng)修飾或經(jīng)修飾的基因(無論相同或不同)在任意生物體中以生物合成方式產(chǎn)生的氨基酸結(jié)構(gòu)。這些術(shù)語指在天然存在(野生型)的蛋白質(zhì)序列或本發(fā)明的序列中不存在的氨基酸殘基。這些包括但不限于不是20種天然存在的氨基酸之一的經(jīng)修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物、硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸(pyl)或吡咯啉-羧基-賴氨酸(pcl，例如描述于pct專利公開wo2010/48582)。此類非天然氨基酸殘基可通過替換天然存在的氨基酸和/或通過將非天然氨基酸插入天然存在(野生型)的蛋白質(zhì)序列或本發(fā)明的序列中而引入。還可摻入非天然氨基酸殘基以賦予分子以預(yù)期的功能，例如，連接官能部分(例如peg)的能力。當(dāng)與氨基酸聯(lián)用時(shí)，符號“u”意指如本文所用的“非天然氨基酸”或“非天然的氨基酸”。如本文提及多肽或蛋白質(zhì)時(shí)所用的術(shù)語"類似物"指其中肽/蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被其它氨基酸殘基替換和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)從肽/蛋白質(zhì)中刪除和/或其中已經(jīng)在肽/蛋白質(zhì)中添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的經(jīng)修飾的肽或蛋白質(zhì)。氨基酸殘基的這種添加或刪除可以在肽的n-末端和/或肽的c-末端發(fā)生。如本文所用的術(shù)語“綴合物的酯”指其中存在羧酸基團(tuán)的酯衍生物(例如c-末端的-co2h已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為-coor)的包含肽或多肽的綴合物，其中所述酯的r表示c1-6烷基基團(tuán)如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等、c3-8環(huán)烴基基團(tuán)如環(huán)戊基、環(huán)己基等、c6-10芳基基團(tuán)如苯基、α-萘基等、c6-10芳基-c1-6烷基基團(tuán)、例如苯基-c1-2烷基基團(tuán)如芐基、苯乙基、二苯甲基等和α-萘基-c1-2烷基基團(tuán)如α-萘基甲基等。當(dāng)綴合物的肽或多肽部分在除c-末端以外的位置具有額外的羧基或羧酸酯基團(tuán)時(shí)，其中這些基團(tuán)被酰胺化或酯化的那些多肽也落入本發(fā)明的多肽的范圍內(nèi)。在此種情形下，這些酯可以例如與上文提及的c-末端酯屬于相同種類的酯。如本文所用的術(shù)語“綴合物的酰胺”指其中存在羧酸基團(tuán)的酰胺衍生物(例如-co2h已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為-co(nr’r’))的包含肽或多肽的綴合物，其中r’是h或r且r如上文所定義。術(shù)語“綴合物的酰胺”還指其中存在氨基基團(tuán)的酰胺衍生物(即不是與脂肪酸綴合的氨基基團(tuán))(例如-nh2已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為-nh-c(o)r)的包含肽或多肽的綴合物，其中r如上文所定義。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，“綴合物的酰胺”是其中c-末端的羧酸基團(tuán)已經(jīng)被酰胺化的包含肽或多肽的綴合物(例如-co2h已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為-c(o)nh2、-c(o)nh-c1-6烷基、-c(o)nh-c1-2烷基苯基或-c(o)n(c1-6烷基)2)。術(shù)語“apj”(也稱為“apelin受體”、“血管緊張素樣-1受體”、“血管緊張素ii-樣1受體”等)表示基因定位于人類11號染色體的長臂上的具有380個(gè)殘基、7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的gi偶聯(lián)受體(ncbi參考序列號:np_005152.1，由ncbi參考序列號:nm_005161編碼)。apj是1993年使用簡并寡核苷酸引物從基因組人類dna首次克隆得到的(o'dowd等人,gene,136:355-60,1993)，與1型血管緊張素ii受體具有顯著同源性。盡管具有這一同源性，然而，血管緊張素ii不結(jié)合apj。盡管作為孤兒多年，但是已經(jīng)分離出內(nèi)源性配體并命名為apelin(tatemoto等人,biochembiophysrescommun251,471-6(1998))。術(shù)語“apj激動(dòng)劑”指apelin多肽：apelin指具有77個(gè)殘基的前蛋白(ncbi參考序列號:np_0059109.3，由ncbi參考序列號:nm_017413.3編碼)，其被加工成apelin肽的生物活性形式，例如apelin-36、apelin-17、apelin-16、apelin-13、apelin-12。全長成熟肽也稱為“apelin-36”，包含36個(gè)氨基酸，但最高效亞型為apelin的13聚體(apelin-13)的焦谷氨酸化形式，其被稱為“pyr-1-apelin-13或pyr1-apelin-13”。不同apelin形式例如描述于美國專利6,492,324b1中。apelin肽激動(dòng)劑還描述于專利申請?zhí)杦o2013/111110、美國申請?zhí)?4/082771和美國臨時(shí)申請?zhí)?1/858263、61/858280和61/858290中，它們引入本文作為參考。術(shù)語“催產(chǎn)素受體激動(dòng)劑肽”或“催產(chǎn)素肽”可互換使用，包括催產(chǎn)素及其類似物。催產(chǎn)素是9個(gè)氨基酸的環(huán)肽激素，具有兩個(gè)半胱氨酸殘基在1位和6位形成二硫橋。人催產(chǎn)素包含序列cys-tyr-ile-gln-asn-cys-pro-leu-gly。術(shù)語“催產(chǎn)素受體激動(dòng)劑肽”還包括維持了生物活性的催產(chǎn)素類似物。這種類似物分子能夠以與內(nèi)源性催產(chǎn)素相似的方法發(fā)揮作用，包括結(jié)合催產(chǎn)素受體。特別感興趣的催產(chǎn)素類似物是pct申請wo2014/095773(特別是實(shí)施例13)中公開的那些；美國專利申請?zhí)杣s2011/044905(特別是實(shí)施例49)中公開的那些；和kazimierzwisniewski等人,journalofmedicinalchemistry2014,57,5306-5317和zbigniewgrzonka等人,journalofmedicinalchemistry1983,26,1786-1787中公開的那些；這些文獻(xiàn)全部引入本文作為參考?！皃ip”或“促乳素誘導(dǎo)肽”指具有g(shù)enbank登記號np_002643的蛋白質(zhì)，其在各種生物過程中展示出作用。pip在本領(lǐng)域還已知為巨囊性病的液狀蛋白-15(gcdfp-15)；分泌性肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(sabp)；腮腺外糖蛋白(extraparotidglycoprotein,ep-gp)；和17-kdacd4-結(jié)合蛋白(gp17)。pip在外分泌器官和在良性和惡性人乳腺腫瘤中表達(dá)。成熟分泌pip蛋白質(zhì)具有13kda的分子量，其在sds-page中顯示為17-20kda多肽，提示了糖基化事件。pip在對人體液有貢獻(xiàn)的大多數(shù)器官中表達(dá)；pip的表達(dá)在唾液腺中是最高的，其次是淚腺、前列腺、肌肉、氣管和乳腺。pip基因編碼pip多肽。如本文所用的“pip肽”指人pip或其保持了人pip的至少一種活性的其同系物、變體、片段或修飾形式。人pip的非限制性實(shí)例的序列如下：seqidno:11:1mrllqllfraspatlllvlclqlgankaqdntrkiiiknfdipksvrpndevtavlavqt61elkecmvvktylissiplqgafnykytaclcddnpktfywdfytnrtvqiaavvdvirel121gicpddaavipiknnrfytieilkve(seqidno:11)seqidno:11表示了全長人野生型pip，包括對功能而言不必需的信號肽(氨基酸1-28)。如本文所用的術(shù)語“pip”的另一個(gè)非限制性實(shí)例是seqidno:11的氨基酸(aa)29-146，其因此缺少信號肽(氨基酸1-28)，在下文作為seqidno:12給出。1qdntrkiiiknfdipksvrpndevtavlavqtelkecmvvktylissiplqgafnykyta61clcddnpktfywdfytnrtvqiaavvdvirelgicpddaavipiknnrfytieilkve(seqidno:12)pip的“同系物”、“變體”、“片段”或“修飾形式”等指與人pip相似、但是不完全相同的多肽，但是其保持了人pip的至少一種活性。這種多肽可具有與人pip的序列(例如seqidno:12)不完全相同的序列，或者具有與人pip的序列(例如seqidno:12)相同的序列、但是以某些其它方式不同(例如翻譯后修飾)。這類多肽可以包括例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的相對于seqidno:12的序列一致性，或者具有最多5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)的相對于seqidno:12的氨基酸序列的氨基酸差異(例如替換、刪除和/或添加)。在一些實(shí)施方案中，pip同系物、變體、片段或修飾形式保持至少90％序列一致性或具有最多25個(gè)相對于seqidno:12的氨基酸差異。pip同系物、變體、片段或修飾形式保持人pip的至少一種活性?！癴gf23”或“成纖維細(xì)胞生長因子23”指還已知為如下的多肽：fgf-23、adhr；fgfn；hpdr2；hypf；phptc；內(nèi)部ids:omim:605380mgi:1891427homologene:10771genecards:fgf23gene；種屬:人；entrez8074；ensemblensg00000118972；uniprot:q9gzv9；refseq(mrna):nm_020638；refseq(蛋白質(zhì)):np_065689；位置(ucsc):chr12:4.48-4.49mb；種屬:小鼠；entrez:64654；ensembl:ensmusg00000000182；uniprot:q9epc2；refseq(mrna):nm_022657；refseq(蛋白質(zhì)):np_073148；位置(ucsc):chr6:127.07-127.08mb。fgf23基因編碼fgf23多肽。如本文所用的“fgf23肽”指人fgf23或其保持了人fgf23的至少一種活性的同系物、變體、片段或修飾形式。包括信號肽在內(nèi)的人fgf23的非限制性實(shí)例的序列顯示在seqidno:9中：seqidno:9表示了全長人野生型fgf23、包括對功能而言不必需的信號肽(氨基酸1-24)。yamashita等人,2000biochem.biophys.res.comm.277:494-498；shimada等人,2001proc.natl.acad.sci.usa98:6500-6505；和zhang等人,2004proteinsci.13:2819-2824。如本文所用的術(shù)語“fgf23”的非限制性實(shí)例是seqidno:9的氨基酸(aa)25-251，其因此缺少信號肽(氨基酸1-24)，在下文作為seqidno:8給出。fgf23的“同系物”、“變體”、“片段”或“修飾形式”等指與人fgf23(例如seqidno:8)相似、但是不完全相同的多肽，但是其保持了人fgf23的至少一種活性。這類多肽可以包括例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的相對于seqidno:8的序列一致性，或者具有例如最多5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)的相對于seqidno:8的氨基酸序列的氨基酸差異(例如替換、刪除和/或添加)。在一些實(shí)施方案中，fgf23同系物、變體、片段或修飾形式保持至少90％序列一致性或具有最多25個(gè)相對于seqidno:8的氨基酸差異。fgf23同系物、變體、片段或修飾形式保持人fgf23的至少一種活性。作為非限制性實(shí)例，這類活性(或功能)包括人fgf23已知具有的那些，包括在結(jié)合fgf23受體中的作用、與klotho蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞增殖和細(xì)胞信號傳導(dǎo)；和各種fgf23活性體外分析、包括egr-1-熒光素酶分析中的活性；和與fgf23-相關(guān)性疾病相關(guān)的活性，所述疾病例如有年齡相關(guān)性病癥(選自少肌癥(sarcopenia)、皮膚萎縮、肌萎縮、腦萎縮、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、免疫無活性、高血壓、癡呆、亨廷頓病、阿爾茨海默病、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、前列腺癌、中風(fēng)、預(yù)期壽命減少、記憶喪失、皺紋、腎功能受損和年齡相關(guān)性聽力損失)、代謝障礙(選自ii型糖尿病、代謝綜合征、高血糖和肥胖)、高磷酸鹽血(腫瘤樣鈣質(zhì)沉著、高磷酸鹽血骨肥厚綜合征)、慢性腎病、慢性腎衰、癌癥、乳癌和/或肌萎縮。yamashita等人,2000biochem.biophys.res.comm.277:494-498；shimada等人,2001proc.natl.acad.sci.usa98:6500-6505；urakawa等人,2006nature444:770-774；zhang等人,2004proteinsci.13:2819-2824；wo2013/027191、wo2011/092234和wo2009/095372。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文所述的脂肪酸和fgf23肽的綴合物，其中fgf23肽保持了fgf23的至少一種活性；在一些實(shí)施方案中，所保持的fgf23活性是體外egr-1-熒光素酶分析中的功能。fgf23的“同系物”指相應(yīng)于人fgf23、但是來自不同來源如哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、食蟹猴、牛、豬、羊、馬、狗等、但是仍然保持了人fgf23的至少一種功能的多肽。fgf23的“變體”指包含一個(gè)或多個(gè)突變(例如刪除、替換或添加)、例如相對于seqidno:8而言的一個(gè)或多個(gè)突變、但是仍然保持了人fgf23的至少一種功能的fgf23。fgf23中的突變包括位置y154、q156、r176、r179、c206和c244處的那些。以前已經(jīng)描述了這類突變。r179處的突變賦予fgf23以蛋白酶解抗性；在adhr中，176rxxr179位點(diǎn)的突變阻止了fgf23的裂解和失活。white等人,2000nat.genet.26:345-348；liu等人,2003j.biol.chem.278:37419-37426。y154處的突變減少了降解；q156處的突變消除了裂解位點(diǎn)；c206和c244處的突變減少了二聚化和聚集。wo2013/027191和wo2011/092234。fgf23同系物、變體或修飾形式可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸(它們不是在野生型人fgf23中常發(fā)現(xiàn)的那些)。fgf23變體的非限制性實(shí)例如下所示：seqidno:10顯示了fgf23的變體，其中信號肽(aa1-24)已經(jīng)被刪除，但是在1位已經(jīng)重新引入了起始m；并且相應(yīng)于r179的氨基酸已經(jīng)被突變?yōu)閝。seqidno:10還指定為“hfgf23r179q”、“fgf23r179”、“hfgf23(r179q)”等，其代表了實(shí)施例28c中所用的fgf23變體。作為非限制性實(shí)例，另外的fgf23變體包括具有seqidno:8或seqidno:10的序列、但是在y154、q156、r176、r179、c206和c244中的一處或多處還具有突變的那些。作為非限制性實(shí)例，另外的fgf23變體包括具有seqidno:8或seqidno:10的序列、但是在y154、q156、r176、r179、c206和c244中的一處或多處還具有突變和進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸(它們不是在野生型人fgf23中常發(fā)現(xiàn)的那些)的那些。fgf23的“片段”指包含一個(gè)或多個(gè)刪除的氨基酸、例如相對于seqidno:8而言的一個(gè)或多個(gè)刪除的氨基酸、但是仍然保持了人fgf23的至少一種功能的fgf23。fgf23的功能性片段包括seqidno:8的氨基酸180-251，goetz等人,2010proc.natl.acad.sci.usa107:407-412。fgf23片段還可以具有一個(gè)或多個(gè)突變，例如在位置y154、q156、r176、r179、c206和c244中的任意一處或多處具有一個(gè)或多個(gè)突變，但是可保持人fgf23的至少一種活性。fgf23的“修飾形式”指包含與fgf23的序列如seqidno:8相似或相同的序列、但是具有一個(gè)或多個(gè)修飾并保持人fgf23的至少一種活性的fgf23。作為非限制性實(shí)例，這類修飾可包括翻譯后修飾(磷酸化、甲基化或添加碳水化合物)或與不是fgf23的第二個(gè)部分綴合。作為非限制性實(shí)例，這類第二個(gè)部分可以是信號肽、α或βklotho或其片段(例如可溶性klotho或sklotho)、fc(例如fclala)或其它修飾。wo2011/092234和wo2009/095372。如本文所用的術(shù)語“agrp肽或多肽”等術(shù)語指野灰蛋白相關(guān)肽(agouti-relatedpeptide)，即在翻譯后加工為其活性或成熟形式agrp(83-132)的由132個(gè)氨基酸組成的信號傳導(dǎo)分子，其含有10個(gè)半胱氨酸殘基，形成了5個(gè)二硫鍵的網(wǎng)絡(luò)。agrp作為黑皮質(zhì)素受體mc3r和mc4r的逆激動(dòng)劑發(fā)揮作用。在所有情況中，術(shù)語“agrp肽”包括其鹽。在一些實(shí)施方案中，agrp可以是酰胺形式，例如c-末端的-co2h酰胺化形成c(o)-nh2。在其它實(shí)施方案中，agrp可以是酸形式。術(shù)語“agrp肽”還包括agrp的較短的生物活性片段。片段是母體序列的一部分，其與母體序列相比在序列上是相同的、但是長度較短，并且保持了生物活性(即逆激動(dòng))。agrp多肽的片段及其變體還已經(jīng)在jackson,p.j.等人,biochemistry41,7565-7572中進(jìn)行了記載，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。例如，agrp(87-120)和agrp(87-132)具有與agrp(83-132)大約相同的mc3r和mc4r親和性，并且呈現(xiàn)出等同的逆激動(dòng)作用。agrp多肽的另外的片段已經(jīng)在christineg.joseph等人,peptides24(2003),263-270中有記載；該文獻(xiàn)引入本文作為參考。片段的實(shí)例有agrp(86-132)和單環(huán)agrp(109-118)以及其在n-和/或c-末端的延伸。術(shù)語“agrp多肽”還包括"agrp突變體多肽"，其為agrp多肽，其中天然存在的agrp多肽序列已經(jīng)被修飾。這類修飾已經(jīng)在pct申請?zhí)杦o2013/006656中有記載，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。術(shù)語“gdf15肽”、"gdf15多肽"和"gdf15蛋白質(zhì)"可互換使用，指在哺乳動(dòng)物如人或小鼠中表達(dá)的天然存在的野生型多肽。對于本公開文本的目的，術(shù)語"gdf15蛋白質(zhì)"可以互換地用于指任意全長gdf15多肽，其由308個(gè)氨基酸殘基組成；(nciref.seq.np_004855.2)含有29個(gè)氨基酸的信號肽(氨基酸1-29)、167個(gè)氨基酸的前結(jié)構(gòu)域(氨基酸30-196)和112個(gè)氨基酸的成熟結(jié)構(gòu)域(氨基酸197-308)，其通過弗林蛋白酶樣蛋白酶從前結(jié)構(gòu)域切割。308-氨基酸gdf15多肽被稱為“全長”gdf15多肽；112個(gè)氨基酸gdf15多肽(例如氨基酸197-308)是“成熟”gdf15多肽。成熟gdf15肽含有7個(gè)形成半胱氨酸結(jié)基序(具有三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵)所必需的保守半胱氨酸殘基和單個(gè)對tgf～超家族而言典型的鏈間二硫鍵。成熟gdf15肽含有兩個(gè)另外的半胱氨酸殘基，它們形成第四個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。因此，具有生物活性的gdf15是通過一個(gè)鏈間二硫鍵共價(jià)連接的成熟肽的同二聚體。因此，gdf15蛋白質(zhì)或多肽還包括蛋白質(zhì)的多聚體、更特別是二聚體。構(gòu)成同二聚體gdf15的每個(gè)單體單元可以與式a1、a2或a3脂肪酸連接。如本文所用的“gdf15”或“gdf15蛋白質(zhì)”還指人gdf15或其同系物、變體、突變體、片段或修飾形式，它們保持了人gdf15的至少一種活性。術(shù)語"gdf15突變體多肽"或“gdf15變體多肽”包括其中天然存在的gdf15多肽序列已經(jīng)被修飾的gdf15多肽。這類修飾包括但不限于一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、包括用非天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸類似物和氨基酸模擬物替換。在一個(gè)方面，術(shù)語"gdf15突變蛋白"或“gdf15變體多肽”指其中至少一個(gè)在天然gdf15多肽的指定位置上正常發(fā)現(xiàn)的殘基被刪除或被在天然gdf15多肽的該位置上未正常發(fā)現(xiàn)的殘基所替換的gdf15蛋白質(zhì)序列。在一些情況中，將可以期望的是，將在天然gdf15多肽的指定位置上正常發(fā)現(xiàn)的單個(gè)殘基用多于一個(gè)在該位置上未正常發(fā)現(xiàn)的殘基替換；在另一些情況中，還可以期望的是，維持天然gdf15多肽并在該蛋白質(zhì)的指定位置插入一個(gè)或多個(gè)殘基；在另一些情況中，還可以期望的是，整個(gè)刪除指定的殘基；所有這些構(gòu)建體都被術(shù)語"gdf15突變蛋白”或“gdf15變體蛋白”所囊括。在本發(fā)明的一個(gè)方面，gdf15突變蛋白或“gdf15變體蛋白”具有選自seqidno1至seqidno7任一項(xiàng)的序列。本發(fā)明還包括編碼這類gdf15突變多肽序列或gdf15變體多肽序列的核酸分子。gdf15的“同系物”、“變體”、“片段”或“修飾形式”等指與人gdf15相似、但是不相同的多肽，但是其保持了人gdf15的至少一種活性。gdf15的“修飾形式”指包含與gdf15的序列相似或相同的序列、但是具有一個(gè)或多個(gè)修飾并保持人gdf15的至少一種活性的gdf15。作為非限制性實(shí)例，這類修飾可包括翻譯后修飾(磷酸化、甲基化或添加碳水化合物)。gdf15的“同系物”指相應(yīng)于人gdf15、但是來自不同來源如哺乳動(dòng)物如食蟹猴、小鼠或大鼠等、但是仍然保持了人gdf15的至少一種功能的多肽。在一些情況中，gdf15同系物可用于治療或改進(jìn)受治療者的來自與該受治療者相同的種屬的gdf15突變多肽的成熟形式的代謝障礙。在各種實(shí)施方案中，gdf15多肽、同系物、變體、突變體、片段或修飾形式包含與天然存在的gdf15蛋白質(zhì)至少約85％一致的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，gdf15多肽包含與天然存在的gdf15多肽氨基酸序列至少約90％或約95、96、97、98或99％一致的氨基酸序列。這類gdf15多肽、同系物、變體、突變體、片段或修飾形式具有野生型gdf15突變多肽的至少一種活性，例如能夠降低血液葡萄糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；能夠減輕體重；或能夠改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰島素敏感性。在各種各自的實(shí)施方案中，gdf15多肽或同系物、變體、突變體、片段或修飾形式具有的生物活性等于、高于或低于成熟gdf15蛋白質(zhì)的天然存在形式的生物活性。生物活性的實(shí)例包括能夠降低血液葡萄糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；能夠減輕體重；或能夠改善葡萄糖耐量、脂質(zhì)耐量或胰島素敏感性；能夠降低尿糖和蛋白質(zhì)排泄。如本文在多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的文本中所用的術(shù)語“n-末端”(或“氨基末端”)和“c-末端”(或“羧基末端”)分別指多肽的末端的氨基和羧基端。如本文所用的術(shù)語“治療性多肽”或“治療性蛋白質(zhì)”指正在被開發(fā)用于治療性用途或已經(jīng)被開發(fā)用于治療性用途的多肽或蛋白質(zhì)。連接基將生物分子和脂肪酸部分分開。其化學(xué)結(jié)構(gòu)不是關(guān)鍵的，因?yàn)槠渲饕米鏖g隔基。連接基是含有兩個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)/官能團(tuán)的化學(xué)部分，其中一個(gè)可以與生物分子反應(yīng)且另一個(gè)與脂肪酸部分部分反應(yīng)。連接基的兩個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)/官能團(tuán)經(jīng)由連接部分或間隔基連接，所述連接部分或間隔基的結(jié)構(gòu)不甚關(guān)鍵的，只要它不干擾連接基與生物分子和式a1、a2或a3脂肪酸部分的偶聯(lián)。連接基可以由通過肽鍵連接在一起的氨基酸組成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，連接基由通過肽鍵連接在一起的1-20個(gè)氨基酸組成，其中氨基酸選自20種天然存在的氨基酸。在各種實(shí)施方案中，所述1-20種氨基酸選自氨基酸甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，連接基由多種無空間位阻的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸組成。在一些實(shí)施方案中，連接基是聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的組合(例如聚(gly-ala))或甘氨酸和絲氨酸的組合(例如聚(gly-ser))。在一些實(shí)施方案中，連接基由多種選自組氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺和甘氨酸的氨基酸組成。在一些實(shí)施方案中，連接基含有聚組氨酸部分。在一些實(shí)施方案中，連接基包含1-20個(gè)氨基酸，所述氨基酸選自非天然氨基酸。雖然1-10個(gè)氨基酸殘基的連接基對于脂肪酸部分的綴合是優(yōu)選的，但是本發(fā)明關(guān)注了任意長度或組成的連接基。非天然氨基酸連接基的實(shí)例有具有下式的8-氨基-3,6-二氧雜辛酸：或其重復(fù)單元。本文所述的連接基是示例性的，更長的和包括其它殘基的連接基也是本發(fā)明關(guān)注的。非肽連接基也是本發(fā)明關(guān)注的。在其它實(shí)施方案中，連接基包含一個(gè)或多個(gè)烷基基團(tuán)、鏈烯基基團(tuán)、環(huán)烴基基團(tuán)、芳基基團(tuán)、雜芳基基團(tuán)、雜環(huán)基團(tuán)、聚乙二醇和/或一個(gè)或多個(gè)天然或非天然氨基酸或其組合，其中烷基、鏈烯基、環(huán)烴基、芳基、雜芳基、雜環(huán)劑、聚乙二醇和/或天然或非天然氨基酸各自任選地組合和連接在一起或連接至生物分子和/或連接至脂肪酸部分，所述連接經(jīng)由選自-c(o)o-、-oc(o)-、-nhc(o)-、-c(o)nh-、-o-、-nh-、-s-、-c(o)-、-oc(o)nh-、-nhc(o)-o-、＝nh-o-、＝nh-nh-或＝nh-n(烷基)-的化學(xué)基團(tuán)?？梢允褂煤型榛g隔基的連接基例如有-nh-(ch2)z-c(o)-或-s-(ch2)z-c(o)-或-o-(ch2)z-c(o)-、-nh-(ch2)z-nh-、-o-c(o)-(ch2)z-c(o)-o-、-c(o)-(ch2)z-o-、-nhc(o)-(ch2)z-c(o)-nh-等，其中z是2-20。這些烷基連接基可以進(jìn)一步被任意無空間位阻的基團(tuán)、包括但不限于低級烷基(例如c1-c6)、低級?；?、鹵素(例如cl、br)、cn、nh2或苯基所取代。連接基可以是任何多聚體性質(zhì)的。連接基可以包括生物穩(wěn)定或生物可降解的聚合物鏈或單元。具有重復(fù)鍵的聚合物在生理?xiàng)l件下可以具有不同程度的穩(wěn)定性，這取決于鍵的易變性。聚合物可以含有諸如聚碳酸酯(-o-c(o)-o-)、聚酯(-c(o)-o-)、聚氨酯(-nh-c(o)-o-)、聚酰胺(-c(o)-nh-)的鍵。這些價(jià)鍵以舉例的方式提供，它們不意欲限制本發(fā)明的聚合物鏈或連接基中可采用的價(jià)鍵的類型。適宜的聚合物包括例如聚乙二醇(peg)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚馬來酸酐、n-(2-羥基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(polyoxyethylatedpolyol)、肝素、肝素片段、多糖、纖維素和纖維素衍生物、淀粉和淀粉衍生物、聚亞烷基二醇及其衍生物、聚亞烷基二醇共聚物及其衍生物、聚乙烯基乙基醚等及其混合物。聚合物連接基例如是聚乙二醇(peg)。peg連接基可以是直鏈或支鏈的。本發(fā)明中的peg連接基的分子量不限于任何特定的大小，但是某些實(shí)施方案具有100-5000道爾頓、例如500-1500道爾頓的分子量。連接基在兩端含有在肽或多肽/蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)和脂肪酸部分的功能性/反應(yīng)活性基團(tuán)(例如式a1、a2和a3脂肪酸部分的羧酸官能團(tuán))之間形成橋的適當(dāng)?shù)墓δ苄苑磻?yīng)活性基團(tuán)。連接基可以包含多個(gè)具有不同性質(zhì)的連接部分(或間隔基)(例如氨基酸、雜環(huán)部分、peg和/或烷基部分的組合)。在這種情況中，每個(gè)連接部分在兩端含有在肽或多肽/蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)和下一個(gè)具有不同性質(zhì)的連接部分之間形成橋的適當(dāng)?shù)墓δ苄苑磻?yīng)活性基團(tuán)，和或含有在具有不同性質(zhì)的在前連接部分和脂肪酸部分之間形成橋的適當(dāng)?shù)墓δ苄苑磻?yīng)活性基團(tuán)。經(jīng)修飾的肽或多肽和/或肽-多肽部分構(gòu)建體(即與部分連接基連接的肽/多肽)包括能夠與脂肪酸部分(或經(jīng)修飾的脂肪酸部分：即已經(jīng)連接了部分連接基)上的可用的反應(yīng)活性官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成共價(jià)鍵的反應(yīng)活性基團(tuán)。反應(yīng)活性基團(tuán)是能夠形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。反應(yīng)活性基團(tuán)位于綴合物的一個(gè)位置，通?？梢允囚然?、磷?；?、?；鶊F(tuán)、酯或混合酸酐、馬來酰亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺、四嗪、炔、亞胺酸酯、吡啶-2-基-二硫烷基，由此能夠與綴合物另一個(gè)位置上的官能團(tuán)如氨基基團(tuán)、羥基基團(tuán)、鏈烯基基團(tuán)、肼基團(tuán)、羥胺基團(tuán)、疊氮基團(tuán)或硫醇基團(tuán)形成共價(jià)鍵。對于將生物分子或經(jīng)修飾的生物分子綴合至連接基和/或?qū)⑦B接基綴合至脂肪酸部分和/或?qū)⒕哂胁煌问降母鞣N連接基綴合在一起而言特別感興趣的反應(yīng)活性基團(tuán)有n-羥基琥珀酰亞胺、炔(更特別是環(huán)辛炔)。官能團(tuán)包括：1.硫醇基團(tuán)，用于與馬來酰亞胺、甲苯磺?；炕蜻拎?2-基二硫烷基反應(yīng)；2.氨基基團(tuán)(例如氨基酸的氨基官能團(tuán))，用于與羧酸或活化羧酸(例如經(jīng)由n-羥基琥珀酰亞胺化學(xué)的酰胺鍵形成)、磷?；鶊F(tuán)、?；鶊F(tuán)或混合酸酐鍵合；3.疊氮化物，以經(jīng)歷與末端炔和更特別是環(huán)辛炔的huisgen環(huán)加成(更常已知為點(diǎn)擊化學(xué))；4.羰基基團(tuán)，以分別與羥胺或肼反應(yīng)形成肟或肼；5.烯烴和更特別是有張力的烯烴(strainedalkene)，以與四嗪在氮雜[4+2]加成反應(yīng)。雖然本文描述了連接基和官能團(tuán)/反應(yīng)活性基團(tuán)的一些實(shí)例，但是本發(fā)明仍然關(guān)注了任意長度和組成的連接基。實(shí)施方案本文描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案?？梢岳斫?，各實(shí)施方案中詳細(xì)說明的特征可以與其它詳細(xì)說明的特征組合來提供其它實(shí)施方案。在實(shí)施方案1中，本發(fā)明涉及包含經(jīng)由連接基與脂肪酸部分連接的生物分子的綴合物，其中所述脂肪酸部分具有如下的式a1、a2或a3：r1是co2h、h；r2、r3和r4相互獨(dú)立地是h、oh、co2h、-ch＝ch2或-c＝ch；ak是支鏈c6-c30亞烷基；n、m和p相互獨(dú)立地是6至30的整數(shù)；或其酰胺、酯或可藥用鹽。在實(shí)施方案1的另一方面，實(shí)施方案1的綴合物可以進(jìn)一步包含如上所述的式a1、a2或a3脂肪酸。鑒于難以獲得脂肪酸與生物分子的選擇性綴合和/或獲得單綴合，本發(fā)明的綴合物可以包含與一個(gè)或多個(gè)式a1、a2或a3脂肪酸部分連接的生物分子。另外，鑒于一些蛋白質(zhì)的多聚體本性，構(gòu)成多聚體蛋白質(zhì)的各個(gè)單體單元可以與脂肪酸部分連接，但是不是所有單體單元必須與脂肪酸部分連接，只要至少一個(gè)單體單元與脂肪酸部分連接即可。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的綴合物的混合物。例如，混合物可以包含與一個(gè)式a1、a2或a3脂肪酸部分連接的生物分子如多聚體生物分子、例如二聚體生物分子和與多于一個(gè)式a1、a2或a3脂肪酸部分連接的生物分子如多聚體生物分子、例如二聚體生物分子。本發(fā)明下文的實(shí)施例進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了脂肪酸與蛋白質(zhì)或多肽的選擇性或非選擇性多綴合的這一方面。在實(shí)施方案1a中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案1的綴合物，其中脂肪酸部分具有式a1。在該實(shí)施方案的特定方面，綴合物包含式a1的脂肪酸部分，其中n和m獨(dú)立地是8至20、優(yōu)選10至16。在該實(shí)施方案的另一方面，本發(fā)明涉及實(shí)施方案1或1a的綴合物，其中脂肪酸部分具有式a1和其中r2和r3中至少一個(gè)是co2h。在實(shí)施方案2中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案1或1a的綴合物，其中脂肪酸部分選自下式：其中ak3、ak4、ak5、ak6和ak7獨(dú)立地是(c8-20)亞烷基，r5和r6獨(dú)立地是(c8-20)烷基。在實(shí)施方案3中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案1、1a或2的綴合物，其中脂肪酸部分選自下式：在實(shí)施方案3a中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案1、1a或2的綴合物，其中脂肪酸部分選自下式：在實(shí)施方案3b中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案1的綴合物，其中脂肪酸部分具有式a2或a3。在該實(shí)施方案的特定方面，綴合物包含其中p是8至20的式a2脂肪酸部分或其中ak是c8-20亞烷基的式a3脂肪酸部分。在實(shí)施方案3c中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案1或3b的綴合物，其中脂肪酸部分選自下式：其中ak2是c8-20亞烷基。在實(shí)施方案4中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中連接基包括一個(gè)或多個(gè)烷基基團(tuán)、鏈烯基基團(tuán)、環(huán)烴基基團(tuán)、芳基基團(tuán)、雜芳基基團(tuán)、雜環(huán)基團(tuán)、聚乙二醇、一種或多種天然或非天然氨基酸或其組合，其中烷基、鏈烯基、環(huán)烴基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、聚乙二醇和/或天然或非天然氨基酸各自任選地組合和連接在一起或連接至生物分子和/或連接至脂肪酸部分，所述連接經(jīng)由選自-c(o)o-、-oc(o)-、-nhc(o)-、-c(o)nh-、-o-、-nh-、-s-、-c(o)-、-oc(o)nh-、-nhc(o)-o-、＝nh-o-、＝nh-nh-或＝nh-n(烷基)-的化學(xué)基團(tuán)。在實(shí)施方案5中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中連接基包含下式的非支鏈低聚乙二醇(oligoethyleneglycol)部分：其中y是0至34。在實(shí)施方案6中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中連接基包含(或進(jìn)一步包含)選自下式的雜環(huán)部分：和這類含雜環(huán)的連接基通過例如疊氮化物-炔huisgen環(huán)加成(更常已知為點(diǎn)擊化學(xué))獲得。更特別地，上文描繪的雜環(huán)中的一些來自環(huán)炔與含疊氮化物的部分的反應(yīng)。環(huán)炔可以容易地從商業(yè)來源獲得，因此其可以經(jīng)由用含有疊氮化物官能團(tuán)的部分(例如含有末端疊氮化物官能團(tuán)的連接基)進(jìn)行環(huán)加成來進(jìn)行官能化。環(huán)炔點(diǎn)擊化學(xué)在蛋白質(zhì)標(biāo)記中的用途的實(shí)例已經(jīng)在us2009/0068738中有記載，該文獻(xiàn)引入本文作為參考?？梢杂糜趆uisgen環(huán)加成的環(huán)炔試劑的非限制性實(shí)例有：在實(shí)施方案6a中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至5任一項(xiàng)的綴合物，其中連接基包含(或進(jìn)一步包含)選自下式的雜環(huán)基：其中r是0至2的整數(shù)且s是0至3的整數(shù)。這類雜環(huán)連接基可以用如下部分經(jīng)由烯烴或優(yōu)選有張力的烯烴如環(huán)烴的氮雜[4+2]環(huán)加成而獲得：其中rf是例如-ch2nh2、-oh、-ch2-co2h、-s-ch2-co2h、-(o-ch2)4-6-c(o)-oh-或這類四嗪部分可以容易地從商業(yè)來源獲得，可以與含烯烴的部分、例如含末端烯烴官能團(tuán)的連接基發(fā)生反應(yīng)。在實(shí)施方案6b中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至5任一項(xiàng)的綴合物，其中連接基包含(或進(jìn)一步包含)下式的雜環(huán)基：這類雜環(huán)部分可以通過馬來酰亞胺與含硫醇的部分、例如含末端硫醇官能團(tuán)的連接基反應(yīng)來獲得。可以容易獲得和/或可自商業(yè)途徑獲得的這些試劑直接或通過如上所述的連接基與感興趣的肽或多肽連接。炔、馬來酰亞胺或四嗪反應(yīng)活性基團(tuán)與脂肪酸部分或連接基-脂肪酸構(gòu)建體(例如peg-脂肪酸構(gòu)建體)上存在的官能基團(tuán)(分別有疊氮化物、硫醇和烯烴)反應(yīng)。在實(shí)施方案7中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中連接基包含或進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸，所述氨基酸獨(dú)立地選自組氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺和甘氨酸。在該實(shí)施方案的一個(gè)特定方面，連接基包含1至6個(gè)選自組氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸。在實(shí)施方案8中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是肽或多肽。在實(shí)施方案8的一個(gè)特定方面，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中肽或多肽是1)人生長分化因子15(gdf15)及其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式；2)apj激動(dòng)劑肽；3)催產(chǎn)素受體激動(dòng)劑肽；4)serelaxin；5)npff；6)pip肽；7)fgf23肽；8)agrp肽；或9)sirna。在實(shí)施方案8a中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是人生長分化因子15(gdf15)及其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式；或其二聚體。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，生物分子是人生長分化因子15(gdf15)突變體或變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物分子是gdf15或其變體或突變體的二聚體。鑒于gdf15多肽或突變體或變體的同二聚體性質(zhì)，構(gòu)成同二聚體的兩條多肽鏈各自(即每個(gè)單體單元)可以經(jīng)由連接基與式a1、a2或a3脂肪酸分子連接。因此，gdf15同二聚體可以經(jīng)由連接基與一種或兩種脂肪酸連接。經(jīng)由連接基與脂肪酸部分連接的gdf15結(jié)構(gòu)可以如下表示：其中fa表示脂肪酸部分，l表示連接基，并且gdf15單體單元1和單體單元2均經(jīng)由連接基與脂肪酸部分連接；或其中fa是脂肪酸部分，l是連接基，并且只有一個(gè)單體單元經(jīng)由連接基與脂肪酸部分連接，并且其中2個(gè)單體單元之間的線表示二硫鍵。而且，本發(fā)明還涉及包含結(jié)構(gòu)a的綴合物和結(jié)構(gòu)b的綴合物的混合物。在實(shí)施方案8b中，本發(fā)明關(guān)注了根據(jù)實(shí)施方案8a的綴合物，其中人gdf15突變體通過用其它殘基替換成熟多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而獲得。在該實(shí)施方案的一個(gè)特定方面，人gdf15的n-末端處的最后兩個(gè)氨基酸殘基(即精氨酸198和丙氨酸197)已經(jīng)被氨基酸序列xh-所替換，其中h是組氨酸且x是選自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺和甘氨酸的氨基酸。在該實(shí)施方案的優(yōu)選方面，hgdf15突變體是mh(199-308)hgdf15或ah(199-308)hgdf15。在實(shí)施方案8c中，人gdf15的n-末端處的最后3個(gè)氨基酸殘基(即天門冬酰胺199、精氨酸198和丙氨酸197)已經(jīng)被氨基酸序列xhx’-所替換，其中h是組氨酸且x’和x是獨(dú)立地選自選自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺和甘氨酸的氨基酸。在該實(shí)施方案的另一方面，gdf15的n-末端處的最后3個(gè)氨基酸殘基(即天門冬酰胺199、精氨酸198和丙氨酸197)已經(jīng)被氨基酸序列ahx’-所替換，其中h是組氨酸且x’是獨(dú)立地選自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺和甘氨酸的氨基酸。