專利名稱：一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種神經(jīng)酸的生產(chǎn)方法，具體涉及一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法，屬于神經(jīng)酸基因生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
神經(jīng)酸，化學(xué)名順-15- 二十四碳單烯酸，是一種ω 9系的長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸，分子式為C24H46O2，相對(duì)分子質(zhì)量為366. 6，在常溫下為白色片狀晶體，能溶于醇，不溶于水，熔點(diǎn) 39 40 0C ο神經(jīng)酸，是大腦神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)組織中的重要成分，在哺乳動(dòng)物中，神經(jīng)酸廣泛分布于脊椎動(dòng)物組織的鞘脂中，其中神經(jīng)酸通過(guò)酰胺鍵與鞘胺醇結(jié)合。是動(dòng)物大腦的白質(zhì)和周圍神經(jīng)組織的重要組成成分。研究表明，神經(jīng)酸能促進(jìn)受損神經(jīng)組織修復(fù)和再生，是神經(jīng)細(xì)胞特別是大腦細(xì)胞、視神經(jīng)細(xì)胞、周圍神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、再發(fā)育和維持的必需營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)提高腦神經(jīng)的活躍程度、防止腦神經(jīng)衰老有重要作用。神經(jīng)酸可以作為多發(fā)性硬化癥、腎上腺髓質(zhì)萎縮癥、視神經(jīng)脊髓炎癥、急性彌漫性腦脊髓炎癥等脫髓鞘疾病以及^llweger綜合癥的輔助治療藥物或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。此外，研究還表明血清中神經(jīng)酸水平低與突發(fā)性感音神經(jīng)性聾有顯著關(guān)系。神經(jīng)酸水平與精神疾病密切相關(guān)。精神疾病，如精神分裂癥、精神病、注意力缺失等，患者的組織和血液中神經(jīng)酸的水平較低。神經(jīng)酸對(duì)與肥胖相關(guān)的代謝病患者、絕經(jīng)期后接受荷爾蒙替換治療者、酗酒者等的冠狀動(dòng)脈疾病危險(xiǎn)有預(yù)防作用。神經(jīng)酸除了具有治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病外，還具有增強(qiáng)免疫的作用。研究表明神經(jīng)酸對(duì)DNA聚合酶β具有抑制作用，神經(jīng)酸還能抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶的活性并表現(xiàn)出量效相關(guān)性。因此，甚至有報(bào)道稱富含神經(jīng)酸的元寶楓油具有增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)和治療艾滋病的作用。由于神經(jīng)酸的重要生物活性，神經(jīng)酸生產(chǎn)和在醫(yī)藥和營(yíng)養(yǎng)方面的應(yīng)用具有廣泛的前景。膳食中添加神經(jīng)酸可以支持大腦和神經(jīng)組織中髓磷脂的合成和發(fā)揮功能作用。含有神經(jīng)酸的補(bǔ)充膳食對(duì)于遺傳性過(guò)氧化物酶體病(如腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，Zellweger’ s綜合證)患者的脂質(zhì)代謝、多發(fā)性硬化癥病患者的康復(fù)和接受嬰兒配方營(yíng)養(yǎng)餐的早產(chǎn)兒的正常發(fā)育都有重要的意義。用富含神經(jīng)酸的油脂治療kllweger’ s綜合證也取得了臨床療效。血漿中神經(jīng)酸的水平與嬰兒營(yíng)養(yǎng)和發(fā)育狀況具有相關(guān)性，母乳喂養(yǎng)的嬰兒紅血球中神經(jīng)酸水平比人工喂養(yǎng)的嬰兒的高，營(yíng)養(yǎng)學(xué)家推薦無(wú)論是足月產(chǎn)還是早產(chǎn)嬰兒，如果人工喂養(yǎng)，其代乳品中應(yīng)該添加神經(jīng)酸、DPA (二十二碳五烯酸)和DHA (二十二碳六烯酸)。為了增加牛乳的神經(jīng)酸含量，甚至有人用含神經(jīng)酸酯的油脂添加到奶牛飼料中來(lái)提高牛奶的神經(jīng)酸含量。由于神經(jīng)酸存在于乳清中，所以這些富含神經(jīng)酸的牛乳特別適合于制作具有特別營(yíng)養(yǎng)的口味宜人的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化酸奶。神經(jīng)酸和ARA (二十碳四烯酸)、DHA和亞麻酸一樣具有促進(jìn)人類健康的生物活性，可以成為保健食品的油脂添加物。人們相信，神經(jīng)酸將是未來(lái)具有巨大應(yīng)用潛力的有利于人類健康的生物活性脂肪酸營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)酸和富含神經(jīng)酸的油脂也將會(huì)迎來(lái)巨大的市場(chǎng)機(jī)會(huì)。然而，到目前為止，在世界范圍內(nèi)還沒(méi)有大規(guī)模的生產(chǎn)技術(shù)，少量的神經(jīng)酸主要從有限的植物資源中提取，或者在從菜籽油生產(chǎn)芥酸的過(guò)程中提取含量極低的神經(jīng)酸，這與DHA的可以通過(guò)微藻大規(guī)模生產(chǎn)的狀況形成鮮明對(duì)比。所以，研究開(kāi)發(fā)通過(guò)微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法。本發(fā)明是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建具有高產(chǎn)神經(jīng)酸能力的微藻藻種，然后利用轉(zhuǎn)基因微藻規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)神經(jīng)酸。本發(fā)明的內(nèi)容包括，將具有高產(chǎn)神經(jīng)酸的生物的脂肪酸延長(zhǎng)合成中的關(guān)鍵酶(3-酮脂酰CoA合酶)的基因轉(zhuǎn)入宿主微藻細(xì)胞中，使微藻具有或增強(qiáng)合成神經(jīng)酸的能力，從而實(shí)現(xiàn)通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因微藻并且促使其積累油脂，從微藻中提取富含神經(jīng)酸的油脂或者進(jìn)一步加工生產(chǎn)神經(jīng)酸。