專利名稱：：產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉及該油脂的發(fā)酵制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)具有重要生理活性的多不飽和油脂的方法，具體涉及到產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉及該油脂的發(fā)酵制備方法。
背景技術(shù)：
：二十碳五烯酸(EicosapetaneiocAcid，簡稱EPA，即5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)屬于"-3系列長鏈不飽和脂肪酸。分子式為C2oH3()02,相對分子量為302.6。因分子中的第一個雙鍵起始于甲基端的第三個碳原子，故屬于(D-3系列不飽和脂肪酸。結(jié)構(gòu)式如下二十碳五烯酸室溫下是液體，不溶于水而易溶于無水乙醇、石油醚等有機溶劑中。由于EPA屬于co-3系列多不飽和脂肪酸，它們和co-6系列的脂肪酸在動物體內(nèi)不能相互轉(zhuǎn)化，人體能將從植物中攝取的a-亞麻酸微量地轉(zhuǎn)化為EPA，滿足一般人的健康需要。但是老年人、幼兒及糖尿病人則不能將a-亞麻酸有效地轉(zhuǎn)化為EPA，這些人必需從食物中直接攝取EPA。二十碳五烯酸俗稱為"血管清道夫",它具有以下幾方面的生理功能:(1)抗凝血、降血脂、預(yù)防動脈硬化等心血管疾??；(2)抗炎作用；(3)抗癌作用等。因此，EPA的研究開發(fā)應(yīng)用已受到世界各國科學(xué)家的關(guān)注和重視。EPA的天然來源主要是海產(chǎn)的魚類、貝類和一些海水藻類，如海狗油、海豹油、金槍魚、沙丁魚、白蛤等。其商業(yè)來源主要為深海魚油，但深海魚油中同時含有EPA和DHA，其中，EPA含量在4X-40X之間。目前，全球的深海魚油年產(chǎn)量約1000噸。隨著人類對自身健康要求的提高，人們對多不飽和脂肪酸的需求越來越多，尤其是隨著全球人口老齡化的趨勢不斷發(fā)展，對含有大量EPA，而不含DHA的油脂需求量日益增多。因此，僅僅依靠魚油資源已無法滿足日益擴大的市場需求。而且魚油腥味大，深加工成本很高。所以，深海魚油市場價一直很高，一般人難以接受。因此，開發(fā)來源廣泛、價格合理的含有大量EPA，而不含DHA的油脂新生物資源及其應(yīng)用已成為全球關(guān)注的熱點。目前，已發(fā)現(xiàn)含有EPA的微生物種類有真菌、海水細菌、藻類。而從真菌中培養(yǎng)獲得EPA報道較多。目前，國外報道的EPA最高發(fā)酵產(chǎn)量為1.88g/L(參考文南犬ShimizuS，KawashimaH.ApplMicrobialBiotechnol1989，32:1-4)，國內(nèi)EPA最高發(fā)酵產(chǎn)量僅為253.7mg/L(參考文獻楊革，王玉萍，李翔太等.多價不飽和脂肪酸發(fā)酵條件的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1997,23(2):8-13)，與國外報道的最高水平及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用都存在較大差距，迫切需要通過菌種篩選和選育獲得產(chǎn)EPA油脂的高產(chǎn)菌株及相應(yīng)的發(fā)酵制備方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉及該油脂的發(fā)酵制備方法。產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉(尸j^2/wm，)HUST-RBB12已于2008年12月8日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏中心地址武漢武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；郵政編碼430072;保藏編號M208247。本發(fā)明的腐霉HUST-RBB12菌株具有以下微生物學(xué)特性(1)形態(tài)學(xué)特性菌落在PDA培養(yǎng)基中菌絲為白色棉毛狀，培養(yǎng)過程中菌落顏色無變化;菌絲無隔，孢子無色。