在該實(shí)施方案的優(yōu)選方面，僅修飾的gdf15蛋白質(zhì)是mha(200-308)hgdf15或aha(200-308)hgdf15。與天然gdf15蛋白質(zhì)相比，gdf15突變體能夠在n-末端選擇性地標(biāo)記蛋白質(zhì)(即在gdf15的優(yōu)選的n-末端處綴合脂肪酸)。肽和蛋白質(zhì)的選擇性標(biāo)記的進(jìn)一步細(xì)節(jié)在共同提交的美國申請?zhí)?2/015,858(律師案件pat056275-us-psp)和62/082,337(律師案件號pat056275-us-psp02)中有記載。在實(shí)施方案8d中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至8任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是apj激動(dòng)劑肽。在該實(shí)施方案的特定方面，apj激動(dòng)劑肽是pct專利申請?zhí)杦o2013/111110、wo2014/081702、wo2015/013168、wo2015/013165、wo2015/013167和wo2015/013169中所述的肽，所述文獻(xiàn)引入本文作為參考。在實(shí)施方案8e中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至8任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是催產(chǎn)素受體激動(dòng)劑肽。在該實(shí)施方案的特定方面，催產(chǎn)素受體激動(dòng)劑肽pct專利申請?zhí)杦o2009/122285(ferringb.v.)和wo2014/095773(hoffman-laroche)中所述的肽，所述文獻(xiàn)引入本文作為參考。在實(shí)施方案8f中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至8任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是agrp肽。在該實(shí)施方案的特定方面，agrp肽是agrp(83-132)，其中c-末端是游離co2h或其酰胺(例如-c(o)nh2)的形式。在實(shí)施方案8g中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至8任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是fgf23肽。在該實(shí)施方案的特定方面，fgf23肽是在r179處具有突變和任選地在y154、q156、r176、r179、c206和c244處具有一個(gè)或多個(gè)另外的突變的seqidno:8的fgf23變體。在該實(shí)施方案的另一個(gè)特定方面，fgf23肽是在r179、q156、c206和c244處具有突變的seqidno:8的fgf23變體。在實(shí)施方案8h中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至8任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是serelaxin。在實(shí)施方案8i中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至8任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是npff肽。在實(shí)施方案8j中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至8任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是pip肽。在該實(shí)施方案的特定方面，pip肽是組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)mhhhhhhh-pip，其中pip具有seqidno:12。在實(shí)施方案8k中，本發(fā)明涉及根據(jù)實(shí)施方案1至8任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子是sirna。在實(shí)施方案8l中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，進(jìn)一步包含經(jīng)由連接基與生物分子連接的第二個(gè)脂肪酸部分。優(yōu)選地，兩個(gè)脂肪酸-連接基部分具有相同的結(jié)構(gòu)。在實(shí)施方案9中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案1、2、8、8a、8b或8c的綴合物，其具有如下結(jié)構(gòu)：其中hgdf15*是hgdf15，其中n-末端的2或3個(gè)氨基酸已經(jīng)分別被氨基酸序列xh-或xhx’-所替換，其中h是組氨酸且x和x’獨(dú)立地選自m和a；或其二聚體；且其中his-hgdf15是hgdf15，其中包含1至6個(gè)組氨酸氨基酸和任選的1或2個(gè)甲硫氨酸氨基酸的標(biāo)簽已經(jīng)被加至hgdf15的n-末端；或其二聚體；和s是20-30的整數(shù)。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，標(biāo)簽包含組氨酸氨基酸和1或2個(gè)不相鄰的甲硫氨酸氨基酸。在該實(shí)施方案的另一方面，組氨酸和甲硫氨酸氨基酸的安排使得與n-末端氨基酸相鄰的位置上的氨基酸是組氨酸。在該實(shí)施方案的另一方面，標(biāo)簽選自mhhhhhhm-和mhhhhhh-。在實(shí)施方案9的特定方面，鑒于hgdf15*和his-hgdf15的同二聚體性質(zhì)，構(gòu)成同二聚體的一條或兩條多肽鏈(單體單元)可以經(jīng)由連接基與脂肪酸分子連接。結(jié)果，同二聚體可以在n-末端經(jīng)由連接基與一個(gè)或兩個(gè)脂肪酸分子連接。該實(shí)施方案可以通過具有下式的經(jīng)由連接基與脂肪酸連接的gdf15生物分子表示：其中his-hgdf15或hgdf15*(如上文所定義)的兩個(gè)單體單元在兩個(gè)n-末端經(jīng)由連接基與脂肪酸部分連接；或其中his-hgdf15或hgdf15*(如上文所定義)的僅一個(gè)單體單元在n-末端經(jīng)由連接基與脂肪酸部分連接。而且，本發(fā)明還關(guān)注了本發(fā)明的綴合物的混合物；例如包含式c綴合物和式e綴合物的混合物或包含式d綴合物和式f綴合物的混合物。在實(shí)施方案10中，本發(fā)明涉及包含式c綴合物和式e綴合物的混合物的組合物。在實(shí)施方案10a中，本發(fā)明涉及包含式d綴合物和式f綴合物的混合物的組合物。因此，在實(shí)施方案10b中，本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1、2、9或10的綴合物，其包含：1.同二聚體hgdf15的變體，其中n-末端的2或3個(gè)氨基酸已經(jīng)分別被氨基酸序列xh-或xhx’-所替換，其中h是組氨酸且x和x’獨(dú)立地選自m和a；或同二聚體hgdf15，其中包含1至6個(gè)組氨酸氨基酸和任選的1或2個(gè)甲硫氨酸氨基酸的標(biāo)簽已經(jīng)被加至hgdf15的n-末端；和2.一個(gè)或兩個(gè)下式的脂肪酸：其中脂肪酸經(jīng)由連接基與多肽鏈的n-末端連接；或綴合物的混合物。在實(shí)施方案10c中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案9、10、10a或10b的綴合物，其中hgdf15*是hgdf15，其中n-末端的2或3個(gè)氨基酸已經(jīng)分別被氨基酸序列xh-或xhx’-所替換，其中h是組氨酸且x和x’獨(dú)立地選自m和a；或其二聚體；和其中his-hgdf15是hgdf15，其中包含4至6個(gè)組氨酸氨基酸和1或2個(gè)甲硫氨酸氨基酸的標(biāo)簽已經(jīng)被加至hgdf15的n-末端；或其二聚體；且s是22至28的整數(shù)。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，標(biāo)簽包含組氨酸氨基酸和1或2個(gè)不相鄰的甲硫氨酸氨基酸。在該實(shí)施方案的另一方面，組氨酸和甲硫氨酸氨基酸的安排使得與n-末端氨基酸相鄰的位置上的氨基酸是組氨酸。在該實(shí)施方案的另一方面，標(biāo)簽選自mhhhhhhm-和mhhhhhh-。在實(shí)施方案11中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中所述生物分子選自m-(his)6-hgdf15(seqidno1)、m-(his)6-m-hgdf15(seqidno:2)、mh(199-308)hgdf15(seqidno:4)、mha(200-308)hgdf15(seqidno:6)、aha(200-308)hgdf15(seqidno:7)和ah(199-308)gdf15(seqidno:5)；或其二聚體。在實(shí)施方案11a中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案11的綴合物，其中所述生物分子選自mh(199-308)hgdf15(seqidno:4)、mha(200-308)hgdf15(seqidno:6)、aha(200-308)hgdf15(seqidno:7)和ah(199-308)gdf15(seqidno:5)；或其二聚體。在實(shí)施方案11b中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案11的綴合物，其中所述生物分子選自aha(200-308)hgdf15(seqidno:7)；或其二聚體。在實(shí)施方案12中，本發(fā)明涉及實(shí)施方案11b的綴合物，其中經(jīng)由連接基與脂肪酸連接的生物分子具有式g或式h：其中aha-hgdf15是seqidno:7，且脂肪酸在1個(gè)或2個(gè)單體單元的n-末端連接。而且，本發(fā)明關(guān)注了包含式g綴合物和式h綴合物的混合物。在實(shí)施方案13中，本發(fā)明涉及包含具有式g的實(shí)施方案12的綴合物和具有式h的實(shí)施方案12的綴合物的混合物的組合物。在該實(shí)施方案的特定方面，混合物是1:1摩爾比的式g綴合物和式h綴合物。aha-(200-308)-hgdf15(seqidno:7)被設(shè)計(jì)成除去在天然蛋白質(zhì)中觀察到的剪切位點(diǎn)以及除去潛在的甲硫氨酸(m1)甲?；稽c(diǎn)和n-199脫酰胺化位點(diǎn)。aha的優(yōu)良品質(zhì)和同質(zhì)性通過材料品質(zhì)檢查得以證實(shí)，所述檢查顯示沒有用hgdf15天然序列觀察到的剪切、脫酰胺化或甲硫氨酸氧化。在實(shí)施方案14中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中脂肪酸殘基經(jīng)由連接基連接在肽或蛋白質(zhì)的n-末端。在實(shí)施方案15中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中綴合物具有多于5小時(shí)的血漿穩(wěn)定性半衰期。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，綴合物具有多于10小時(shí)的血漿穩(wěn)定性半衰期。在該實(shí)施方案的另一方面，綴合物具有多于20小時(shí)或多于30小時(shí)的血漿穩(wěn)定性半衰期。在該實(shí)施方案的另一方面，綴合物具有多于40小時(shí)或多于50小時(shí)的血漿穩(wěn)定性半衰期。在實(shí)施方案16中，本發(fā)明涉及根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物，其中與非綴合生物分子相比的血漿穩(wěn)定性半衰期的改善為2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或75倍。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，生物分子、連接基和脂肪酸部分(r1至r4、n、mp和ak)是下文實(shí)施例部分中所定義的那些。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及下式的化合物：r1是co2h或h；r2和r3相互獨(dú)立地是h、oh、co2h、-ch＝ch2或-c＝ch；前提是r2和r3不相同；r4是co2h；n和m相互獨(dú)立地是6至30的整數(shù)；或其酰胺、酯或可藥用鹽。在該實(shí)施方案的另一方面，本發(fā)明涉及式a1化合物，其中r2和r3中至少一個(gè)是co2h。在該實(shí)施方案的另一方面，本發(fā)明涉及選自如下的化合物：肽/多肽和/或其修飾形式的合成本發(fā)明的肽或多肽可以通過合成化學(xué)方法或通過重組方法或兩種方法的聯(lián)合來產(chǎn)生。肽或多肽/蛋白質(zhì)構(gòu)建體可以制備成全長的或者可以合成為非全長片段和結(jié)合的。本發(fā)明的肽和多肽可以通過對肽合成而言本身已知的方法來產(chǎn)生。肽合成方法可以是固相合成和液相合成中的任一者。因此，感興趣的肽和多肽可以如下來產(chǎn)生：將能夠構(gòu)成蛋白質(zhì)的部分肽或氨基酸與其殘余部分縮合，當(dāng)產(chǎn)物具有保護(hù)基時(shí)分離保護(hù)基，由此可以生產(chǎn)預(yù)期的肽。已知的縮合和脫保護(hù)方法包括以下文獻(xiàn)(1)至(5)中記載的操作。(1)m.bodanszky和m.a.ondetti,peptidesynthesis,intersciencepublishers,紐約,1966；(2)schroeder和luebke,thepeptide,academicpress,紐約,1965；(3)nobuoizumiya等人,fundamentalsandexperimentsinpeptidesynthesis,maruzen,1975；(4)haruakiyajima和shumpeisakakibara,biochemicalexperimentseries1,proteinchemistryiv,205,1977；和(5)haruakiyajima(編輯),developmentofdrugs-continued,14,peptidesynthesis,hirokawashoten。反應(yīng)后，肽或多肽可以通過常規(guī)純化技術(shù)如溶劑萃取、柱色譜法、液相色譜法、尺寸排阻色譜法和離子交換色譜法和重結(jié)晶的聯(lián)合來進(jìn)行純化和分離。當(dāng)如上所分離的肽為游離化合物時(shí)，可通過已知方法將其轉(zhuǎn)化成適宜的鹽。相反地，如果所分離的產(chǎn)物是鹽，則可通過已知方法將其轉(zhuǎn)化成游離肽。可通過采用適于酰胺化的用于肽合成的樹脂來獲得多肽的酰胺。所述樹脂包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、氨甲基樹脂、4-芐氧基芐醇樹脂、4-甲基二苯甲胺樹脂、pam樹脂、4-羥基甲基甲基苯基乙酰氨基甲基樹脂、聚丙烯酰胺樹脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-羥甲基)苯氧基樹脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-fmoc-氨甲基)苯氧基樹脂、2-氯三苯甲基氯樹脂等。采用這類樹脂，通過本身已知的各種縮合技術(shù)，根據(jù)目標(biāo)肽的序列使其中側(cè)鏈的α-氨基和官能基團(tuán)已經(jīng)適當(dāng)保護(hù)的氨基酸在該樹脂上縮合。在系列反應(yīng)結(jié)束時(shí)，從樹脂移除肽或被保護(hù)的肽，除去保護(hù)基團(tuán)，并且在需要時(shí)形成二硫鍵，以獲得目標(biāo)多肽。對于上述被保護(hù)的氨基酸的縮合，可使用多種用于肽合成的活化試劑，例如hatu、hctu或例如碳二亞胺。碳二亞胺包括dcc、n,n'-二異丙基碳二亞胺和n-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺。對于利用這類試劑的活化，可使用外消旋化抑制劑添加劑，例如hobt或oxymapure。被保護(hù)的氨基酸可與活化試劑及外消旋化抑制劑一起直接添加至樹脂中，或者可預(yù)先活化為對稱的酸酐、hobt酯或hoobt酯，然后添加至樹脂中。用于被保護(hù)的氨基酸的活化或與樹脂縮合的溶劑可適當(dāng)?shù)剡x自已知可用于肽縮合反應(yīng)的溶劑。例如，可提及的是n,n-二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯啶酮、氯仿、三氟乙醇、二甲亞砜、dmf、吡啶、二烷、二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、乙酸乙酯或它們的適宜的混合物。反應(yīng)溫度可選自迄今已知可用于肽鍵形成的范圍，通常選自約-20℃-50℃的范圍?；罨陌被嵫苌锿ǔＲ?.5-4倍過量的比例使用。若通過利用茚三酮反應(yīng)的測試發(fā)現(xiàn)縮合不充分，則可在不去除保護(hù)基團(tuán)的情況下重復(fù)縮合反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)充分縮合。如果重復(fù)縮合仍無法提供足夠程度的縮合，則可用乙酸酐或乙?；溥蚴刮捶磻?yīng)的氨基乙?；?。用于起始材料氨基酸的氨基的保護(hù)基包括z、boc、叔戊氧基羰基、異冰片基氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、ci-z、br-z、金剛烷基氧基羰基、三氟乙酰基、鄰苯二甲?；?、甲?；?、2-硝基苯基亞磺?；?、二苯基硫膦基(diphenylphosphinothioyl)或fmoc?？墒褂玫聂然Ｗo(hù)基包括但不限于上述的c1-6烷基、c3-8環(huán)烴基和c6-10芳基-c1-2烷基以及2-金剛烷基、4-硝基芐基、4-甲氧基芐基、4-氯芐基、苯甲酰甲基、芐氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基和三苯甲基酰肼基。絲氨酸和蘇氨酸的羥基可通過酯化或醚化來保護(hù)。適于所述酯化的基團(tuán)包括碳衍生的基團(tuán)，例如低級烷?；?例如乙?；?、芳酰基(例如苯甲?；?、芐氧羰基和乙氧基羰基。適于所述醚化的基團(tuán)包括芐基、四氫吡喃基和叔丁基。用于酪氨酸的酚羥基的保護(hù)基包括bzl、cl2-bzl、2-硝基芐基、br-z和叔丁基。用于組氨酸的咪唑保護(hù)基包括tos、4-甲氧基-2,3,6-三乙基苯磺?；?、dnp、芐氧基甲基、bum、boc、trt和fmoc。起始氨基酸的活化羧基包括相應(yīng)的酸酐、疊氮化物和活性酯，例如與諸如五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲醇、對硝基苯酚、honb、n-羥基琥珀酰亞胺、n-羥基鄰苯二甲酰亞胺、hobt等的醇形成的酯。起始氨基酸的活化氨基包括相應(yīng)的磷酰胺。消除保護(hù)基的方法包括在催化劑如鈀黑或披鈀碳的存在下使用氫氣催化還原，用無水氫氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或這類酸的混合物進(jìn)行酸處理，用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪進(jìn)行堿處理，在液氨中用金屬鈉還原。通過上述酸處理的消除反應(yīng)通常在-20℃-40℃的溫度下進(jìn)行，并且可通過添加陽離子受體有利地進(jìn)行，所述陽離子受體諸如苯甲醚、苯酚、苯甲硫醚、間甲酚、對甲酚、甲硫醚、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇。用于保護(hù)組氨酸的咪唑基團(tuán)的2,4-二硝基苯基可通過用硫酚處理來消除，而用于保護(hù)色氨酸的吲哚基團(tuán)的甲酰基可通過用稀氫氧化鈉溶液或稀氨水堿處理以及在1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇存在下通過上述酸處理來消除。用于保護(hù)不應(yīng)參與起始原料反應(yīng)的官能基團(tuán)的方法、可使用的保護(hù)基、去除保護(hù)基的方法和活化欲參與反應(yīng)的官能基團(tuán)的方法可全部從已知基團(tuán)和方法中有判斷地選擇。另一種獲得多肽的酰胺形式的方法包括：首先使c-末端氨基酸的-羧基酰胺化，然后向n-側(cè)延長肽鏈直至期望的鏈長度，然后選擇性地脫保護(hù)c-末端肽的α-氨基和待形成目標(biāo)多肽的剩余部分的氨基酸或肽的α-羧基，在混合溶劑(例如提及上文所的那些)中縮合所述兩個(gè)片段，其中該兩個(gè)片段的α-氨基和側(cè)鏈官能基團(tuán)已經(jīng)用上文所述的適宜保護(hù)基進(jìn)行了保護(hù)。該縮合反應(yīng)的參數(shù)可以與上文所述相同。通過上述方法，從通過縮合獲得的被保護(hù)的肽中去除所有保護(hù)基，從而提供期望的粗肽。可通過已知純化方法來純化該粗肽，將主要級分冷凍干燥，以提供目標(biāo)酰胺化多肽。為獲得多肽的酯，使c-末端氨基酸的α-羧基與期望的醇縮合，得到氨基酸酯，然后進(jìn)行上文對制造酰胺所述的程序。或者，重組表達(dá)方法是特別有用的。利用宿主細(xì)胞的重組蛋白表達(dá)(人工工程化以包含編碼肽序列的核酸的細(xì)胞，且其將轉(zhuǎn)錄和翻譯并任選分泌肽至細(xì)胞培養(yǎng)基中)是現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)使用的。對于重組生產(chǎn)方法，編碼肽的氨基酸序列的核酸典型地通過常規(guī)方法合成并被整合至表達(dá)載體中。此類方法特別優(yōu)選用于制備包含融合至另外的肽序列或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或結(jié)構(gòu)域的肽的多肽組合物。宿主細(xì)胞可任選為選自以下的至少一種：e.coli、cos-1、cos-7、hek293、bht21、cho、bsc-1、hepg2、653、sp2/0、293、hela、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆蟲或植物細(xì)胞或其任意衍生的、固定化的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明還囊括編碼上述可以是rna形式或dna形式的變體的多核苷酸，其中dna包括cdna、基因組dna和合成dna。dna可以是雙鏈或單鏈的。編碼本發(fā)明的組合物的編碼序列可以由于基因代碼的冗余或簡并而不同。編碼本發(fā)明的組合物的多核苷酸可以包括以下那些：只有變體編碼序列、變體編碼序列和另外的編碼序列如功能性多肽、或者前導(dǎo)序列或分泌序列或前蛋白序列；變體編碼序列和非編碼序列如內(nèi)含子或變體編碼序列的非編碼序列5’和/或3’。因此，術(shù)語“編碼變體的多核苷酸”不僅囊括可包括變體編碼序列的多核苷酸，而且囊括包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸的變體，其編碼含有指定替換的多肽的片段、類似物和衍生物。多核苷酸變體可以是人gdf15序列的天然存在等位變體、非天然存在的變體或截短的變體，如上文所述。因此，本發(fā)明還包括如上所述的編碼變體的多核苷酸以及這類多核苷酸的變體，所述變體編碼所公開的變體的片段、衍生物或類似物。這類核苷酸變體包括刪除變體、替換變體、截短變體和添加或插入變體，只要存在第一個(gè)或第二個(gè)實(shí)施方案的指定氨基酸替換中的至少一個(gè)。在序列已經(jīng)經(jīng)手術(shù)連接至表達(dá)控制序列(即被放置以確保表達(dá)控制序列的功能)后，本發(fā)明的多核苷酸可以在宿主中表達(dá)。這些表達(dá)載體通?？梢栽谒拗魃矬w中作為附加體或作為宿主染色體dna的完整部分進(jìn)行復(fù)制。通常，表達(dá)載體將含有選擇標(biāo)記如四環(huán)素、新霉素和二氫葉酸還原酶以允許檢測用預(yù)期dna序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞。gdf15變體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中在適當(dāng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。還可以應(yīng)用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)、采用衍生自本發(fā)明的dna構(gòu)建體的rna來產(chǎn)生這類蛋白質(zhì)。大腸埃希氏菌(escherichiacoli,e.coli)是可特別用于克隆本發(fā)明的多核苷酸的原核生物。其它適用的微生物宿主包括枯草芽胞桿菌(bacillussubtilus)、鼠傷寒沙門菌(salmonellatyphimurium)和各種屬的沙雷菌屬(serratia)、假單胞菌屬(pseudomonas)、鏈球菌屬(streptococcus)和葡萄球菌屬(staphylococcus)，雖然也可以使用其它的微生物宿主作為選擇。在這些原核生物宿主中，也可以制作表達(dá)載體，所述表達(dá)載體通常將含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列(例如復(fù)制起點(diǎn))。另外，可以存在多種已知啟動(dòng)子中的任一種，例如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)或來自噬菌體λ或t7的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子通常將任選地用操縱子序列來控制表達(dá)，并且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等用于起始和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，可以在成熟序列的n-末端引入甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列用于在e.coli中表達(dá)，這也被本發(fā)明的范圍內(nèi)所關(guān)注。因此，除非另有指出，否則在e.coli中表達(dá)的本發(fā)明的組合物具有在n-末端引入的甲硫氨酸序列。其它微生物如酵母菌或真菌也可以用于表達(dá)。巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母菌絲(schizosaccharomycespombe)和安格斯畢赤酵母(pichiaangusta)是優(yōu)選酵母宿主的實(shí)例，具有適宜的具有表達(dá)控制序列如啟動(dòng)子、包括3-磷酸基甘油酸激酶或其它糖酵解酶和復(fù)制起點(diǎn)、終止序列等預(yù)期的那些的載體。黑曲霉((aspergillusniger)、(trichodermareesei)和(schizophyllumcommune)是真菌宿主的實(shí)例，雖然也可以使用其它作為選擇。哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)物也可用于表達(dá)和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。在本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)了很多能夠分泌完整變體的適宜宿主細(xì)胞，包括cho細(xì)胞系、各種cos細(xì)胞系、nso細(xì)胞、敘利亞倉鼠卵巢細(xì)胞系、hela細(xì)胞或人胚腎細(xì)胞系(即hek293、hek293ebna)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括表達(dá)控制序列如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和必需的加工信息位點(diǎn)如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna剪接位點(diǎn)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列有來自sv40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、raus肉瘤病毒等的啟動(dòng)子。優(yōu)選的多聚腺苷酸化位點(diǎn)包括來自sv40和牛生長激素的序列。含有感興趣的多核苷酸序列的載體(例如編碼本發(fā)明的組合物和表達(dá)控制序列的那些)可以通過已知方法轉(zhuǎn)入細(xì)胞宿主中，所述方法根據(jù)宿主細(xì)胞類型而不同。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染常用于原核生物細(xì)胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可以用于其它細(xì)胞宿主。可以采用各種蛋白質(zhì)純化方法，這類方法是已知的，并且記載在例如deutscher,methodsinenzymology182:83-9(1990)和scopes,proteinpurification:principlesandpractice,springer-verlag,ny(1982)中。所選擇的純化步驟將取決于例如用于本發(fā)明的組合物的生產(chǎn)方法的性質(zhì)。多肽可以以基本上純的或分離形式(例如不含其它多肽)制備。多肽可以存在于相對于可以存在的其它組分(例如其它多肽或其它宿主細(xì)胞組分)而言富含多肽的組合物中。例如，可以提供經(jīng)純化的多肽，以便多肽存在于基本上不含其它表達(dá)蛋白質(zhì)的組合物中，例如少于90％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或少于1％的組合物由其它表達(dá)蛋白質(zhì)構(gòu)成。脂肪酸部分的合成流程1描述了式a2脂肪酸部分的合成。其中p1和p2是羧酸保護(hù)基如甲基、乙基、叔丁基、甲氧基芐基、芐基、芐基氧基、甲氧基甲基、甲基硫甲基、四氫吡喃基、苯甲?；谆-苯鄰二甲酰亞胺、肉桂基、三苯基甲基、9-蒽基甲基、胡椒基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或2-烷基1,3噁唑啉；其中l(wèi)g是離去基如鹵素(例如br、cl、i)或三氟甲磺?；趸推渲衦4和p如實(shí)施方案1中所述。在堿(例如氫化鈉、碳酸鉀或碳酸銫、氫氧化鈉、二異丙基氨基鋰、雙(三甲基甲硅烷基)氨基鈉、雙(三甲基甲硅烷基)氨基鉀、四甲基哌啶鋰(lithiumtertamethylpiperidide)、1,8-二氮雜環(huán)十一碳-7-烯、n,n-二異丙基乙基胺或2,6-二叔丁基putridine)的存在下、在溶劑如dmf、thf或二甲基乙酰胺中用烷基化劑(1b)使被保護(hù)的丙二酸(1a)烷基化，產(chǎn)生了被保護(hù)的脂肪酸部分(1c)。當(dāng)r4是oh或co2h時(shí)，在烷基化步驟之前可以要求對這些官能團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。羥基保護(hù)基是本領(lǐng)域已知的，例如有：1.醚，例如甲基醚、甲氧基甲基醚(mom)、四氫吡喃基醚(thp)、叔丁基醚、烯丙基醚、芐基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、叔丁基二苯基甲硅烷基醚、三芐基甲硅烷基醚、異丙基二甲基甲硅烷基醚、三苯基甲基醚、硝基芐基醚、2.酯和碳酸酯，例如乙酸酯、甲酸酯、三氯乙酸酯、苯氧基乙酸酯、新戊酸酯、苯甲酸酯、甲基碳酸酯、芐基碳酸酯、烯丙基碳酸酯、硝酸酯、adamanoate酯、硝基苯基碳酸酯。式a2脂肪酸部分可采用適當(dāng)?shù)拿摫Ｗo(hù)方法通過脫保護(hù)獲得。標(biāo)準(zhǔn)方法可用于采用選自但不限于naoh、koh或lioh的堿或選自但不限于tfa、hcl或bcl3的酸將中間體(1c)進(jìn)行水解。當(dāng)p1或p2是芐基或甲氧基芐基時(shí)，優(yōu)選的脫保護(hù)方法是在催化劑、例如但不限于披鈀碳的存在下氫化。流程2解釋了其中r1是c(o)2h的式a1脂肪酸部分的合成。其中p1和p2、lg如上文所定義，且r2、r3、n和m如實(shí)施方案1中所定義。被保護(hù)的丙二酸(1a)用烷基化劑(2a)和(2c)進(jìn)行了2步連續(xù)的烷基化，它們的順序可以顛倒，然后如上文流程1中所述采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行脫保護(hù)。當(dāng)r2和r3是oh或co2h時(shí)，在烷基化步驟之前可以要求對這些官能團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。其中r1是h的式a1脂肪酸部分可以通過將相應(yīng)的其中r1是co2h的式a1脂肪酸部分進(jìn)行脫羧來制備。脫羧條件是本領(lǐng)域已知的，例如在堿性條件(例如氫氧化銨)下脫羧。生物分子-連接基構(gòu)建體的合成其中b是生物分子或其修飾形式，z1是c1-c20亞烷基連接基，其中亞烷基鏈任選被氧代基(＝o)取代，和其中一個(gè)或多個(gè)碳被o或nh替換；和其中c1是任選被氟取代的單、二或三環(huán)碳環(huán)或雜環(huán)環(huán)系。采用標(biāo)準(zhǔn)的酰胺偶聯(lián)方法，使環(huán)炔(3b)經(jīng)由其羧酸反應(yīng)活的性基團(tuán)與生物分子(3a)的氨基殘基(例如賴氨酸的側(cè)臉的n-末端的氨基官能團(tuán))連接?？梢圆捎靡阎呐悸?lián)方法，包括但不限于在存在或不存在堿如叔胺(例如三乙胺或n,n-二異丙基乙基胺)或k2co3的情況下用生物分子(3a)將中間體(3b)轉(zhuǎn)化為其活化形式[例如轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的吡咯烷-2,5-二酮(采用標(biāo)準(zhǔn)的n-氫琥珀酰亞胺化學(xué))，采用諸如三光氣、羰基二咪唑、氯甲酸4-硝基苯基酯或碳酸二琥珀酰亞胺基酯的試劑轉(zhuǎn)化酸(3b)，采用諸如亞硫酰氯或草酰氯的試劑將酸(3b)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰鹵，采用諸如clc(o)o-異丁基、2,4,6-三氯苯甲酰氯或丙基膦酸酐環(huán)狀三聚體(t3p)的試劑將酸(3b)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的混合酸酐，繼之以噁唑烷-2,5-二酮、酰鹵或混合酸酐的反應(yīng)]。或者，可以采用縮合試劑、在存在或不存在諸如1-羥基苯并三唑、1-羥基-7-氮雜苯并三唑或二甲基氨基吡啶的情況下使生物分子3a與酸3b偶聯(lián)，所述縮合試劑包括但不限于二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)、二異丙基碳二亞胺(dic)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edchcl)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-(pybop)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-(bop)。優(yōu)選地，采用nhs化學(xué)將環(huán)炔/酸中間體(3b)轉(zhuǎn)化為其活化形式，然后與生物分子上的氨基官能團(tuán)反應(yīng)。生物分子的n-末端處的氨基官能團(tuán)的選擇性酰化已經(jīng)在共同提交的美國申請?zhí)?2/015,858(律師案卷pat056275-us-psp)和62/082,337(律師案件號pat056275-us-psp02)中進(jìn)行了研發(fā)和報(bào)道。選擇性?；婕皀hs活化環(huán)辛炔類似物((3b)的nhs衍生物)與其中n-末端已經(jīng)被修飾以包括與n-末端氨基酸相鄰的組氨酸氨基酸的生物分子的反應(yīng)。當(dāng)在ph4進(jìn)行時(shí)，該反應(yīng)對于n-末端的氨基官能團(tuán)而言是高度選擇性的，這是由于存在組氨酸氨基酸的鄰近效應(yīng)。脂肪酸殘基連接基構(gòu)建體的合成用于點(diǎn)擊化學(xué)的脂肪酸-連接基構(gòu)建體流程4描述了具有末端疊氮基官能基團(tuán)的脂肪酸-peg連接基構(gòu)建體的合成。其中y是0至34，且fa是式a1、a2或a3中所述的脂肪酸部分，其經(jīng)由其羧酸官能團(tuán)之一與peg連接基連接，fa具有下式：脂肪酸部分(4b)經(jīng)由酰胺偶聯(lián)反應(yīng)與含peg的連接基(4a)連接。已知的偶聯(lián)方法已經(jīng)在上文流程3中進(jìn)行了詳細(xì)記載。優(yōu)選地，采用nhs化學(xué)使脂肪酸部分上的酸官能團(tuán)活化。當(dāng)r1是co2h、r2、r3和r4是co2h或oh時(shí)，可能需要在偶聯(lián)反應(yīng)之前引入保護(hù)基以控制反應(yīng)活性位點(diǎn)。羧酸和羥基基團(tuán)的保護(hù)基已經(jīng)在上文流程1中有記載?；蛘?，可以采用nhs化學(xué)進(jìn)行羧酸的選擇性活化。用于直接與感興趣的生物分子連接的脂肪酸-連接基流程5描述了具有末端co2h官能基團(tuán)的脂肪酸-peg連接基構(gòu)建體的合成。其中fa如上文流程4中所定義，且y是0至34。脂肪酸(4b)可以采用上文所述的酰胺偶聯(lián)與含peg的連接基(5a)連接。用于采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶與感興趣的生物分子連接的脂肪酸-連接基構(gòu)建體流程5a描述了采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶制備含有谷氨酸氨基酸的脂肪酸-連接基構(gòu)建體，其允許了賴氨酸的位置選擇性修飾。其中y和fa如前面所定義。這類構(gòu)建體允許賴氨酸的側(cè)鏈上的氨基基團(tuán)的選擇性位置修飾。蛋白質(zhì)的這種谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶選擇性位置修飾已經(jīng)在2013年7月11日提交的美國申請?zhí)?1/845,273(律師案卷號pat055641-us-psp)中有記載。本發(fā)明的綴合物的合成采用點(diǎn)擊化學(xué)的綴合其中b是感興趣的生物分子或其修飾形式(例如含組氨酸標(biāo)簽的生物分子或突變體)，且y、c1、z1、fa和y如上文所定義。用脂肪酸-連接基構(gòu)建體(4c)的末端疊氮化物使環(huán)炔構(gòu)建體(3c)進(jìn)行huisgen環(huán)加成，如點(diǎn)擊化學(xué)中公知的那樣。點(diǎn)擊化學(xué)的實(shí)例已經(jīng)在us2009/0068738中有記載。采用偶聯(lián)條件經(jīng)由直接連接進(jìn)行的綴合其中b是感興趣的生物分子或其修飾形式(例如含組氨酸標(biāo)簽的生物分子和/或突變體)，且脂肪酸-連接基構(gòu)建體連接至生物分子的n-末端。采用標(biāo)準(zhǔn)的酰胺偶聯(lián)方法，將脂肪酸-連接基構(gòu)建體(5b)經(jīng)由其羧酸反應(yīng)活性基團(tuán)連接至生物分子(3a)的氨基殘基(例如連接至賴氨酸的n-末端或側(cè)鏈的氨基官能團(tuán))。已知的偶聯(lián)方法已經(jīng)在上文流程3中詳細(xì)記載。優(yōu)選地，脂肪酸-連接基構(gòu)建體上的酸官能團(tuán)采用nhs化學(xué)進(jìn)行活化。生物分子的n-末端處的氨基官能團(tuán)的選擇性?；呀?jīng)在共同提交的美國申請?zhí)?2/015,858(律師案卷pat056275-us-psp)和62/082,337(律師案件號pat056275-us-psp02)中進(jìn)行了研發(fā)和報(bào)道。選擇性?；婕皀hs活化化合物((5b)的nhs衍生物)與其中n-末端已經(jīng)被修飾以包括與n-末端氨基酸相鄰的組氨酸氨基酸的生物分子的反應(yīng)。當(dāng)在ph4進(jìn)行時(shí)，該反應(yīng)對于n-末端的氨基官能團(tuán)而言是高度選擇性的，這是由于存在組氨酸氨基酸的鄰近效應(yīng)。采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的綴合生物分子在其賴氨酸側(cè)鏈的選擇性修飾可以采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶獲得。這類修飾已經(jīng)報(bào)道在2013年7月11日提交的美國申請?zhí)?1/845,273(律師案卷號pat055641-us-psp)或wo2015/006728(該申請的實(shí)施例25)中。藥物組合物本發(fā)明的綴合物可以以多種方式中的任一種施用，包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、吸入、鼻內(nèi)、口服等。本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方案使用本發(fā)明的綴合物或其酰胺、酯或鹽的連續(xù)靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明的綴合物可作為推注或作為連續(xù)輸注在一段時(shí)間內(nèi)施用?？梢允褂每芍踩氡?。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，間歇或連續(xù)綴合物施用持續(xù)1天至數(shù)天(例如2-3天或更多天)或更長時(shí)間段，例如數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。在一些實(shí)施方案中，提供間歇或連續(xù)綴合物施用至少約3天、優(yōu)選至少約6天。在其它實(shí)施方案中，提供間歇或連續(xù)綴合物施用至少約1周。在其它實(shí)施方案中，提供間歇或連續(xù)綴合物施用至少約2周。在施用期間或在施用多個(gè)劑量之間維持平均血漿綴合物濃度高于特定閾值可能是所期望的?？衫缁谑苤委熣叩纳頎顩r、疾病嚴(yán)重性等來確定期望濃度。這些期望值可通過實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗(yàn)來確定。備選地，肽和其綴合物可通過fcrn機(jī)制被口服遞送(natrevimmunol.7(9),715-25,2007；natcommun.3；3:610,2012,amjphysiolgastrointestliverphysiol304:g262–g270,2013)。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的綴合物或其酰胺、酯、鹽及一或多種可藥用載體的藥物組合物。該藥物組合物可被配制用于特定施用途徑如口服施用、皮下施用、胃腸外施用和直腸施用等。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以以固體形式(包括但不限于膠囊、片劑、丸劑、顆粒、凍干粉、粉劑或栓劑)或以液體形式(包括但不限于溶液劑、混懸劑或乳劑)制備。可對藥物組合物進(jìn)行常規(guī)醫(yī)藥操作(例如無菌生產(chǎn)、滅菌)和/或可含有常規(guī)惰性稀釋劑、塊成形劑(cakeformingagents)、張度劑、潤滑劑或緩沖劑、以及輔助劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑和緩沖劑等。適于注射的藥物組合物通常包括無菌水溶液(當(dāng)可溶于水時(shí))或分散體和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)施用而言，適宜的載體包括生理鹽水、抑菌水、cremophoreltm(basf,parsippany,n.j.)或磷酸鹽緩沖液(pbs)。在所有情形下，組合物均應(yīng)當(dāng)是無菌的，并且應(yīng)當(dāng)是以易于注射的程度流動(dòng)的。優(yōu)選的藥物制劑在制造和儲存條件下是穩(wěn)定的，而且必須能在抵抗微生物(例如細(xì)菌和真菌)污染作用的情況下保存。一般而言，相關(guān)載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)，及其適宜的混合物?？赏ㄟ^例如使用諸如卵磷脂的包衣、在分散劑的情況下通過維持所需粒徑以及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？赏ㄟ^各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑如對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來實(shí)現(xiàn)對微生物作用的預(yù)防。在許多情況下，在組合物中包括等滲劑如糖、多元醇(例如甘露醇)、氨基酸、山梨醇、氯化鈉是優(yōu)選的?？赏ㄟ^將可延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠納入組合物中來延長可注射組合物的吸收。