3-酮脂酰CoA合酶的基因可以來(lái)自于具有高產(chǎn)神經(jīng)酸能力的植物，如蒜頭果、元寶楓、金錢草、碎米芥等。宿主可以是具有較強(qiáng)的積累油脂能力，并且油脂中的脂肪酸成分中油酸含量比其他脂肪酸含量高得多，或22碳以下的單不飽和脂肪酸含量占不飽和脂肪酸總量的大部分的微藻，如富油新綠藻(Afeo^Woris oleoabundans)等。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是首先，可以提高神經(jīng)酸的含量，目前人們還沒(méi)有掌握哪一種微藻其神經(jīng)酸的含量具有商業(yè)價(jià)值，通過(guò)本技術(shù)可以獲得高產(chǎn)神經(jīng)酸的微藻藻種；其次，可以解決神經(jīng)酸資源稀缺因而產(chǎn)量很低的現(xiàn)狀，目前人們發(fā)現(xiàn)只有少量稀有高等植物具有較高的神經(jīng)酸含量，但是由于這些植物生長(zhǎng)條件苛刻生長(zhǎng)慢，所以神經(jīng)酸的產(chǎn)量無(wú)法提高，微藻生長(zhǎng)快、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、可以工業(yè)化培養(yǎng)，所以通過(guò)本發(fā)明的技術(shù)有希望實(shí)現(xiàn)神經(jīng)酸的高產(chǎn)；第三，推廣應(yīng)用本技術(shù)有利于保護(hù)稀有植物；第四，現(xiàn)有的提取神經(jīng)酸的技術(shù)主要從神經(jīng)酸含量很低的植物油中分離提取，成本很高，神經(jīng)酸的價(jià)格很高，不利于推廣應(yīng)用，推廣本發(fā)明技術(shù)將可以降低生產(chǎn)成本、增大產(chǎn)量，從而可以降低產(chǎn)品價(jià)格，有利于神經(jīng)酸的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
取蒜頭果組織，提取總RNA用作模版，用設(shè)計(jì)好的引物RT-PCR得到3-酮脂酰CoA合酶的mRNA，用RACE技術(shù)得到全長(zhǎng)，連接到載體，用基因槍將載體注入富油新綠藻細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)培轉(zhuǎn)化子，收集微藻細(xì)胞，提取油脂，水解油脂，用GC-MS分析脂肪酸組成，結(jié)果微藻油脂含量45% (對(duì)細(xì)胞干重)，神經(jīng)酸占總脂肪酸的40%以上。實(shí)施例2
取元寶楓組織，提取總RNA，用設(shè)計(jì)好的引物RT-PCR得到3-酮脂酰CoA合酶的mRNA，用RACE技術(shù)得到全長(zhǎng)，連接到載體，用利用農(nóng)桿菌將載體轉(zhuǎn)入小球藻細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)培轉(zhuǎn)化子，收集微藻細(xì)胞，提取油脂，水解油脂，用GC-MS分析脂肪酸組成，結(jié)果微藻油脂含量30% (對(duì)細(xì)胞干重)，神經(jīng)酸占總脂肪酸的35%以上。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法，其特征在于將脂肪酸延長(zhǎng)合成中的關(guān)鍵酶——3-酮脂酰CoA合酶基因轉(zhuǎn)入宿主微藻細(xì)胞中，使微藻具有或增強(qiáng)合成神經(jīng)酸的能力，從而實(shí)現(xiàn)通過(guò)培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)基因的微藻并促使其積累油脂，然后從培養(yǎng)的微藻細(xì)胞中提取得到神經(jīng)酸含量很高的油脂，從這種油脂中提取得到神經(jīng)酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法，其特征在于所述的3-酮脂酰CoA合酶的基因來(lái)自于具有高產(chǎn)神經(jīng)酸能力的生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法，其特征在于所述的生物包括但不限于植物蒜頭果(Malania oleifera)、元寶楓(Acer truncaturn)、金錢草(Lunaria annua) >( Cardamine graeca\
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法，其特征在于所述的宿主是具有積累油脂能力達(dá)到和超過(guò)細(xì)胞油脂含量占細(xì)胞干重的10%以上的微藻。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法，其特征在于用于作為轉(zhuǎn)基因宿主的微藻的天然產(chǎn)油脂的脂肪酸成分中，油酸含量比其他任何一種脂肪酸含量高，或22碳以下的單不飽和脂肪酸含量占不飽和脂肪酸總量的比率大于30%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法，其特征在于所述的宿主為但不限于富油新綠藻(Neochloris οleoabundans)和小球藻(Chlorillasp.)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)神經(jīng)酸的方法，是將具有高產(chǎn)神經(jīng)酸能力的生物中脂肪酸延長(zhǎng)合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶——3-酮脂酰CoA合酶的基因轉(zhuǎn)入宿主微藻細(xì)胞中，使微藻具有或增強(qiáng)合成神經(jīng)酸的能力，從而實(shí)現(xiàn)通過(guò)培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)基因的微藻并促使其積累油脂，然后從培養(yǎng)的微藻細(xì)胞中提取得到神經(jīng)酸含量很高的油脂，從這種油脂中提取得到神經(jīng)酸。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102559735SQ201110446659
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者李雁群 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)