(2)培養(yǎng)學(xué)特性在PDA培養(yǎng)基中，在2(TC培養(yǎng)，該菌株生長快速，兩天即可長滿培養(yǎng)皿；在液體種子培養(yǎng)基或是發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，菌絲分散良好，發(fā)酵液呈小米粥狀，菌絲球直徑小于5mm。(3)生理特性本發(fā)明的HUST-RBB12菌株是一種需氧菌，發(fā)酵培養(yǎng)時，在25"顯示出最佳的生長能力。作為碳源，蔗糖、大米粉水解液、麥芽糖、葡萄糖最利于HUST-RBB12的生長；而用阿拉伯糖、半乳糖作為碳源時，菌體生長緩慢。腐霉HUST-RBB12菌株是通過以下方法得到(1)菌株分離純化取5g土樣，放于盛有45ml的無菌水(帶玻璃珠)的三角瓶中，振蕩10分鐘，將土樣打勻。取0.5ml轉(zhuǎn)于4.5ml無菌水中，依次稀釋至10—4。取10'2，l(T3，10—4三個稀釋度，涂布于加入抗生素的PDA平板表面。于25。C培養(yǎng)至有霉菌長出，立刻挑取單菌落轉(zhuǎn)接、純化(2)初篩分別挑取少量各純化過的菌絲于小試管中，加入蘇丹II與蘇丹IV混合液，染色3-8分鐘，用水沖洗2-5次。然后挑少量菌絲放到載玻片上，在400倍顯微鏡下進行鏡檢。菌絲體內(nèi)脂肪粒被染成紅色，選取脂肪粒大而多的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)。同時，對這些菌株進行斜面保種；(3)復(fù)篩將初篩后的菌株接至PDA斜面培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，溫度18°C-25°C，時間3-5天，無菌操作倒入10ml無菌水，洗脫孢子，然后轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，20°C-30°C，180rpm培養(yǎng)5天。收獲濕菌體并在50°C-9(TC溫度進行烘干，然后研磨，從中提取油脂，甲脂化后進行氣相色譜分析。將EPA產(chǎn)量最高的菌株命名為HUST-RBB，經(jīng)生理生化鑒定和分子鑒定，最終鑒定為腐霉(/^/'Wmw.)，通過常規(guī)誘變育種得到一株產(chǎn)量更高的菌種，且產(chǎn)量較為穩(wěn)定，命名為HUST-RBB12。將上述HUST-RBB12菌種進行菌種活化培養(yǎng)，將菌種的孢子懸液進行種子培養(yǎng)，再將得到的種子培養(yǎng)液進行發(fā)酵培養(yǎng)，收獲濕菌體，烘干研磨，從中提取二十碳五烯酸油脂。采用自行篩選并經(jīng)誘變獲得的腐霉HUST-RBB12菌株，進行發(fā)酵制備二十碳五烯酸油脂。獲得EPA最高產(chǎn)量達到2.1g/L，高于目前國內(nèi)外報道的最高產(chǎn)量。同時，本發(fā)明方法所制得的微生物油脂不含有二十二碳六烯酸(DHA)殘基，故有利于含EPA油脂的分離純化，滿足市場對含有EPA，不含有DHA的特種多不飽和油脂的廣泛需求。此發(fā)明方法為EPA的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了新的技術(shù)支撐，具有巨大的潛在開發(fā)價值。具體而言，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉(尸3^7^m^.)，并自行經(jīng)篩和誘變獲得一株EPA高產(chǎn)菌株HUST-RBB12，為二十碳五烯酸油脂的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了新的微生物來源;(2)本發(fā)明采用腐霉HUST-RBB12菌種生產(chǎn)高產(chǎn)量的具有重要生理活性的二十碳五烯酸(EPA)油脂，本發(fā)明方法所制得的油脂含有6%15%的二十碳五烯酸殘基，且二十碳五烯酸產(chǎn)量高達2.1g/L，高于目前國內(nèi)外已報道的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的最高產(chǎn)量；(3)本發(fā)明方法所制得的油脂不含有二十二碳六烯酸(DHA)殘基，故有利于EPA油脂的分離純化，滿足市場對含有EPA，不含有DHA的特種多不飽和油脂的廣泛需求；(4)該二十碳五烯酸油脂的生產(chǎn)方法成本低、操作簡單，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。