在一些實(shí)施方案中，多功能賦形劑如重組白蛋白可以引入制劑過程中以有助于綴合物產(chǎn)品對抗降解或聚集的穩(wěn)定性、改善溶解性和幫助活性組分的施用和釋放(biopharminternational,2012,第23卷,第3期,第40-44頁)。某些可注射組合物是等滲水溶液或混懸液，栓劑有利地從脂肪乳液或混懸液制備。所述組合物可被滅菌和/或含有輔助劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化劑、溶解促進(jìn)劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。此外，它們還可以含有其它治療上有價(jià)值的物質(zhì)。所述組合物分別根據(jù)常規(guī)混和、制粒或包衣方法來制備，并且含有約0.1-75％或含有約1-50％的活性成分。無菌可注射溶液可通過以下方式制備：將所需量的活性化合物與上文所列舉的成分中的一種或組合摻入適當(dāng)溶劑中，如需要的那樣，隨后過濾滅菌。通常，分散體通過將活性化合物摻入含有堿性分散介質(zhì)和來自那些上文所列舉的所需其它成分的無菌載體中來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情形下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分和來自先前經(jīng)滅菌過濾的其溶液的任意另外的期望成分的粉末?？诜M合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。出于口服治療施用的目的，活性化合物可摻入到賦形劑中，以片劑、含錠(troches)或膠囊(例如明膠膠囊)的形式使用?？诜M合物還可使用漱口用流體載體來制備。醫(yī)藥上相容的粘合劑和/或輔助材料可作為組合物的一部分被包含其中。片劑、丸劑、膠囊、含錠等可含有任意以下成分或具有類似性質(zhì)的化合物：粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如海藻酸、primogel或玉米淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或sterotes；助流劑，例如膠體二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或矯味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙香精。用于經(jīng)口遞送的制劑可有利地引入用于改進(jìn)在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)吸收的物質(zhì)。對于通過吸入施用而言，本發(fā)明的治療劑優(yōu)選地從含有適宜拋射劑(例如諸如二氧化碳的氣體)的加壓容器或分配器或從噴霧器中以氣溶膠噴霧劑形式遞送。應(yīng)注意到，肺為治療劑的全身遞送提供了很大的表面積。可將這些活性劑囊封于例如聚合微粒中，例如在美國公開20040096403中描述的那些，或與本領(lǐng)域已知的各種其它藥物遞送載體中的任一種聯(lián)合。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，活性劑與帶電脂質(zhì)聯(lián)合遞送，例如在美國公開20040062718中所述的那樣。應(yīng)注意到，后一系統(tǒng)已用于施用治療性多肽、胰島素，這表明這一系統(tǒng)適用于施用肽物質(zhì)。還可通過經(jīng)黏膜或經(jīng)皮方式來實(shí)施全身施用。適用于經(jīng)皮施用的組合物包括有效量的本發(fā)明的綴合物與適宜的載體。適用于經(jīng)皮遞送的載體包括幫助穿過宿主皮膚的可吸收性藥理上可接受的溶劑。例如，經(jīng)皮裝置為繃帶形式，其包含背襯部件、含有該化合物(任選地含有載體)的貯庫、任選的速度控制屏障(其以受控的和預(yù)定的速度在延長時(shí)間遞送化合物至宿主皮膚)以及將裝置固定至皮膚上的工具。適用于局部施用(例如施用至皮膚及眼睛)的組合物包括水溶液、混懸液、軟膏、乳膏、凝膠或例如通過氣溶膠遞送的可噴霧制劑等。此類局部遞送系統(tǒng)將尤其適用于真皮施用。因此，它們特別適用于本領(lǐng)域熟知的局部施用制劑，包括化妝品制劑。其可含有增溶劑、穩(wěn)定劑、張力增加劑、緩沖劑和防腐劑。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物用于皮下施用。適用于多肽治療劑(例如抗體、融合蛋白等)的皮下施用的制劑組分和方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如已公開的美國專利申請?zhí)?011/0044977和美國專利號8,465,739和美國專利號8,476,239。通常，用于皮下施用的藥物組合物含有適宜的穩(wěn)定劑(例如氨基酸如甲硫氨酸和或糖如蔗糖)、緩沖劑和張力劑(tonicifyingagents)。如本文所用的局部施用還可涉及吸入或鼻內(nèi)施用。它們可在使用或未使用適宜拋射劑的情況下以干燥粉末形式(單獨(dú)、作為混合物(例如與乳糖的干混合物)或混合組分顆粒(例如與磷脂的))從干粉吸入器或以氣溶膠噴霧形式從加壓容器、泵、噴射器、霧化器或噴霧器中方便地遞送。本發(fā)明還提供了藥物組合物和劑型，其包含一種或多種可降低作為活性成分的本發(fā)明的化合物的分解速率的物質(zhì)。本文稱作“穩(wěn)定劑”的此類物質(zhì)包括但不限于抗氧化劑(例如抗壞血酸)、ph緩沖劑或鹽緩沖劑、重組白蛋白。如本文所用的術(shù)語“可藥用鹽”指保持了本發(fā)明的綴合物的生物有效性和性質(zhì)并且其通常在生物上或在其它方面不是不期望的鹽。在許多情形下，本發(fā)明的綴合物能夠借助氨基和/或羧基或與之類似的基團(tuán)的存在形成酸和/或堿鹽?？墒褂脽o機(jī)酸和有機(jī)酸來形成可藥用的酸加成鹽，例如乙酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、chlortheophyllonate、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘酸鹽、萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、巴莫酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基水楊酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽和三氟乙酸鹽。可由其衍生鹽的無機(jī)酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等?？捎善溲苌}的有機(jī)酸包括例如乙酸、丙酸、羥乙酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸等?？膳c無機(jī)堿和有機(jī)堿來形成可藥用的堿加成鹽。可由其衍生鹽的無機(jī)堿包括例如銨鹽和周期表第i族至第xii族的金屬。在某些實(shí)施方案中，所述鹽衍生自鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅和銅；尤其適宜的鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽?？捎善溲苌}的有機(jī)堿可包括例如伯、仲和叔胺、取代胺包括天然存在的取代胺、環(huán)狀胺、堿性離子交換樹脂等。某些有機(jī)胺包括異丙基胺、芐星(benzathine)、膽堿鹽、二乙醇胺、二乙胺、賴氨酸、葡甲胺、哌嗪及氨丁三醇。本發(fā)明的可藥用鹽可通過慣用化學(xué)方法從母體化合物、堿性或酸性部分來合成。通常，這些鹽可通過使這些化合物的游離酸形式與化學(xué)計(jì)量的適當(dāng)堿(例如na、ca、mg或k的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等)進(jìn)行反應(yīng)來制備，或通過使這些化合物的游離堿形式與化學(xué)計(jì)量的適當(dāng)酸進(jìn)行反應(yīng)來制備。這些反應(yīng)通常是在水或有機(jī)溶劑或二者的混合物中進(jìn)行。通常，在可行的情況下，使用非水性介質(zhì)如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈是合乎需要的。其它適宜的鹽的列表可例如在“remington'spharmaceuticalsciences”,第20版,mack出版公司,伊斯頓,pa.,(1985)；和stahl和wermuth的“handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse”(wiley-vch,weinheim,德國,2002)中找到。如本文所用的術(shù)語“可藥用載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料、多功能賦形劑如重組白蛋白等及其組合，其對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的(例如參見remington'spharmaceuticalsciences,第18版，mackprintingcompany,1990,pp.1289-1329)。除了其與活性成分不相容以外，在治療或藥物組合物中考慮使用任何常規(guī)載體。本發(fā)明的方法已經(jīng)報(bào)道了gdf15循環(huán)水平在多種病理學(xué)和生理學(xué)狀況、最常見是妊娠(mooreag2000.jclinendocrinolmetab85:4781-4788)、β-地中海貧血(tannot2007,natmed13:1096-101)(zimmermannmb,2008amjclinnutr88:1026-31)和先天性紅細(xì)胞生成障礙性貧血(tamaryh2008,blood.112:5241-4)中升高。在文獻(xiàn)報(bào)道中，gdf15hia已經(jīng)與多種生物活性聯(lián)系。gdf15敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究提示，gdf15可以保護(hù)性對抗缺血性/再灌注-或超負(fù)荷-誘導(dǎo)的心臟損傷(kempft,2006,circres.98:351-60)(xuj,2006,circres.98:342-50)、保護(hù)性對抗年齡相關(guān)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元損失(strelauj、2009,jneurosci.29:13640-8)、溫和地保護(hù)性對抗腎臟的代謝性酸中毒和可引起癌癥患者的惡病質(zhì)(johnenh2007natmed.11:1333-40)。很多小組還研究了gdf15在細(xì)胞凋亡和增殖中的作用，并采用不同的細(xì)胞培養(yǎng)物和異種移植物模型報(bào)道了有爭議的結(jié)果。對轉(zhuǎn)基因小鼠的研究顯示，gdf15保護(hù)性地對抗致癌物或ape突變引起的腸和肺中的瘤形成(baeksj2006,gastroenterology.131:1553-60；cekanovam2009,cancerprevres2:450-8)。還已經(jīng)報(bào)道了gdf15在炎癥、癌癥和代謝中有作用(samulebreit等人,growthfactors,2011年10月；29(5):187-195)。gdf15還已經(jīng)牽涉在生理學(xué)食欲和體重的調(diào)節(jié)中(vickywang-weitsai等人,publiclibraryofscience:plosone2013,第8卷,第2期,e55174)。本發(fā)明提供了在需要其的受治療者中治療或預(yù)防代謝障礙或疾病、糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂異常癥、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它進(jìn)行性肝疾病、抗胰島素性、高胰島素血、葡糖耐受不良、高血糖、代謝綜合征、高血壓、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈疾病、中風(fēng)、心力衰竭、冠心病、糖尿病并發(fā)癥(包括但不限于慢性腎病)、神經(jīng)病、胃輕癱和其它代謝障礙的方法，該方法包括：給所述受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物或其酰胺、酯或鹽或綴合物的混合物，其中所述生物分子是人生長分化因子15(gdf15)和其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式。該方法可以具有諸如降低施用頻率的有利作用。因此，作為進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了如本文所述的綴合物或其酰胺、酯或可藥用鹽或本文所述的綴合物的混合物用于治療代謝障礙或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂異常癥、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它進(jìn)行性肝疾病、抗胰島素性、高胰島素血、葡糖耐受不良、高血糖、代謝綜合征、高血壓、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈疾病、中風(fēng)、心力衰竭、冠心病、糖尿病并發(fā)癥(包括但不限于慢性腎病)、神經(jīng)病、胃輕癱和其它代謝障礙的用途，其中所述生物分子是人生長分化因子15(gdf15)、其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式。因此，作為進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了綴合物或其酰胺、酯或可藥用鹽或綴合物的混合物在療法中的用途。治療上使用的本發(fā)明的藥物組合物或組合的有效量將取決于例如治療背景和目標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，用于治療的適當(dāng)劑量水平因此將部分地根據(jù)所遞送的分子、使用該綴合物的適應(yīng)癥、施用途徑以及患者的尺寸(體重、體表或器官尺寸)和情況(年齡及健康狀況)而改變。因此，臨床醫(yī)師可確定劑量并改變施用途徑以獲得最佳治療效果。根據(jù)上述因素，典型劑量可以是約0.1μg/kg至高達(dá)約100mg/kg的范圍或更高。在其它實(shí)施方案中，劑量范圍可以是0.1μg/kg直至約100mg/kg；或1μg/kg直至約100mg/kg。在該實(shí)施方案的另一方面，劑量范圍可以是5μg/kg至25μg/kg。在該實(shí)施方案的另一方面，劑量范圍可以是10μg/kg至20μg/kg。給藥頻率將取決于所用制劑中的雙重功能蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通常，臨床醫(yī)師將施用組合物直至達(dá)到可實(shí)現(xiàn)期望效果的劑量。因此，組合物可作為單一劑量施用，按時(shí)間以兩個(gè)或更多個(gè)劑量施用(各劑量可以或可不含有相同量的期望分子)，或通過植入裝置或?qū)Ч芤赃B續(xù)輸注方式施用。適當(dāng)劑量的進(jìn)一步細(xì)分是本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)方式實(shí)施并在他們所實(shí)施的常規(guī)任務(wù)的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^使用適當(dāng)劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)來確定適當(dāng)劑量。如本文所用的術(shù)語"治療有效劑量"和"治療有效量"指綴合物在組織系統(tǒng)、動(dòng)物或人類中引起研究者、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)師所追尋的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)響應(yīng)的量，其包括緩解或改善所治療疾病或障礙的癥狀，即支持可觀測水平的一種或多種預(yù)期的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)響應(yīng)的gdf15(或gdf15突變體)多肽綴合物的量，所述響應(yīng)例如有降低血液葡萄糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低體重；減少食物攝入或改善葡萄耐量、能量消耗或胰島素敏感性)。術(shù)語"患者"或"受治療者"可互換地用于指人或非人動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，如本文所用的術(shù)語“治療”任意疾病或障礙指改善該疾病或障礙(即減緩或阻止或減輕該疾病或其至少一種臨床癥狀的發(fā)展)。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，“治療”指減輕或改善至少一個(gè)身體參數(shù)，包括患者不能感受到的那些。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“治療”指在身體方面調(diào)控疾病或障礙(例如穩(wěn)定可感受到的癥狀)或在生理學(xué)方面調(diào)控疾病或障礙(例如穩(wěn)定身體參數(shù))或二者。因此，治療包括抑制(即阻止疾病、障礙或病癥或與之相關(guān)的臨床癥狀的發(fā)展或進(jìn)一步發(fā)展)活性疾病(例如在gdf15綴合物的情況中，以便減輕體重、減少食物攝入、降低血流中的胰島素和/或葡萄糖水平、增加葡萄糖耐量以使得葡萄糖水平的波動(dòng)最小，和/或以便保護(hù)避免葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞導(dǎo)致的疾病)。在另一實(shí)施方案中，“治療”指預(yù)防或延遲疾病或障礙的發(fā)作或發(fā)展或進(jìn)程。如本文所用的術(shù)語"需要該治療"指醫(yī)師或其它看護(hù)者做出的患者需要或?qū)⑹芤嬗谥委煹呐袛唷＿@種判斷是基于醫(yī)師或看護(hù)者經(jīng)驗(yàn)范圍內(nèi)的多種因素做出的。術(shù)語"預(yù)防"、"阻止"等指以一種方式(例如在疾病、障礙、病癥或其癥狀發(fā)作前)開始的動(dòng)作過程(例如施用本發(fā)明的綴合物包含綴合物的藥物組合物)，從而暫時(shí)地或永久地阻止、遏制、抑制或減少受治療者發(fā)展出疾病、障礙、病癥等的風(fēng)險(xiǎn)(如通過例如不存在臨床癥狀所確定的那樣)或延緩其發(fā)作，通常是在受治療者容易患有特定疾病、障礙或病癥的背景下。在某些情況中，該術(shù)語還指減緩疾病、障礙或病癥的進(jìn)程或抑制其進(jìn)展為有害的或其它方面不期望的狀態(tài)。術(shù)語"代謝疾病或障礙"指一系列相關(guān)的特質(zhì)，包括但不限于高胰島素血、異常葡萄糖耐量、肥胖、脂肪至腹部或上身腔室的再分布、高血壓、以高甘油三酯為特征的血脂異常癥、低的高密度脂蛋白(hdl)-膽固醇和高的小而密低密度脂蛋白(ldl)顆粒?；加写x疾病或障礙的受治療者處于發(fā)展出2型糖尿病和例如動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)中。短語"葡萄糖代謝障礙"囊括以與受治療者相對于健康個(gè)體的葡萄糖水平升高和/或胰島素水平升高相關(guān)的臨床癥狀或臨床癥狀組合為特征的任意障礙。葡萄糖和/或胰島素水平升高可以表現(xiàn)在如下疾病、障礙和病癥中：高血糖、ii型糖尿病、妊娠糖尿病、i型糖尿病、抗胰島素性、葡萄糖耐量降低、高胰島素血、葡萄糖代謝受損、前驅(qū)糖尿病、代謝障礙(例如代謝疾病或障礙，其也稱為x綜合征)和肥胖等。本公開內(nèi)容的gdf15綴合物及其組合物可用于例如獲得和/或維持葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)，例如降低血流中的葡萄糖水平和/或降低胰島素水平至在健康個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的范圍。如本文所用的術(shù)語"抗胰島素性"指其中正常量的胰島素不能產(chǎn)生正常的生理學(xué)或分子響應(yīng)的病癥。在一些情況中，超過生理學(xué)量的胰島素(內(nèi)源性產(chǎn)生或外源性施用)能夠完全地或部分地克服抗胰島素性，并產(chǎn)生生物學(xué)響應(yīng)。如本文所用的短語"葡萄糖耐量"指當(dāng)葡萄糖攝入波動(dòng)時(shí)個(gè)體控制血漿葡萄糖和/或血漿胰島素水平的能力。例如，葡萄糖耐量包括個(gè)體在約120分鐘內(nèi)使血漿葡萄糖降回?cái)z入葡萄糖之前測定的水平的能力。術(shù)語“葡糖耐受不良”或“葡萄糖耐量降低(igt)”是血糖代謝障礙的前驅(qū)糖尿病狀態(tài)，其伴有心血管病狀的風(fēng)險(xiǎn)增加。前驅(qū)糖尿病病狀阻止患者將葡萄糖有效地移入細(xì)胞中和將其用作有效的燃料來源，導(dǎo)致血液葡萄糖水平增加和某個(gè)程度的抗胰島素性。術(shù)語“2型糖尿病”是以葡萄糖產(chǎn)生過量為特征的病癥，循環(huán)葡萄糖水平由于葡萄糖清除不足夠和胰腺不能產(chǎn)生足夠的胰島素而保持過分地高。如本文所用的術(shù)語"高血糖"指其中相對于健康個(gè)體而言增加量的葡萄糖在患者的血漿中循環(huán)的病癥。高血糖可以采用本領(lǐng)域已知的方法、包括如本文所述的空腹血糖水平測定來診斷。術(shù)語“低血糖癥”還稱為低血糖，其在血液葡萄糖水平下降過低以至于不能給身體活動(dòng)提供足夠能量時(shí)發(fā)生。如本文所用的術(shù)語"高胰島素血"指其中循環(huán)胰島素水平增加的病癥，同時(shí)血液葡萄糖水平增加或正常。高胰島素血可以由抗胰島素性引起，其伴有血脂異常癥如高甘油三酯、高膽固醇、高低密度脂蛋白(ldl)和低高密度脂蛋白(hdl)；高尿酸水平；多囊卵巢綜合征；ii型糖尿病和肥胖。高胰島素血可以診斷為具有高于約2pu/ml的血漿胰島素水平。術(shù)語“胰腺炎”是胰腺的炎癥。術(shù)語“血脂異常癥”是脂蛋白代謝的障礙，包括脂蛋白超量產(chǎn)生或缺乏。血脂異常癥可以通過血液中總膽固醇、低密度脂蛋白(ldl)膽固醇和甘油三酯濃度升高和高密度脂蛋白(hdl)膽固醇濃度下降來表現(xiàn)。術(shù)語“脂肪肝疾病(fld)”還稱為脂肪肝，它是其中甘油三酯脂肪的大泡經(jīng)由脂肪變性過程在肝細(xì)胞中蓄積(即脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)異常滯留)的病癥。盡管有多種起因，脂肪肝可以被認(rèn)為是在世界范圍在過度飲酒和肥胖的那些中發(fā)生的單一疾病(有或無抗胰島素性胰島素的作用)。當(dāng)該脂肪代謝過程被破壞，脂肪可以在肝臟中過量蓄積，因而導(dǎo)致脂肪肝。脂肪蓄積還可以伴有肝臟的進(jìn)行性炎癥(肝炎)，稱為脂肪性肝炎。通過考慮酒精的貢獻(xiàn)，脂肪肝還稱為酒精性脂肪變性或非酒精性脂肪肝疾病非酒精性脂肪肝疾病(nafld)和更嚴(yán)重的形式如酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎(nash)。術(shù)語“脂肪性肝炎”是一種以肝細(xì)胞的脂肪變化為特征的肝臟疾病，伴有小葉內(nèi)炎癥和纖維變性。當(dāng)不與過量酒精攝入相關(guān)時(shí)，其稱為非酒精性脂肪性肝炎(nash)。術(shù)語“進(jìn)行性肝疾病”是多種肝臟病狀引起的肝臟疾病，其從相對良性的狀態(tài)如肝脂肪變性發(fā)展為更嚴(yán)重的狀態(tài)、包括肝炎、纖維變性、肝硬化和肝細(xì)胞癌。pnpla3已經(jīng)被明確地與進(jìn)行性肝疾病如nafld/nash、afld/ash、病毒性肝炎、wilson’s疾病、遺傳性血色病和原發(fā)性硬化性膽管炎相關(guān)聯(lián)(paoladongiovanni等人,worldjournalofgastroenterology,2013,19(41),6969-6978).就人患者而言的術(shù)語“肥胖”可以定義為體重指數(shù)(bmi)為30或更高的成人(centersfordiseasecontrolandprevention)?！按x綜合征”可以定義為一系列增加心臟疾病和其它疾病如糖尿病和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素。這些危險(xiǎn)因素包括：高血糖—禁食后至少110毫克/分升(mg/dl)；高甘油三酯—血流中至少150mg/dl；低hdl--少于40mg/dl；和130/85mmhg或更高的血壓(worldhealthorganization)。術(shù)語“心血管疾病”是與心臟或血管相關(guān)的疾病。術(shù)語“動(dòng)脈粥樣硬化”是以大動(dòng)脈和中等大小的動(dòng)脈的內(nèi)膜中的不規(guī)律分布的脂質(zhì)沉積為特征的血管疾病，有時(shí)導(dǎo)致動(dòng)脈管腔縮窄和最終發(fā)展為纖維變性和鈣化。病損通常是局部的，緩慢和間歇地進(jìn)行。血液流速的受限導(dǎo)致大多數(shù)臨床表現(xiàn)，所述臨床表現(xiàn)隨病損的分布和嚴(yán)重性而不同。術(shù)語“冠心病”還稱為冠狀動(dòng)脈疾病，其為供應(yīng)血液和氧氣至心臟的小血管變窄?！疤悄虿〔l(fā)癥”是高血葡萄糖水平引起的問題，具有其它身體功能如腎臟、神經(jīng)(神經(jīng)病)、足(足潰瘍和循環(huán)不佳)和眼(例如視網(wǎng)膜病變)。糖尿病還增加了心臟疾病和骨和關(guān)節(jié)障礙的風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病的其它長期并發(fā)癥包括皮膚問題、消化問題、性功能障礙以及牙齒和牙齦問題。如本文所用的短語"體重障礙"指與體重過重和/或食欲增加相關(guān)的病癥。各種參數(shù)用于確定個(gè)體相對于參比健康個(gè)體而言是否超重，包括個(gè)體的年齡、身高、性別和健康狀態(tài)。例如，通過評價(jià)個(gè)體的體重指數(shù)(bmi)可以認(rèn)為個(gè)體是超重的或肥胖的，體重指數(shù)(bmi)是通過將個(gè)體體重的千克數(shù)除以個(gè)體身體的米數(shù)的平方計(jì)算而得。bmi范圍為-18.5至-24.9kg/m的成人被認(rèn)為具有正常體重；bmi為-25至-29.9kg/m的成人被認(rèn)為是超重的(肥胖前期)；bmi為-30kg/m或更高的成人可以被認(rèn)為是肥胖。食欲增加經(jīng)常導(dǎo)致體重過重。存在一些伴有食欲增加的病癥，包括例如夜食綜合征，其特征為早晨食欲缺乏和晚間多食且常伴有失眠，但是其可以與下丘腦損害相關(guān)。除非本文另外指明或上下文另外明顯矛盾，否則本文所述所有方法均可以任意適宜的順序?qū)嵤１疚奶峁┑娜魏魏退袑?shí)例或示例性語言(如“例如”)的使用僅旨在更好地闡明本發(fā)明，而不對要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍進(jìn)行任何限制。本發(fā)明的綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性可以通過下文描述的如下方法進(jìn)行評價(jià)。分析和數(shù)據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1和19b的gdf15綴合物活性和血漿穩(wěn)定性可以按照下文描述的體外和體內(nèi)方法來評價(jià)。動(dòng)物研究方法這份文件中描述的所有動(dòng)物研究由生物醫(yī)學(xué)研究動(dòng)物照顧和使用委員會諾華研究所(novartisinstitutesforbiomedicalresearchanimalcareandusecommittee)按照地方和聯(lián)邦規(guī)程和指導(dǎo)所批準(zhǔn)。飲食誘導(dǎo)的肥胖雄性小鼠(c57bl/6ntac)購自taconic并從6周齡開始喂食60％脂肪飲食(研究飲食d12492i)。到達(dá)后，將小鼠以每個(gè)籠子一只動(dòng)物在12h:12h反亮-暗循環(huán)下進(jìn)行圈養(yǎng)。在任意使用之前，動(dòng)物均接受最少1周的適應(yīng)期。通常小鼠在3-4月齡進(jìn)行研究。在研究前一天，將小鼠按照體重隨機(jī)分配，以便每組具有相似的平均體重。在研究當(dāng)天，將小鼠放在新鮮籠子中，移除舊的食物。約1小時(shí)后和臨近暗循環(huán)之前，小鼠接受溶媒(30mm乙酸鈉,ph4)或脂質(zhì)綴合的gdf15類似物(0.5mg/kg)的單次皮下劑量。在所有注射完成后，將小鼠重新稱重，重新供應(yīng)確定量的食物(每只小鼠～50g)。歷經(jīng)2周歷程、在圖中指定的時(shí)間測定食物攝入和體重。在如上所述處置的替代動(dòng)物中，在指定時(shí)間收集血漿，通過elisa、按照生產(chǎn)商的指示(r&dsystemsquantikinehumangdf15immunoassay；dgd150)測定gdf15水平。dio小鼠單次0.5mg/kgsc劑量在如上所述的分析中測試本發(fā)明的綴合物的活性和半衰期。表1*瘦小鼠(leanmice)exp1:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1；exp2:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)2。表1中的數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明的綴合物與未綴合的hgdf15相比和/或與聚乙二醇化hgdf15相比具有顯著更長的作用持續(xù)時(shí)間。gdf15-綴合物在飼料喂養(yǎng)的狗中的效力：gdf15-脂肪酸綴合物研究目標(biāo)：為了在比格犬中在急性設(shè)置(6小時(shí))中和歷經(jīng)96小時(shí)時(shí)期評價(jià)皮下施用0.05mg/kg本發(fā)明的gdf15-脂肪酸部分綴合物或溶媒對照對食物攝入的效力。在整個(gè)14天的給藥后時(shí)期在不同時(shí)間點(diǎn)收集血漿樣品，以評價(jià)該化合物的pk性質(zhì)。在整個(gè)研究中測定體重。動(dòng)物：基線體重和處置狗id體重(kg)處置5012.65溶媒628.85溶媒7710.15溶媒678.85gdf15739.95gdf157512.25gdf15表2給藥方法：在基線體重和血樣收集后，給予溶媒或gdf15。gdf15-脂肪酸部分綴合物作為0.97mg/ml溶液供應(yīng)，在沒有稀釋的情況下以0.05mg/kg皮下注射進(jìn)行給藥。將等體積的30mmol/l乙酸鈉ph4溶媒(52μl/kg)通過皮下注射給予溶媒動(dòng)物。血液收集：從頭或頸靜脈采集血樣(3ml,在含有edta和蛋白酶抑制劑diprotina和抑肽酶的試管中)，放置在冰上直至于4℃以3,000rpm離心20分鐘。將血漿以等分試樣分配，于-70℃儲存至分析。收集以下時(shí)間點(diǎn)：0、6.75、24.75、48.75、72.75和96.75小時(shí)。在第7、10和14天收集另外的樣品。食物攝入測定：在給藥后45分鐘開始隨意食物攝入的測定。該食物攝入測定由兩個(gè)階段組成：急性測定(0-6小時(shí))和亞慢性測定(0-96小時(shí))。從0-2小時(shí)，對狗給予500g普通飼料(hill’sj/d飲食)。在2小時(shí)，移出剩余食物并稱重，在2-4小時(shí)時(shí)期提供另外500g飼料。在4小時(shí)，移出剩余食物并稱重，在4-6小時(shí)時(shí)期提供另外300g飼料。在6小時(shí)，移出剩余食物并稱重。在該時(shí)間(6.75小時(shí))收集血樣。然后給狗提供500g飼料過夜。在第1-4天的早晨，移出剩余食物并稱重，從每只動(dòng)物收集血樣。在第1-3天，然后給狗提供500g飼料達(dá)24小時(shí)時(shí)期。在第4天，將狗返回至它們的正常飼料配給(260g)。另外的食物攝入測定：在第7、14和28天，給予研究動(dòng)物6小時(shí)以食用它們的每日飼料(260g)。在該時(shí)期結(jié)束時(shí)，收集任何剩余的食物并稱重。體重測定：在基線和第2、4、7、10、14、18和28天測定體重。在禁食狀態(tài)收集基線體重。在第2和4天收集的體重是未禁食的。對于溶媒處置的動(dòng)物，所有其它體重在禁食狀態(tài)收集。對于gdf15處置的動(dòng)物，在第7-28天測定的體重是未禁食的，因?yàn)閯?dòng)物被連續(xù)給予食物以刺激食欲和獲得體重。在飼料喂養(yǎng)的狗中的本發(fā)明的gdf15-脂肪酸分析綴合物的效應(yīng)研究目標(biāo)：為了在比格犬中在急性設(shè)置(6小時(shí))中和歷經(jīng)96小時(shí)時(shí)期評價(jià)皮下施用溶媒對照和0.015mg/kg或0.005mg/kg本發(fā)明的gdf15-脂肪酸部分綴合物對食物攝入的效力(在該研究中，在所有狗中，溶媒組將在處置組之前進(jìn)行)。在整個(gè)14天的給藥后時(shí)期在不同時(shí)間點(diǎn)收集血漿樣品，以評價(jià)該化合物的pk性質(zhì)。在整個(gè)研究中測定體重。動(dòng)物：基線體重和處置表3給藥方法：在基線體重和血樣收集后，給予溶媒劑量。通過皮下注射將52μl/kg30mmol/l乙酸鈉ph4溶媒(52μl/kg)給予溶媒動(dòng)物。gdf15的給藥在基線體重和血樣收集后進(jìn)行。gdf15-脂肪酸部分綴合物作為1.20mg/ml溶液供應(yīng)，在稀釋后以0.015mg/kg和0.005mg/kg通過皮下注射進(jìn)行給藥。將gdf15儲備液進(jìn)行稀釋以維持在前面研究中遞送的52μl/kg。血液收集：從研究的溶媒組和治療組采集血樣。從頭或頸靜脈采集血樣(3ml,在含有edta和蛋白酶抑制劑diprotina和抑肽酶的試管中)，放置在冰上直至于4℃以3,000rpm離心20分鐘。將血漿以等分試樣分配，于-70℃儲存至分析。收集以下時(shí)間點(diǎn)：0、6.75、24.75、48.75、72.75和96.75小時(shí)。在第7、10和14天收集另外的樣品。食物攝入測定：在研究的溶媒組和處置組期間測定食物攝入。在給藥后45分鐘開始隨意食物攝入的測定。該食物攝入測定由兩個(gè)階段組成：急性測定(0-6小時(shí))和亞慢性測定(0-96小時(shí))。從0-2小時(shí)，對狗給予500g普通飼料(hill’sj/d飲食)。在2小時(shí)，移出剩余食物并稱重，在2-4小時(shí)時(shí)期提供另外500g飼料。在4小時(shí)，移出剩余食物并稱重，在4-6小時(shí)時(shí)期提供另外300g飼料。在6小時(shí)，移出剩余食物并稱重。在該時(shí)間(6.75小時(shí))收集血樣。然后給狗提供500g飼料過夜。在第1-4天的早晨，移出剩余食物并稱重，從每只動(dòng)物收集血樣。在第1-3天，然后給狗提供500g飼料達(dá)24小時(shí)時(shí)期。在第4天，將狗返回至它們的正常飼料配給(260g)。另外的食物攝入測定：在溶媒組第7和14天期間和在治療組第7和28天之間的各天，給予研究動(dòng)物6小時(shí)以食用它們的每日飼料(260g)。在該時(shí)期結(jié)束時(shí)，收集任何剩余的食物并稱重。每周一次進(jìn)行食物食用的定時(shí)測定。在喂食后1、2、4和6小時(shí)測定225g飼料的食用以測定釋放每只動(dòng)物的食用情況已經(jīng)返回至正常。體重測定：在該研究的溶媒組和處置組期間測定體重。在溶媒組期間，在基線和第2、4、7、10和14天測定體重。在處置組期間，在基線和第2、4、7、10、14、17、21、24和28天測定體重。在第2和4天收集的體重是未禁食的。所有其它體重在禁食狀態(tài)收集。在上述分析中測試了實(shí)施例2的綴合物。狗單次sc劑量表4gdf15-綴合物改善肥胖小鼠中代謝疾病、包括糖尿病和脂肪肝疾病的測定飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠每周一次給予溶媒或?qū)嵤├?9bm(0.5mg/kg/s.c.)達(dá)4周。在第一次劑量后2周測定非禁食葡萄糖和胰島素，在第一次劑量后4周測定過夜禁食葡萄糖和胰島素。實(shí)施例19bm降低非禁食葡萄糖達(dá)23％(207.1mg/dl溶媒處置vs.160.4mg/dl實(shí)施例19bm；p<0.05)。實(shí)施例19bm與溶媒處置的小鼠相比降低非禁食胰島素水平達(dá)75％(2.1vs8.7ng/ml；p<0.05)。初始劑量后4周，實(shí)施例19bm降低禁食血葡萄糖達(dá)28％(142.7vs.199.5mg/dl；p<0.05)和降低禁食胰島素達(dá)78％(0.77vs.3.5ng/ml；p<0.05)。脂肪肝疾病的標(biāo)記也通過實(shí)施例19bm的四個(gè)每周一次劑量得以改善。實(shí)施例19bm降低肝脂肪變性達(dá)57.5％(11.36vs.26.73％肝脂肪；p<0.05)和降低肝細(xì)胞損害標(biāo)記丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)的血清水平達(dá)58％(46.2vs.110.5u/l；p<0.05)。另外，實(shí)施例19bm降低pnpla3(進(jìn)行性肝疾病中的原因性基因)的肝臟表達(dá)達(dá)77％(p<0.05)。本發(fā)明的實(shí)施例20和21的apj-激動(dòng)劑綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性可以按照下文描述的體外和體內(nèi)方法進(jìn)行評價(jià)。hapj鈣流分析：將chem-5apj穩(wěn)定細(xì)胞(millipore#hts068c)以384孔模式以10,000個(gè)細(xì)胞/孔鋪于25ul生長培養(yǎng)基中，然后在37℃組織培養(yǎng)箱中生長24小時(shí)。在分析前1小時(shí)，添加25ul/孔flipr鈣4染料(moleculardevicesr8142)和2.5mm丙磺舒，在37℃組織培養(yǎng)箱中培育細(xì)胞1小時(shí)。將肽溶于hbss、hepes&0.1％bsa緩沖液中，一式三份從50um至5pm連續(xù)稀釋10倍。使用fliprtetra將肽添加至具有染料的細(xì)胞中(1:5，最終肽濃度為10um至1pm)。細(xì)胞內(nèi)部的flipr染料在結(jié)合至鈣后發(fā)射熒光，而來自細(xì)胞外部的熒光則被遮蔽。在fliprtetra上使用470-495激發(fā)波長及515-575發(fā)射波長來測量熒光。在肽添加前10秒開始進(jìn)行讀數(shù)，總計(jì)讀數(shù)3分鐘。針對每個(gè)肽濃度計(jì)算最大-最小值并作圖，并針對肽對鈣流的刺激使用graphpadprism軟件來計(jì)算曲線拐點(diǎn)處的ec50值。體內(nèi)分析：將綴合物溶于pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)中至1mg/ml的濃度以形成給藥溶液。經(jīng)由外側(cè)尾靜脈將給藥溶液以1ml/kg的體積(相當(dāng)于1mg/kg的劑量)經(jīng)靜脈內(nèi)施用至雄性sprague-dawley大鼠。在給藥后在指定時(shí)間從頸靜脈導(dǎo)管取靜脈血樣并立即放置在濕冰上。將這些樣品于4℃離心，將上清血漿轉(zhuǎn)移至新鮮試管待分析。生物分析：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：通過將肽綴合物溶于水中至1mg/ml制備了儲備液。將10ul儲備液與990ul大鼠血漿混合以形成在血漿中的10,000ng/ml的工作儲備液。將其在血漿中系列稀釋以形成5000、1000、500、100、50、10、5和1ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)。樣品和標(biāo)準(zhǔn)的制備：將25ul血漿樣品或標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)移至干凈板中。向每個(gè)小瓶加入含100ng/ml格列本脲作為內(nèi)標(biāo)的150ul乙腈:meoh(1:1)，將板渦旋以混合內(nèi)容物。將板于4℃以4000rpm進(jìn)行離心。將125ul上清液轉(zhuǎn)移至干凈板中，與50ul水混合，通過lc/ms進(jìn)行分析。lc/ms分析：hplc:具有自動(dòng)采樣器的agilent1290hplc柱子:mac-modacec18,3μm,30mmx2.1mmi.d。流動(dòng)相a：0.1％甲酸在乙腈中的溶液流動(dòng)相b:0.1％甲酸在水中的溶液梯度方案：質(zhì)譜儀：absciex6500ms條件：q1(m/z+)809.3；q3(m/z+)923.7；dp:60；ce:25數(shù)據(jù)分析：采用watsonlimsv7.4軟件收集和分析ms數(shù)據(jù)。采用上述分析的本發(fā)明的apj激動(dòng)劑-綴合物的活性和穩(wěn)定性表5通過按照下述體外和體內(nèi)方法可以評價(jià)本發(fā)明的實(shí)施例26a和26b的催產(chǎn)素綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性。體外分析描述材料&方法化合物板的制備所供應(yīng)的化合物在dmso中制備和最終在eurofinsdiscoveryservices分析緩沖液中制備至濃度比最終分析濃度高三倍。類似地，制備溶媒對照和陽性對照以確保所有分析被適當(dāng)?shù)乜刂?。參比對照gpcr靶參比激動(dòng)劑emaxot催產(chǎn)素1.25μm采用eurofinsdiscoveryservices分析緩沖液制備孔。分析緩沖液是經(jīng)修飾的hanks平衡鹽溶液(hbss)，其中補(bǔ)充了hbss以含有20mmhepes和2.5mm丙磺舒,ph7.4。鈣流分析激動(dòng)劑分析對于每個(gè)分析濃度，將所供應(yīng)的化合物一式兩份鋪板。以相似方式制備參比激動(dòng)劑催產(chǎn)素作為分析對照。參比激動(dòng)劑催產(chǎn)素被包括在emax(參比激動(dòng)劑引起最大響應(yīng)的濃度)中。在fliprtetra儀器上進(jìn)行激動(dòng)劑分析，其中在建立熒光/發(fā)光基線后將受試化合物、溶媒對照和參比激動(dòng)劑加入分析板中。激動(dòng)劑分析總計(jì)為180秒，用于評價(jià)每種化合物激活所分析的gpcr的能力。完成3分鐘激動(dòng)劑分析后，將分析板于25℃孵育另外7分鐘數(shù)據(jù)加工：所有板進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕€校正。一旦進(jìn)行了基線校正，輸出最大熒光/發(fā)光值，處理數(shù)據(jù)以計(jì)算激活百分比和抑制百分比。0至-30％的復(fù)值可能是生物變異的結(jié)果。數(shù)據(jù)處理計(jì)算如下：((maxrlu)-(基線平均值))/((陽性平均值)-(基線平均值))。體內(nèi)分析描述：將綴合物溶于pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)中至3mg/ml的濃度以形成給藥溶液。經(jīng)由外側(cè)尾靜脈將給藥溶液以1ml/kg的體積(相當(dāng)于3mg/kg的劑量)經(jīng)靜脈內(nèi)施用至雄性sprague-dawley大鼠。在給藥后在指定時(shí)間從頸靜脈導(dǎo)管取靜脈血樣并立即放置在濕冰上。將這些樣品于4℃離心，將上清血漿轉(zhuǎn)移至新鮮試管待分析。生物分析：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：通過將肽綴合物和肽在兩個(gè)單獨(dú)的小瓶中溶于二甲亞砜中至1mg/ml制備了儲備液。將10ul每種儲備液與980ul大鼠血漿混合以形成在血漿中的10,000ng/ml的工作儲備液。將其在血漿中系列稀釋以形成5000、1000、500、100、50、10、5、1、0.5和0.1ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)。樣品和標(biāo)準(zhǔn)的制備：將25ul血漿樣品或標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)移至干凈板中。向每個(gè)小瓶加入含100ng/ml格列本脲作為內(nèi)標(biāo)的150ul乙腈，將板渦旋以混合內(nèi)容物。將板于4℃以4000rpm進(jìn)行離心。將125ul上清液轉(zhuǎn)移至干凈板中，與150ul水混合，通過lc/ms進(jìn)行分析。lc/ms分析：hplc:具有自動(dòng)采樣器的agilent1290hplc柱子:mac-modacec18,3μm,30mmx2.1mmi.d。流動(dòng)相a：0.1％甲酸在乙腈中的溶液流動(dòng)相b:0.1％甲酸在水中的溶液梯度方案：質(zhì)譜儀：absciex6500肽ms條件：q1(m/z+)945.20；q3(m/z+)687.27；dp:140；ce:39肽綴合物ms條件：q1(m/z+)1270.85；q3(m/z+)468.30；dp:140；ce:77數(shù)據(jù)分析：采用watsonlimsv7.4軟件收集和分析ms數(shù)據(jù)。按照上述分析的本發(fā)明的催產(chǎn)素脂肪酸綴合物的活性和穩(wěn)定性表6wo2014/095773的實(shí)施例13如下所示：本發(fā)明的催產(chǎn)素-脂肪酸綴合物與未綴合的催產(chǎn)素類似物相比顯示出半衰期增加75倍。通過按照下述的體外和體內(nèi)方法可以評價(jià)本發(fā)明的實(shí)施例27a和27b的agrp綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性。a)htrfcamp分析方案：hek293/mc4r細(xì)胞的傳代細(xì)胞：hek293/mc4r穩(wěn)定細(xì)胞系完全培養(yǎng)基：dmem/f121:1(gibco,目錄號11039,對于分析,非酚紅培養(yǎng)基目錄號21041)10％fbs(熱滅活,gibco,目錄號10082)200μg/ml遺傳霉素(gibco,目錄號10131)15mmhepes(gibco,目錄號15630)2mml-谷氨酰胺(gibco,目錄號25030)燒瓶：150cm2組織培養(yǎng)處理瓶(corning,目錄號430825)。-抽吸條件培養(yǎng)基-用25mldpbs(gibco,目錄號14190)洗滌，然后抽吸*fbs抑制胰蛋白酶-edta處置。-加入2.5ml0.05％胰蛋白酶-edta(gibco,目錄號25300)-放置數(shù)分鐘，拍瓶數(shù)次以使細(xì)胞分離-加入25ml完全培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶-edta處置*用于分析的細(xì)胞制備，必須使用非酚紅完全培養(yǎng)基。-輕輕抽吸數(shù)次以使聚集的細(xì)胞重新混懸-將混懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中-于1200rpm自旋3min-抽吸上清液-輕輕拍底部使細(xì)胞分散-加入5-10ml完全培養(yǎng)基，然后通過輕輕吸取使之重新混懸*用于分析的細(xì)胞制備，必須使用非酚紅完全培養(yǎng)基。-轉(zhuǎn)移0.5ml混懸液至樣品試管中用于vi-細(xì)胞-采用vi-細(xì)胞對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)*每次記錄細(xì)胞密度和存活-轉(zhuǎn)移1-3x106個(gè)細(xì)胞至新的150cm燒瓶中對于3天：3x106個(gè)細(xì)胞/燒瓶對于4天：1x106細(xì)胞/燒瓶-于37c以5％co2進(jìn)行孵育用于htrfcamp分析的細(xì)胞接種(分析前一天)·如傳代部分中那樣制備細(xì)胞混懸液·將混懸液稀釋至2.34x105個(gè)細(xì)胞/ml*13ml對于一塊384孔板是足夠的?！?0μl細(xì)胞混懸液分配至聚-d-賴氨酸biocoat384-孔澄清(bectondickinson,目錄號354660)的各孔中：7000個(gè)細(xì)胞/孔*聚-d-賴氨酸涂布的板在該分析中是必要的。*沒有細(xì)胞用于camp標(biāo)準(zhǔn)的孔·于37℃用5％co2進(jìn)行孵育過夜htrfcamp分析1.試劑的制備·1mibmxibmx(mw222.25g/mol,acros目錄號228420010)111mgdmso(sigmaaldrich,目錄號d2650)500ul于4℃儲存·40mg/mlbsa溶液牛血清清蛋白(sigmaa7030-50g)200mgdh2o5ml于4℃儲存·1mg/ml(176um)agrp母液(在hbss中/2mg/mlbsa)r&d人agrpc-末端(目錄號3726-ag-100)100ug/小瓶1xhanks緩沖鹽溶液(hbss)(gibco,目錄號14065,w/ca和mg)95ul40mg/mlbsa溶液5ul于4℃儲存·2mmndp-amsh母液ndp-amsh(mw1646.9,bachem,目錄號h1100)1mg/小瓶dh2o304ul*一旦溶解，將10ul等分試樣分散在200ul試管中，然后于-20℃儲存·分析緩沖液1hbss10ml1mhepes(gibco,目錄號15630)0.2ml1mibmx20ul*為避免ibmx沉淀，請將緩沖液渦旋直至完全溶解?！し治鼍彌_液2*為避免ibmx沉淀，請將緩沖液渦旋直至完全溶解。·6nmndp-amsh用于igg滴定和agrp滴定2umndp-amsh(母液的1000-倍稀釋)10.8ul分析緩沖液13600ul*一份384孔分析的實(shí)例·120nmagrp用于igg滴定10-倍稀釋的母液(17.6um)26ul分析緩沖液23800ul*一份384孔分析的實(shí)例·ndp-amsh工作溶液用于滴定(參見試劑)·agrp工作溶液用于滴定(參見試劑)·igg工作溶液用于滴定(參見試劑)·camp標(biāo)準(zhǔn)溶液(參見試劑)2.分析(2步方案)分析試劑盒：cisbiocamphirangehtrf試劑盒(目錄號62am6peb)-制備igg/agrp混合料(1:1)·將15uligg工作溶液和15ul120nmagrp混合，然后于環(huán)境溫度孵育1小時(shí)-制備分析板·通過將含有細(xì)胞的384-孔分析板倒放在wipeall上、然后輕叩以除去培養(yǎng)基來清除培養(yǎng)基?！は蚋骺准尤?00μldpbs，以相同方式清除。*一旦清除pbs，盡可能快地進(jìn)行下一步以避免干涸·基于你的樣品排列向各孔轉(zhuǎn)移10μl如下試劑-將384孔板于1200rpm快速自旋-將細(xì)胞于環(huán)境溫度孵育15分鐘-基于你的樣品排列向各孔加入10μl如下試劑-將384孔板于1200rpm快速自旋-將細(xì)胞于環(huán)境溫度孵育另外30分鐘*該孵育時(shí)間不是如此嚴(yán)格。根據(jù)分析發(fā)展數(shù)據(jù)，+/-5min應(yīng)當(dāng)是可以的。-加入10μlcamp-d2(在試劑盒中提供的緩沖液中以1:4稀釋)*重要?。τ陉幮詫φ?，不是camp-d2，而是僅僅是溶解緩沖液。-加入10μl抗-camp穴狀化合物(cryptate)(在試劑盒中提供的緩沖液中以1:4稀釋)-于1200rpm快速自旋。-將孵育分析板于環(huán)境溫度孵育45-60分鐘。-轉(zhuǎn)移30μl每種樣品至組織培養(yǎng)基處理的白色聚苯乙烯384-孔分析板(corning,目錄號3572)中-于1200rpm快速自旋。-采用moleculardevicem5或m5e以以下設(shè)置進(jìn)行熒光測定。moleculardevicem5/m5e設(shè)置b)mc3camp分析材料：細(xì)胞：hek293/mc3r穩(wěn)定細(xì)胞系完全培養(yǎng)基：dmem/f121:1(gibco,目錄號11039)10％fbs(熱滅活,gibco,目錄號10082)x200μg/ml遺傳霉素(gibco,目錄號10131)2mml-谷氨酰胺(gibco,目錄號25030)燒瓶:150cm2組織培養(yǎng)處理瓶(corning,目錄號430825).分析緩沖液板384孔實(shí)底greinerbio-one(目錄號-781080)分析方案(拮抗劑方案)：i.抽吸條件培養(yǎng)基ii.用25mldpbs(gibco,目錄號14190)洗滌iii.加入2ml0.25％胰蛋白酶-edta(gibco,目錄號25200-056)iv.將燒瓶在孵育器中放置數(shù)分鐘，拍瓶數(shù)次以使細(xì)胞分離。v.加入10ml完全培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶-edta處置，通過輕輕抽吸數(shù)次以使聚集的細(xì)胞重新混懸而將其充分混合vi.轉(zhuǎn)移1.5ml細(xì)胞至新的含有20ml完全培養(yǎng)基的150cm燒瓶中vii.將剩余的混懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中viii.于1200rpm自旋4min。抽吸上清液ix.向試管中加入6ml分析緩沖液，將細(xì)胞通過輕輕抽吸重新混懸x.轉(zhuǎn)移0.5ml混懸液至樣品試管中用于vi-細(xì)胞，加入另外0.5mlpbs。xi.采用vi-細(xì)胞對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)*每次記錄細(xì)胞密度和存活i.將細(xì)胞以4k/孔鋪在10ul/孔的含有ibmx的分析緩沖液中。ii.將板在孵育器中放置～30mins，然后在混懸細(xì)胞上開始分析。進(jìn)行了兩步camp方案用于camp測定。操作i.向10ul/孔的細(xì)胞中加入在分析緩沖液中以3x制備的5ulagrp，僅加至激動(dòng)劑孔中。ii.將5ul緩沖液加至陽性對照孔(將具有ndp-α-msh的孔)中。iii.將板于37℃溫育～20分鐘。iv.向含有agrpdrc的孔中加入5ul/孔的以4x制備的激動(dòng)劑ec80(ndp-α-msh)。v.對于ndp-α-mshec50計(jì)算，加入5ul/孔的以4x制備的激動(dòng)劑(ndp-α-msh)drc(板中的最終最高濃度是100nm)vi.僅向陰性對照中加入緩沖液。vii.將384孔板脈沖自旋，將細(xì)胞在孵育器中孵育30分鐘。viii.向各孔加入10μl如下試劑：a.10μlcamp-d2b.*重要??！對于陰性對照，不要加入camp-d2，而是僅加入溶解緩沖液和10ul/孔的tb-穴狀化合物c.10μl抗-camp穴狀化合物d.將板脈沖自旋，于室溫孵育60分鐘。c.體內(nèi)分析描述:將10納摩爾綴合物溶于300μlpbs(磷酸鹽緩沖鹽水)中以形成給藥溶液。經(jīng)由外側(cè)尾靜脈將給藥溶液(300μm)經(jīng)靜脈內(nèi)施用至雄性sprague-dawley大鼠(相當(dāng)于每只大鼠10納摩爾的劑量)。在給藥后在指定時(shí)間經(jīng)由剪斷尾巴取血并立即放置在濕冰上。將這些樣品于4℃離心，將上清血漿轉(zhuǎn)移至新鮮試管待分析。生物分析：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：實(shí)施例27a和27b的兩種脂肪酸綴合物和一種成熟人agrp肽用于制備標(biāo)準(zhǔn)。通過將儲備的標(biāo)記肽在用酪蛋白稀釋至100ug/ml的elisa樣品中稀釋制備了每種agrp的中間體儲備液。對于分析，將中間體稀釋至2500pg/ml的最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，然后在用牛血清清蛋白(bsa)稀釋的elisa樣品中2-倍系列稀釋至16點(diǎn)，包括零劑量標(biāo)準(zhǔn)。樣品稀釋:將血漿樣品在用bsa稀釋的elisa樣品中10-倍稀釋，然后5-倍系列稀釋至31,250-倍。5b1人agrpelisa方法:于室溫將384孔微板以30ul/孔在1xpbs中涂布抗人agrp克隆5b1過夜。抽吸板并用基于乳的封閉劑以90ul/孔于室溫封閉2小時(shí)。以30ul/孔進(jìn)行所有其它孵育。將板再次抽吸，將標(biāo)準(zhǔn)于室溫加入孔中達(dá)2小時(shí)。然后將板用基于磷酸鹽的含吐溫20的洗滌緩沖液洗滌3次，向孔中加入生物素化山羊抗人agrp多克隆抗體以檢測于室溫2小時(shí)所結(jié)合的agrp。將板再次洗滌，于室溫30分鐘向各孔加入hrp-標(biāo)記的鏈霉抗生物素試劑。將板最后一次洗滌，向所有孔加入化學(xué)發(fā)光底物，在用于光輸出的spectramxm5上理解讀板。數(shù)據(jù)分析:將原始數(shù)據(jù)組織化并用于基礎(chǔ)pk參數(shù)分析。根據(jù)上述分析的本發(fā)明的agrp脂肪酸綴合物的活性和穩(wěn)定性：表7通過按照下述體外方法可以評價(jià)實(shí)施例28a、28b和28c的fgf23綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性。體外活性分析egr-1-熒光素酶:純化hfgf23-fa綴合物的生物活性在egr-1-熒光素酶報(bào)道基因分析中進(jìn)行了測試。hfgf23-fa綴合物與fgf23受體的結(jié)合導(dǎo)致egr-1下游激活和egr-1啟動(dòng)子所調(diào)整的熒光素酶報(bào)道基因的表達(dá)。egr-1-熒光素酶報(bào)道基因是基于urakawa等人(nature,2006,第444卷,770-774)的報(bào)道來構(gòu)建的。將接種在48-孔聚-d-賴氨酸板中的hek293t細(xì)胞用egr-1-熒光素酶報(bào)道基因、klotho的全長跨膜形式和轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)道基因(renilla熒光素酶)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后5小時(shí)，將轉(zhuǎn)染混合物用含有分等級濃度的測試蛋白質(zhì)的3mldmem+1％fbs進(jìn)行替換。稍后將細(xì)胞在被動(dòng)溶解緩沖液(promega,目錄號e194a)中溶解20小時(shí)，采用dual-glo熒光素酶分析系統(tǒng)(promega,目錄號e2940)測定熒光素酶活性。結(jié)果實(shí)施例ec50(nm)實(shí)施例28b1.195實(shí)施例28c0.258表8通過按照下述的體外和體內(nèi)方法可以測定本發(fā)明的實(shí)施例29a和29b的serelaxin脂肪酸綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性。體外活性分析#1:材料dmem:f12培養(yǎng)基(gibco,目錄號11320)ibmx(sigma,目錄號i5879)384實(shí)底白色板(greinerbio-one,目錄號781945)20,000動(dòng)態(tài)-2camp試劑盒(cisbio,目錄號62am4pec)腺苷3′,5′-環(huán)單磷酸(sigma,目錄號a9501)matrix-platemateplus(用于添加5μl分析試劑)pbs-gibco(目錄號10010-023)方案:第1天:在實(shí)底pdl涂布的白色板中在10μldmem:f12培養(yǎng)基中接種rxfp1-hek293/親本hek293細(xì)胞8k第2天:用化合物進(jìn)行分析激動(dòng)劑模式(概述):·細(xì)胞在10μldmem:f12培養(yǎng)基中，@37℃o/n·于37℃將5μl2000μm(4x)ibmx加至細(xì)胞中達(dá)30min·于37℃將5μl4x化合物/serelaxin加至上述物質(zhì)中30min(來自化合物稀釋的步驟3，400nm-最終是100nm的最高濃度)·10μlcamp-d2綴合物·10μl抗-camp穴狀化合物綴合物·于室溫孵育1小時(shí)·讀fret信號-envision665nm/620nm化合物制備serelaxin:1)將儲備液683.3μm、即11.7μl稀釋在188.3pbsph7.4中，通過轉(zhuǎn)移15μl化合物至30μl(最終是40μm)在pbs中稀釋3x次–手工2)稀釋1:10，即6μl上述物質(zhì)在54μldmem:f12中(最終是4μm)-手工3)稀釋1:10，即10μl上述物質(zhì)在90μldmem:f12中(最終是400nm)-手工serelaxin-fa綴合物1)將儲備液在pbsph7.4中稀釋至40μm，通過轉(zhuǎn)移15μl化合物至30μl在pbs中稀釋3x次2)稀釋1:10，即6μl上述物質(zhì)在54μldmem:f12中-手工3)稀釋1:10，即10μl上述物質(zhì)在90μldmem:f12中(1:100稀釋)-手工脂肪酸1)將儲備液在pbsph7.4中稀釋至40μm，通過轉(zhuǎn)移15μl化合物至30μl在pbs中稀釋3x次2)稀釋1:10，即6μl上述物質(zhì)在54μldmem:f12中-手工3)稀釋1:10，即10μl上述物質(zhì)在90μldmem:f12中(1:100稀釋)-手工camp標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋:1.稀釋于dmem:f12培養(yǎng)基中的150μlcampstd至第一列(2800nm)2.100μldmem:f12培養(yǎng)基至以后的列至10(1-11)3.3x稀釋，通過轉(zhuǎn)移50μl至100μl4.來自步驟3的20μl至標(biāo)準(zhǔn)曲線板的適當(dāng)孔5.10μlanti-d2&anti-camp穴狀化合物綴合物6.于室溫孵育1小時(shí)7.讀取fret信號-envision665nm/620nm分析:采用graphpadprism將campnm濃度進(jìn)行l(wèi)og(x)轉(zhuǎn)化。由采用4參數(shù)非線性回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線外推camp量。采用10^y轉(zhuǎn)化將外推值轉(zhuǎn)化為nm。采用4參數(shù)非線性回歸，將計(jì)算機(jī)camp量對化合物濃度作圖。結(jié)果：化合物ec50(nm)serelaxin1.12實(shí)施例29b的serelaxin-fa綴合物4.51表9在牛血清清蛋白和人血清#2存在下的體外活性：材料:dmem:f12培養(yǎng)基(gibco,目錄號11320)ibmx(sigma,目錄號i5879)384實(shí)底白板(greinerbio-one,目錄號781945)20,000動(dòng)態(tài)-2camp試劑盒(cisbio,目錄號62am4pec)腺苷3′,5′-環(huán)單磷酸(sigma,目錄號a9501)matrix-platemateplus(用于添加5μl分析試劑)pbs-gibco(目錄號10010-023)1mhepesgibco(cat-15630-080)1xhbssgibco(cat-14175-095)分析緩沖液-1xhbss+10mmhepes牛血清清蛋白cat#a2153(sigma-aldrich)sigmaaldrich-h4522(人血清)條件:·600μmbsa·4％人血清·10％人血清(sigmaaldrich-h4522)·分析緩沖液受試化合物：·serelaxin·serelaxin-fa(實(shí)施例29a)化合物處理:serelaxin-：儲備液是(796.57um)即4.75mg/ml，mw是5963道爾頓serelaxin10ul儲備液溶于190ulpbs中，最終濃度為40μm，將其通過轉(zhuǎn)移30ul至60ul分析緩沖液中稀釋3x倍，11點(diǎn)曲線(a2-a12)，第12個(gè)是零。serelaxin-fa綴合物：儲備液是(287.79um)、即2.61mg/ml，mw是9069道爾頓serelaxin27.798ul儲備液溶于172.2ulpbs中，最終濃度為40μm，將其通過轉(zhuǎn)移30ul至60ul分析緩沖液中稀釋3x倍，11點(diǎn)曲線(a2-a12)，第12個(gè)是零。bsa儲備液制備：對于666.66umbsa：通過溶解1.32gmsbsa制備分析緩沖液30mls對于600umbsa：通過溶解1.18gmsbsa制備分析緩沖液30mls無bsa，僅具有分析緩沖液人血清對于4.44％hs：1.34mls在28.66mls分析緩沖液中對于4％hs：1.2mls在28.8mls分析緩沖液中對于11.11％hs：3.33mls在26.67mls分析緩沖液中對于10％hs：3mls在27mls分析緩沖液中操作：第1天：在實(shí)底板上在基礎(chǔ)dmem:f12培養(yǎng)基中以10μl/孔的體積接種8,000個(gè)細(xì)胞/孔的rxfp1-hek293和hek293(親本)細(xì)胞。將細(xì)胞于37℃/5％co2孵育過夜。第2天：1.將細(xì)胞用50ul分析緩沖液洗滌2x次，在第一次和第二次洗滌后在紙巾上輕敲以除去分析緩沖液2.將細(xì)胞用15ul含各自培養(yǎng)基(單獨(dú)的600umbsa、4％bsa、10％人血清和分析緩沖液)的ibmx(666.66um)的培養(yǎng)基于37℃預(yù)處理30分鐘3.將化合物系列稀釋3x次，11點(diǎn)曲線-從前孔轉(zhuǎn)移15ul化合物至具有30ulpbs的隨后的孔，孔11僅為pbs4.來自步驟3的在分析緩沖液中的稀釋(1:10)(即10ul至90ul分析緩沖液中)5.來自步驟4的在各自培養(yǎng)基(666.66μmbsa&4.44％&11.11％人血清和分析緩沖液)中的再次稀釋，bsa的最終濃度為600μm，人血清是4&10％6.(*將化合物在各自的培養(yǎng)基中于室溫孵育1小時(shí)，然后加入細(xì)胞中)7.來自步驟6的5ul、即4xserelaxin/serelaxin-fa至15ul細(xì)胞中于37℃達(dá)另外30分鐘(serelaxin的最高濃度是100nm)8.加入10ulcampd2綴合物9.加入10ul抗-camp-穴狀化合物10.于室溫孵育1小時(shí)11.在envision上讀取fret12.在它們各自的培養(yǎng)基制備camp標(biāo)準(zhǔn)曲線。camp標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋：camp標(biāo)準(zhǔn)的起始儲備液是1120000nm1.通過將20ulcamp儲備液溶于60ul分析緩沖液中稀釋起始儲備液(1:4)2.步驟1在分析緩沖液中的(1:10)稀釋(即20ul在180ul分析緩沖液中)3.步驟2在各濃度的4.44％&11.11％hs、666.66umbsa或無bsa中的(1:10)稀釋—最終濃度將結(jié)束為4％、10％hs和600μmbsa。camp標(biāo)準(zhǔn)曲線1.將150μl各camp標(biāo)準(zhǔn)加入第一列(2800nm)2.將具有各濃度600umbsa、4％&10％hs和0％)的100μl分析緩沖液加入隨后的11列、即(2-12)3.通過轉(zhuǎn)移50μl至100μl隨后的孔進(jìn)行3x稀釋，第12孔為零，無camp4.來自步驟3的20μl至標(biāo)準(zhǔn)曲線板的適當(dāng)孔中5.加入10μld2綴合物6.于室溫孵育1小時(shí)7.在htrf-envision上讀數(shù)分析:采用graphpadprism將campnm濃度進(jìn)行l(wèi)og(x)轉(zhuǎn)化。由采用4參數(shù)非線性回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線外推camp量。采用10^y轉(zhuǎn)化將外推值轉(zhuǎn)化為nm。采用4參數(shù)非線性回歸，將計(jì)算機(jī)camp量對化合物濃度作圖。結(jié)果:表10體內(nèi)分析可以在各種嚙齒類動(dòng)物模型中測試化合物(serelaxin和serelaxin綴合物)以評價(jià)短期和長期心血管響應(yīng)。短期模型—將小鼠(任意品系，但是優(yōu)選dba/2)或大鼠(任意品系，但是優(yōu)選sprague-dawley)通過吸入異氟烷進(jìn)行麻醉，用在100％氧中的～2％異氟烷維持在穩(wěn)定的手術(shù)麻醉水準(zhǔn)，直腸溫度維持在正常水平。通過疊壓皮膚切口暴露出頸動(dòng)脈和頸靜脈(小鼠)或股動(dòng)脈和靜脈(大鼠)，血管插入導(dǎo)管。動(dòng)脈導(dǎo)管與血壓傳感器連接，信號指向數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)采集系統(tǒng)(例如ponemah)用于連續(xù)測定動(dòng)脈壓和激發(fā)心率?；蛘撸穆释ㄟ^經(jīng)由皮下插入的針狀電極記錄的心電圖信號而觸發(fā)。允許動(dòng)脈壓和心率穩(wěn)定后，歷經(jīng)～3-4分鐘靜脈內(nèi)施用植物神經(jīng)阻斷劑的合劑(例如各2mg/kg的阿托品和普萘洛爾)。當(dāng)心血管參數(shù)重新穩(wěn)定后，歷經(jīng)3秒將serelaxin或serelaxin綴合物作為靜脈內(nèi)推注進(jìn)行注射。松弛素引起具有特征性的緩慢啟動(dòng)(峰響應(yīng)～6分鐘)和持久的作用持續(xù)時(shí)間(小時(shí))的心率增加。在相同的動(dòng)物制備物中，通過收集線下分析的系列超聲心動(dòng)圖測定了心室功能(例如射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)、心輸出量)。長期模型—將小鼠(任意品系，但是優(yōu)選dba/2)或大鼠(任意品系，但是優(yōu)選sprague-dawley)通過吸入異氟烷進(jìn)行麻醉，用在100％氧中的～2％異氟烷維持在穩(wěn)定的手術(shù)麻醉水準(zhǔn)。在圍手術(shù)期和手術(shù)后施用鎮(zhèn)痛劑。動(dòng)脈和靜脈如上所述插導(dǎo)管，但是導(dǎo)管通過背側(cè)皮膚區(qū)域穿出、用肝素化鹽水沖洗和用不銹鋼針塞住。還將皮下導(dǎo)管經(jīng)皮下植入小鼠，以相同方式穿出。在大鼠中，導(dǎo)管直接穿過spring-tether/swivel系統(tǒng)定向。在研究當(dāng)天，動(dòng)脈導(dǎo)管與血壓傳感器連接，如上所述獲得植物神經(jīng)阻斷，不同的是阻斷劑還可以經(jīng)由小鼠的皮下導(dǎo)管施用，之后通過連續(xù)靜脈內(nèi)或皮下輸注植物神經(jīng)阻斷劑來維持兩個(gè)品系的阻斷。采用數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)采集系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測動(dòng)脈壓和心率。允許動(dòng)脈壓和心率穩(wěn)定后，歷經(jīng)～3-4分鐘靜脈內(nèi)或皮下施用植物神經(jīng)阻斷劑。當(dāng)心血管參數(shù)重新穩(wěn)定后，歷經(jīng)3秒將serelaxin或serelaxin綴合物作為靜脈內(nèi)推注進(jìn)行注射。對于在小鼠或大鼠中歷經(jīng)數(shù)周時(shí)期評價(jià)心室功能和心率，每周1-3次皮下注射serelaxin綴合物，在基線和之后每周收集系列超聲心動(dòng)圖。serelaxin來源：serelaxin(重組1-鏈人松弛素)conneticscorporation,lot#00l6051.0mg/ml(5ml小瓶)在20nm乙酸鈉緩沖液(ph5.0)中將儲備液在溶媒中稀釋至每個(gè)劑量的預(yù)期serelaxin濃度。按照下述體外和體內(nèi)方法可以評價(jià)實(shí)施例30的pip綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性。葡萄糖刺激的胰島素分泌(gsis)分析:在高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖(dio)小鼠中進(jìn)行g(shù)sis測試追蹤重組人促乳素誘導(dǎo)蛋白(hpip)作為體內(nèi)胰腺β細(xì)胞功能的度量。簡言之，小鼠(m＝5-7/基團(tuán))禁食過夜(5:00pm-8:00am)，測試當(dāng)天的體重和血葡萄糖(bg；采用embrace葡萄糖計(jì)測定)指定為基線時(shí)間點(diǎn)。接著，給小鼠一次性靜脈內(nèi)(iv)施用hpip(天然和fa-綴合的pip；在pbs中的溶液；以4ml/kg體重施用)或溶媒對照(pbs)。施用hpip后45分鐘，所有小鼠給予口服葡萄糖(3g/kg右旋糖；在pbs中的溶液；以4ml/kg體重施用)。在葡萄糖負(fù)荷之前立即(指定為0min時(shí)間點(diǎn))和在給予葡萄糖后15和30分鐘測定血葡萄糖。收集血樣用于血漿分離，在給予葡萄糖后0、15和30min進(jìn)行血漿胰島素的測定。藥物動(dòng)力學(xué)(pk)分析:在dio小鼠中在單次iv施用后測定hpip暴露。簡言之，給自由飲食的dio小鼠(n＝2)一次性靜脈內(nèi)(iv)施用hpip(天然和fa-綴合的pip；在pbs中的溶液；以4ml/kg體重施用)。在給藥后0.25、0.5、1、3、7、24和48小時(shí)收集樣品并通過內(nèi)部elisa分析(方案如下所示)分離血漿。通過如下步驟測定分析：·將板于室溫用30ulhpip抗體(指定為pip-8-ab；內(nèi)部產(chǎn)生；nbcclone#87.19g9a11,以8ug/ml在pbs中)涂布過夜。·抽吸，然后用100ul封閉試劑封閉2小時(shí)?！こ槲?，加入30ul樣品孵育2小時(shí)，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)稀釋于酪蛋白緩沖液(1％酪蛋白,1.7mm磷酸二氫鈉,8.1mm磷酸氫二鈉七水合物,0.15m氯化鈉,0.7％tritonx-100和0.1％疊氮化鈉)中。·將板用teknova洗滌緩沖液(0.05％tween,在pbs中)洗滌3x100ul·將30ul生物素化pip抗體(指定為pip-6ab；內(nèi)部生產(chǎn),mbcclone#87.8c6b3,10ug/ml在酪蛋白緩沖液中)孵育1小時(shí)·如上所述進(jìn)行洗滌·加入30ul鏈霉抗生物素-hrp(piercecat#21140,以0.4ug/ml,在hrp緩沖液中)hrp緩沖液(0.4％酪蛋白、1.7mm磷酸二氫鈉、8.1mm磷酸氫二鈉七水合物、0.15m氯化鈉和0.1％氯乙酰胺)孵育30分鐘。·如上所述進(jìn)行洗滌·加入30femtochemiluminescentsubstrate(thermocat#34096)和立即讀數(shù)根據(jù)上文所述分析的本發(fā)明的pip脂肪酸綴合物的活性和穩(wěn)定性**與溶媒相比表11本發(fā)明的pip脂肪酸綴合物具有延長的暴露，導(dǎo)致效力改善。通過下述體外方法可以測定實(shí)施例31的npff綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性。用cisbiocamp試劑盒進(jìn)行的camp分析方案在下述分析中在弗司扣林的存在下測試了本發(fā)明的npff-fa綴合物。試劑/材料第1天：將細(xì)胞鋪在384-孔板中按照“傳代培養(yǎng)方案”。1.制備不含抗生素的生長培養(yǎng)基(如果需要的話)。2.在用70％乙醇噴霧后將不含抗生素的生長培養(yǎng)基瓶在37℃水浴中平衡。3.用versene分離細(xì)胞(每t.75燒瓶3ml)。4.轉(zhuǎn)移入50ml含17ml生長培養(yǎng)基的falcon試管中。5.于150g離心4min。6.將細(xì)胞沉淀重新混懸于10ml刺激緩沖液中。對細(xì)胞計(jì)數(shù)。7.在含有抗生素的生長培養(yǎng)基中以5’000個(gè)細(xì)胞/50ul制備細(xì)胞混懸液。8.采用viaflow384-125ul吸管將50ul細(xì)胞混懸液鋪板。9.將板在tc罩下放置15min。10.于37℃、5％co2和90％濕度下孵育。第2天:試劑溶液的制備:1.分析緩沖液:500mlhbss+10mlhepes。于室溫儲存分析緩沖液:250mlhbss/hepes+250ulibmx1000x溶液+0.1％bsa(825ul)。每天新鮮制備。2.弗司扣林2x溶液:在分析中最終1um:對于化合物稀釋:40ulfsk/100ml分析緩沖液。對于npff稀釋:10uldmso/10ml2xfsk。3.npff稀釋：在dh2o中的儲備液1mm–在分析中最終1uma.5ul儲備液/625ululfsk2x/dmso。b.100ul溶液a+300ulfsk2x/dmso。在分析中最終1um。c.制備1o稀釋步驟1/4:100ul+300ul在fsk2x/dmso中。4.化合物稀釋:儲備液10mm在dmso中-在分析中最終40uma.5ul儲備液/625ulfsk2x。b.制備11稀釋步驟1/4:100ul+300ulfsk2x。5.camp標(biāo)準(zhǔn):a.10ulcamp標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.12mm)+90ul分析緩沖液。b.10ul稀釋液a+90ul刺激緩沖液。c.20ul稀釋液b+428ul刺激緩沖液:500nm。d.從稀釋c開始制備11稀釋1/2:100ul稀釋液c+100ul刺激緩沖液。6.camp檢測試劑:a.d2-camp:1000ul/20ml溶解緩沖液(250ul/5ml用于1塊384-孔板)。b.穴狀化合物綴合物:1000ul/20ml溶解緩沖液.(250ul/5ml用于1塊384-孔板)。分析操作步驟1:1.制備刺激緩沖液。2.將cisbio溶解緩沖液放置在室溫下。3.制備wellmate(用70％醇、然后用dh2o和hbss/hepes洗滌)。4.制備弗司扣林和化合物稀釋。步驟2:用弗司扣林刺激1.用50ul刺激緩沖液洗滌細(xì)胞:a.輕拍板以除去o/n培養(yǎng)基。b.將白色紙巾放在板頂部，采用vwrsymphony4417離心機(jī)將板于300rpm倒置離心20秒。c.采用wellmate添加50ul刺激緩沖液。d.輕拍板以除去o/n培養(yǎng)基。e.將白色紙巾放在板頂部，采用vwrsymphony4417離心機(jī)將板于300rpm倒置離心20秒。f.在顯微鏡下檢測細(xì)胞。2.采用viaflow384添加10ul含ibmx的刺激緩沖液3.采用viaflow384添加10ul含化合物的2x弗司扣林溶液(在第7層)。將溶液混合，然后加入孔中。4.于室溫孵育30min(將板放在抽屜中以避免溫度變化)。5.制備camp標(biāo)準(zhǔn)曲線和camp檢測試劑。6.將20ul/孔的camp標(biāo)準(zhǔn)曲線加至標(biāo)準(zhǔn)曲線板(與分析板相同的板)。步驟3:lancecamp分析1.采用combi384將10uld2camp/孔加至分析板2.手工將10ul/孔穴狀化合物綴合物加至分析板。3.密封板。4.于室溫孵育最少1小時(shí)(板可以在24小時(shí)內(nèi)讀數(shù))。5.將tape放置在板底。6.在envision程序“cisbio384fullplate”上讀數(shù)。7.在附件文件中查看原始數(shù)據(jù)。8.用graphpad分析數(shù)據(jù)(在附件文件中查看文件)。結(jié)果:表12通過下述體內(nèi)方法可以評價(jià)其中生物分子是sirna的本發(fā)明的綴合物的活性和血漿穩(wěn)定性。方法實(shí)施例24的綴合物是與galnac(參比實(shí)施例3)和脂肪酸綴合的apoc3sirna的化合物。人apoc3轉(zhuǎn)基因小鼠(b6；cba-tg(apoc3)3707bres/j)購自jacksonlaboratory(barharbor,me)。小鼠隨意取食標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料和飲水，具有12小時(shí)亮/暗循環(huán)。在這種條件下，apoc3轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)地發(fā)展出血漿tg含量顯著增加的高甘油三酯血(aalto-setalak,jclininvest1992)。每組四只小鼠皮下注射參比實(shí)施例3(apoc3sirna-galnac)或?qū)嵤├?4的綴合物，劑量為25mg/kg體重。在臨注射前在基線和在注射后2、4、7和14天采集血。血漿用于采用來自cisbio的htrf分析測定人apoc3蛋白質(zhì)水平。采用單因素anova來比較各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果參比實(shí)施例3和綴合物24組中的基線血漿apoc3水平分別為176±21mg/dl和178±9mg/dl。參比實(shí)施例3時(shí)間依賴性地降低血漿apoc3水平，與基線水平相比在給藥后5天降低56％。通過比較，實(shí)施例24的綴合物更有效地降低血漿apoc3，在給藥后5天降低80％(圖1)。作用持續(xù)時(shí)間對于參比實(shí)施例3和實(shí)施例24而言是類似的，如圖1所示。本發(fā)明的綴合物具有至少5小時(shí)、至少10小時(shí)、至少20小時(shí)、至少30小時(shí)、至少40小時(shí)或至少50小時(shí)的血漿穩(wěn)定性。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，與非綴合生物分子相比的血漿穩(wěn)定性改善為至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍或75倍。組合治療本發(fā)明的綴合物可在施用一種或多種其它治療劑的同時(shí)、之前或之后施用。本發(fā)明的綴合物可通過相同或不同施用途徑與其它活性劑分開施用，或在同一藥組合物中與其它活性劑一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)品，其包含前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物或?qū)嵤┓桨?0和13中所述的綴合物混合物以及至少一種其它治療劑，其用作在治療中同時(shí)、分開或依序使用的組合制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療是在需要其的患者中治療代謝障礙或疾病、2型糖尿病、肥胖、血脂異常癥、升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平和糖尿病性腎病，其包括：給所述患者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物或其酰胺、酯或鹽，其中生物分子是人生長分化因子15(gdf15)、其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式。作為組合制劑提供的產(chǎn)品包括組合物，所述組合物在同一個(gè)藥物組合物中一起包含前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物以及其它治療劑，或以分開的形式(例如以藥盒形式)包含前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物以及其它治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物或?qū)嵤┓桨?0或13的綴合物混合物以及另外的治療劑。任選地，該藥物組合物可包含如上文所述的可藥用賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含兩種或更多種分開的藥物組合物的藥盒，所述藥物組合物的至少之一含有前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥盒包含用于獨(dú)立地保持所述組合物的裝置，例如容器、分立式瓶或分立式箔片包。此類藥盒的實(shí)例有例如常用于包裝片劑、膠囊等的泡罩包裝。本發(fā)明的藥盒可用于施用不同劑型(例如口服及胃腸外)，以不同的劑量間隔施用獨(dú)立的組合物，或用于相互之間調(diào)整獨(dú)立組合物的劑量。為有助于依從性，本發(fā)明的藥盒通常包含用于施用的說明書。在本發(fā)明的組合治療中，本發(fā)明的綴合物及其它治療劑可由相同或不同制造商制造和/或配制。此外，可將本發(fā)明的綴合物與其它治療劑如下一起帶入組合治療中：(i)在發(fā)放組合產(chǎn)品給醫(yī)師之前(例如在包含本發(fā)明的綴合物和其它治療劑的藥盒的情況下)；(ii)在即將施用前由醫(yī)師自身(或在醫(yī)師指導(dǎo)下)；(iii)由患者自己，例如在依序施用本發(fā)明的綴合物與其它治療劑期間。本發(fā)明還提供了前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物用于治療本文給出的疾病或病癥的用途，其中該患者先前(例如在24小時(shí)內(nèi))已經(jīng)用其它治療劑進(jìn)行過治療。本發(fā)明還提供了另外的治療劑用于治療本文給出的疾病或病癥的用途，其中該患者先前(例如在24小時(shí)內(nèi))已經(jīng)用前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的綴合物進(jìn)行過治療。術(shù)語與第二活性劑或治療“組合”包括共同施用本發(fā)明的綴合物(例如前述實(shí)施方案任一項(xiàng)所述的綴合物或本文以其他方式描述的綴合物)與第二種活性劑或治療；首先施用本發(fā)明的化合物，隨后施用第二種活性劑或治療；以及首先施用第二種活性劑或治療，隨后施用本發(fā)明的綴合物。術(shù)語“第二種活性劑”和“共用活性劑”可互換使用，包括本領(lǐng)域已知可用于治療或預(yù)防本文所述的疾病或障礙或者減輕其癥狀的任意活性劑，所述疾病或障礙例如是選自如下的障礙或疾?。捍x障礙或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂異常癥、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它進(jìn)行性肝疾病、抗胰島素性、高胰島素血、葡糖耐受不良、高血糖、代謝綜合征、高血壓、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈疾病、中風(fēng)、心力衰竭、冠心病、糖尿病并發(fā)癥(包括但不限于慢性腎病)、神經(jīng)病、胃輕癱和其它代謝障礙。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，治療是在需要其的患者中治療代謝障礙或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂異常癥、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它進(jìn)行性肝疾病、抗胰島素性、高胰島素血、葡糖耐受不良、高血糖、代謝綜合征、高血壓、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈疾病、中風(fēng)、心力衰竭、冠心病、糖尿病并發(fā)癥(包括但不限于慢性腎病)、神經(jīng)病、胃輕癱和其它代謝障礙，其包括：給所述患者施用治療有效量的本發(fā)明的綴合物或其酰胺、酯或鹽，其中生物分子是人生長分化因子15(gdf15)、其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式。用于與本發(fā)明的綴合物(其中生物分子是人生長分化因子15(gdf15)、其同系物、變體、突變體、片段和其它修飾形式)組合的第二種活性劑的實(shí)例包括：1.抗糖尿病劑，例如胰島素、胰島素衍生物和模擬物；胰島素促分泌劑如磺脲(例如氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺己脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪)；格列本脲和亞莫利阿瑪爾；促胰島素磺酰脲受體配體如氯茴苯酸類、例如那格列奈和瑞格列奈；噻唑啉二酮藥物(例如羅西格列酮(avandia)、曲格列酮(rezulin)、吡格列酮(actos)、巴格列酮(balaglitazone)、利格列酮(rivoglitazone)、netoglitazone、曲格列酮、恩格列酮、環(huán)格列酮、adaglitazone、達(dá)格列酮，它們增強(qiáng)胰島素作用(例如通過胰島素敏化)、因而促進(jìn)外周組織的葡萄糖利用；蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1b(ptp-1b)抑制劑如ptp-112；膽固醇脂轉(zhuǎn)移蛋白(cetp)抑制劑如托徹普(torcetrapib)、gsk3(糖原合酶激酶-3)抑制劑如sb-517955、sb-4195052、sb-216763、nn-57-05441和nn-57-05445；rxr配體如gw-0791和agn-194204；鈉依賴性葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑如t-1095；糖原磷酸化酶a抑制劑如bayr3401；雙胍如二甲雙胍和其它通過促進(jìn)葡萄糖利用、減少肝葡萄糖產(chǎn)生和/或減少腸葡萄糖輸出的活性劑；α-糖苷酶抑制劑如阿卡波糖和migiitoi)和其它減慢碳水化合物消化和因此減少從腸吸收餐后高血糖的活性劑；glp-1(高血糖素樣肽-1)、glp-1類似物如exendin-4和glp-1模擬物；和dppiv(二肽基肽酶iv)抑制劑如維格列?。?.降血脂劑，例如3-羥基-3-甲基-戊二?；o酶a(hmg-coa)還原酶抑制劑，例如洛伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、維洛他汀(velostatin)、氟伐他汀、達(dá)伐他汀、阿托伐他汀、羅蘇伐他汀和rivastatin(雷司他汀)；鯊烯合酶抑制劑；fxr(farnesoidx受體)和lxr(肝x受體)配體；膽汁酸螯合劑如考來烯胺和考來維侖；貝特類藥物(fibrates)；煙酸和阿司匹林；3.抗肥胖劑，例如奧利司他或利莫那班、芬特明、托吡酯、qunexa和locaserin；4.抗高血壓劑，例如髓袢利尿劑如依他尼酸、呋塞米和托塞米；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)抑制劑如貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利和群多普利；na-k-atp酶膜泵抑制劑如地高辛；中性內(nèi)肽酶(nep)抑制劑；ace/nep抑制劑如奧馬曲拉、山帕曲拉和法西多曲；血管緊張素ii拮抗劑如坎地沙坦、依普羅沙坦、厄貝沙坦、氯沙坦、替米沙坦和纈沙坦，特別是纈沙坦；腎素抑制劑如地替吉侖、占吉侖、特拉吉侖、阿利吉侖、ro66-1132和ro-66-1168；β-腎上腺素能受體阻斷劑如醋丁洛爾、阿替洛爾、倍他洛爾、比索洛爾、美托洛爾、納多洛爾、普萘洛爾、索他洛爾和噻嗎洛爾；影響收縮力的物質(zhì)如地高辛、多巴酚丁胺和米力農(nóng)；鈣通道阻斷劑如氨氯地平、芐普地爾、地爾硫卓、非洛地平、尼卡地平、尼莫地平、硝苯地平、尼索地平和維拉帕米；醛固酮受體拮抗劑；和醛固酮合酶抑制劑；5.過氧化物酶體增殖物激活受體激動(dòng)劑，例如非諾貝特、吡格列酮、羅西格列酮、替格他唑(tesaglitazar)、bms-298585、l-796449、在專利申請wo2004/103995中具體描述的化合物、即實(shí)施例1至35的化合物或權(quán)利要求21中具體列出的化合物或在專利申請wo03/043985中具體記載的化合物、即實(shí)施例1至7的化合物或權(quán)利要求19中具體列出的化合物和尤其是(r)-1-{4-[5-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噁唑-4-基甲氧基]-苯磺?