圖1為該菌種發(fā)酵后染色鏡檢(400倍)；圖2為菌種HUST-RBB12的菌落形態(tài)；圖3為菌株HUST-RBB12脂肪酸氣相色譜分析。具體實施例方式使用本發(fā)明提供的腐霉(尸^/2i"wHUST-RBB12菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)可以制備二十碳五烯酸油脂，其發(fā)酵制備二十碳五烯酸油脂的優(yōu)化方案為(1)將HUST-RBB12菌種進行12-48小時的菌種活化培養(yǎng)；(2)將菌種的孢子懸液接入種子培養(yǎng)基進行24-72小時培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；(3)將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到搖瓶培養(yǎng)基中，進行第一階段搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)4-8天，或轉(zhuǎn)接到10L發(fā)酵罐進行第一階段發(fā)酵罐培養(yǎng)4-8天；(4)再進行3-10天第二階段發(fā)酵培養(yǎng)，收獲濕菌體，并在5(TC-9(TC溫度進行烘干，然后研磨，從中提取油脂。上述種子培養(yǎng)的優(yōu)化方案為用無菌水對試管中的孢子進行沖洗，然后將3-15ml洗液接入種子培養(yǎng)基，種子活化培養(yǎng)基配方葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2P040.3-0.8g/L、NaN033-8g/L,其余為自來水，pH5.0-8.0;裝液量250ml三角瓶中裝50-120ml發(fā)酵液；搖床轉(zhuǎn)速100-300rpm，溫度15。C隱32。C，時間2-5天。第一階段搖瓶發(fā)酵的優(yōu)化培養(yǎng)方案為將3-15ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2P040.3-0.8g/L、NaN033-8g/L、MgS040.2-2.0g/L、CaCl20.2-2.0g/L，其余為自來水，pH5.0-8.0;搖床轉(zhuǎn)速100-300rpm，溫度2(TC-32。C，培養(yǎng)4-8天。第一階段發(fā)酵罐培養(yǎng)方案為將200-900ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的IOL發(fā)酵罐中，裝液量為4-7L，發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2P040.3-0.8g/L、NaN033-8g/L、MgS040.2-2.0g/L、CaCl20.2-2.0g/L，其余為自來水，pH5.0-8.0;攪拌轉(zhuǎn)速100-300rpm，溫度20。C-32。C，時間4-8天。第二階段搖瓶或第二階段IOL發(fā)酵罐發(fā)酵的優(yōu)化培養(yǎng)方案為向第一階段發(fā)酵培養(yǎng)4-8天后的發(fā)酵液中，加入下列物質(zhì)乙醇20-120g/L，硝酸鉀1.0-6.0g/L，氯化鈣0.2陽2.0g/L、pH4.0-7.5;培養(yǎng)條件溫度0-18。C，時間3-10天，搖床轉(zhuǎn)速或發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速0-100rpm。油脂提取的優(yōu)化方案將低溫發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液進行抽濾，收集濕菌體，50。C-90。C烘干，然后仔細研磨，再用石油醚萃取兩次，每克干菌體用5-10ml石油醚萃取，每次3-6小時，減壓回收石油醚得到含EPA的油脂。下面通過借助以下實施例將更加詳細說明本發(fā)明，且以下實施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實施例的限制。實施例1:EPA高產(chǎn)菌株篩選'(1)菌株分離純化取5g土樣，放于盛有45ml的無菌水(帶玻璃珠)的三角瓶中，振蕩IO分鐘，將土樣打勻。取0.5ml轉(zhuǎn)于4.5ml無菌水中，依次稀釋至io-4。