；鶀-2,3-二氫-1h-吲哚-2-甲酸或其鹽；和6.在expertopininvestigdrugs2003,12(4):623-633,圖1至7中所述的特定的抗糖尿病化合物。而且，本公開內(nèi)容還關(guān)注了與用于促進(jìn)體重減輕、例如刺激代謝或降低食欲的活性劑和方法和用于促進(jìn)體重減輕的改善的飲食和/或運(yùn)動(dòng)方案的組合治療。本發(fā)明的實(shí)施例縮略語can乙腈beh亞乙基橋雜化boc叔丁氧羰基bsa牛血清清蛋白dcm二氯甲烷dccn,n’-二環(huán)己基碳二亞胺dicn,n’-二異丙基碳二亞胺dipean,n’-二異丙基乙胺dmap二甲基氨基吡啶dmfn,n’-二甲基甲酰胺dtt二硫蘇糖醇dot3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇edc1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺edta乙二胺四乙酸esi電噴射離子化ffa熒光焦點(diǎn)分析(fluorescentfocusassay)fmoc芴基甲基氧基羰基氯hctu六氟磷酸o-(6-氯苯并三唑-1-基)-n,n,n’,n’-四甲基脲鎓hep庚烷hfip六氟異丙醇hplc高效液相色譜法hrms高分辨質(zhì)譜法hobt羥基苯并三唑hs人血清lc/ms液相色譜法質(zhì)譜法聯(lián)用ms質(zhì)譜法mw分子量mrt平均保留時(shí)間nhsn-羥基琥珀酰亞胺nmmn-甲基嗎啉nmr核磁共振peg聚乙二醇pe焦谷氨酸鹽/酯pbf2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；鵳g保護(hù)基pk藥物動(dòng)力學(xué)pol聚合物載體qtof四級飛行時(shí)間質(zhì)譜儀rt:保留時(shí)間rt或rt:室溫rpm:每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)sc皮下sfc超臨界流體spps固相肽合成tbme甲基叔丁基醚trt三苯甲基thf四氫呋喃tea三甲胺tis三乙基甲硅烷t,s,quin,br,m,d(三重峰,單峰,五重峰,寬,多重峰)uplc超效液相色譜法合成:描述的lcms方法hplc-分析方法f·柱子:xbridgebeh300c18(100x4.6mm),3μm；部件號:186003612·洗脫劑a:0.1％tfa在水中/洗脫劑b:0.1％tfa在can中·流速:1.0ml/min·溫度:40℃·梯度:時(shí)間[min]a[％]b[％]0.0982182982029822982uplc-hrms–分析方法g·watersacquitybehc18,1.7μm,2.1x50mm；部件號:186002350·洗脫劑a:0.05％fa+3.75mm乙酸銨在水中；洗脫劑b:0.04％fa在can中·流速:1.0ml/min·溫度:50℃·梯度:2至98％,4.4min方法h:lc-ms方法·hplc:流動(dòng)相a:2％hfip+0.1％tea；流動(dòng)相b:甲醇；·梯度:0min95％a,4min:75％a,8min10％a,8.1min95％a,10min95％a；·流速:250μl/min；·柱子:acquityuplcbehc18,1.7um,2.1x50mm(waters)；·柱溫:75℃·ms:qtof(waters)陰性模式；·esi:2.9kv；毛細(xì)管溫度350℃；噴射氣體:600ml/min；源溫:150℃方法i:lc-ms方法:·流動(dòng)相a:水+0.1％甲酸；·流動(dòng)相b:乙腈+0.1％甲酸；·梯度:0min.98％a,0.06min.98％a,1.76min.2％a,2.06min.2％a,2.16min.98％；流速:1ml/min.；·柱子:acquityuplcbehc18,1.7μm,2.1mmx50mm；·柱溫:50℃；·檢測器:uv/vis/cad(電霧式檢測器)uplchrms方法j:·柱子:acquitybeh300c41.7μm,2.1x50mm·洗脫劑a:水(0.1％tfa)·洗脫劑b:acn(0.1％tfa)·流速:0.5ml/min·溫度:40℃·梯度:20％保持0.5min,在10min升至80％acn方法k:·柱子:watersproteinbehc4柱子,300埃,3.5um,4.6x100mm·流動(dòng)相:a:水(0.05％tfa)b:acn(0.05％tfa)·流速:2ml/min·溫度:40℃·梯度:25％b保持1min,在10min由hol25-60％can升至在10.5min的95％b并保持2mins，然后在25％平衡2min。總運(yùn)行時(shí)間為15mins。·質(zhì)譜儀:waterszq質(zhì)譜儀·uplc:柱子:behc4,300埃,1.7um,2.1x50mm方法l:·柱子:proswiftmonolith4.6x50mm·流動(dòng)相:a:水(0.1％甲酸)b:acn(0.1％甲酸)·流速:1ml/min·溫度:50℃·梯度:0min3％b；3％至80％b,2min；2.1min10％b；2.8min95％b；2.9min3％b·質(zhì)譜儀:qtofesi掃描范圍100-1900；通過maxent1在masslynx軟件包中去卷積·uplc:watersacquity分析方法s:·xbridgec18柱,3.5μm,3.0x3.0mm·洗脫劑:a:水+5mm氫氧化銨b:acn·流速:2ml/min·梯度:0.0min2％b；2％至95％b,1.70min；2.00min95％b；2.10min5％b；·質(zhì)譜儀:單四極esi·hplc:agilent1100series·溫度:40c分析方法t:中間體1:11-溴十一烷酸芐基酯在n2下于室溫將11-溴十一烷酸(4g,15.08mmol)、芐基醇(1.875ml,18.10mmol)和dmap(92mg,0.754mmol)溶于dcm中。加入edc-hcl(4.34g,22.63mmol)，反應(yīng)物攪拌17小時(shí)。將反應(yīng)物濃縮,然后用et2o(150ml)稀釋?；旌衔镉盟腿?30ml)，水相用et2o(150ml)萃取。合并的有機(jī)物用鹽水洗滌(20ml)，經(jīng)na2so4干燥。除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱純化(二氧化硅120g,0-10％et2o/石油醚)，得到中間體1，為無色液體(6.75g,定量):lcms方法方法art＝1.79min,m+h355.2；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.18-1.36(m,10h)1.37-1.47(m,2h)1.64(quin,j＝7.33hz,2h)1.85(dt,j＝14.56,7.06hz,2h)2.35(t,j＝7.58hz,2h)3.40(t,j＝6.88hz,2h)5.11(s,2h)7.28-7.45(m,5h)。中間體2:十一烷-1,1,11-三甲酸三芐基酯在n2下于0℃將nah(113mg,2.83mmol)混懸于dmf(6ml)中。歷經(jīng)30分鐘將丙二酸二芐基酯(0.704ml,2.82mmol)緩慢加入攪拌的混懸液中。加入溶于dmf(3ml)中的中間體1(903mg,2.54mmol)，使反應(yīng)物于0℃攪拌2.75小時(shí)，然后溫?zé)嶂潦覝?，攪拌過夜。反應(yīng)物用et2o(75ml)稀釋，用水(20ml)萃取。水相用et2o(75ml)萃取，合并的有機(jī)物用鹽水(30ml)洗滌。有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥，濃縮。將濃縮物經(jīng)快速柱(二氧化硅80g,0-10％etoac/hep)純化，得到無色油(770mg,1.38mmol,34％)，70％純度:lcms方法brt＝1.41min,m+h559.6。中間體3:二十二烷-1,11,11-三甲酸三芐基酯于0℃在n2下向nah(66.1mg,1.65mmol)在dmf(2ml)中的混懸液中加入在dmf(4ml)中的中間體2(770mg,1.38mmol)。35分鐘后，將1-溴十一烷(0.338ml,1.52mmol)在dmf(2ml)中的溶液加入反應(yīng)物中，使其溫?zé)嶂潦覝?，然后攪?5分鐘。將反應(yīng)物攪拌2天。將反應(yīng)物用et2o(75ml)稀釋，用10％licl(25ml)萃取。水相用et2o(75ml)萃取。合并的有機(jī)物用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)溶劑。將殘余物經(jīng)快速柱(二氧化硅80g,0-10％etoac/hep)純化，得到中間體3，為無色油(590mg,0.827mmol,33％):lcms方法方法brt＝1.89min,m+na735.5；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.87-0.95(m,3h)1.07(br.s.,4h)1.14-1.36(m,28h)1.66(quin,j＝7.43hz,2h)1.85-1.95(m,4h)2.37(t,j＝7.58hz,2h)5.12(s,4h)5.14(s,2h)7.27(d,j＝2.32hz,1h)7.28-7.43(m,14h)。中間體4:二十二烷-1,11,11-三甲酸將溶于thf(12ml)中的中間體3(590mg,0.827mmol)與10％披鈀碳在thf(8ml)中的混懸液合并。將混懸液攪拌，經(jīng)由氣囊放置在氫氣氛圍下。1小時(shí)后，將反應(yīng)物穿過濾膜，將固體用etoac沖洗。將濾液蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物，為無色油(353mg,0.798mmol,96％):lcms方法方法brt＝1.16min,m+h443.5；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.77-0.84(m,3h)1.06-1.33(m,32h)1.59(quin,j＝7.18hz,2h)1.83-1.92(m,4h)2.32(t,j＝7.03hz,2h)。中間體5:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-十一烷基十三烷二元酸在n2下將dcc(126mg,0.610mmol)在dcm(1.57ml)中的溶液加入中間體4和n-羥基琥珀酰亞胺在dcm(5ml)和thf(5ml)中的溶液中。3.5小時(shí)后，蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)超臨界流體色譜法(sfc；princeton2-乙基-吡啶,20x150mm,20-30％meoh/co2)純化，得到標(biāo)題化合物，為無色油(138mg,0.256mmol,50％):lcms方法brt＝1.21min,m+h540.5；1hnmr(600mhz,乙腈-d3)δppm0.91(t,j＝7.20hz,3h)1.22-1.42(m,34h)1.57(quin,j＝7.34hz,2h)1.93-1.96(m,2h)2.28(t,j＝7.47hz,2h)2.79(br.d,j＝6.30hz,4h)。中間體6和6a:2-(疊氮基-peg23-氨甲酰基)-2-十一烷基十三烷二元酸構(gòu)建體(6)和12-(疊氮基-peg23-氨甲?；?二十三烷酸構(gòu)建體(6a)將中間體5(36mg,0.066mmol)和疊氮基-dpeg23-nh2(quantabiodesign:73mg,0.066mmol)在thf(1.5ml)中合并，在振搖盤上混合15分鐘，然后加入dipea(17μl,0.10mmol)。將反應(yīng)物在振搖盤上放置過夜。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)hplc(sunfirec1830x50mm,55-80％acn/水+0.1％tfa)純化，得到中間體6(39mg,0.025mmol,38％)和中間體6a(20mg,0.013mmol,20％):lcms方法brt＝1.11min,[m+2h]+2763.4；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.86-0.93(m,3h)1.10-1.19(m,2h)1.20-1.29(m,23h)1.32(br.s.,7h)1.58-1.69(m,2h)1.69-1.79(m,2h)1.96-2.10(m,2h)2.35(t,j＝7.15hz,2h)3.41(t,j＝5.07hz,2h)3.51-3.57(m,2h)3.58-3.62(m,2h)3.62-3.73(m,90h)7.46(br.s.,1h)；lcms方法brt＝1.23min,[m+2]+2740.9；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.83-0.96(m,3h)1.27(br.s.,25h)1.29-1.37(m,7h)1.37-1.46(m,2h)1.53-1.73(m,4h)2.34(t,j＝7.21hz,2h)3.41(t,j＝5.07hz,2h)3.44-3.52(m,2h)3.55-3.60(m,2h)3.60-3.74(m,90h)6.19-6.30(m,1h)。或者，按照如下操作獲得構(gòu)建體6a：將中間體5(48mg,0.042mmol)在thf(1ml)中的溶液加入裝有疊氮基-peg23-胺(quantabiodesign,目錄號10525)(46mg,0.042mmol)的小瓶中。將反應(yīng)物振搖20分鐘，然后加入dipea(11μl,0.063mmol)，然后維持過夜。加入疊氮基-peg23-胺(23mg,0.021mmol)和dipea(5μl,0.029mmol)，將反應(yīng)物振搖另外一天。蒸發(fā)溶劑，將殘余物經(jīng)hplc(xbridgec1830x50mm,10-30％acn/5mmnh4oh)純化。將級分冷凍干燥，得到產(chǎn)物的混合物。將材料經(jīng)hplc(sunfirec1830x50mm,45-70％acn/水+0.1％tfa)純化，得到標(biāo)題中間體6a(30mg,0.020mmol,48％):lcms方法brt＝0.81min,[m+h+h3o]+2764.5；1hnmr(400mhz,乙腈-d3)δppm1.30(br.s.,28h)1.40-1.50(m,2h)1.50-1.62(m,6h)2.14(t,j＝7.52hz,2h)2.23-2.35(m,3h)3.32(q,j＝5.58hz,2h)3.37-3.43(m,2h)3.47-3.52(m,2h)3.53-3.68(m,90h)6.54(br.s.,1h)。中間體7:(((11-溴十一烷基)氧基)次甲基)三苯在n2下將三苯甲基氯(2.49g,8.92mmol)、11-溴十一烷-1-醇(2.00g,7.96mmol)和dmap(10mg,0.080mmol)溶于dcm(16ml)中。在攪拌下加入dipea(1.39ml,7.96mmol)，將反應(yīng)物維持7天。將反應(yīng)物在dcm(20ml)和水(10ml)之間分配。將有機(jī)相用水(20ml)萃取，經(jīng)mgso4干燥，濃縮。將濃縮物經(jīng)快速柱純化(二氧化硅120g,0-6％etoac/hep)，得到中間體7(2.50g,5.07mmol,64％)，為無色油:1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.19-1.49(m,14h)1.58-1.69(m,2h)1.79(dt,j＝14.50,7.00hz,1h)1.87(dt,j＝14.55,7.03hz,1h)3.07(t,j＝6.66hz,2h)3.43(t,j＝6.85hz,1h)3.55(t,j＝6.79hz,1h)7.18-7.36(m,10h)7.42-7.52(m,5h)。中間體8:2-(11-(三苯甲基氧基)十一烷基)丙二酸二芐基酯于0℃在n2下將nah(113mg,2.83mmol)混懸于dmf(6ml)中。將丙二酸二芐基酯緩慢加入攪拌的混懸液中。30分鐘后，加入中間體7(1.26g,2.54mmol)在dmf(3ml)中的溶液。攪拌15分鐘后，將所得混合物溫?zé)嶂潦覝亍?天后，將反應(yīng)物用et2o(75ml)稀釋，用水(40ml)萃取。水相用et2o(75ml)萃取。合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥，濃縮。將濃縮物經(jīng)快速柱(二氧化硅80g,0-10％etoac/hep)純化，得到標(biāo)題化合物，為無色油(815mg,1.17mmol,41％):hplc方法brt＝1.68min；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.16-1.40(m,16h)1.58-1.69(m,2h)1.94(q,j＝7.38hz,2h)3.06(t,j＝6.66hz,2h)3.45(t,j＝7.52hz,1h)5.16(s,4h)7.21-7.28(m,3h)7.28-7.39(m,16h)7.42-7.51(m,6h)。中間體9:22-(三苯甲基氧基)二十二烷-1,11,11-三甲酸三芐基酯在n2下于0℃將中間體8(815mg,1.17mmol)在dmf(2ml)中的溶液加入nah(56mg,1.40mmol溶液)在dmf(2ml)中的混懸液中。將混合物攪拌1小時(shí)。將在dmf(2ml)中的11-溴十一烷酸芐基酯(457mg,1.29mmol)加入反應(yīng)物中。在加入后20分鐘，使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?，攪拌過夜。將反應(yīng)物用et2o(75ml)稀釋，用水(25ml)萃取。水相用et2o(75ml)萃取，合并有機(jī)物。合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速柱(二氧化硅40g,0-10％etoac/hep)純化，得到標(biāo)題化合物，為無色油(780mg,0.803mmol,69％):1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.99-1.14(m,4h)1.15-1.41(m,26h)1.58-1.71(m,4h)1.82-1.96(m,4h)2.37(t,j＝7.52hz,2h)3.06(t,j＝6.66hz,2h)5.12(s,4h)5.14(s,2h)7.28(s,24h)7.42-7.52(m,6h)。中間體10:22-(三苯甲基氧基)二十二烷-1,11,11-三甲酸將10％披鈀碳(11mg,0.010mmol)在thf(2.5ml)中的混懸液加入中間體9(200mg,0.206mmol)在thf(2.5ml)中的溶液中。將經(jīng)攪拌的混懸液經(jīng)氣囊放置在氫氣下。2.25小時(shí)后，將反應(yīng)物穿過濾膜，將固體用etoac沖洗。將濾液蒸發(fā)，得到中間體10(150mg,定量):1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.04-1.33(m,30h)1.45-1.62(m,4h)1.76-1.91(m,4h)2.21-2.36(m,2h)2.97(t,j＝6.60hz,2h)7.06-7.18(m,4h)7.19-7.24(m,5h)7.33-7.50(m,6h)。中間體11:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-(11-(三苯甲基氧基)十一烷基)十三烷二元酸(11)將中間體10(150mg,0.214mmol)和n-羥基琥珀酰亞胺(25mg,0.214mmol)在dcm(4ml)中合并。加入溶于dcm(0.61ml)中的dcc(49mg,0.235mmol)，將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)hplc(sunfirec1830x50mm；65-95％acn/水+0.1％tfa)、然后經(jīng)sfc(princeton2-乙基吡啶柱20x100mm,25-35％meoh/co2)純化，得到中間體11(34mg,0.043mmol,20％)，為無色油:lcms方法brt＝1.47min,m-co2h752.7；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.13-1.42(m,30h)1.56-1.73(m,4h)1.94-2.14(m,4h)2.37(t,j＝7.21hz,2h)2.83(br.s.,4h)3.06(t,j＝6.66hz,2h)7.15-7.28(m,3h)7.29-7.36(m,6h)7.41-7.50(m,6h)。中間體12:2-((疊氮基-peg23)氨甲?；?-2-(11-羥基十一烷基)十三烷二元酸構(gòu)建體在n2下將在thf(1.5ml)中的疊氮基-dpeg23-胺(quantabiodesign)42mg,0.038mmol)與中間體11(34mg,0.043mmol)合并。反應(yīng)物放置在振搖盤上，振蕩20min。加入dipea(7.44μl,0.043mmol)，反應(yīng)物振蕩2小時(shí)。加入dipea(4μl,0.023mmol)，反應(yīng)物維持過夜。蒸發(fā)溶劑，殘余物溶入dcm(3ml)和tfa(0.5ml)中。將溶液振搖1小時(shí)，此時(shí)溶劑被提出。將殘余物經(jīng)hplc(sunfirec1830x50mm,45-70％acn/水+0.1％tfa)純化，得到中間體12(4mg,1.8μmol,4.2％):lcms方法brt＝0.75min,[m+2h]+2771.4；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.05-1.39(m,30h)1.52-1.82(m,6h)1.97-2.09(m,2h)2.35(t,j＝7.21hz,2h)3.41(t,j＝5.07hz,2h)3.51-3.63(m,6h)3.63-3.75(m,90h)4.36(t,j＝6.72hz,1h)7.49-7.65(m,1h)。中間體13:13-(芐基氧基)-12-((芐基氧基)羰基)-13-氧代十三烷酸在n2下于0℃將在dmf(3ml)中的丙二酸二芐基酯(0.88ml,3.52mmol)緩慢加入nah(274mg,6.86mmol)的混懸液中。將混合物攪拌1.5小時(shí)，然后溫?zé)嶂潦覝?。加入在dmf(3ml)中的11-溴十一烷酸(933mg,3.52mmol)，反應(yīng)物過夜。將反應(yīng)物加熱至80℃達(dá)3小時(shí)，然后冷卻。反應(yīng)物用etoac(50ml)和et2o(50ml)稀釋，用1mhcl(25ml)萃取。水相用etoac/et2o(100ml)萃取。合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)溶劑。將殘余物經(jīng)快速柱(c1850g30-100％acn/水+0.1tfa)純化，得到中間體13(315mg,0.672mmol,19％)，為白色粉末:lcms方法brt＝1.05min,m+h469.5。中間體14:23-(芐基氧基)-12,12-雙((芐基氧基)羰基)-23-氧代二十三烷酸于0℃在n2下將nah(54mg,1.34mmol)混懸于dmf(1ml)中。以滴加方式向混合物中加入在dmf(3ml)中的中間體13(315mg,0.672mmol)。反應(yīng)物攪拌1小時(shí)，然后加入在dmf(1ml)的中間體1(239mg,0.672mmol)。反應(yīng)物于0℃維持另外45分鐘，然后使其溫?zé)嶂潦覝亍７磻?yīng)物攪拌過夜。反應(yīng)物用1:1et2o和etoac(75ml)稀釋，用1mhcl(20ml)萃取。水相用1:1et2o和etoac(75ml)萃取。合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)。將所得殘余物經(jīng)hplc(xbridgec1830x50mm,45-70％acn/水+5mmnh4oh)純化，得到標(biāo)題化合物(132mg,0.178mmol,26％):lcms方法b；rt＝1.53min,m-h741.8。中間體15:二十一烷-1,11,11,21-四甲酸1,11,11-三芐基酯21-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯將在dcm(1ml)中的dcc(44mg,0.213mmol)加入中間體14(132mg,0.178mmol)和n-羥基琥珀酰亞胺(20mg,0.178mmol)在dcm(2.5ml)中的溶液中。將反應(yīng)物在振搖盤上振蕩17小時(shí)。將反應(yīng)物過濾，固體用dcm沖洗。濾液濃縮，經(jīng)快速柱(二氧化硅12g,0-40％etoac/hep)純化，得到中間體15(107mg,0.127mmol,72％):lcms方法brt＝1.53min,m+na862.8。中間體16:22-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-22-氧代二十二烷-1,11,11-三甲酸向中間體15(107mg,0.127mmol)在thf(2.5ml)中的溶液中加入10％披鈀碳在thf(2.5ml)中的混懸液。將混合物放置在氫氣氛圍下達(dá)1.5小時(shí)。使反應(yīng)物穿過濾膜，將固體用dcm和thf洗滌。濾液蒸發(fā)，得到無色油(95mg,定量)，其含有標(biāo)題化合物:lcms方法brt＝0.65min,m+h570.5。中間體17:2-(11-(疊氮基-peg23-氨基)-11-氧代十一烷基)十三烷二元酸構(gòu)建體將中間體16(48mg,0.042mmol)在thf(1ml)中的溶液加入裝有疊氮基-dpeg23-胺(quantabiodesign:46mg,0.042mmol)的小瓶中。將反應(yīng)物振蕩20min，然后加入dipea(11μl,0.063mmol)，然后維持過夜。加入疊氮基-peg23-胺(23mg,0.021mmol)和dipea(5μl,0.029mmol)，將反應(yīng)物攪拌另外一天。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)hplc(xbridgec1830x50mm,10-30％acn/5mmnh4oh)純化。將級分冷凍干燥，得到產(chǎn)物混合物。將材料經(jīng)hplc(sunfirec1830x50mm,45-70％acn/水+0.1％tfa)純化，得到標(biāo)題中間體17(30mg,0.020mmol,48％):lcmssq4rt＝0.81min,[m+h+h3o]+2764.5；1hnmr(400mhz,乙腈-d3)δppm1.30(br.s.,28h)1.40-1.50(m,2h)1.50-1.62(m,6h)2.14(t,j＝7.52hz,2h)2.23-2.35(m,3h)3.32(q,j＝5.58hz,2h)3.37-3.43(m,2h)3.47-3.52(m,2h)3.53-3.68(m,90h)6.54(br.s.,1h).中間體18:二十一烷-1,11,11,21-四甲酸四芐基酯于0℃在n2下向nah(48mg,1.21mmol)在dmf(2ml)中的混懸液中緩慢加入在dmf(2ml)中的中間體2(337mg,0.603mmol)?；旌衔飻嚢?5min，然后加入在dmf(2ml)中的中間體1(429mg,1.21mmol)。反應(yīng)物于0℃攪拌20min，然后使其溫?zé)嶂潦覝?。反?yīng)物于室溫?cái)嚢杈S持3天。反應(yīng)物用et2o(75ml)稀釋，用水(20ml)萃取。水相用et2o(75ml)萃取。合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥和蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速柱(二氧化硅24g,0-15％etoac/hep)純化，得到標(biāo)題化合物(315mg,0.378mmol,63％):lcms方法brt＝1.70min,m+na855.8；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.95-1.13(m,4h)1.13-1.40(m,24h)1.59-1.72(m,4h)1.82-1.95(m,4h)2.37(t,j＝7.52hz,4h)5.12(s,4h)5.14(s,4h)7.14-7.44(m,20h)。中間體19:二十一烷-1,11,11,21-四甲酸將10％披鈀碳(20mg,0.019mmol)在thf(4ml)中的混懸液加入中間體18(315mg,0.378mmol)在thf(6ml)中的溶液中，將反應(yīng)物在氫氣氛圍下放置2小時(shí)。使用膜濾器以移出固體，將其用etoac洗滌。蒸發(fā)濾液，得到中間體19(179mg,定量)，為白色固體:lcms方法art＝1.24min,m+h473.4；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm0.99-1.15(m,4h)1.24(br.s.,24h)1.48(quin,j＝6.94hz,4h)1.62-1.76(m,4h)2.18(t,j＝7.34hz,4h)12.23(br.s,4h)。中間體20:11-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)二十一烷-1,11,21-三甲酸將n-羥基琥珀酰亞胺(20mg,0.170mmol)和中間體19(90mg,0.190mmol)溶于dcm(3ml)和thf(0.3ml)中。加入dcc(39mg,0.190mmol)在dcm(0.5ml)中的溶液，將反應(yīng)物攪拌過夜。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)hplc(sunfirec1830x50mm；35-60％acn/水+0.1％tfa)純化，得到標(biāo)題化合物，為白色粉末(21mg,0.037mmol,19％):lcms(方法crt＝1.01min,m+h570.3。中間體21和21a:11-((疊氮基-peg23)氨甲?；?二十一烷-1,11,21-三甲酸(21)和12-((疊氮基-peg23)氨甲酰基)二十三烷二元酸(21a)將疊氮基-peg23-胺(41mg,0.037mmol)和中間體20(21mg,0.037mmol)在thf(1ml)中合并，振蕩10min。加入dipea(9.66μl,0.055mmol)，將反應(yīng)物攪拌過夜。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)hplc(sunfirec1830x50mm,35-60％acn/水+0.1％tfa)純化，得到中間體21(22mg,0.014mmol,38％)和21a(4mg,2.6μmol,7％):lcms方法brt＝0.69min,m+h1555.3；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.27(br.s.,19h)1.29-1.41(m,9h)1.65(quin,j＝7.12hz,4h)1.78(td,j＝12.13,4.22hz,2h)1.95-2.08(m,2h)2.35(t,j＝7.21hz,4h)3.41(t,j＝5.07hz,2h)3.54(q,j＝5.05hz,2h)3.58-3.77(m,92h)7.60(t,j＝4.95hz,1h)；lcms方法brt＝0.78min,m-h1509.3；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.18(br.s.,19h)1.21-1.38(m,11h)1.43-1.63(m,6h)1.91-2.04(m,1h)2.26(t,j＝7.15hz,4h)3.31(t,j＝5.07hz,2h)3.40(q,j＝5.14hz,2h)3.46-3.50(m,2h)3.51-3.69(m,90h)6.23(t,j＝5.01hz,1h)。中間體22:2-十一烷基丙二酸二芐基酯在n2下于0℃將在dmf(1.5ml)中的丙二酸二芐基酯(0.88ml,3.52mmol)滴加至nah(155mg,3.87mmol)在dmf(6ml)中的混懸液中。將混合物攪拌30min，然后將在dmf(1.5ml)中的1-溴十一烷(0.785ml,3.52mmol)加入反應(yīng)物中。使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?，攪?天。反應(yīng)物用et2o(75ml)稀釋，用水(20ml)萃取。水相用et2o(75ml)萃取。合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥和蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速柱(二氧化硅80g,0-10％etoac/hep)純化，得到標(biāo)題化合物(974mg,2.22mmol,63％)，為無色油:lcms方法brt＝1.55min,m+h439.5。中間體23:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-十一烷基十三烷酸在n2下于0℃將在dmf(1ml)中的2-十一烷基丙二酸二芐基酯(中間體22:400mg,0.912mmol)滴加至nah(44mg,1.09mmol)在dmf(2ml)中的混懸液中。混合物攪拌45min，然后將在dmf(1ml)中的1-溴十一烷(0.285ml,1.28mmol)加入反應(yīng)物中。使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?，攪?天。反應(yīng)物用et2o(75ml)稀釋，用水(20ml)萃取。水相用et2o(75ml)萃取。合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥和蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速柱(二氧化硅40g,0-5％etoac/hep)純化，得到無色油(412mg)。將油溶于thf/meoh中，通過具有10％pd/c短柱的thalesnanoh-cube(1ml/min,2barh2,22c)。收集洗脫物并蒸發(fā)，得到蠟狀固體(272mg)。將蠟狀固體溶于3:1dcm/thf中，濃縮至油狀物。在n2下將油狀物重新溶于dcm(6ml)中，加入n-羥基琥珀酰亞胺(68mg)、然后加入在dcm(3ml)中的dcc(136mg)。反應(yīng)物攪拌1天。將反應(yīng)物過濾，濾液濃縮。將濃縮物經(jīng)快速柱純化(c1812g,25-100％acn/水+0.1％甲酸)。所得物質(zhì)進(jìn)一步通過超臨界流體色譜法(princeton2-乙基吡啶20x150mm；5-15％meoh/co2)純化，得到中間體23(37mg,0.073mmol,8％):lcms方法brt＝1.67min,m+nh4527.6；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.80-0.94(m,6h)1.18-1.42(m,36h)1.97-2.14(m,4h)2.87(br.s.,4h)。中間體24:2-((疊氮基-peg23)氨甲?；?-2-十一烷基十三烷酸將中間體23(37mg,0.073mmol)在thf(1ml)中的溶液加入裝有疊氮基-dpeg23-胺(quantabiodesign:80mg,0.073mmol)的小瓶中。將溶液在振蕩板上攪拌，加入dipea(11μl,0.065mmol)。反應(yīng)物攪拌過夜，然后加入另外部分的dipea(12μl,0.071mmol)，使反應(yīng)物過夜。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)超臨界流體色譜法(princeton氨基21x150mm；20-30％meoh/co2)純化，得到標(biāo)題化合物(45mg,0.030mmol,41％):lcms方法brt＝1.50min,[m+2h]+2748.1；1hnmr(400mhz,氯仿-d)σppm0.90(t,j＝6.85hz,6h)1.09-1.38(m,30h)1.58(br.s.,12h)1.64-1.76(m,2h)1.98-2.16(m,2h)3.41(t,j＝5.14hz,2h)3.46-3.64(m,5h)3.64-3.91(m,83h)。中間體25:2-十一烷基丙二酸二叔丁基酯在n2下于0℃將在dmf(2ml)中的丙二酸二叔丁基酯(1.0g,4.62mmol)加入nah(213mg,5.32mmol)在dmf(5ml)中的混懸液中。反應(yīng)物攪拌30min，然后加入在dmf(2ml)中的1-溴十一烷。加入后，使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?，攪?天。反應(yīng)物用et2o(75ml)稀釋，用水(25ml)萃取。水相用et2o(75ml)萃取。合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥和蒸發(fā)溶劑。將濃縮物經(jīng)快速柱純化(二氧化硅120g,0-40％et2o/石油醚)，得到中間體25(0.998g,2.69mmol,58％):lcms方法brt＝1.64min,m+na393.5；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.85-0.94(m,3h)1.24-1.36(m,18h)1.41-1.52(m,18h)1.74-1.86(m,2h)3.13(t,j＝7.58hz,1h)。中間體26:二十二烷-1,11,11-三甲酸1-芐基酯11,11-二-叔丁基酯采用中間體25作為原料，以與中間體9相似的方式合成了標(biāo)題化合物，得到無色油(980mg,1.52mmol,66％):1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.89(t,j＝6.91hz,3h)1.06-1.20(m,4h)1.20-1.35(m,28h)1.45(s,18h)1.58-1.70(m,2h)1.72-1.83(m,4h)2.36(t,j＝7.52hz,2h)5.12(s,2h)7.30-7.45(m,5h)。中間體27:12,12-雙(叔丁氧羰基)二十三烷酸采用中間體26，以與中間體19類似的方式合成了標(biāo)題化合物(472mg,0.851mmol,100％):lcms方法brt＝1.76min,m-h553.6；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.84-0.95(m,3h)1.07-1.21(m,4h)1.21-1.40(m,28h)1.46(s,18h)1.58-1.70(m,2h)1.72-1.84(m,4h)2.37(t,j＝7.46hz,2h)。中間體28:二十二烷-1,11,11-三甲酸11,11-二-叔丁基酯1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯將中間體27(200mg,0.360mmol)和n-羥基琥珀酰亞胺(42mg,0.360mmol)溶于dcm(3ml)中。加入dcc(89mg,0.433mmol)在dcm(1.6ml)中的溶液，反應(yīng)物攪拌4.5小時(shí)。反應(yīng)物過濾，濾液濃縮。將濃縮物經(jīng)快速柱純化(二氧化硅24g,0-40％etoac/hep)，得到標(biāo)題化合物，為無色油(70mg,0.107mmol,30％):lcms方法brt＝1.74min,m+na674.7。中間體29和29a:2-(11-((疊氮基-peg23)-氨基)-11-氧代十一烷基)-2-十一烷基丙二酸(29)和13-((疊氮基-peg23)-氨基)-13-氧代-2-十一烷基十三烷酸(29a)將中間體28(35mg,0.054mmol)在thf(1ml)中的溶液加入裝有疊氮基-peg23-胺(59mg,0.054mmol)的小瓶中。加入dipea(14μl,0.081mmol)，反應(yīng)物攪拌過夜。蒸發(fā)溶劑，殘余物重新溶于dcm(1ml)和tfa(0.2ml)中。反應(yīng)物振蕩1.25小時(shí)，然后蒸發(fā)溶劑。將殘余物經(jīng)hplc純化(sunfire30x50mmc18,55-80％acn/水+0.1％tfa)，將所得物質(zhì)重新溶于dcm(4ml)和tfa(2ml)中，振蕩1.5小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)hplc純化(sunfire30x50mmc18,55-80％acn/水+0.1％tfa)，得到中間體29(28mg,0.016mmol,29％)和中間體29a(1mg,0.6μmol,1％):lcms方法brt＝1.08min,[m+h+h3o]+2771.5；1hnmr(400mhz,氯仿-d)σppm0.90(t,j＝6.72hz,3h)1.26(br.s.,24h)1.32-1.41(m,8h)1.62(quin,j＝7.64hz,2h)1.88-2.01(m,4h)2.31(t,j＝7.70hz,2h)3.41(t,j＝5.07hz,2h)3.46-3.56(m,3h)3.57-3.90(m,91h)；lcms方法brt＝1.29min,[m+2h]+2741.1。中間體30:22-((疊氮基-peg23)氨基)-22-氧代二十二烷-1,11,11-三甲酸將中間體16(58mg,0.063mmol)在thf(1ml)中的溶液加入裝有疊氮基-peg23-胺(70mg,0.063mmol)的小瓶中。加入dipea(17μl,0.095mmol)，反應(yīng)物在振蕩板上攪拌過夜。反應(yīng)物濃縮，經(jīng)hplc純化(sunfirec1830x50mm,35-60％acn/水+0.1％tfa)，得到中間體30(57mg,0.036mmol,57％)，為蠟狀白色固體:lcms方法brt＝0.62min,m+h1555.4；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.28(br.s.,18h)1.30-1.40(m,10h)1.63(m,j＝7.10,7.10,7.10,7.10,7.10hz,4h)1.88-2.02(m,4h)2.28(t,j＝8.10hz,2h)2.35(t,j＝7.40hz,2h)3.41(t,j＝5.07hz,2h)3.50(dt,j＝9.20,4.39hz,2h)3.57-3.63(m,2h)3.63-3.73(m,90h)中間體31:2-十一烷基丙二酸1-芐基酯3-叔丁基酯于0℃在n2下向nah(160mg,4.0mmol)在dmf(8ml)中的混懸液中加入在dmf(2ml)中的丙二酸芐基酯叔丁基酯(1.0g,4.0mmol)?；旌衔飻嚢?0min，然后加入在dmf(2ml)中的1-溴十一烷。另外攪拌1小時(shí)后，使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝亍７磻?yīng)物維持過夜。加入et2o(100ml)和水(20ml)以分配反應(yīng)物。水相用et2o(100ml)萃取，合并的有機(jī)物經(jīng)na2so4干燥。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)快速柱純化(c1812g,40-100％acn/水+0.1％tfa)，得到標(biāo)題化合物，為無色油(1.14g,2.82mmol,71％):lcms方法art＝1.58min,m+na427.4；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.84-0.96(m,3h)1.28(br.s,12h)1.31(m,j＝3.90hz,6h)1.41(s,9h)1.88(q,j＝7.38hz,2h)3.29(t,j＝7.58hz,1h)5.19(q,j＝12.27hz,2h)7.30-7.42(m,5h)?；蛘?，丙二酸叔丁基酯的烷基化可以采用1-碘十一烷(1.2eq)在甲酸鉀(2eq)的存在下在dmf中進(jìn)行。中間體32:二十二烷-1,11,11-三甲酸1,11-二芐基酯11-叔丁基酯采用中間體31(650mg,1.61mmol)作為原料，以與中間體9類似的方式合成了標(biāo)題化合物，得到無色油(823mg,1.21mmol,75％):1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.84-0.94(m,3h)1.12(m,j＝6.60hz,4h)1.19-1.33(m,28h)1.35(s,9h)1.66(quin,j＝7.40hz,2h)1.85(t,j＝8.44hz,4h)2.37(t,j＝7.52hz,2h)5.14(s,2h)5.16(s,2h)7.30-7.42(m,10h)。中間體33:13-(芐基氧基)-2-((芐基氧基)羰基)-13-氧代-2-十一烷基十三烷酸向中間體32(200mg,0.295mmol)在dcm(3ml)中的溶液中加入tfa(0.6ml)，反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)快速柱純化(二氧化硅12g,0-15％etoac/hep)，得到標(biāo)題化合物(177mg,0.284mmol,96％):1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.87-0.94(m,3h)0.94-1.05(m,2h)1.19(br.s.,14h)1.23-1.37(m,16h)1.65(quin,j＝7.40hz,2h)1.78-1.91(m,2h)1.93-2.05(m,2h)2.37(t,j＝7.52hz,2h)5.14(s,2h)5.27(s,2h)7.31-7.44(m,10h)。中間體34:二十二烷-1,11,11-三甲酸1,11-二芐基酯11-(2,5-二氧代環(huán)戊基)酯采用中間體33(177mg,0.284mmol)作為原料，以與中間體15類似的方式合成了標(biāo)題化合物，得到無色油(153mg,0.213mmol,75％):1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.86-0.93(m,3h)1.12-1.21(m,2h)1.21-1.37(m,30h)1.66(quin,j＝7.40hz,2h)1.89-2.07(m,4h)2.37(t,j＝7.58hz,2h)2.84(br.s.,4h)5.13(s,2h)5.25(s,2h)7.30-7.47(m,10h)。中間體35:將中間體34(145mg,0.201mmol)在thf(1.5ml)和dcm(1.5ml)中的溶液加入裝有氨基-peg24-酸的小瓶中。加入dipea(88μl,0.504mmol)，反應(yīng)物在振蕩板上攪拌15小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)超臨界流體色譜法(watershilic20x150mm；15-25％meoh/co2)純化，得到中間體35(151mg,0.086mmol,43％):lcms方法drt＝1.30min,[m+2h]+2876.4；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.86-0.93(m,3h)0.93-1.04(m,2h)1.19(br.s.,15h)1.23-1.37(m,15h)1.61-1.68(m,2h)1.78(td,j＝12.44,4.34hz,2h)1.92-2.05(m,2h)2.37(t,j＝7.58hz,2h)2.62(t,j＝6.05hz,2h)3.49(dd,j＝6.72,2.32hz,2h)3.52-3.59(m,2h)3.59-3.73(m,92h)3.80(t,j＝6.05hz,2h)5.13(s,2h)5.18(s,2h)7.31-7.42(m,10h)8.09(t,j＝5.26hz,1h)。中間體36:將在dcm(0.265ml)中的dcc(22mg,0.103mmol)加入中間體35(150mg,0.086mmol)和n-羥基琥珀酰亞胺在dcm(1.5ml)中的溶液中。反應(yīng)物攪拌1.5小時(shí)。加入另外的在thf(0.5ml)中的n-羥基琥珀酰亞胺(10mg)和在dcm(0.265ml)中的dcc(22mg)，反應(yīng)物攪拌過夜。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)快速柱純化(二氧化硅12,0-5％meoh/dcm)，得到中間體36(159mg,定量)，為白色固體:lcms方法brt＝1.55min,[m+h3o+h]+2933.9。中間體37:向中間體36(159mg,0.086mmol)在thf(5ml)中的溶液中加入10％披鈀碳(4.6mg,4.3μmol)在thf(1ml)中的混懸液。反應(yīng)物放置在氫氣中，攪拌40min。再加入披鈀碳(7mg,6.5μmol)，在氫氣下攪拌另外1小時(shí)。反應(yīng)物穿過膜濾器，濾液蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)hplc純化(sunfirec1830x50mm,45-70％acn/水+0.1％tfa)，得到標(biāo)題化合物(83mg,0.047mmol,54％):lcms方法brt＝1.03min,[m+2h]+2835.2；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.84-0.94(m,3h)1.17(br.s.,2h)1.21-1.39(m,30h)1.57-1.68(m,2h)1.69-1.80(m,2h)1.97-2.10(m,2h)2.34(t,j＝7.21hz,2h)2.86(s,4h)2.92(t,j＝6.48hz,2h)3.51-3.73(m,96h)3.87(t,j＝6.48hz,2h)7.45(t,j＝4.46hz,1h)中間體38:11-溴十一碳-1-炔在n2下于0℃向10-十一炔-1-醇(2.29ml,11.9mmol)和四溴化碳(4.34g,13.1mmol)在dcm(10ml)中的溶液中歷經(jīng)30分鐘分批加入三苯膦(3.43g,13.1mmol)。加入完成后，使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝亍?.5小時(shí)后，將反應(yīng)物倒入攪拌的環(huán)己烷(75ml)中，收集沉淀。將固體用環(huán)己烷洗滌，將合并的濾液蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速柱純化(二氧化硅80g,0-10％etoac/hep)，得到標(biāo)題化合物(1.75g,7.57mmol,64％):1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.21-1.35(m,6h)1.35-1.48(m,4h)1.48-1.59(m,2h)1.80-1.91(m,2h)1.94(t,j＝2.63hz,1h)2.19(td,j＝7.09,2.69hz,2h)3.41(t,j＝6.85hz,2h)。中間體39:2-(十一碳-10-炔-1-基)丙二酸二叔丁基酯于0℃在n2下將丙二酸二叔丁基酯(800mg,3.70mmol)溶于dmf(9ml)中，加入nah(148mg,3.70mmol)。反應(yīng)物于0℃攪拌30分鐘，緩慢滴加中間體38(770mg,3.33mmol)，產(chǎn)生黃色溶液。反應(yīng)物于0℃攪拌2小時(shí)，然后溫?zé)嶂潦覝?，攪?6小時(shí)。將混合物加入etoac(75ml)中，用h2o(25ml)洗滌。將水層用etoac(75ml)萃取，合并的有機(jī)層經(jīng)na2so4干燥、過濾和濃縮?；旌衔锝?jīng)快速柱純化兩次(12g二氧化硅短柱,0-20％etoac/庚烷)，將級分濃縮，得到162.1mg預(yù)期產(chǎn)品，為無色油(12％)。lcms(watersacquityuplcbehc18,1.7μm,2.1mmx50mm,50℃,溶劑名稱a:水+0.1％甲酸,溶劑名稱b:乙腈+0.1％甲酸，歷經(jīng)2.20min98％b):rt＝1.37min,ms[m+h]實(shí)測值:366.0,計(jì)算值:366.535。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.29(s,10h)1.47(s,18h)1.52(dd,j＝14.78,7.20hz,3h)1.48(d,j＝1.26hz,1h)1.75-1.83(m,2h)1.94(t,j＝2.65hz,1h)2.18(td,j＝7.14,2.65hz,2h)3.11(t,j＝7.58hz,1h)。中間體40:二十二碳-21-炔-1,11,11-三甲酸11,11-二-叔丁基酯1-乙基酯于0℃將中間體39(162.1mg,0.442mmol)溶于dmf(2ml)中，加入nah(21.23mg,0.531mmol)。反應(yīng)物于0℃攪拌15分鐘，緩慢滴加11-溴十一烷酸乙基酯(143mg,0.486mmol)。反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢?6小時(shí)。混合物用etoac(40ml)稀釋，用h2o(20ml)洗滌一次。將水層用etoac(40ml)萃取一次，合并有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥，過濾和濃縮，得到澄清黃色油狀物。將樣品溶于1mldcm中，經(jīng)快速柱純化(12g二氧化硅柱,0-20％etoac/庚烷,15min)。合并級分并濃縮，得到90.1mg預(yù)期產(chǎn)品(35％)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.28(br.s.,24h)1.45(s,18h)1.48(s,3h)1.53(d,j＝7.58hz,3h)1.51(s,1h)1.64(br.s.,1h)1.61(d,j＝7.33hz,1h)1.77(d,j＝16.93hz,2h)1.74-1.80(m,2h)1.94(t,j＝2.65hz,1h)2.18(td,j＝7.07,2.53hz,2h)2.29(t,j＝7.58hz,2h)4.13(q,j＝7.24hz,2h)。中間體41:12,12-雙(叔丁氧羰基)二十三碳-22-炔酸于30℃在n2下向中間體40(21.7mg,0.037mmol)在tbuoh(1ml)中的溶液中加入kotbu(114mg,1.012mmol)在tbuoh(2ml)中的溶液?；旌衔镉谑覝?cái)嚢?，通過tlc(1:1etoac/己烷,kmno4,回流)監(jiān)測。起始原料在3小時(shí)消耗掉，將反應(yīng)混合物用1mhcl(20ml)淬滅，用etoac(25ml)萃取兩次。合并有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥、過濾和濃縮至澄清無色油狀物(18mg,87％)。將材料未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步驟。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.27(br.s.,22h)1.44(br.s.,18h)1.48(s,3h)1.52(s,3h)1.62(br.s.,2h)1.77(br.s.,4h)1.94(br.s.,1h)2.18(s,2h)2.35(s,2h)。中間體42:二十二碳-21-炔-1,11,11-三甲酸將tfa(2ml)加入中間體41(12mg,0.022mmol)中，反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。混合物用dcm(10ml)稀釋，濃縮兩次，得到棕色油狀物。將物質(zhì)溶于etoac(10ml)中，用h2o(20ml)洗滌。有機(jī)層經(jīng)na2so4干燥、過濾和濃縮至棕色油狀物。粗物質(zhì)溶于1mlmeoh中，經(jīng)ms-觸發(fā)的hplc純化(sunfire30x50mm5um柱acn/h2ow/0.1％tfa75ml/min,1.5ml進(jìn)樣體積,45-70％acn歷經(jīng)3.5min):rt＝3.42min；ms[m+h+na]實(shí)測值:461.00,計(jì)算值:461.597。匯集級分并冷凍干燥，得到5.3mg標(biāo)題化合物，56％產(chǎn)率。中間體43:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-(十一碳-10-炔-1-基)十三烷二元酸向中間體42(5.3mg,0.012mmol)在thf(0.5ml)中的溶液中加入n-羥基琥珀酰亞胺(1.53mg,0.013mmol)。加入dcc(2.493mg,0.012mmol)在thf(0.5ml)中的溶液，混合物于室溫在n2下攪拌4小時(shí)。通過lcms觀察起始物質(zhì)的完全轉(zhuǎn)化。將混合物濃縮，未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步驟。lcms(sunfirec183.5μm3.0x30mm,40℃,酸性洗脫劑a:水+0.05％三氟乙酸,堿性洗脫劑a:水+5mm氫氧化銨,洗脫劑b:acn,5-95％歷經(jīng)2min):rt＝1.72min；ms[m+h+na]觀察值:558.0,計(jì)算值:558.67.中間體44:向中間體43(3.2mg,5.97μmol)在dcm(0.5ml)中的溶液中加入疊氮基-dpeg23-胺(quantabiodesign,7.88mg,7.17μmol)在dcm(0.5ml)和dipea(2.09μl,0.012mmol)中的溶液，將混合物于室溫?cái)嚢?6小時(shí)，此時(shí)通過lcms觀察起始物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)混合物濃縮，溶于1mlmeoh中，經(jīng)ms-觸發(fā)的hplc純化(sunfire30x50mm5um柱acn/h2ow/0.1％tfa75ml/min,1.5ml進(jìn)樣體積,55-80％acn5min梯度,rt＝1.92min)，匯集級分并冷凍干燥，得到1.7mg標(biāo)題化合物，19％產(chǎn)率。lcms(acquitybeh1.7μm2.1x50mm-50℃,溶劑名稱a:水+0.1％甲酸，溶劑名稱b:乙腈+0.1％甲酸，98％b歷經(jīng)2.20min):rt＝1.89min；ms[m+h/2]實(shí)測值:760.0,計(jì)算值:759.5.中間體45:二十二碳-21-烯-1,11,11-三甲酸按照用于中間體39-42的方法，用11-溴-癸-1-烯代替11-溴-癸-1-炔，制備中間體45。中間體46:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-(十一碳-10-烯-1-基)十三烷二元酸將在dcm(2ml)中的dcc(187mg,0.908mmol)加入n-羥基琥珀酰亞胺(99mg,0.862mmol)和二十二碳-21-烯-1,11,11-三甲酸(中間體45:400mg,0.908mmol)在dcm(7ml)和thf(0.7ml)中的溶液中。反應(yīng)物攪拌過夜，然后蒸發(fā)溶劑。將殘余物經(jīng)hplc純化(sunfirec1830x50mm；55-80％acn/水+0.1％tfa)，得到標(biāo)題化合物(155mg,0.288mmol,32％):lcms方法crt＝1.51min,m+h538.3；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm1.16-1.46(m,28h)1.60-1.87(m,3h)1.91-2.17(m,5h)2.38(t,j＝7.03hz,2h)2.86(br.s.,4h)3.68(dd,j＝11.25,7.34hz,1h)3.78(dd,j＝11.31,5.20hz,1h)3.99-4.10(m,1h)。中間體47和47a:將疊氮基-dpeg23-胺(quantabiodesign:164mg,0.149mmol)和中間體46(80mg,0.149mmol)溶于thf(2.5ml)中。加入dipea(39μl,0.233mmol)，反應(yīng)物攪拌過夜。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)hplc純化(sunfirec1830x50mm；45-70％acn/水+0.1％tfa)，得到化合物47(97mg,0.061mmol,41％)和47a(32mg,0.021mmol,14％):lcms方法crt＝1.35min,[m+2h]+2761.9；1hnmr(400mhz,乙腈-d3)δppm1.05-1.18(m,3h)1.19-1.32(m,20h)1.36(t,j＝7.15hz,1h)1.48-1.59(m,2h)1.65-1.75(m,2h)2.01-2.06(m,2h)2.25(t,j＝7.46hz,2h)3.33-3.39(m,2h)3.39-3.44(m,2h)3.50-3.67(m,98h)4.84-4.95(m,1h)4.95-5.06(m,1h)5.83(ddt,j＝17.07,10.29,6.68,6.68hz,1h)7.31(t,j＝5.44hz,1h)；lcms方法crt＝1.50min,[m+2h]+2739.9；1hnmr(400mhz,乙腈-d3)δppm1.16-1.42(m,30h)1.42-1.63(m,5h)2.00-2.07(m,2h)2.22-2.28(m,2h)2.40-2.52(m,2h)3.25-3.33(m,2h)3.33-3.42(m,2h)3.42-3.50(m,2h)3.50-3.68(m,88h)4.86-5.06(m,2h)5.83(ddt,j＝17.04,10.26,6.71,6.71hz,1h)6.40-6.74(m,1h)。中間體48:2-十一烷基丙二酸采用中間體22(290mg,0.661mmol)，以與中間體19類似的方式合成了標(biāo)題化合物(185mg,定量):lcms方法blcmsrt＝0.82min,m-h257.3中間體49:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)十三烷酸將dcc(122mg,0.592mmol)加入中間體48(170mg,0.658mmol)和n-羥基琥珀酰亞胺(68mg,0.592mmol)在dcm(6ml)和thf(0.5ml)中的溶液中。將反應(yīng)物攪拌16小時(shí)，然后再加入在dcm(0.5ml)中的dcc(30mg,0.145mmol)。反應(yīng)物攪拌另外2天。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)hplc純化(sunfirec1830x50mm,45-70％acn/水+0.1％tfa)，得到標(biāo)題化合物，為白色粉末(46mg,0.129mg,20％):lcms方法brt＝0.94min,m+h356.3；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.89(t,j＝7.00hz,3h)1.20-1.40(m,16h)1.43-1.55(m,2h)1.99-2.14(m,2h)2.86(s,4h)3.71(t,j＝7.46hz,1h)。中間體50和50a:以與50和50a類似的方式，由中間體49(30mg,0.084mmol)合成了標(biāo)題化合物，得到中間體50(18mg,0.013mmol,16％)和中間體50a(5mg,4μmol,5％):lcms方法brt＝0.85min,m+h1340.3；1hnmr(400mhz,氯仿-d)δppm0.82-0.98(m,3h)1.20-1.36(m,16h)1.36-1.51(m,2h)1.83-2.02(m,1h)2.11-2.27(m,1h)2.33(dd,j＝11.80,4.22hz,1h)3.41(t,j＝5.14hz,3h)3.49(d,j＝5.01hz,1h)3.56-3.79(m,92h)；lcms方法brt＝0.96min,m+h1296.3。中間體51-57：gdf15蛋白質(zhì)的突變體人gdf-15蛋白質(zhì)在e.coli細(xì)胞中的表達(dá)將e.coli種屬bl21(de3)gold(stratagene)和rosetta(de3)plyss細(xì)胞(novagen)分別用構(gòu)建體51至56和構(gòu)建體maha-(200-308)-hgdf15(克隆入pet26b載體中)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在抗生素選擇下首先在3ml和然后再50mlluriabroth(細(xì)菌用胰蛋白胨10g/l,酵母提取物5g/l,nacl5/l,葡萄糖6g/l)中生長直至達(dá)到od600為1.5。將預(yù)培養(yǎng)物用于接種兩個(gè)裝有terrific肉湯培養(yǎng)基(nh4so41.2g/l,h2po40.041g/l,k2hpo40.052g/l,細(xì)菌用胰蛋白胨12g/l,酵母提取物24g/l)的1-l發(fā)酵罐。當(dāng)ph升高至7.1以上時(shí)，通過自動(dòng)添加1mm異丙基-β-d-半乳糖硫吡喃糖苷(iptg)引起培養(yǎng)。其它發(fā)酵參數(shù)為：溫度＝37℃；ph7.0+/-0.2，通過添加2nnaoh/h2so4來調(diào)節(jié)；po2>30％，具有攪拌子速度、氣流流速和氧氣添加的級聯(lián)。引起后5小時(shí)，將培養(yǎng)物冷卻至10℃，通過離心收集細(xì)胞。gdf15變體的純化和重折疊a)包涵體將表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的重組細(xì)胞沉淀重新混懸于(5％w/v)50mmnah2po4/150mmnacl/5mm芐脒.hcl/5mmdtt,ph8.0,4℃中，勻化，通過兩次穿過弗細(xì)胞壓碎器(800和80巴)進(jìn)行溶解。通過于4℃以12‘000rpm離心60分鐘分離包涵體(ibs)。b)粗的展開蛋白質(zhì)的純化將ibs溶解在(5％w/v)6m胍/100mmnah2po4/10mmtris/20mmβ-巰基乙醇ph8.0中，于室溫?cái)嚢?小時(shí)。通過于12‘000rpm離心除去碎片。將溶解的ibs在ni-nta-superflow(不具有his標(biāo)簽的構(gòu)建體由于高組氨酸含量也與該樹脂結(jié)合)上進(jìn)一步純化。用6m胍/100mmnah2po4/10mmtris/5mmβ-巰基乙醇ph8.0進(jìn)行基線洗滌后，用調(diào)節(jié)至ph4.5的相同緩沖液洗脫出所結(jié)合的物質(zhì)。將洗脫液調(diào)節(jié)至ph8.0，加入100mmdtt，將溶液于4℃攪拌過夜。然后通過添加三氟乙酸(tfa,在水中的10％儲備液)調(diào)節(jié)ph至2，將溶液用0.1％tfa水溶液進(jìn)一步稀釋1:1。將粗的蛋白質(zhì)溶液通過rp-hplc(poros)、采用50min0-50％乙腈的梯度進(jìn)行進(jìn)一步純化。匯集含gdf-15的級分并冷凍干燥。c)蛋白質(zhì)折疊方法1：將冷凍干燥的物質(zhì)以2mg/ml溶于100mm乙酸中，在折疊緩沖液(100mmches/1mnacl/30mmchaps/5mmgsh/0.5mmgssg/20％dmso,ph9.5,4℃)中稀釋15-20倍，將溶液于4℃溫和攪拌3天。3天后，加入3體積的100mm乙酸，將溶液經(jīng)超濾濃縮(5kda截留)至約100-200ml，用100mm乙酸稀釋10倍，再次濃縮。將重折疊的物質(zhì)經(jīng)制備型rp-hplc在于50℃運(yùn)行的vydacc4柱(緩沖液a:0.1％tfa水溶液；緩沖液b:0.05％tfa在乙腈中的溶液)上進(jìn)一步純化。上樣后，將柱子用15％緩沖液b洗滌，用15％b至65％b50min的梯度洗脫。將所收集的含有感興趣蛋白質(zhì)的級分用等體積的緩沖液a稀釋，冷凍干燥。對于兩種蛋白質(zhì)而言，重折疊產(chǎn)率為約25％。方法2：按照方法1中的方案，采用折疊緩沖液:100mmches,ph9.4,0.9m精氨酸,0.5mnacl,1mmedta,2.5mmgsh,1mmgssg(終濃度)。按照上述操作制備了如下gdf15突變體：中間體51:m-(his)6-hgdf15mhhhhhharngdhcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtvpapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci(seqidno:1)lcms:計(jì)算質(zhì)量:26462實(shí)測質(zhì)量:26464中間體52:m-(his)6-m-hgdf15mhhhhhhmarngdhcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtupapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchgi(seqidno.2)lcms:計(jì)算質(zhì)量:26724實(shí)測質(zhì)量:26725中間體53:his-dgdf15:mhhhhhhahardgcplgegrccrlqslraslqdlgwanwvvapreldvrmcvgacpsqfrsanthaqmqarlhglnpdaapapccvpasyepvvlmhqdsdgrvsltpfddlvakdchcv(seqidno:3)lcms:計(jì)算質(zhì)量(二聚體):26368實(shí)測質(zhì)量:26363中間體54:mh-(199-308)-hgdf15mhngdhcplgpgrccrlhturasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtvpapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci(seqidno:4)lcms:計(jì)算質(zhì)量:24636實(shí)測質(zhì)量:24638中間體55:ah-(199-308)-hgdf15ahngdhcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtvpapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci(seqidno:5)步驟1:構(gòu)建體m-his6-tev(enlyfq/a)-h-hsgdf15aa199-308的制備按照上述操作(步驟a、b和c)制備了構(gòu)建體m-his6-tev(enlyfq/a)-h-hsgdf15aa199-308。步驟2:來自步驟1的蛋白質(zhì)的tev切割將冷凍干燥的蛋白質(zhì)溶解于水中至1.75mg/ml的終濃度。蛋白質(zhì)通過在6mguan/50mmtris,ph8,0+50mmdtt中1:1稀釋而再次展開，于室溫?cái)嚢?小時(shí)。將物質(zhì)經(jīng)制備型rp-hplc在vydacc4柱上再次純化，冷凍干燥。將26mg冷凍干燥物溶解于26ml50mmtris/3murea,ph7,5+3000unitsactev蛋白酶(invitrogen,12575-023)中，溫育4天。然后通過添加三氟乙酸(tfa,在水中的10％儲備液)調(diào)節(jié)ph至2，將溶液用0.1％tfa水溶液進(jìn)一步稀釋至150ml。通過0.22um膜過濾后，將物質(zhì)再次經(jīng)制備型rp-hplc在vydacc4柱上純化，成功地分離出切割的蛋白質(zhì)。手工收集級分；分離含目標(biāo)蛋白質(zhì)的級分并冷凍干燥。然后，切割的gdf15蛋白質(zhì)重折疊和重折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，如上文所述。lcms:計(jì)算質(zhì)量(二聚體):24516實(shí)測質(zhì)量:24518按照上述操作可以制備如下gdf15突變體：中間體56:mha-(200-308)-hgdf15mhagdhcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtvpapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci(seqidno:6)lcms:計(jì)算質(zhì)量(二聚體):24752按照上述操作可以制備如下gdf15突變體：中間體57:aha-(200-308)-hgdf15ahagdhcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtvpapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci(seqidno:7)lcms:計(jì)算質(zhì)量(二聚體):24430:實(shí)測質(zhì)量(二聚體):24432中間體58:his-hgdf15bcn綴合物his-hgdf15seq:mhhhhhhmarngdhcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtvpapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci將his-hgdf15的儲備液(中間體52:0.6ml,4.8mg/ml)用30mmnaoacph4.5緩沖液(5.2ml)稀釋至0.5mg/ml。緩慢加入碳酸(1r,8s,9s)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(nhs-bcn)在dmso(251μl)中的10mg/ml儲備液，反應(yīng)物在振搖盤上于24℃放置21小時(shí)。將反應(yīng)物用30mmnaoacph4.5緩沖液稀釋至30ml，采用10kdamwco超濾短柱(重復(fù)4x)濃縮至2ml，得到2.5ml的濃縮物。根據(jù)a280(ε＝29090m-1cm-1，26730g/mol)，濃縮物為0.93mg/ml(2.33mg,80％):lcmsqt2_15-60kda_15min_polar(方法e)。將所得溶液通過maldi進(jìn)行分析，主要綴合物指示為+1和+2(單體和二聚體的n-末端標(biāo)記)標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％tic(ms+)強(qiáng)度gdf15267262672626gdf15+1bcn269032690443gdf15+2bcn270802708023gdf15+3bcn27257272569his-hgdf15+1bcn(雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔基)相應(yīng)于在gdf15同二聚體的一個(gè)分子上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2bcn相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3bcn相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。中間體59:his-hgdf15bcn綴合物his-hgdf15seq:mhhhhhharngdhcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtvpapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci將his-hgdf15的儲備液(中間體51:7.04ml,1.42mg/ml)用30mmnaoacph4.5緩沖液(12.95ml)稀釋至0.5mg/ml。緩慢加入碳酸(1r,8s,9s)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(nhs-bcn)在dmso(0.88ml)中的10mg/ml儲備液，反應(yīng)物在振搖盤上于24℃放置24小時(shí)。加入另外部分的nhs-bcn儲備液(176μl)，反應(yīng)物于24℃維持24小時(shí)。將反應(yīng)物用30mmnaoacph4.5緩沖液稀釋至60ml，采用10kdamwco超濾短柱(重復(fù)4x)濃縮至4ml，得到4.1ml濃縮物。根據(jù)a280(ε＝29090m-1cm-1,26700g/mol)，濃縮物為2.19mg/ml(8.98mg,89％):lcmsqt2_15-60kda_15min_polar(方法e)標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％tic(ms+)強(qiáng)度gdf15264682646433gdf15+1bcn266452664034gdf15+2bcn268222681721gdf15+3bcn26999269933his-hgdf15+1bcn(雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔基)相應(yīng)于在gdf15同二聚體的一個(gè)分子上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2bcn相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3bcn相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。中間體60:his-dog-gdf15-bcn將100ulhis-dgdf15(0.68mg/ml)、100ulph4.5緩沖液、4ul的10mg/mlbcn-nhs溶液合并，于室溫溫育2天。將所得混合物用amicon10k洗滌4次，得到200ul溶液，將其用于下一步驟。產(chǎn)物作為粗品用于進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為綴合物。本發(fā)明的實(shí)施例：his-hgdf15+脂肪酸-peg-n3點(diǎn)擊的通用方法。將bcn標(biāo)記的gdf15在30mmnaoacph4.5緩沖液中稀釋至0.5mg/ml，同時(shí)制備fa-peg-n3(脂肪酸-peg23-疊氮化物)在水中的10mg/ml溶液。向gdf15溶液中加入10eqfa-peg-n3，將反應(yīng)物在振搖盤上于24℃放置過夜。通過lcms(qtof方法15-60kda_15min_polar)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，加入另外的fa-peg-n3，需要的話至50eq，直至沒有觀察到未反應(yīng)的bcn標(biāo)記的gdf15。然后將反應(yīng)物用30mmnaoacph4緩沖液稀釋5-10x，采用10kdamwco超濾短柱用新鮮緩沖液進(jìn)行緩沖液交換(4個(gè)濃縮、然后稀釋的循環(huán))。將樣品濃縮至～1mg/ml(如通過a280測定)，將回收定量至34％。最終綴合物通過lcms(qtof方法15-60kda_15min_polar)或maldi進(jìn)行分析。實(shí)施例1:綴合至中間體21的his-hgdf15bcn(i-59):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15264682646618his-hgdf15+1fa281982819236his-hgdf15+2fa299282992635his-hgdf15+3fa316583165411his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例2:綴合至中間體44的his-hgdf15bcn(i-59):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15264642646438his-hgdf15+1fa281622816233his-hgdf15+2fa298602986021his-hgdf15+3fa31558315589his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例3:綴合至中間體29a的his-hgdf15bcn(i-59):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15264642646650his-hgdf15+1fa281242812028his-hgdf15+2fa297802977616his-hgdf15+3fa31436314327his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例4:綴合至中間體24的his-hgdf15bcn(中間體58):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15267262672827his-hgdf15+1fa283962839842his-hgdf15+2fa300663006824his-hgdf15+3fa31736317387his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例5:綴合至中間體29的his-hgdf15bcn(i-58):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15267262672830his-hgdf15+1fa284252842636his-hgdf15+2fa301253012623his-hgdf15+3fa318253174012his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例6:綴合至中間體55的his-hgdf15bcn(i-58):his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于在gdf15同二聚體的一個(gè)分子上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例7:綴合至中間體6a的his-hgdf15bcn(i-58):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15267262672828his-hgdf15+1fa283822838242his-hgdf15+2fa300383004029his-hgdf15+3fa31916n/an/ahis-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)單體單元上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例9:綴合至中間體30的his-hgdf15bcn(i-58):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15267262672821his-hgdf15+1fa284562845647his-hgdf15+2fa301863018832his-hgdf15+3fa31916n/an/ahis-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)分子(單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例10:綴合至中間體12的his-hgdf15bcn(i-58):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15267262672917his-hgdf15+1fa284422844537his-hgdf15+2fa301583015832his-hgdf15+3fa318743187713his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)分子(單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例13:綴合至中間體6的his-hgdf15bcn(i-59):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15264682646428his-hgdf15+1fa281682816442his-hgdf15+2fa298682986421his-hgdf15+3fa315683156410his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)分子(兩個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例14:綴合至中間體17的his-hgdf15bcn(i-58):負(fù)載度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15267262672818his-hgdf15+1fa284132841434his-hgdf15+2fa301003005435his-hgdf15+3fa317873172613his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)分子(兩個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。實(shí)施例15:步驟1:向2,2,13,13-四甲基十四烷二元酸(aldrichcpr,訂單號ph002322)(100mg,0.318mmol)和n-羥基琥珀酰亞胺(40.3mg,0.35mmol)在thf(5ml)中的溶液中加入dcc(65.6mg,0.318mmol)在thf(5ml)中的溶液，將混合物于室溫?cái)嚢柽^夜。通過lc-ms分析觀察向預(yù)期產(chǎn)品的部分轉(zhuǎn)化。將混合物過濾，濾液濃縮。將殘余物重新溶于dcm(40ml)中，用水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，經(jīng)二氧化硅色譜法、用庚烷/etoac/dcc(10:1:1)洗脫進(jìn)行純化，得到混合物。將混合物進(jìn)一步經(jīng)ms觸發(fā)的酸hplc純化[(55-80％acn3.5min梯度):rt＝2.48min,質(zhì)量計(jì)算值:314.46質(zhì)量實(shí)測值:314.00]，得到干凈的產(chǎn)物(50mg,38.2％產(chǎn)率)并回收原料。步驟2:向nhs-2,2,13,13-四甲基十四烷二元酸(10mg,0.024mmol)在dcm(3ml)中的溶液中加入疊氮基-dpeg3-胺(10mg,0.049mmol)和dipea(9ul,0.049mmol)，將混合物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。將混合物濃縮，重新溶于meoh(3ml)中，經(jīng)ms-觸發(fā)的hplc純化(55-80％acn3.5min梯度rt＝2.35,質(zhì)量預(yù)測值:514.70質(zhì)量實(shí)測值:514.40)，得到7mg干凈的產(chǎn)物，58％產(chǎn)率。步驟3:向100μlbcn-dgdf15溶液(i-60:0.68mg/ml,在ph4.5緩沖液中)中加入ph4.5緩沖液(100μl)和疊氮化物(6μl在dmso中,10mg/ml)，將混合物于室溫孵育過夜。將混合物用amicon10k洗滌4次。所得溶液通過maldi進(jìn)行分析，主要綴合物指示為+1和+2。maldi:計(jì)算質(zhì)量:26546實(shí)測質(zhì)量:26483；計(jì)算質(zhì)量:27060實(shí)測質(zhì)量:27128；計(jì)算質(zhì)量:27574實(shí)測質(zhì)量:27789。實(shí)施例16:綴合至中間體44的his-hgdf15bcn(i-58):標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％auc@280nmhis-hgdf15267262672845his-hgdf15-bcn269022690421his-hgdf15+1fa284222836025his-hgdf15+2fa29868300129his-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的一個(gè)分子(一個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。his-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩個(gè)分子(兩個(gè)單體單元)上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)。實(shí)施例17:綴合至中間體52的his-hgdf15-bcn向3ml環(huán)辛炔gdf15(i-58:0.46mg/ml,0.051umol)在7mlph4乙酸鈉緩沖液中的溶液中加入脂肪酸peg疊氮化物(15ul,在35mg/mldmso中,0.36umol)，將混合物于室溫溫育過夜。通過maldi分析觀察到完全轉(zhuǎn)化。將產(chǎn)物通過amicon過濾10kd洗滌三次進(jìn)行純化，得到4.3ml0.29mg/ml預(yù)期產(chǎn)品，90％產(chǎn)率。maldi:環(huán)辛炔sm～5％預(yù)期質(zhì)量:26902質(zhì)量實(shí)測值:26997；+1脂肪酸～40％預(yù)期質(zhì)量:28421實(shí)測質(zhì)量:28525；+2脂肪酸～50％預(yù)期質(zhì)量:29940實(shí)測質(zhì)量:30191+3脂肪酸5％預(yù)期質(zhì)量:31459實(shí)測質(zhì)量:31874。實(shí)施例18:綴合至中間體37的mh-(199-308)gdf15(i-54)將mh-(199-308)-gdf15(中間體54:0.393ml,0.028μmol,1.78mg/ml)加入1.5ml30mm乙酸鈉緩沖液中，nhs脂肪酸(474ug,0.284umol,10mg/ml)加入溶液中。5小時(shí)后，根據(jù)maldi反應(yīng)完全。將產(chǎn)物采用amicon超濾10kd洗滌5次進(jìn)行純化，得到575ug綴合物，73％產(chǎn)率。maldi:sm(18％),預(yù)期質(zhì)量:24638實(shí)測質(zhì)量:24735；+1脂肪酸(38％)預(yù)期質(zhì)量:26192實(shí)測質(zhì)量:26268；+2脂肪酸(40％)預(yù)期質(zhì)量:27746實(shí)測質(zhì)量:27798；+3脂肪酸(4％)預(yù)期質(zhì)量:29300實(shí)測質(zhì)量:29333。實(shí)施例19a:綴合至中間體37的his-hgdf15(i-59)將his-gdf15(0.493ml,0.026μmol,1.42mg/ml)加入1.5ml30mm乙酸鈉ph＝4緩沖液中，nhs脂肪酸(0.221mg,0.132umol,10mg/ml)加入溶液中。反應(yīng)過夜未完全，所以再加入2.5當(dāng)量的脂肪酸nhs(0.110mg,0.066umol,10mg/ml)，5小時(shí)后，maldi顯示+2綴合物為主要產(chǎn)物。產(chǎn)物采用amicon超濾10kd洗滌5次進(jìn)行純化，得到565ug綴合物，76％產(chǎn)率。maldi:sm(18％),預(yù)期質(zhì)量:26468實(shí)測質(zhì)量:26553；+1脂肪酸(38％)預(yù)期質(zhì)量:28022實(shí)測質(zhì)量:28099；+2脂肪酸(40％)預(yù)期質(zhì)量:29576實(shí)測質(zhì)量:29649；+3脂肪酸(4％)預(yù)期質(zhì)量:31130實(shí)測質(zhì)量:31201。實(shí)施例19b:與中間體37綴合的aha-hgdf15制備中間體37在分子生物學(xué)級水中的10mg/ml溶液。向aha-hgdf15(中間體57,6.67mg/ml,在30mmnaoacph4.0中,5.247ml,1.433μmol)中加入30mmnaoacph4.6(可接受的范圍4.5-5.0)，得到0.88mg/ml的最終蛋白質(zhì)濃度。加入中間體37(10eq.,2.39ml,0.014mmol)，將反應(yīng)物于室溫混合18小時(shí)。在反應(yīng)小瓶中已經(jīng)形成沉淀。將反應(yīng)混合物通過4x15ml10kdaamicon離心過濾器分離，每份用30mmnaoacph4.0稀釋至15ml。將物質(zhì)通過緩沖液更換4x進(jìn)入30mmnaoacph4.0中，將樣品合并，體積為25.6ml，在各洗滌之間用吸管尖端攪動(dòng)濾器中的沉淀物。沉淀物保留在溶液中，所以將混合物于4℃靜置過夜。濃度通過a280(30040cm-1m-1,27538g/mol)測定為1.62mg/ml(100％)。