取io-2，10—3，104三個稀釋度，涂布于加入抗生素的PDA平板表面。于25。C培養(yǎng)至有霉菌長出，立刻挑取單菌落轉(zhuǎn)接、純化并做編號；(2)初篩挑取少量各純化過的菌絲于小試管中，加入蘇丹n與蘇丹IV混合液，染色4分鐘，用水沖洗3次。挑少量菌絲放到載玻片上，在400倍顯微鏡下進行鏡檢。菌絲體內(nèi)脂肪粒被染成紅色，選取脂肪粒大而多的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)。同時，對這些菌株進行斜面保種；(3)復(fù)篩將初篩后的菌株接至PDA斜面培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，溫度25°C，時間3天，無菌操作倒入10ml無菌水，洗脫孢子，然后轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，2CTC，180rpm培養(yǎng)5天。收獲濕菌體并在60。C溫度進行烘干，然后研磨，從中提取油脂，甲脂化后進行氣相色譜分析。將EPA產(chǎn)量最高的菌株命名為HUST-RBB，經(jīng)生理生化鑒定和分子鑒定，最終鑒定為腐霉通過常規(guī)誘變育種得到一株產(chǎn)量更高的菌種，且產(chǎn)量較為穩(wěn)定，命名為HUST-RBB12。相關(guān)實驗圖片見圖l，圖2:菌種活化將HUST-RBB12菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基，2(TC培養(yǎng)6天；PDA培養(yǎng)基配方為土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，加自來水補足到1L,12rC滅菌20分鐘。種子培養(yǎng)菌種HUST-RBB12在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天后，用無菌水將孢子進行懸浮，孢子液濃度為6xl07個/L，然后將3ml洗液接入種子活化培養(yǎng)基，種子活化培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L、酵母粉7g/L、K2P040.3g/L、NaN038g/L，加自來水補足到1L，pH5.0;裝液量250ml三角瓶中裝50ml發(fā)酵液，搖床轉(zhuǎn)速300rpm，溫度15"，時間5天。第一階段發(fā)酵培養(yǎng)過程菌種活化5天后，將3ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L、酵母粉7g/L、K2P040.3g/L、NaNO38g/L、MgS040.2g/L、CaCl20.2g/L，大豆油0.5g/L，加自來水補足到1L;pH8.0,裝液量250ml三角瓶中裝50ml發(fā)酵液，搖床轉(zhuǎn)速100rpm，溫度32。C，時間4天。第二階段發(fā)酵培養(yǎng)過程向發(fā)酵4天后的發(fā)酵液中，加入下列物質(zhì)進入第二階段發(fā)酵培養(yǎng)乙醇120g/L，硝酸鉀1.0g/L，氯化鈣0.2g/L;培養(yǎng)條件溫度18°C，時間3天，pH7.5，搖床轉(zhuǎn)速100rpm。實驗結(jié)果為菌體干重為11.5g/L，油脂含量為2.30g/L，EPA產(chǎn)量為285mg/L，脂肪酸成分表1。實施例3菌種活化同實施例2。種子活化菌種HUST-RBB12在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天后，用無菌水將孢子進行懸浮，孢子液濃度為4xl(^個/L，然后將5ml洗液接入種子活化培養(yǎng)基，種子活化培養(yǎng)基配方為葡萄糖130g/L、酵母粉2g/L、K2P040.8g/L、NaN033g/L，其余為自來水，pH8.0，裝液量250ml三角瓶中裝120ml發(fā)酵液；搖床轉(zhuǎn)速100rpm，溫度32'C，培養(yǎng)2天。第一階段發(fā)酵培養(yǎng)過程菌種活化2天后，將15ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖130g/L、酵母粉2.0g/L、K2P040.8g/L、NaNO33.0g/L，MgS042.0g/L、CaCl22.0g/L，大豆油4.0g/L，其余為自來水；pH4.0，裝液量250ml三角瓶中裝120ml發(fā)酵液。