uplc分析顯示+1fa(保留時(shí)間:4.88min)和+2fa產(chǎn)物(保留時(shí)間:5.80min)(方法j)的回收為60％。lcms方法t顯示出預(yù)期的質(zhì)量。體內(nèi)測試了實(shí)施例19b的粗混合物(下表給出了比例)并在表1中報(bào)道：aha-hgdf15+1fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的多肽鏈之一上(單體單元上)的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)(如實(shí)施方案11b,式h中給出)。aha-hgdf15+2fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的兩條多肽鏈上的n-末端氨基官能團(tuán)處的反應(yīng)(如實(shí)施方案11b,式g中給出)。aha-hgdf15+3fa(脂肪酸)相應(yīng)于gdf15同二聚體的某個(gè)其它位置處的非選擇性反應(yīng)。純化:在watersbeh3003.5μm,4.6mmx100mm流速2.5ml/min上將粗產(chǎn)物經(jīng)反相色譜法純化(緩沖液a0.1％tfa水溶液；緩沖液b0.1mtfa在can中的溶液；梯度99％-80％緩沖液a)。級分1:未反應(yīng)的aha-hgdf15:rt＝17.33min級分2:(19b1):aha-gdf15+1fa:rt＝20.2min(約15％產(chǎn)率)(式h)級分3:(19b2):aha-gdf15+2fa:rt＝21.6min(約15％產(chǎn)率)(式g)級分4:(19b3):aha-gdf15+3fa:rt＝23.0min(約5％產(chǎn)率)制備了19b1和19b2的1:1比例混合物并進(jìn)行了測試(19bm)?；蛘?，反應(yīng)可以在10mmna2hpo4-7h2o和30mmnaoac中在ph4.73進(jìn)行：制備中間體37在分子生物學(xué)級水中的10mg/ml溶液。向aha-hgdf15(中間體57,12.04mg/ml,在30mmnaoacph4.0,4.15μl,0.002μmol)中加入30mmnaoac10mmna2hpo4-7h2oph4.73，得到0.88mg/ml的最終蛋白質(zhì)濃度。加入中間體37(20eq.,6.83μl,0.041μmol)，反應(yīng)物于室溫混合18小時(shí)。反應(yīng)混合物隨著沉淀變得渾濁。uplc分析顯示出58％+1和+2產(chǎn)物(方法j)。種類計(jì)算值％實(shí)測值aha-gdf15244300aha-gdf15+1fa2598411aha-gdf15+2fa2753847aha-gdf15+3fa2909234aha-gdf15+4fa306467反應(yīng)還可以在30mmnaoac和10mmk2hpo4中在ph4.6進(jìn)行：制備中間體37在分子生物學(xué)級水中的10mg/ml溶液。向aha-hgdf15(中間體57,6.21mg/ml,在30mmnaoacph4.0中,5.261ml,1.337μmol)中加入30mmnaoac10mmk2hpo4ph4.6(可接受的范圍4.5-5.0)，得到0.88mg/ml的最終蛋白質(zhì)濃度。加入中間體37(10eq.,68.3μl,0.409μmol)，反應(yīng)物于室溫混合7小時(shí)。反應(yīng)混合物隨著沉淀變得渾濁。在15ml10kdaamicon離心過濾器中將反應(yīng)混合物分為四個(gè)9ml部分，用30mmnaoacph4.0稀釋至15ml。將物質(zhì)通過緩沖液更換4x進(jìn)入30mmnaoacph4.0中，在各洗滌之間用吸管尖端攪動(dòng)沉淀物。反應(yīng)混合物濃縮至75ml的體積。沉淀物保留，所以將物質(zhì)于4℃儲存2天。濃度通過a280(30040cm-1m-1,27538g/mol)測定未0.4mg/ml(97％)。uplc分析顯示+1和+2產(chǎn)物的回收為61％(方法j)。參比實(shí)施例1:綴合至中間體peg-肉豆蔻酸構(gòu)建體的his-hgdf15bcn(i-58):步驟1:向疊氮基-peg23-胺(30mg,0.027mmol)和肉豆蔻酸nhs酯(torontoresearchchemicals,cat#s69080)(12mg,0.037mmol)的混合物中加入dcm(1ml)和dipea(13ul)，將混合物于室溫?cái)嚢柽^夜。將混合物經(jīng)二氧化硅色譜法、用etoac/庚烷(0-100％)、然后用meoh/dcm(0-10％)洗脫純化，得到在約5％meoh/dcm中的干凈的產(chǎn)物。lcms:(梯度:從40至98％b,1.4min-流速1ml/min洗脫劑a:水+0.05％甲酸+3.75mm乙酸銨,洗脫劑b:乙腈+0.04％甲酸)lcms:rt＝2.20(方法c)質(zhì)量+h計(jì)算值:1354.71質(zhì)量實(shí)測值:1354.4。步驟2:向bcn-hgdf15溶液(i-52:800ul,0.25mg/ml)中加入(2mg/ml,在dmso中,6.3ul,10eq)，混合物于室溫?cái)嚢柽^夜。1.1ml0.20mg/ml定量產(chǎn)率。(maldi:+1質(zhì)量計(jì)算值:28223質(zhì)量實(shí)測值:28640；+2質(zhì)量計(jì)算值:29543；質(zhì)量實(shí)測值:29962,+3質(zhì)量計(jì)算值:30863質(zhì)量實(shí)測值:31426,+4質(zhì)量計(jì)算值:32183質(zhì)量實(shí)測值:32911)。參比實(shí)施例2:his-hgdf15-peg23標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％his-hgdf152646826360.35his-hgdf15-bcn26644n/a0his-hgdf15+1peg232756728178.615his-hgdf15+2peg232866629385.146his-hgdf15+3peg232976530547.228his-hgdf15+4peg233086431731.85向his-hgdf15bcn(i59:427μl,1.17mg/ml,0.019μmol)在30mmnaoacph4.0(427μl)中的溶液中加入疊氮基-dpeg23-胺(quantabiodesign,104μg,0.094μmol)。反應(yīng)物于室溫混合16小時(shí)，此時(shí)采用10kdamwcoamicon離心過濾器通過稀釋和將樣品濃縮五次至140μl體積而將混合物交換入30mmnaoacph4.0中。maldi分析顯示完全轉(zhuǎn)化為+1至+4產(chǎn)物。濃度通過a280(29090m-1cm-1,27600g/mol)測定為2.099mg/ml(57％)。實(shí)施例20:綴合至中間體47的apelin環(huán)肽bcn:步驟1:pe-r-p-c*-l-s-c*-k-g-p-(d-nle)-nh(苯乙基)(二硫化物c4-c7)乙酸酯的合成·中間體20a的制備(具有fmoc-d-nle-oh的2-氯三苯甲基氯樹脂的加載、fmoc除去和樹脂加載的確定)將2-氯三苯甲基氯樹脂(50.0g,85.0mmol)混懸于dcm(400ml)中，將混懸液攪拌10min，然后倒出溶劑，將樹脂用dcm(3x200ml)洗滌。然后將fmoc-d-nle-oh(24.0g,68.0mmol)和dipea(96.5ml,552.5mmol)在dcm(120.0ml)中的溶液加入樹脂中，將混懸液充氮?dú)猓谑覝財(cái)嚢?min。加入另一份dipea(22.7ml,127.5mmol)，反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢柽^夜。倒出反應(yīng)混合物，將樹脂用dcm(3x250ml)洗滌，每次2分鐘。將樹脂用混合物dcm/meoh/dipea(70:15:15)(2x250ml)淬滅，每次10分鐘。fmoc基團(tuán)通過用哌啶/dmf(1:3)(1x300ml)處理樹脂5分鐘而裂解。然后將樹脂排液(1x300ml)15min，然后進(jìn)行洗滌步驟：dmf(6x250ml,每次2min)、異丙醇(2x250ml,每次2min)和tbme(6x250ml,每次2min)。將樹脂于35℃真空干燥24小時(shí)，得到中間體20a(57.8g,加載＝1.08mmol/g)?！ぶ虚g體20b的制備(線性肽的裝配)中間體20a(18.5g,20.0mmol)在自動(dòng)肽合成儀(csbio536tm)上進(jìn)行固相肽合成。偶聯(lián)循環(huán)如下所定義：·氨基酸偶聯(lián)：aa(3.0eq.)、dic(3.0eq.)、hobt(3.0eq.)、dmf(見下表)·洗滌：dmf(4x150ml,每次2min)。·fmoc脫保護(hù)：哌啶/dmf(1:3)(150ml5min，然后150ml15min)?！は礈欤篸mf(6x150ml,每次2min)。在肽裝配后，將樹脂用dmf(6x150ml,每次2min)、異丙醇(6x150ml,每次2min)和tbme(6x150ml,每次2min)洗滌。將肽樹脂在高真空下于35℃干燥過夜，得到中間體20b(57.6g,20.0mmol)?！ぶ虚g體20c的制備(從樹脂裂解hfip)將一部分中間體20b(27g,9.37mmol)混懸于dcm(300ml)中，攪拌15min。將樹脂排液，然后用hfip/dcm(3:7)處理(3x270ml,每次15min)。濾出裂解溶液并收集。將樹脂用dcm(3x300ml)洗滌。將合并的裂解和洗滌溶液在真空中濃縮至干。將白色粉末在真空中于35℃干燥過夜，得到中間體20c-第1批(23.5g,9.37mmol)。用另一部分中間體20b(28.0g,9.72mmol)重復(fù)上述操作，得到中間體20c-第2批(26.1g,9.72mmol)。·中間體20d的制備(苯乙基胺的溶液相偶聯(lián))將中間體20c-第2批(20.0g,7.44mmol,1.0eq)和hatu(5.23g,13.8mmol,1.85eq)溶于dmf(400ml)中。加入苯乙基胺(1.67g,13.8mmol,1.85eq)和dipea(3.56g,27.6mmol,3.71eq)在dmf(60ml)中的溶液。將反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢?0min，然后冷卻至℃，然后加入鹽水(460ml)。將混懸液攪拌10min，然后通過過濾分離產(chǎn)物。將濾餅用h2o(300ml)洗滌，然后將其小心移出，然后溶于dcm(300ml)中。將溶液經(jīng)mgso4干燥，然后在真空中濃縮至干。粗產(chǎn)物進(jìn)行二氧化硅膠快速色譜法(洗脫劑:dcm和dcm/iproh(8:2))，得到中間體20d-第1批(14.4g,6.6mmol)。用中間體20c-第1批(23.4g,9.37mmol)重復(fù)相同操作，排除快速色譜法，得到中間體20d-第2批(28.0g,9.37mmol)。·中間體20e的制備(保護(hù)基除去)將中間體20d-第2批(28.0g,9.37mmol)溶于tfa/dcm/edt/tis(90:5:2.5:2.5)(290ml)中，反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。將裂解溶液濾出，倒在冷tbme(3l)(0-4℃)上。將渾濁混懸液在冰水浴中攪拌30min，然后經(jīng)4孔玻璃濾器過濾。將由此獲得的白色固體用tbme(2x100ml)洗滌，然后于35℃真空干燥過夜，得到中間體20e-第1批(8.9g,5.9mmol)。采用中間體20d-第1批(14.4g,6.6mmol)重復(fù)相同的操作，得到中間體20e-第2批(9.6g,6.3mmol)?！e-r-p-c*-l-s-c*-k-g-p-(d-nle)-nh(苯乙基)(二硫化物c4-c7)乙酸酯的制備1)環(huán)化將中間體20e(5.0g,3.3mmol)溶于水(500ml)中。一次性加入碘(1.18g,4.66mmol,1.41eq)在乙酸(93ml)中的溶液。將反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢?0min。加入抗壞血酸(1.03g,5.83mmol,1.77eq)在水(5.8ml)中的溶液，將反應(yīng)混合物攪拌10min，過濾，于4℃儲存至純化。重復(fù)相同的環(huán)化操作直至已經(jīng)加工了18.3g(12.1mmol)中間體20e。2)純化將環(huán)肽溶液接受制備型hplc，每次進(jìn)樣0.5-5.0g肽。匯集具有高于95％的純度的級分，冷凍干燥，得到總量為4.89g(3.2mmol)的純化肽(tfa鹽)。3)通過離子交換進(jìn)行的乙酸酯形成將75g(100ml)oh-形式的強(qiáng)陰離子交換樹脂(ionexchangeriii,merck)放在燒結(jié)玻璃漏斗(孔隙率3)中，然后加入乙酸/水(1:3)溶液(300ml)，將混懸液手工攪拌2分鐘，然后將樹脂排液。用另一份乙酸/水(1:3)(300ml)重復(fù)該操作。將樹脂用去離子水洗滌，直至觀察到中性排液。然后將樹脂轉(zhuǎn)移至裝配有燒結(jié)玻璃漏斗(孔隙率3)的4x20cm柱。將4.8g純化肽溶于去離子水(50ml)中，加到柱子上。將產(chǎn)物用去離子水(200ml)洗脫。通過tlc點(diǎn)樣控制產(chǎn)物的洗脫，將富含的級分匯集并冷凍干燥，得到pe-r-p-c*-l-s-c*-k-g-p-(d-nle)-nh(苯乙基)(二硫化物c4-c7)乙酸酯(4.1g,2.9mmol)。通過分析型hplc(分析方法f；tr＝8.01min)和uplc-hrms(分析方法g；測定值:[m+2h]2+＝643.328；計(jì)算值:[m+2h]2+＝643.324)對純產(chǎn)物進(jìn)行分析。乙酸酯含量為7.99-8.27％，水含量為1.94-1.96％。步驟2:pe-r-p-c*-l-s-cp-n6-[[(1α,8α,9α)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基]-k-g-p-(d-nle)-nh(苯乙基)[二硫化物c4-c7]的制備將pe-r-p-c*-l-s-c*-k-g-p-(d-nle)-nh(苯乙基)三乙酸酯[二硫化物c4-c7](100mg,0.068mmol)、碳酸氫鈉(38mg,0.452mmol)和水(83ul)在dmf(1ml)中的混合物于室溫?cái)嚢?0mins，然后加入碳酸(1r,8s)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯琥珀酰亞氨基酯(berry&associates,20mg,0.068mmol)。反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢?0mins。將1ml水加入混合物中，將所得溶液冷凍干燥，得到粉末，將其未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步驟。步驟3:實(shí)施例20的制備:將pe-r-p-c*-l-s-c*-n6-[[(1α,8α,9α)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基]-k-g-p-(d-nle)-nh(苯乙基)[二硫化物c4-c7](50mg,來自步驟2的產(chǎn)物,在1ml水中,0.034mmol)和中間體47(52mg,在268ul水中)的混合物于室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物經(jīng)制備型hplc純化(sunfire30x50mm5um柱acn/h2ow/0.1％tfa75ml/min,15-40％acn5min梯度)。將產(chǎn)物級分冷凍干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物，為tfa鹽(24mg,21％)。lcms(watersacquityuplcbehc181.7um2.1x50mm,50℃,洗脫劑a:水+0.1％甲酸，洗脫劑b:乙腈+0.1％甲酸,梯度2％至98％b/a,歷經(jīng)5.15mins):保留時(shí)間:2.77mins；ms[m+2]2+:實(shí)測值:1491.8808,計(jì)算值:1491.8560。實(shí)施例21a:綴合至中間體47的apelin環(huán)肽bcn步驟1:將pe-r-p-r-l-c*-h-k-g-p-nle-c*-f-oh(二硫化物c6-c12)50mg,0.033mmol,如美國專利號8,673848中制備)、碳酸氫鈉(18mg,0.215mmol)和水(40ul)在dmf(0.5ml)中的混合物于室溫?cái)嚢?0mins，然后加入然算(1r,8s)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯琥珀酰亞氨基酯(berry&associates,18mg,0.065mmol)。將反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢?0mins。通過lcms觀察+1和+2混合物添加，所有將混合物經(jīng)質(zhì)量觸發(fā)的hplc純化(肽方法525-50％acn5min梯度:條件:sunfire30x50mm5um柱acn/h2ow/0.1％tfa75ml/min1.5ml進(jìn)樣體積):rt3.2min(+1),rt4.65min,4.9min(+1和+2混合物)。lcms證實(shí)了61％產(chǎn)率的預(yù)期+1產(chǎn)物和18％產(chǎn)率的+1,+2混合物。lcms:(堿性洗脫劑a:水+5mm氫氧化銨洗脫劑b:can酸性柱子:sunfirec183.5μm3.0x30mm-40℃堿性柱子:xbridgec183.5μm3.0x30mm-40℃)保留時(shí)間:0.98mins；ms[m+2]2+:實(shí)測值:856.0,計(jì)算值:865.0245。步驟2:將pe-r-p-r-l-c*-h-n6-[[(1α,8α,9α)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基]-k-g-p-nle-c*-f-oh(二硫化物c6-c12)(21.33mg,0.014mmol)和中間體47(24mg,0.014mmol)的混合物于室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)。通過lcms完成反應(yīng)，將其冷凍干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(23mg,48％)。lcms(watersacquityuplcbehc181.7um2.1x50mm,50℃,洗脫劑a:水+0.1％甲酸，洗脫劑b:乙腈+0.1％甲酸,梯度2％至98％b/a,歷經(jīng)5.15mins):保留時(shí)間:2.22mins；ms[m+2]2+:實(shí)測值:1616.9464,計(jì)算值:1616.976。實(shí)施例21b:綴合至脂肪酸-連接基構(gòu)建體i-37的apelin環(huán)肽步驟1:a-h-q-r-p-c-l-s-c-k-g-p-dnle-苯乙基胺中間體21b1的合成使苯乙基胺-ameba樹脂(sigmaaldrich,0.1mmol,1.0mmol/g)在自動(dòng)肽合成儀上接受固相肽合成(cemlibertybluemicrowave)，采用標(biāo)準(zhǔn)雙arg用于arg殘基和dnle偶聯(lián)雙時(shí)間。將氨基酸制成在dmf中的0.2m溶液。標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)循環(huán)如下定義：·氨基酸偶聯(lián):aa(5eq.)/hatu(5eq.)/diea(25eq.)·洗滌：dmf(3x7ml)·fmoc脫保護(hù)：20％哌啶/0.1mhobt(2x7ml)·洗滌：dmf(4x7ml，然后1x5ml)在肽裝配后，將樹脂用dmf(2x50ml)和dcm(2x50ml)洗滌，然后真空干燥，得到中間體21b1(276mg,0.1mmol)。步驟2:中間體21b2的制備(從樹脂裂解肽)將中間體21b1(276mg,0.1mmol)與4mltfa溶液(37mltfa,1mlh2o,1mltips,3.06gdtt)合并，于室溫振搖3小時(shí)。將溶液從樹脂除去，沉淀入40ml冷et2o中。將溶液渦旋，在冰上靜置10分鐘，然后于4000rpm離心5分鐘。除去溶劑，將白色固體用et2o再洗滌兩次(每次40ml)，離心(每次5分鐘)，傾析。將固體真空干燥過夜，得到中間體21b2(17.4mg,0.012mmol)。lcms(sq2productanalysis-acidic-peptide-polar,acquityuplcbehc18柱,1.7μm,2.1mmx50mm,50℃):rt＝1.83分鐘,ms[m+h]1513.5。步驟3:中間體21b3的制備(半胱氨酸殘基的環(huán)化)將中間體21b1(29.6mg,0.020mmol)溶于水(3ml)和10滴dmso中，得到略微渾濁的溶液。緩慢滴加碘(50mm,在hoac中,0.783ml,0.039mmol)，將反應(yīng)物于室溫混合過夜。對粗反應(yīng)物進(jìn)行l(wèi)cms分析顯示起始物質(zhì)完全轉(zhuǎn)化。滴加0.5m抗壞血酸直至顏色消散。將物質(zhì)經(jīng)由ms-觸發(fā)的hplc純化。將匯集的級分冷凍干燥，得到7mg預(yù)期產(chǎn)品，為白色粉末(4.63μmol,24％)。lcms(sq2productanalysis-acidic-peptide,acquityuplcbehc18柱,1.7μm,2.1mmx50mm,50℃):rt＝0.90分鐘,ms[m+h]1511.8。步驟4:制備包含apelina-h-q-r-p-c-l-s-c-k-g-p-dnle-苯乙基胺和中間體i-37的綴合物(n-末端綴合)-實(shí)施例21b在h2o中制備nhs-脂肪酸的10mg/ml溶液。將中間體21b3(1.5mg,0.993μmol)溶于30mmph4naoac緩沖液(672μl)中，加入nhs-脂肪酸(i-37:0.850ml,5.10μmol)。將反應(yīng)物于室溫混合16小時(shí)，此時(shí)加入另外的1.5mgnhs-脂肪酸(10mg/ml,在h2o中)，將反應(yīng)物于室溫混合16小時(shí)。加入8mgnhs-脂肪酸(10mg/ml,在h2o中)，將反應(yīng)物于室溫混合3天，加入1.7mgnhs-脂肪酸(10mg/ml,在h2o中)。將混合物于室溫振搖16小時(shí)，經(jīng)m-觸發(fā)的hplc純化，得到1.7mg標(biāo)題化合物，為白色粉末(0.510μmol,51％)。lcms(sq2productanalysis-acidic-peptide-polar,acquityuplcbehc18柱,1.7μm,2.1mmx50mm,50℃):rt＝3.87分鐘,ms[m+h+2/2]1533.1；[m+h+3/3]1022.9。實(shí)施例22至24涉及脂肪酸與sirna的綴合物。用于sirna合成的試劑盒可購買獲得，例如購自newenglandbiolabs和ambion。sirna劑可以采用本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)來構(gòu)建。例如，sirna劑可以采用天然存在的核苷酸或各種修飾的核苷酸來化學(xué)合成，所述各種修飾的核苷酸被設(shè)計(jì)成降低脫靶作用和/或增加分子的生物穩(wěn)定性或增加在反義和正義核苷酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸?！癵”、“c”、“a”、“t”和“u”各自通常表示分別含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作為堿的核苷酸。然而，術(shù)語“核糖核酸”,“脫氧核苷酸”或“核苷酸”可以指經(jīng)修飾的核苷酸或替代的置換部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，能夠采用本領(lǐng)域已知的任意常規(guī)方法如期望那樣合成和修飾sirna(參見henschel等人,2004deqor:aweb-basedtoolfordesignandqualitycontrolofsirnas.nucleicacidsresearch32(webserverissue):w113-w120)。實(shí)施例22:式a3脂肪酸部分與sirna的綴合制備中間體22a:采用標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸操作(例如與6-(4-單甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰基乙基)-(n,n-二異丙基)-亞磷酰胺(glenresearch目錄號10-1906))，由ttrsirna[sirna至轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(ttr),采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法合成]轉(zhuǎn)化為22a。ttrsirna:反義鏈:puagagcaagaacacugu*u*rx058，其中：p是磷酸酯基，小寫字母表示2’-ome修飾的核苷酸，下劃線字母表示2’-f修飾的核苷酸，斜體字母表示2’-moe修飾的核苷酸，r是基礎(chǔ)的核糖醇,*指硫代磷酸酯連接，且x058是下式的非核苷酸3’端帽：正義鏈：aacaguguucuugcucuar-c6oh。-指磷酸酯基；且c6oh(還已知為c6)是下式的非核苷酸3’端帽：制備中間體22b：于0℃向sirna22a的0.556ml溶液(ttrsirna14.02mm,在h2o中,7.79μmol)中加入0.556mldmf，溫?zé)嶂潦覝亍Ｈ缓蠹尤?08μltea(0.3m在dmf中,62μmol)，260μlbcn-nhs(碳酸(1r,8s,9s)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯n-琥珀酰亞氨基酯)(0.15m,在dmf中,39μmol)。所得反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。分析型hplc顯示起始物質(zhì)22a的小時(shí)。將反應(yīng)物用去離子h2o稀釋至10ml，其變得渾濁。將上述混合物用乙酸乙酯萃取5次以除去小的有機(jī)分子。分離水層并冷凍干燥。原樣使用干燥的產(chǎn)物固體(22b)。制備實(shí)施例22:混合80μl化合物22b(12.3mm,在h2o中,0.968μmol)和65μl雙脂肪酸-n3(22c:實(shí)施例15的步驟2:44.7mm,在dmso中,2.90μmol)。所得混合物是渾濁的，因此加入80μl1:1dmf/thf，反應(yīng)物仍然是略微渾濁的。加入另外80μldmso以得到澄清溶液。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)物用去離子h2o稀釋，經(jīng)hplc純化，得到5.6mg化合物22(65.9％產(chǎn)率)。hplc純化條件:柱子:xselectprep苯基己基5umobd19x50mm；有機(jī)溶劑:用100mmtea.hoac改性的acn；水性溶劑:用100mmtea.hoac改性的h2o；梯度:5-60％accn/h2o；時(shí)間:10min。在lc-ms方法h下，產(chǎn)物顯示出單峰，保留時(shí)間為5.44min，在去卷積后具有8778的預(yù)期mw。實(shí)施例23：式a1脂肪酸部分與sirna的綴合物化合物4的制備采用與實(shí)施例22相同的方法制備了實(shí)施例23。制備23a:向nhs-脂肪酸(20mg)在dcm(16ml)中的溶液中加入疊氮基-peg7-胺(quantabiodesign,cat#10523)(31mg)和dipea(52ul)，混合物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。lc-ms分析觀察到轉(zhuǎn)化完全。將混合物濃縮，重新溶于meoh(3ml)中，經(jīng)ms觸發(fā)的hplc、用0.1％tfa(rt＝1.59min,預(yù)期質(zhì)量(m+1):818.062質(zhì)量實(shí)測值:817.9)純化，得到干凈的產(chǎn)物。由于hplcms系統(tǒng)的800da截留設(shè)置損失一半物質(zhì)。獲得5-10mg(17-33％)干凈的產(chǎn)物?；旌?0μl22b(12.3mm,在h2o中,0.968μmol)和65μl三脂肪酸-n3(23a:44.7mm,在dmso中,2.90μmol)。該反應(yīng)得到5.2mg化合物23(58.0％產(chǎn)率)。在lc-ms方法h下，產(chǎn)物顯示出單峰，保留時(shí)間為5.87min，在去卷積后具有9257的預(yù)期mw。實(shí)施例24：式a3脂肪酸與apociiisirna的綴合制備24b向24a(1.244g,4.19mmol)在25mldcm中的溶液中加入tea(0.58ml,4.19mmol)，然后加入n3-戊酸(500mg,3.49mmol)。最后加入edc(804mg,4.19mmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)物在鹽水和dcm之間萃取。合并所有有機(jī)物，干燥，濃縮，經(jīng)sio2膠用60％乙酸乙酯/庚烷純化，得到1.20g化合物24b(89％產(chǎn)率)。1hnmr(氯仿-d,400nhz)d:5.88-6.37(m,1h),4.60(d,j＝4.8hz,2h),3.77(s,3h),3.33(t,j＝6.7hz,2h),3.13(d,j＝6.5hz,2h),2.30(t,j＝7.2hz,2h),1.81-1.95(m,1h),1.63-1.81(m,5h),1.48-1.57(m,2h),1.46(s,9h),1.36(d,j＝6.8hz,2h)制備24c向24b(860mg,2.23mmol)在12mlthf中的溶液中加入1nnaoh(5.58ml,5.58mmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。反應(yīng)物用鹽水稀釋，加入20mldcm。將水層的ph用1nhcl調(diào)節(jié)至ph～5，然后用dcm萃取。合并所有有機(jī)物，干燥，濃縮，粗固體重新溶于6mldcm中。加入0.6mltfa，反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)物濃縮，得到粗的24c(400mg,54％)，將其未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在0.43min顯示出主要的峰，質(zhì)量為272.5(m+h+)。制備24e向24c(400mg,1.04mmol)在10mldcm中的溶液中加入tea(0.434ml,3.11mmol)，然后加入24d(538mg,1.35mmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)物在h2o和dcm之間萃取。合并所有有機(jī)物，干燥，濃縮，經(jīng)sio2膠用8％meoh/dcm純化，得到475mg24e(82％產(chǎn)率)。1hnmr(氯仿-d,400mhz)d:6.74-6.98(m,1h),5.95-6.13(m,1h),4.55(dd,j＝7.2,2.4hz,2h),3.32(t,j＝6.7hz,4h),3.11(d,j＝5.8hz,2h),2.30-2.37(m,2h),2.20-2.26(m,2h),1.90(br.s.,2h),1.71-1.80(m,2h),1.59-1.71(m,4h),1.51-1.59(m,2h),1.35-1.51(m,13h),1.20-1.35(m,13h)制備24f制備中間體24f2向24f1(1.0g,4.97mmol)在meoh(40ml)中的溶液中加入tea(1.04ml,7.45mmol),然后加入焦碳酸二叔丁基酯(2.17g,9.94mmol)。反應(yīng)物于60℃加熱1.5小時(shí)。將反應(yīng)物濃縮，經(jīng)sio2柱用5％meoh/dcm純化，得到1.2g化合物24f2(80％產(chǎn)率)。1hnmr(氯仿-d,400mhz)d:4.51(br.s,1h),3.00-3.22(m,2h),2.37(t,j＝7.4hz,2h),1.59-1.71(m,2h),1.46(s,11h),1.29(br.s.,12h)。制備中間體24f3向24f2(1.2g,3.98mmol)在dcm(30ml)中的溶液中加入n-羥基琥珀酰亞胺(0.60g,5.18mmol)，然后加入edc(1.0g,5.18mmol)。將溶液于室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)物濃縮，直接上樣到sio2柱上，用40％乙酸乙酯/庚烷純化，得到1.46g化合物24f3(92％產(chǎn)率)。1hnmr(氯仿-d,400mhz)d:4.49(br.s,1h),3.04-3.19(m,2h),2.86(d,j＝4.5hz,4h),2.62(t,j＝7.4hz,2h),1.70-1.82(m,2h),1.37-1.53(m,13h),1.30(br.s.,10h)制備中間體24f向galnac3-nh2(300mg,0.16mmol)在dcm(1.5ml)中的溶液中加入tea(0.11ml,0.79mmol)，然后加入24f3(188mg,0.47mmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢柽^夜。然后加入三氟乙酸(1.0ml)。2小時(shí)后，lc-ms顯示中間體消失。將反應(yīng)物濃縮，經(jīng)開放存取(openaccess)hplc在酸性條件下以elsd作為檢測進(jìn)行純化。收集含有產(chǎn)物的hplc級分，蒸發(fā)溶劑，得到220mg化合物24f(67％產(chǎn)率)。lc-ms顯示，部分產(chǎn)物失去一個(gè)乙酰基基團(tuán)。hplc純化條件:柱子:sunfire30x100mm5um柱；有機(jī)溶劑:acnw/7.5％tfa；水性溶劑:h2ow/7.5％tfa；流速:75ml/min.梯度:15-40％h2o/accn；時(shí)間:9.5min。檢測:elsd(蒸發(fā)激光散射檢測器)作為檢測。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在0.83min處顯示出峰。質(zhì)量為989.9(m/2+h+)。制備24g向24e(172mg,0.31mmol)在3mldcm中的溶液中加入24f(250mg,0.12mmol)，然后加入tea(0.069ml,0.50mmol)。最后加入edc(95mg,0.5mmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)物濃縮，經(jīng)sio2柱用5％meoh/dcm純化，得到230mg24g(74％產(chǎn)率)。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在1.30min處顯示出峰。質(zhì)量為1258.2(m/2+h+)。制備24h向24g(230mg,0.091mmol)在1mlthf中的溶液中加入0.457ml4nhcl(在二噁烷中,1.83mmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)物濃縮，經(jīng)hplc純化，得到50mg24h(23％產(chǎn)率)，其失去糖上的一個(gè)乙?；鶊F(tuán)。hplc純化條件:柱子:sunfire30x100mm5um柱；有機(jī)溶劑:acnw/7.5％tfa；水性溶劑:h2ow/7.5％tfa；流速:75ml/min.梯度:15-40％h2o/accn；時(shí)間:9.5min。檢測:elsd(蒸發(fā)激光散射檢測器)作為檢測。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在0.95min顯示出峰。質(zhì)量為1187.1(m/2+h+)。制備24i向2,2,13,13-四甲基十四烷二元酸(40mg,0.127mmol)在2mldcm中的溶液中加入n-oh琥珀酰亞胺(9.81mg,0.085mmol)，然后加入edc(16.34mg,0.085mmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)物濃縮，經(jīng)hplc純化，得到20mg24i(38％產(chǎn)率)。hplc純化條件:柱子:sunfire30x100mm5um柱；有機(jī)溶劑:acnw/7.5％tfa；水性溶劑:h2ow/7.5％tfa；流速:75ml/min.梯度:45-70％h2o/accn；時(shí)間:9.5min。檢測:elsd(蒸發(fā)激光散射檢測器)作為檢測。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在1.55min顯示出峰。質(zhì)量為434.3(m+na+)。制備24j向24h(20mg,8.05μmol)在0.5mldcm中的溶液中加入tea(4.5μl,32μmol)，然后加入24i(6.62mg,16μmol)和dmap(3.93mg,32μmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢柽^夜。然后加入0.5ml2nmenh2/meoh用于脫保護(hù)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢柙俅芜^夜。反應(yīng)物濃縮，加入丙酮以沉淀出產(chǎn)物和除去過量試劑和脂質(zhì)，得到12mg24j(64％產(chǎn)率)。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在0.69min顯示出峰。質(zhì)量為1166.9(m/2+h+)。制備24k步驟1:apociiisirna[sirna至基因apociii(還稱為apoc3或apoc3)，采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法合成]：退火寡核苷酸通用操作在離心機(jī)中簡單旋轉(zhuǎn)每種寡核苷酸沉淀，以高濃度(每100ml緩沖液1-10od260)溶于duplex緩沖液(100mm乙酸鉀；30mmhepes,ph7.5)中?？梢允褂眉訜?高至94℃)和渦旋以促進(jìn)重新混懸。然后以等摩爾量一起加入正義鏈和反義鏈。然后將混合的寡核苷酸加熱至94℃，逐漸冷卻下來。對于具有顯著的二級結(jié)構(gòu)的序列，可以采用更逐漸的冷卻/退火步驟。這容易地通過將寡溶液置于水浴或加熱塊中并拔下插座/關(guān)閉機(jī)器來進(jìn)行。所得產(chǎn)物將是穩(wěn)定的雙鏈形式，可以于4℃儲存或冷凍。apociiisirna的反義鏈包含apociii的序列，其中鏈的3’端終止于磷酸酯基并以5’至3’順序進(jìn)一步包含核糖醇、其它磷酸酯基和3’端帽x058、即下式的非核苷酸3’端帽：正義鏈包含與反義鏈互補(bǔ)的apociii序列，其中鏈的3’端終止于磷酸酯基并以5’至3’順序進(jìn)一步包含核糖醇、其它磷酸酯基和3’端帽c6oh、即下式的非核苷酸3’端帽：apociiisirna與2-二甲氧基三苯甲基氧基甲基-6-芴基甲氧基羰基氨基-己烷-1-琥珀?；?長鏈烷基氨基-cpg(glenresearch目錄號20-2957)反應(yīng)，生成產(chǎn)物24k1。步驟2將apociiisirna(24k1:401μl,11.2mm在h2o中,4.49μmol)與401μldmf混合，得到澄清溶液。然后加入tea(180μl,0.25m在dmf中,45μmol)，然后加入bcn-nhs(碳酸(1r,8s,9s)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯n-琥珀酰亞氨基酯)(9.16mg,31μmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)物用h2o稀釋至10ml，用乙酸乙酯萃取3次。分離水層，濃縮至～5ml，經(jīng)pd-10脫鹽柱純化(gehealthcare).制備24將24j(5.8mg,2.5μmol)加入105μl化合物24k(apoc3sirna9.5mm在h2o中,0.993μmol)中。1小時(shí)后，反應(yīng)物變得粘稠。所以加入另外的60μlh2o，將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)物用h2o稀釋，經(jīng)hplc純化，得到5mg綴合物24(57％產(chǎn)率)。hplc純化條件:柱子:xselectprep苯基己基5umobd19x50mm；有機(jī)溶劑:用100mmtea.hoac改性的accn；水性溶劑:用100mmtea.hoac改性的h2o；梯度:5-50％accn/h2o；時(shí)間:10min。在lc-ms方法h下，在去卷積后，產(chǎn)物在5.96min顯示出峰，預(yù)期質(zhì)量為8896。參比實(shí)施例3:與galnac綴合的sirna按照實(shí)施例24的方法制得參比實(shí)施例3(用galnac3-n3(如下)代替24j)。galnac3-n3的制備制備中間體2將化合物1(2.06g,1.07mmol)溶于20ml乙醇中，加入tfa(82ul,1.07mmol)，然后加入10％pd/c(0.114g,0.11mmol)。將反應(yīng)物在h2氣囊下處理6小時(shí)。反應(yīng)物過濾,用乙醇洗滌，濃縮，得到白色固體，將其直接用于下一步驟。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在0.81min顯示出峰。質(zhì)量為898.5(m/2+h+)。制備中間體3將化合物2(4.848g,0.479mmol)溶于10ml無水dmf中，加入4-疊氮基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基-酯(0.325g,1.436mmol)，然后加入dipea(0.418ml,2.394mmol)。使反應(yīng)物于室溫反應(yīng)過夜。將反應(yīng)物不經(jīng)加熱進(jìn)行濃縮、直接上樣到預(yù)平衡的sio2柱和用0-20％甲醇/dcm不連續(xù)梯度進(jìn)行純化，得到2.383g化合物3(49.25％產(chǎn)率)。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在1.27min顯示出峰。質(zhì)量為953.7(m/2+h+)。制備中間體4將化合物3(1.33g,0.70mmol)與menh2(17.45ml,2.0m在甲醇中,34.9mmol)混合。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。lc-ms僅顯示出產(chǎn)物峰。將反應(yīng)物濃縮。然后將固體重新溶于乙醇中，用丙酮沉淀，得到1.0g化合物4(94％產(chǎn)率)。在lc-ms方法i下，產(chǎn)物在0.53min顯示出峰。質(zhì)量為764.5(m/2+h+)。實(shí)施例25:載體蛋白(crm197)與脂肪酸的綴合步驟1:2-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧雜-5-氮雜四十烷-40-基)氨甲酰基)-2-十一烷基十三烷二元酸(25a)將t-boc-n-酰氨基胺(100mg,0.155mmol,quantabiodesign)和中間體5(80mg,0.148mmol)溶于thf(3ml)中，在氮?dú)庀掠谑覝財(cái)嚢琛?0分鐘后，加入dipea(0.05ml,0.286mmol)，將應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢柽^夜。通過lcms觀察到反應(yīng)完全(酸性洗脫劑a:水+0.05％三氟乙酸,洗脫劑b:acn,柱sunfirec183.5μm3.0x30mm-40℃,5-95％梯度2分鐘,保留時(shí)間1.92min)。將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，然后溶于約1.5ml乙腈中。在ms-觸發(fā)的hplc上純化(sunfire30x50mm5um柱acn/h2ow/0.1％tfa75ml/min1.5ml進(jìn)樣體積,65-95％acn3.5min梯度,保留時(shí)間3.23分鐘)，匯集級分并冷凍干燥，得到85mg干凈的產(chǎn)物，54％產(chǎn)率。澄清油lcms:方法drt＝1.18min,m+h1070.1；1hnmr(400mhz,乙腈-d3)δppm0.82-1.03(m,1h)1.11-1.37(m,10h)1.37-1.51(m,2h)1.51-1.64(m,1h)1.69-1.82(m,1h)1.90-2.04(m,66h)2.05-2.21(m,8h)2.21-2.42(m,1h)3.17-3.28(m,1h)3.40-3.68(m,13h)。步驟2:2-((35-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧雜三十五烷基)氨甲?；?-2-十一烷基十三烷二元酸(25b)。將25a(5mg,4.68μmol)溶于dcm(體積:2ml)中，然后加入三氟乙酸(25μl,0.324mmol)。將反應(yīng)混合物于室溫在氮?dú)夥諊聰嚢杓s2小時(shí)。通過lcms觀察到轉(zhuǎn)化完全(酸性洗脫劑a:水+0.05％三氟乙酸,洗脫劑b:acn,柱sunfirec183.5μm3.0x30mm-40℃,5-95％梯度2分鐘,保留時(shí)間1.45min)。將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，然后用dcm沖洗，再次濃縮3次。溶于乙腈和dmso的混合物中。在ms-觸發(fā)的hplc上純化(sunfire30x50mm5um柱acn/h2ow/0.1％tfa75ml/min1.5ml進(jìn)樣體積,45-70％acn3.5min梯度,保留時(shí)間2.50分鐘)，匯集級分并冷凍干燥，得到2.5mg干凈的產(chǎn)物，55％產(chǎn)率。澄清油。方法art＝1.45min,m+h969.9；1hnmr(400mhz,乙腈-d3)δppm0.62-0.91(m,2h)0.91-1.10(m,3h)1.10-1.31(m,18h)1.46(quin,j＝7.21hz,2h)1.59-1.89(m,35h)1.94-2.09(m,1h)2.16(t,j＝7.40hz,2h)2.97-3.11(m,1h)3.24-3.37(m,1h)3.37-3.61(m,28h)3.61-3.89(m,2h)7.85(br.s.,1h)。步驟3:2-(((s)-5-(3-氨基-3-氧代丙基)-3,6-二氧代-1-苯基-2,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧雜-4,7-二氮雜四十二烷-42-基)氨甲?；?-2-十一烷基十三烷二元酸(25d)。將25b(20mg,0.018mmol)在thf(體積:2ml)中的溶液加入z-l-gln-osu25c(santacruzbiotechnology,cas34078-85-8,11mg,0.029mmol)中，然后加入dipea(75μl,0.429mmol)。于室溫在氮?dú)夥諊聰嚢柽^周末。通過lcms觀察到轉(zhuǎn)化完全(酸性洗脫劑a:水+0.05％三氟乙酸,洗脫劑b:acn,柱sunfirec183.5μm3.0x30mm-40℃,5-95％梯度2分鐘,保留時(shí)間1.77min)。將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，然后溶于乙腈中。在ms-觸發(fā)的hplc上純化(sunfire30x50mm5um柱acn/h2ow/0.1％tfa75ml/min1.5ml進(jìn)樣體積,55-80％acn3.5min梯度,保留時(shí)間2.70分鐘)，匯集級分并冷凍干燥，得到10.5mg干凈的產(chǎn)物，46％產(chǎn)率，為澄清無色油狀物。方法crt＝1.60min,m+h1232.4；1hnmr(400mhz,乙腈-d3)δppm0.67-0.93(m,2h)0.93-1.10(m,2h)1.10-1.32(m,15h)1.45(quin,j＝7.24hz,1h)1.59-1.69(m,1h)1.75-1.93(m,30h)1.94-2.21(m,20h)3.23(quin,j＝5.26hz,1h)3.28-3.51(m,23h)3.95(td,j＝7.73,5.44hz,1h)4.92-5.22(m,1h)5.78(br.s.,1h)6.13-6.42(m,1h)6.88(br.s.,1h)7.20-7.36(m,2h)7.42(t,j＝5.07hz,1h)。步驟4：具有脂肪酸的crm197的tg酶介導(dǎo)的標(biāo)記向25d在100mmtris緩沖液ph8(8mg/ml,203μl,1.316μmol)中的溶液中加入crm197(33mg/ml,1.515μl,0.00086μmol)，然后加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(ajinomoto)在pbs(50mg/ml,0.455μl,0.00060μmol)中的溶液。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?6小時(shí)。采用10kdamwcoamicon離心過濾器通過稀釋和離心反應(yīng)物5次至100μl體積將反應(yīng)混合物交換入100mmtris緩沖液ph8中。lcms分析顯示轉(zhuǎn)化為+1,+2,+3和+4產(chǎn)物。lcmsqt2；蛋白質(zhì)_35-70kda_3min:rt＝1.45min；ms[m+25d]:實(shí)測值:59625,計(jì)算值:59624；ms[m+(2x25d)]:實(shí)測值:60839,計(jì)算值:60838；ms[m+(3x25d)]:實(shí)測值:62054,計(jì)算值:62052；ms[m+(4x25d)]:實(shí)測值:63270,計(jì)算值:63266。crm197序列:gaddvvdssksfvmenfssyhgtkpgyvdsiqkgiqkpksgtqgnydddwkefystdnkydaagysvdnenplsgkaggvvkvtypgltkvlalkvdnaetikkelglslteplmeqvgteefikrfgdgasrvvlslpfaegsssveyinnweqakalsveleinfetrgkrgqdamyeymaqacagnrvrrsvgsslscinldwdvirdktktkieslkehgpiknkmsespnktvseekakqyleefhqtalehpelselktvtgtnpvfaganyaawavnvaqvidsetadnlekttaalsilpgigsvmgiadgavhhnteeivaqsialsslmvaqaiplvgelvdigfaaynfvesiinlfqvvhnsynrpayspghktqpflhdgyavswntvedsiirtgfqgesghdikitaentplpiagvllptipgkldvnkskthisvngrkirmrcraidgdvtfcrpkspvyvgngvhanlhvafhrsssekih標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％rt(min)crm19758410n/a0n/acrm197+125d5962459625141.45crm197+225d6083860839231.45crm197+325d6205262054351.45crm197+425d6326663270281.45肽譜實(shí)驗(yàn)概述:肽譜消化：將5μg經(jīng)修飾的crm197和陽性對照crm197樣品用20mmdtt還原和用1/30(w/w)酶/蛋白質(zhì)、用胰蛋白酶于26℃消化過夜。將等分試樣的經(jīng)胰蛋白酶消化的蛋白質(zhì)進(jìn)一步用gluc酶以1/20酶/蛋白質(zhì)比例于26℃消化4小時(shí)；注，所有酶購自rochediagnostics(gmbh,德國)。反相l(xiāng)c-ms/ms分析：將所產(chǎn)生的經(jīng)消化的肽通過液相色譜法電霧化串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-esims/ms)在與agilentcaplc(santaclara,ca)偶聯(lián)的thermoltqorbitrapdiscovery(thermofisherscientificinc.,waltham,ma)上進(jìn)行分析。在40℃柱子上裝載～10-15pmole的crm對照和經(jīng)修飾的crm197消化物(watersacuitybehc18,1.7μm,1x100mm柱)。運(yùn)行80min，總梯度為在0-1min開始10μl/min、4％b、在1.1min升至7％b、在55min45％b、然后在63min95％b，然后洗滌和柱平衡。質(zhì)譜儀參數(shù)包括采用ftms分析儀在30000分辨率從m/z300-2000達(dá)30ms的全掃描事件。在離子收集分析儀中在7個(gè)最強(qiáng)的離子(包括1+離子)上進(jìn)行了碰撞誘導(dǎo)解離ms/ms，于500(對于所有事件)信號強(qiáng)度閾值為30ms。數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)庫檢索:在qualbrowserv2.0.7(thermoscientific)中進(jìn)行所有質(zhì)譜法。采用msdecontools(r.d.smithlab,ppnl)產(chǎn)生了mascotgeneric文件(mgf)，采用mascotv2.3.01(matrixscienceinc.,boston,ma)數(shù)據(jù)庫檢索針對加至內(nèi)部慣例數(shù)據(jù)庫的所提供的蛋白質(zhì)和swissprot數(shù)據(jù)庫(具有513,877個(gè)序列的v57)用于污染蛋白質(zhì)進(jìn)行了檢索。檢索參數(shù)包括：酶：半胰蛋白酶或胰蛋白酶/glu-c，允許一直到三個(gè)錯(cuò)切割；可變的修飾：將小分子的預(yù)期質(zhì)量(362.147787da和463.206698da)加至稱為“crmtg酶+炔362damod(ckr),crmtg酶+炔362damod(n-term),crmtg酶+疊氮化物463damod(ckr),crmtg酶+疊氮化物463damod(n-term)”的數(shù)據(jù)庫；肽容許:±20ppm；ms/ms容許:±0.6da。在離子評分>95％置信度上進(jìn)行序列覆蓋和小分子修飾評價(jià)。然后選擇高評分的肽離子用于采用qualbrowser進(jìn)行手工ms/ms分析。賴氨酸修飾發(fā)生的位置可以按照上述譜實(shí)驗(yàn)來確定。根據(jù)2014年7月11日提交的美國申請?zhí)?015/0017192(律師案卷號pat055641-us-np)中對crm197記載的類似綴合物，我們外推出：修飾發(fā)生在lys37或lys39、lys33和lys440。實(shí)施例26a:催產(chǎn)素衍生物和脂肪酸的綴合步驟1：在樹脂上的被保護(hù)的催產(chǎn)素的制備類似于實(shí)施例21b步驟1合成了在樹脂上的催產(chǎn)素的被保護(hù)的形式(26a1)。步驟2：烯丙基脫保護(hù)、環(huán)化、從樹脂上裂解將被保護(hù)的中間體(26a1)(0.2mmol)加入6ml含苯基甲硅烷(1mmol)和pd(pph3)4(0.02mmol)的dcm中。將樹脂在該溶液中攪拌15分鐘，然后過濾。用苯基甲硅烷/pd(pph3)4在dcm中的溶液重復(fù)該過程兩次。最后攪拌后，將樹脂過濾，用nmp(3次)、dcm(3次)、0.5％diea/dcm(3次)和最后用nmp(3次)洗滌。將所得的經(jīng)洗滌的樹脂在真空下干燥。將一部分干燥的樹脂(～0.1mmol)加入pybop(0.2mmol)、hobt(0.4mmol)和diea(0.5mmol)在6mlnmp中的溶液中。將該反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?0小時(shí)。將樹脂過濾，用etoac(3次)和dcm(3次)洗滌。然后將樹脂加入4ml95/2.5/2.5tfa/tips/h2o中，振蕩2小時(shí)、然后將tfa/tips/h2o溶液過濾溶入冷(<-20℃)et2o中以沉淀出切割的肽。離心后，傾析出et2o，將灰白色殘余物用et2o洗滌，再次離心。將所得灰白色固體在n2下干燥過夜。將該固體在質(zhì)量觸發(fā)的預(yù)備型hplc上純化(watersautopurehplcsystem；sunfirec1830x50mm5um柱；流動(dòng)相:7.5-20％acn水溶液,5min梯度,75ml/min,用0.1％tfa改性)。將相應(yīng)于中間體(26a2)的級分合并、冷凍和冷凍干燥至白色固體(13.5mg,14％).hrms-分析方法g:rt＝0.90mins,msm/z988.5225[m+h]+。步驟3:綴合至脂肪酸向中間體(26a2)(2.82μmol)在0.5mlph＝6.40磷酸鹽緩沖液中的溶液中加入i-37(8.39μmol)在0.5mlph＝6.40磷酸鹽緩沖液中的溶液。將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?8小時(shí)。然后經(jīng)4.5μmfrit過濾反應(yīng)混合物，在質(zhì)量觸發(fā)的預(yù)備型hplc上純化(watersautopurehplcsystem；sunfirec1830x50mm5um柱；流動(dòng)相:45-70％acn水溶液,5min梯度,75ml/min,用0.1％tfa改性)。將相應(yīng)于催產(chǎn)素-fa綴合物(26a)的級分合并、冷凍和冷凍干燥至白色固體(1.71mg,24％).lcms-分析方法g:rt＝3.07mins,msm/z2540.5[m+h]+。實(shí)施例26b:催產(chǎn)素衍生物和脂肪酸的綴合按照上述實(shí)施例26a步驟3，通過如下反應(yīng)可以制備上述實(shí)施例(26b)：使*丁酸酯-tyr-ile-gln-asn-cys*-gly(n-ch2ch2ch2nh2)-leu-gly-nh2*＝硫化物鍵(26b1):(26b1)與中間體i-37反應(yīng)。環(huán)肽(26b1)通過修改wisniewski等人,j.med.chem.(2014),575306-5317中公開的實(shí)施例41的方法制得，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。在1mmolfmoc-rinkamideams樹脂上經(jīng)由fmoc化學(xué)手工合成了肽。用于氨基酸的保護(hù)基為：叔丁基基團(tuán)用于tyr，trt基團(tuán)用于gln和asn。使用了兩種不尋常的氨基酸fmoc-cys(ch2ch2ch2co2烯丙基)-oh和fmoc-[nα-ch2ch2ch2nh(boc)]gly-oh。在樹脂上通過反復(fù)除去fmoc保護(hù)基和在dmf中偶聯(lián)被保護(hù)的氨基酸(3eq)裝配了肽鏈。使用hbtu和hobt(3eq:3eq)作為偶聯(lián)試劑；n-甲基嗎啉(nmm,6eq)用作堿。哌啶在dmf中的20％溶液(3倍于樹脂體積)用作脫-fmoc試劑。在每次偶聯(lián)和脫-fmoc后將樹脂通過dmf洗滌(3倍于樹脂體積)；在每次偶聯(lián)后進(jìn)行茚三酮試驗(yàn)以檢測偶聯(lián)效率。在除去最后的fmoc保護(hù)基后，將樹脂用乙醚洗滌，在真空下干燥。通過pd(pph3)4/5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮(1eq/10eq)在dcm/thf(1/1,10倍于樹脂體積)中在樹脂上選擇性地除去烯丙基酯保護(hù)基達(dá)3小時(shí)。將樹脂用dmf(3x)洗滌，然后通過二乙基二硫代氨甲酸鈉在dmf中的0.5％溶液(5x)洗滌。最后，通過hctu/nmm(3eq/6eq)在dmf中進(jìn)行樹脂上環(huán)化。將樹脂洗滌，在真空下干燥，得到3.2克肽樹脂，將其于室溫用32mltfa/tis/dot/h2o(92.5/2.5/2.5/2.5,v/v)處理3小時(shí)以除去側(cè)鏈保護(hù)基和從樹脂上切割肽。從冷醚中沉淀出肽粗品，然后過濾收集，在高真空下干燥。產(chǎn)量：1.15g(116％)。將所有肽粗品在2-英寸c18柱上用tfa緩沖液(緩沖液a,0.1％tfa水溶液；緩沖液b,乙腈)純化。將所匯集的純度>95％的級分冷凍干燥至干。獲得84mg最終的肽(tfa鹽)。ms:991.6[m+h]+,hplc保留時(shí)間9.49min(方法:流速1.2ml/min；緩沖液a:0.1％tfa水溶液；緩沖液b:tfa在乙腈中的0.1％溶液；室溫；柱:discovery,c18,4.6mmx250mm,5micro；梯度(線性)15％-35％緩沖液b,20mins；進(jìn)樣體積0.02ml)實(shí)施例27:野灰蛋白相關(guān)性蛋白(agrp)-脂肪酸綴合物agrp(83-132)-fa綴合物：實(shí)施例27a：agrp的單脂肪酸綴合物(agrp+1fa)，其中脂肪酸經(jīng)由連接基(peg)連接至agrp的n-末端。其中agrp(83-132)具有如下序列：ser-ser-arg-arg-cys-val-arg-leu-his-glu-ser-cys-leu-gly-gln-gln-val-pro-cys-cys-asp-pro-cys-ala-thr-cys-tyr-cys-arg-phe-phe-asn-ala-phe-cys-tyr-cys-arg-lys-leu-gly-thr-ala-met-asn-pro-cys-ser-arg-thr；其在位置c87&c102、c94&c108、c101&c119、c105&c129、c110&c117橋處含有5個(gè)二硫橋。實(shí)施例27b：agrp(83-132)的二脂肪酸綴合物(agrp+2fa)，其中一個(gè)脂肪酸經(jīng)由連接基(peg)連接至agrp的n-末端(即絲氨酸83)和其它脂肪酸經(jīng)由peg連接基連接至121位的賴氨酸的側(cè)鏈。向0.90mlagrp(83-132)(可獲自r&dsystemstm)在ph4.5檸檬酸鹽緩沖液(9mg,1.585μmol)中的10mg/ml溶液中加入0.80mlph＝4.43乙酸鹽緩沖液，然后加入1.30mli-37在h2o中的10mg/ml溶液(13mg,7.79μmol)。將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?6小時(shí)。hrms(qt2)顯示了存在agrp+1fa,m/z7226.3[m+h]+,1.89min和agrp+2fa,m/z8778.4[m+h]+,2.41min兩者。將反應(yīng)物經(jīng)4.5μmfrit過濾，與上述第二個(gè)反應(yīng)物(0.881μmolagrp,2.64μmoli-37)合并，在預(yù)備型hplc上純化(watersautopurehplcsystem；watersproteinbehc4柱,300埃,5um,10x250mm；流動(dòng)相:20-80％acn水溶液,11min梯度,10ml/min,用0.1％tfa改性；運(yùn)行時(shí)間:15min；級分收集:uv210nm)。分離相應(yīng)于agrp+1fa和agrp+2fa的級分，冷凍和冷凍干燥，得到agrp+1fa(27a)和agrp+2fa(27b)的tfa鹽，為白色固體(3.24mg,16％agrp+1fa；2.26mg,9％agrp+2fa)。lcms-分析方法g:(agrp+1fa)rt＝1.91mins,msm/z7226.4[m+h]+；(agrp+2fa)rt＝2.43mins,msm/z8778.4[m+h]+。標(biāo)記實(shí)驗(yàn)以確定脂肪酸的連接位置按照生產(chǎn)商的方案通過將反應(yīng)混合物用asp-n(promega)消化確認(rèn)了n-末端ser殘基的標(biāo)記。采用偶聯(lián)有brukermaxisimpactq-tof質(zhì)譜儀的thermodionexultimate3000lc進(jìn)行了所有肽譜分析。分離在保持在40℃的acquityuplcbeh130c18柱(2.1x150mm,1.7μm,waters)上進(jìn)行。流速為0.1ml/min，采用0.1％fa水溶液作為流動(dòng)相a和fa在乙腈中的0.1％溶液作為流動(dòng)相b。將asp-n溶液(promegapart#v162a)用20ulhplc/ms水(0.1μg/μl)重構(gòu)。將約10μg樣品在6m脲、10mm二硫蘇糖醇、5mmedta和50mmtris_hcl(ph＝8.0)中稀釋至25μl的終體積。還原和烷基化后，將溶液用50mmtris_hcl(ph＝8.0)稀釋6次，然后用另外的1微克asp-n進(jìn)行蛋白酶解。消化于37℃進(jìn)行過夜。lcms分析表明，在野生型agrp和在每個(gè)片段上具有一個(gè)另外的脂肪酸的經(jīng)修飾的agrp的n-末端d位置處已經(jīng)發(fā)生了裂解，如下表所示。實(shí)施例28(28a、28b和28c)涉及hfgf23變體的綴合物。所用的fgf23變體該實(shí)施例中使用的和稱為“hfgf23(r179q)”、““hfgf23r179””或簡單地是“hfgf23”的人fgf23變體的序列在seqidno:10中提供。這種fgf23變體缺少信號肽，但是在1位具有恢復(fù)的m和在r179具有突變(r179q)。采用這種fgf23肽(實(shí)施例28c)制備了包含本文所述的脂肪酸的綴合物，其顯示出保留表8中的至少一種fgf23活性。在該實(shí)施例中還使用了人fgf23的兩種其它變體(實(shí)施例28a和28b)以構(gòu)建具有本文公開的脂肪酸的綴合物。像seqidno:10的肽一樣，它們?nèi)鄙賔gf23信號肽和在r179處具有突變，但是還具有一個(gè)或多個(gè)另外的突變，但是還保留至少一種fgf23活性。在該實(shí)施例中使用了這兩種fgf23變體，并且兩者稱為“hfgf23-變體”或“fgf23變體”等?？梢圆捎闷渌黤gf23肽、包括fgf23或其同系物、變體、片段或修飾形式使用產(chǎn)生本文所述的綴合物的方法。fgf23變體生成的方案轉(zhuǎn)化通過pet28c-hfgf23r179q表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞、在冰上孵育30分鐘、于42℃熱激45秒、添加soc培養(yǎng)基和將細(xì)菌于37℃振蕩器中孵育1小時(shí)制備了hfgf23(r179)多肽。然后，將細(xì)菌培養(yǎng)物鋪在含有卡那霉素的lb板上并于37℃孵育過夜。將所分離的集落轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，在振搖下于37℃孵育過夜，將25ml等分試樣轉(zhuǎn)移至新的含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃振搖約2.5小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞具有足夠的密度(od為～0.6)時(shí)，向各培養(yǎng)物中加入1miptg并于37℃繼續(xù)振搖以誘導(dǎo)多肽的表達(dá)。4小時(shí)后，將細(xì)胞通過于6000rpm離心10分鐘沉淀，將沉淀物于-20℃冷凍下來。隨后，將沉淀物重新混懸于溶解緩沖液(50mmtris,ph8,100mmnacl,0.1％tritonx-100)中，將細(xì)胞采用微流體化儀(microfluider)溶解。每100ml溶解混合料中加入10mg溶菌酶和10μldnase(1單位/ml,invitrogen)，于室溫溫育30min，然后于4℃以8000rpm旋轉(zhuǎn)20min，三次更換100ml溶解緩沖液和旋轉(zhuǎn)進(jìn)行洗滌，四次使用溶解緩沖液且不使用tritonx-100。將來自最終旋轉(zhuǎn)的沉淀物(包涵體的沉淀物)立即溶于50mmtris,ph7.4,6m胍,10mmdtt中，測定蛋白質(zhì)濃度，在重折疊前調(diào)整為1mg/ml。蛋白質(zhì)重折疊:為了重折疊蛋白質(zhì)，向每400ml溶解包涵體中加入368mg還原型谷胱甘肽(gssh)和74mg氧化谷胱甘肽(gssg)。將蛋白質(zhì)于4℃用4l50mmtris,ph8.0和250mm精氨酸透析過夜。然后移除2l透析緩沖液，用2l水替換，繼續(xù)透析另外8小時(shí)。然后將透析緩沖液換成20mmtris,ph8.0,50mmnacl,25mm精氨酸，繼續(xù)透析過夜。蛋白質(zhì)純化:為了純化蛋白質(zhì)，將透析混合物于12000rpm旋轉(zhuǎn)30min，將上清液上樣到用最終透析緩沖液平衡的肝素-sepharose柱子上，將柱子用20x床體積的1xpbs洗滌。將重折疊蛋白質(zhì)用補(bǔ)充有0.5mnacl的1xpbs洗脫，蛋白質(zhì)純度通過sds-page膠評價(jià)，蛋白質(zhì)濃度通過在280nm波長的od測定。實(shí)施例28a：hfgf23變體與脂肪酸的綴合其中hfgf23變體-nh2-中的-nh2指賴氨酸殘基的氨基官能團(tuán)。步驟1:中間體28a將5-氨基-2-(((芐基氧基)羰基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(0.5g,1.325mmol)溶于dmf(體積:9.96ml)中，加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酸叔丁基酯(0.503ml,2.120mmol)。向混合物中加入dipea(0.274g,2.120mmol)，將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)，此時(shí)lcms分析顯示形成預(yù)期產(chǎn)品和消耗zq-nhs起始物質(zhì)(方法a,rt＝0.98min,m+h511.4)。將反應(yīng)混合物倒入dcm(100ml)中，用冰水(3x50ml)洗滌。有機(jī)層經(jīng)na2so4干燥，過濾和濃縮，得到1.14g黃色油狀物。lcms分析指示了預(yù)期產(chǎn)品的存在(方法m,rt＝1.82min,m+h511.4,1.14g)。將物質(zhì)未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步驟。步驟2:中間體28b,(5-氨基-1-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-1,5-二氧代戊烷-2-基)氨甲酸芐基酯將三氟乙酸(10ml,2.233mmol)加入中間體28a(1.14g,2.233mmol)中，于室溫?cái)嚢杓s1小時(shí)。lcms分析顯示起始物質(zhì)完全轉(zhuǎn)化為預(yù)期產(chǎn)品(方法a,rt＝0.56min,m+h411.3)。將反應(yīng)混合物加入dcm(30ml)中，濃縮至油狀物兩次。將油狀物用1mlacn和1mlmeoh稀釋，經(jīng)ms-觸發(fā)的hplc純化(方法n)。匯集具有預(yù)期質(zhì)量的級分、冷凍并冷凍干燥，得到中間體28b，為白色粉末(方法o,rt＝0.22min,m+h411.3,160mg,18％)步驟3:中間體28c將中間體28b(19.69mg,0.048mmol)溶于dmf(0.5ml)中，加入中間體37(50mg,0.030mmol)在dmf(1.0ml)中的溶液中。加入3滴dipea，將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)，此時(shí)lcms分析顯示完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(方法b,rt＝1.22min,m+h+2/2982.9)。將反應(yīng)混合物上樣到20gc-18柱用于反相色譜法。采用歷經(jīng)20分鐘從100％水(0.1％tfa)至100％mecn的溶劑梯度，收集級分并通過lcms分析。合并具有預(yù)期質(zhì)量的級分，冷凍并冷凍干燥過夜，得到中間體28c，為澄清無色油狀物(方法c,rt＝1.21min,m+h+2/2982.9,m+h+3/3655.5,15.3mg,26％)。暫時(shí)解釋的1h-nmr指示了存在在6.29ppm(1h,brm)形成的酰胺鍵。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ7.52(s,1h),7.35(d,j＝3.3hz,5h),5.10(s,2h),4.30(s,1h),3.77(t,j＝5.8hz,2h),3.69-3.49(m,94h),3.46(s,4h),2.59(s,3h),2.32(t,j＝7.2hz,25h),2.08-1.94(m,4h),1.79-1.65(m,2h),1.65-1.52(m,2h),1.40-1.06(m,31h),0.94-0.82(m,3h)。步驟4：hfgf23-變體+中間體28c對于該步驟，使用了人fgf23(hfgf23)變體(“hfgf23-變體”)，其缺少信號肽，但是相對于seqidno:8具有一個(gè)或多個(gè)突變，但是保留至少一種fgf23活性，并且其中“fgf23-變體-nh2”中的“-nh2”指賴氨酸殘基的氨基官能團(tuán)。制備了tg酶在30mmmesph6中的50mg/ml溶液和中間體28c在30mmmesph6緩沖液中的8mg/ml溶液。脂肪酸溶液在mesph6中變得渾濁。向hfgf23-變體(0.3mg/ml,在30mmmesph6中,7.5ml,0.088μmol)中加入中間體28c(217μl,0.883μmol)、然后加入tg酶(33.5μl,0.044μmol)。將反應(yīng)物于室溫混合18小時(shí)，加入另外217μl中間體28c。將反應(yīng)物于室溫混合18小時(shí)，加入另外的217μl中間體28c。反應(yīng)物于室溫混合18小時(shí)，加入另外的108.5μl中間體28c。反應(yīng)物于室溫混合4小時(shí)，此時(shí)lcms分析顯示起始物質(zhì)完全轉(zhuǎn)化(方法p,rt＝1.55min,m+h27432)。將反應(yīng)混合物分在兩個(gè)4ml10kdamwcoamicon離心過濾器之間，用30mmmesph6緩沖液進(jìn)行緩沖液更換3x，然后濃縮至1.5ml。將物質(zhì)在冰箱中儲存過夜。一些固體沉積在試管底。通過a280測定上清液濃度(18730cm-1m-1,25485g/mol)為0.43mg/ml(27％)。實(shí)施例28b：hfgf23-變體與zqg-peg11-脂肪酸的綴合對于該實(shí)施例，制備了包含脂肪酸和fgf23變體的綴合物，所述變體缺少信號肽和相對于seqidno:8具有一個(gè)或多個(gè)突變，但是所述變體保留至少一種fgf23活性。其中hfgf23-變體-nh2中的-nh2指賴氨酸殘基的氨基官能團(tuán)。在100mmph8tris緩沖液中制備中間體25d的8mg/ml溶液。在h2o中制備tg酶的50mg/ml溶液。向hfgf23-變體的溶液(6.5ml,0.090μmol)中加入中間體25d(0.207ml,1.343μmol)、然后加入tg酶(0.136ml,0.179μmol)。將反應(yīng)物于室溫混合3天，觀察到90％轉(zhuǎn)化為+1品種(lcms方法q,rt＝7.24min,m+h26616)。采用10kdamwcoamicon離心過濾器通過稀釋和離心反應(yīng)物6次至2ml體積將反應(yīng)混合物交換入pbs1x緩沖液中。通過a280(18730cm-1m-1,26617g/mol)測定濃度為0.125mg/ml(lcms方法q,rt＝7.24min,m+h26616)。實(shí)施例28c：h-fgf23r179+zqg-peg11-脂肪酸的綴合對于該實(shí)施例，采用fgf23變體“hfgf23r179”制備了綴合物。其缺少信號肽和在r179具有突變。該序列提供為seqidno:10。計(jì)算質(zhì)量:25463在100mmph8tris緩沖液中制備中間體25d的8mg/ml溶液。在h2o中制備tg酶的50mg/ml溶液。向hfgf23r179溶液(2.50e+04μl,0.393μmol)中加入中間體25d(750μl,4.87μmol)、然后加入tg酶(597μl,0.785μmol)。將反應(yīng)物于室溫混合2天，此時(shí)lcms分析顯示起始物質(zhì)完全轉(zhuǎn)化(方法p,rt＝1.58min,m+h26674)。將反應(yīng)混合物經(jīng)離子交換色譜法純化，得到+1綴合物(方法r,rt＝3.87min,m+h26674):其中hfgf23r179-nh2中的-nh2指賴氨酸殘基的氨基官能團(tuán)。實(shí)施例29a和29b涉及serelaxin的綴合物。實(shí)施例29a：serelaxin-脂肪酸綴合物(+1脂肪酸綴合物)serelaxin+zqg-peg11-脂肪酸(實(shí)施例25d):serelaxin序列:dswmeeviklcgrelvraqiaicgmstwscfralsrktcgvhccknalasyle和“serelaxin-nh2”中的-nh2指如通過如下譜實(shí)驗(yàn)所顯示的賴氨酸k17的側(cè)鏈處的反應(yīng)活性氨基官能團(tuán)；mw5963g/mol。在100mmtrisph8緩沖液中制備zqg-peg11-脂肪酸(實(shí)施例25d)的8mg/ml溶液。在h2o中制備mtg酶的50mg/ml溶液。向serelaxin(211μl,0.168μmol)在100mmtrisph8(1.018ml,0.5mg/ml反應(yīng)物)中的溶液中加入實(shí)施例25d(516μl,3.35μmol)、然后加入mtg酶(ajinomoto,255μl,0.335μmol)。將反應(yīng)物于37℃混合3天，然后加入另外的100μlzqg-peg11-脂肪酸。將反應(yīng)物于37℃混合18小時(shí)和然后采用10kdamwcoamicon離心過濾器通過稀釋和離心反應(yīng)物5次至0.7ml的體積交換入pbs1x緩沖液中。將物質(zhì)經(jīng)方法k純化，匯集含有預(yù)期物質(zhì)的級分，冷凍并冷凍干燥，得到白色粉末。將物質(zhì)溶于1ml30mmnaoac緩沖液ph5中，通過a280(5969cm-1m-1,7178g/mol)測定濃度為0.25mg/ml(25％)。lcms方法l:rt＝1.65min；ms[m+1+1fa]:實(shí)測值:7180,計(jì)算值:7178。serelaxin譜的實(shí)驗(yàn)操作樣品蛋白酶解在6m脲、10mm二硫蘇糖醇、5mmedta和50mmtris_hcl(ph＝8.0)中將約10μg蛋白質(zhì)溶解至25μl的終體積，于37℃維持1小時(shí)以還原二硫鍵。加入碘乙酰胺(500mm,1ul)以使游離硫醇烷基化，使溶液于室溫在暗處靜置1小時(shí)。然后將溶液用50mmtris_hcl(ph＝8.0)稀釋6x，加入lysc(1ug,promegav107a)，將溶液于37℃維持過夜以消化蛋白質(zhì)。加入甲酸(98％,2ul)以淬滅蛋白酶解，將所得肽混合物通過lc-ms/ms進(jìn)行分析。lc-ms/ms分析采用偶聯(lián)有brukermaxisimpactq-tof質(zhì)譜儀的thermodionexultimate3000hplc進(jìn)行了肽譜。ms采用brukercompassv.1.7和brukerotofcontrolv.3.4軟件進(jìn)行控制，具有如下儀器參數(shù)設(shè)置：質(zhì)量范圍300-2,000da；噴霧電壓4.0kv；毛細(xì)柱溫度200℃；干燥氣體流速5.0l/min。采用維持于40℃的watersacquityuplcbeh130c18柱(2.1x100mm,1.7μm)進(jìn)行分餾。流動(dòng)相為甲酸分別在水和乙腈中的0.1％溶液，流速為100ul/min。所用梯度為0-2min,2％b；2-3min,2％-8％b；3-10min,8％-29％b；10-14min,29％-33％b；14-16min,33％-37％b；16-20min,37％-73％b；20-22min,73％-95％b；22-25min,95％b；25-26min,95％-2％b；26-30min,2％b。采用brukerdataanalysisv.4.2進(jìn)行數(shù)據(jù)加工。譜實(shí)驗(yàn)表明，基于指定為[cchvgctk17(fa)rslarfc-2h2o]的肽，脂肪酸加成至serelaxin主要發(fā)生在賴氨酸k17，質(zhì)量:3088.56da,電荷:5,rt＝13.4min,實(shí)測m/z618.71,預(yù)期m/z618.72。實(shí)施例29b：serelaxin-脂肪酸綴合物(如下所示的+1fa、+2fa和+3fa綴合物的混合物)其中“serelaxin-nh2”中的-nh2指賴氨酸側(cè)鏈處的反應(yīng)活性氨基官能團(tuán)。serelaxin+中間體37：實(shí)施例29b作為如下混合物進(jìn)行測試標(biāo)記度計(jì)算值實(shí)測值％serelaxin596359643serelaxin+1fa7517751619serelaxin+2fa9071906952serelaxin+3fa106251062225序列：dswmeeviklcgrelvraqiaicgmstwscfralsrktcgvhccknalasylpe在h2o中制備了脂肪酸中間體37的10mg/ml溶液。向serelaxin(105μl,0.084μmol,4.75mg/ml)在30mmnaoac緩沖液ph4(755μl)中的溶液中加入脂肪酸中間體37(140μl,0.839μmol)。反應(yīng)物于室溫混合16小時(shí)，此時(shí)lcms分析顯示起始物質(zhì)90％轉(zhuǎn)化。加入另外的70μl中間體37，反應(yīng)物于室溫混合16小時(shí)，此時(shí)maldi分析表明>95％轉(zhuǎn)化。采用3kdamwcoamicon離心過濾器通過稀釋和離心反應(yīng)物4次至0.2ml體積將溶液交換至pbs1x緩沖液中。通過a280(5969m-1cm-1；9068g/mol)測定濃度為2.61mg/ml。lcms方法l:rt＝1.56min；ms[m+1+1fa]:實(shí)測值:7516,計(jì)算值:7517；rt＝1.65min；ms[m+1+2fa]:實(shí)測值:9069,計(jì)算值:9071；rt＝1.74min；ms[m+1+3fa]:實(shí)測值:10622,計(jì)算值:10625。實(shí)施例30：m-his-hpip與脂肪酸構(gòu)建體(i-37)的綴合-(如上所示的+1fa綴合物和+2fa綴合物的混合物)m-his-hpip(29-146)序列:mhhhhhhqdntrkiiiknfdipksvrpndevtavlavqtelkecmvvktylissiplqgafnykytaclcddnpktfywdfytnrtvqiaavvdvirelgicpddaavipiknnrfytieilkve(seqidno：13)表達(dá)形式表達(dá)蛋白質(zhì)序列:metdtlllwvlllwvpgstgmhhhhhhqdntrkiiiknfdipksvrpndevtavlavqtelkecmvvktylissiplqgafnykytaclcddnpktfywdfytnrtvqiaavvdvirelgicpddaavipiknnrfytieilkve核苷酸序列:gctagccaccatggagactgatactttgttgttgtgggtactgttgctttgggtgcccggtagtaccggtatgcatcaccaccaccatcaccaggacaacacccggaagatcatcatcaagaacttcgacatccctaagagcgtgcgcccaaacgatgaagtcaccgcggtgctggcagtgcagactgagctgaaggagtgcatggtggtcaagacgtacctgatttcgtccatcccgctgcaaggcgccttcaactacaagtacactgcctgcctctgtgacgacaaccccaagaccttttactgggacttctacaccaatagaactgtccagattgctgccgtggtggatgtgatcagggaattgggaatttgccccgacgatgcggccgtgattccgatcaagaacaaccgcttctataccatcgagatccttaaagtggaatgagaattcpip表達(dá)載體：通過標(biāo)準(zhǔn)克隆方法產(chǎn)生了編碼人pip的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。對含有鼠igκ鏈信號序列、繼之以mhhhhh序列、然后是具有5’-nhei(繼之以kozak序列)和3’-ecori位點(diǎn)的成熟pip的片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化和合成(dna2.0)。然后將該序列克隆入cmv啟動(dòng)子的下游的基于pcdna3.1(invitrogen)的載體的獨(dú)特5’-nhei和3’-ecori位點(diǎn)。pip表達(dá)和純化:采用標(biāo)準(zhǔn)聚乙烯亞胺方法，以1x106個(gè)細(xì)胞/ml將pip表達(dá)質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染至hek293t細(xì)胞中。然后將500ml培養(yǎng)物在3l燒瓶中在freestyle293medium(lifetechnologies)中于37℃、8％co2的濕潤氣氛下生長。從澄清的條件培養(yǎng)基中純化pip蛋白質(zhì)。其中m-his-pip具有seqidno:12且“m-his”是mhhhhhh。綴合物:在h2o中制備了脂肪酸-連接基構(gòu)建體#1的10mg/ml溶液。將m-his-hpip(0.700ml,0.048μmol)用30mmnaoac緩沖液ph4(619μl,0.5mg/ml反應(yīng)物)稀釋，加入中間體37(0.081ml,0.484μmol)。將反應(yīng)物于室溫混合18小時(shí)，此時(shí)lcms分析顯示70％轉(zhuǎn)化為+1(50％)和+2(20％)產(chǎn)物。然后采用3kdamwcoamicon離心過濾器通過稀釋和離心反應(yīng)物5次至350μl體積將物質(zhì)交換至pbs1x緩沖液中。通過a280(13850cm-1m-1,14472g/mol)測定濃度為1.7mg/ml(70％)。lcms方法l,rt＝1.46min；ms[m+1]:實(shí)測值:14472,計(jì)算值:14476.rt＝1.57min；ms[m+1+1fa去糖基化的]:實(shí)測值:16025,計(jì)算值:16030.rt＝1.69min；ms[m+1+2fa去糖基化的]:實(shí)測值:17578,計(jì)算值:17584。m-his-hpip+脂肪酸-連接基構(gòu)建體i-37：實(shí)施例30作為如下混合物進(jìn)行測試pip譜的實(shí)驗(yàn)操作樣品蛋白酶解將約10μg蛋白質(zhì)在6m脲、10mm二硫蘇糖醇、5mmedta和50mmtris_hcl(ph＝8.0)中溶解至25μl的終體積，于37℃維持1小時(shí)以還原二硫鍵。加入碘乙酰胺(500mm,1ul)以使游離硫醇烷基化，使溶液于室溫在暗處靜置1小時(shí)。然后將溶液用50mmtris_hcl(ph＝8.0)稀釋6x，加入lysc(1ug,promega)或胰蛋白酶/lysc混合料(1ug,promega)，將溶液于37℃維持過夜以消化蛋白質(zhì)。加入甲酸(98％,2ul)以淬滅蛋白酶解，將所得肽混合物通過lc-ms/ms進(jìn)行分析。lc-ms/ms分析采用偶聯(lián)有brukermaxisimpactq-tof質(zhì)譜儀的thermodionexultimate3000hplc進(jìn)行了肽譜。ms采用brukercompassv.1.7和brukerotofcontrolv.3.4軟件進(jìn)行控制，具有如下儀器參數(shù)設(shè)置：質(zhì)量范圍300-2,000da；噴霧電壓4.0kv；毛細(xì)柱溫度200℃；干燥氣體流速5.0l/min。采用維持于40℃的watersacquityuplcbeh130c18柱(2.1x100mm,1.7μm)進(jìn)行分餾。流動(dòng)相為甲酸分別在水和乙腈中的0.1％溶液，流速為100ul/min。所用梯度為0-2min,2％b；2-3min,2％-8％b；3-10min,8％-29％b；10-14min,29％-33％b；14-16min,33％-37％b；16-20min,37％-73％b；20-22min,73％-95％b；22-25min,95％b；25-26min,95％-2％b；26-30min,2％b。采用brukerdataanalysisv.4.2進(jìn)行數(shù)據(jù)加工。譜實(shí)驗(yàn)表明，脂肪酸加成至mh6-pip優(yōu)先發(fā)生在n-末端，如通過[fa-mhhhhhhqdntrk]所證實(shí),質(zhì)量:3265.76da,電荷:4,rt＝23.4min,實(shí)測m/z:817.44,預(yù)期m/z:817.45。低程度的脂肪酸加成發(fā)生在賴氨酸k42，如通過肽片段[svrpndevtavlavqtelk(fa)ecmvvk],質(zhì)量:4366.45da,電荷3,rt＝23.5min,實(shí)測m/z:1456.49,預(yù)期m/z:1456.49。在k42處加成脂肪酸阻斷了鄰近該賴氨酸的胰蛋白酶裂解，用于證實(shí)了加成位置。實(shí)施例31：采用點(diǎn)擊化學(xué)的npff與脂肪酸的綴合步驟1：npff點(diǎn)擊化學(xué)手柄(handle)的制備計(jì)算mh+1258.8向npff(alfaaesar,j66509,5mg,3.82μmol)在dmso(1ml)中的溶液中加入三乙胺(5.32μl,0.038mmol)，然后加入碳酸(1r,8s,9r)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(1.335mg,4.58μmol)。將反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢?。完成后，將反?yīng)混合物作為粗品用于下一反應(yīng)步驟。步驟2：綴合向步驟1的粗反應(yīng)混合物中加入中間體6(i-6)。將反應(yīng)混合物于室溫振搖。完成后，將反應(yīng)混合物采用反相色譜法純化(系統(tǒng)：agilentbioinertsystemdate；柱:watersproteinbehc4柱,300埃,5um,10x250mm；用于uplc方法開發(fā)的柱子是behc4m,300a,1.7um,2.1x50mm；流動(dòng)相:6min46-56％acn梯度,用0.1％tfa改性,a:水,b:乙腈；流速:2.0ml/min；運(yùn)行時(shí)間:15min；級分收集:uv210nm)，得到標(biāo)題化合物，為白色固體，為tfa鹽；lcms:方法s:elsd:rt1.46mins；msm/z928.3[(m/3)+h]+可以看出，本發(fā)明的綴合物與非綴合生物分子相比具有相似的或改善的效力，但是另外地，本發(fā)明的綴合物與非綴合生物分子相比具有改善的血漿穩(wěn)定性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上述實(shí)施例中的綴合物具有高于5小時(shí)、高于10小時(shí)、高于20小時(shí)、高于30小時(shí)、高于40小時(shí)和在一些情況中高于50小時(shí)的血漿穩(wěn)定性。已經(jīng)如此描述了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員注意的是，這些公開內(nèi)容僅是示例性的，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進(jìn)行各種其它替換、適應(yīng)和修改。因此，本發(fā)明不限于文中列舉的具體實(shí)施方案。當(dāng)前第1頁12