發(fā)酵4天，搖床轉(zhuǎn)速300rpm，溫度20°C。第二階段發(fā)酵培養(yǎng)過程向發(fā)酵4天后的發(fā)酵液中，加入下列物質(zhì)乙醇20g/L，硝酸鉀6.0g/L，氯化鈣2.0g/L;溫度0°C，發(fā)酵時間10天，pH4.0，搖床轉(zhuǎn)速Orpm。結(jié)果為菌體干重為26.5g/L，油脂含量為8.32g/L，EPA產(chǎn)量為666mg/L。實施例4菌種活化同實施例2。種子活化菌種HUST-RBB12在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天后，用無菌水將孢子進行懸浮，孢子液濃度為5.5xl(^個/L，然后將5ml洗液接入種子活化培養(yǎng)基，種子活化培養(yǎng)基配方為葡萄糖130g/L、酵母粉2g/L、K2P040.8g/L、NaN033g/L，其余為自來水，pH8.0，裝液量250ml三角瓶中裝70ml發(fā)酵液；搖床轉(zhuǎn)速100rpm，溫度32'C，培養(yǎng)2天。第一階段發(fā)酵培養(yǎng)過程菌種活化2天后，將200ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖130g/L、酵母粉2.0g/L、K2P040.8g/L、NaNO33,0g/L，MgS042.0g/L、CaCl22.0g/L，大豆油4.0g/L，其余為自來水；pH4.0，裝液量10L發(fā)酵罐中裝4L發(fā)酵液。發(fā)酵4天，搖床轉(zhuǎn)速300rpm,溫度20°C。第二階段發(fā)酵培養(yǎng)過程向發(fā)酵4天后的發(fā)酵液中，加入下列物質(zhì)乙醇80g/L，硝酸鉀24.0g/L，氯化鈣8.0g/L;溫度0°C，發(fā)酵時間10天，pH4.0，攪拌轉(zhuǎn)速Orpm。結(jié)果為菌體干重為16.5g/L，油脂含量為5.12g/L，EPA產(chǎn)量為576mg/L。實施例5菌種活化同實施例2。種子活化用無菌水將在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天的菌種的孢子進行沖洗，然后將洗液接入種子活化培養(yǎng)基，種子活化培養(yǎng)基配方為葡萄糖70g/L、酵母粉4g/L、K2P040.6g/L、NaN034g/L，其余為自來水，pH7.0，裝液量250ml三角瓶中裝100ml發(fā)酵液；搖床轉(zhuǎn)速180rpm，溫度25"C，培養(yǎng)3天。第一階段發(fā)酵罐培養(yǎng)過程菌種活化3天后，將200ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖80g/L、酵母粉6g/L、K2PO40.7g/L、NaN034g/L，MgS040.6g/L、CaCl21.4g/L，大豆油2.0g/L，其余為自來水;pH4.5，裝液量10L發(fā)酵罐中裝4L發(fā)酵液。發(fā)酵4天，搖床轉(zhuǎn)速300rpm，溫度20°C。第二階段發(fā)酵罐培養(yǎng)過程向發(fā)酵4天后的發(fā)酵液中，加入下列物質(zhì)乙醇40g/L，硝酸鉀5.0g/L，氯化鈣0.6g/L;溫度8°C，發(fā)酵時間8天，pH5.0，搖床轉(zhuǎn)速40rpm。結(jié)果為菌體干重24.5g/L，油脂含量8.24g/L，EPA產(chǎn)量1045mg/L，脂肪酸成分表2。實施例6菌種活化同實施例2。種子活化用無菌水將在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天的菌種的孢子進行沖洗，然后將洗液接入種子活化培養(yǎng)基，種子活化培養(yǎng)基配方為葡萄糖110g/L、酵母粉4g/L、K2P040.5g/L、NaN034g/L，其余為自來水，pH5.5，裝液量250ml三角瓶中裝120ml發(fā)酵液；搖床轉(zhuǎn)速200rpm，溫度20。C，培養(yǎng)3天。第一階段發(fā)酵培養(yǎng)過程菌種活化結(jié)束，將8ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖100g/L、酵母粉7g/L、K2P040.4g/L、NaN036g/L，MgS040.8g/L、CaCl21.2g/L，大豆油4.0g/L，其余為自來水；pH4.0，裝液量250ml三角瓶中裝120ml發(fā)酵液。發(fā)酵4天，搖床轉(zhuǎn)速300rpm，溫度20°C。第二階段發(fā)酵培養(yǎng)過程向發(fā)酵4天后的發(fā)酵液中，加入下列物質(zhì)乙醇70g/L,硝酸鉀6.0g/L，氯化鈣1.4g/L;溫度0°C，發(fā)酵時間10天，pH4.0，搖床轉(zhuǎn)速80rpm。結(jié)果為菌體干重為32.5g/L，油脂含量為13.12g/L，EPA產(chǎn)量為1210mg/L。實施例7菌種活化同實施例2。種子活化用無菌水將在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天的菌種的孢子進行沖洗，然后將洗液接入種子活化培養(yǎng)基，種子活化培養(yǎng)基配方為葡萄糖80g/L、酵母粉6g/L、K2P040.6g/L、NaN037g/L，其余為自來水，pH5.0,裝液量250ml三角瓶中裝90ml發(fā)酵液；搖床轉(zhuǎn)速220rpm，溫度20°C，培養(yǎng)4天。第一階段發(fā)酵培養(yǎng)過程菌種活化結(jié)束，將8ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖100g/L、酵母粉7g/L、K2P040.6g/L、NaN036g/L，MgS040.5g/L、CaCl21.0g/L，大豆油2.0g/L，其余為自來水；pH4.5，裝液量250ml三角瓶中裝80ml發(fā)酵液。發(fā)酵6天，搖床轉(zhuǎn)速2S0rpm，溫度20°C。第二階段發(fā)酵培養(yǎng)過程向發(fā)酵4天后的發(fā)酵液中，加入下列物質(zhì)乙醇80g/L，硝酸鉀7.0g/L，氯化鈣0.8g/L;溫度10°C，發(fā)酵時間8天，pH5.0，搖床轉(zhuǎn)速90rpm。結(jié)果:菌體干重36.5g/L，油脂量14.3g/L，EPA量2.1g/L，脂肪酸成分見表3，氣相結(jié)果見圖3。表l.微生物油脂脂肪酸成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3.微生物油脂脂肪酸成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1、產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉(Pythiumsp.)HUST-RBB12CCTCCNo.M208247。2、一種二十碳五烯酸油脂的發(fā)酵制備方法，將HUST-RBB12菌種進行菌種活化培養(yǎng)，將菌種的孢子懸液進行種子培養(yǎng)，再將得到的種子培養(yǎng)液進行發(fā)酵培養(yǎng)，收獲濕菌體，烘干研磨，從中提取油脂。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵制備方法，其特征在于(1)將HUST-RBB12菌種進行12-48小時的菌種活化培養(yǎng)；(2)將菌種的孢子懸液接入種子培養(yǎng)基進行24-72小時培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；(3)將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到搖瓶培養(yǎng)基中，進行第一階段搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)4-8天，或轉(zhuǎn)接到10L發(fā)酵罐進行第一階段發(fā)酵罐培養(yǎng)4-8天；(4)再進行3-10天第二階段發(fā)酵培養(yǎng)，收獲濕菌體，并在5(TC-9(TC溫度進行烘干，然后研磨，從中提取油脂。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵制備方法，其特征在于種子培養(yǎng)過程為用無菌水對試管中的孢子進行沖洗，然后將3-15ml洗液接入種子培養(yǎng)基，種子活化培養(yǎng)基配方葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2P040.3-0.8g/L、NaN033-8g/L，其余為自來水，pH5.0-8.0;裝液量250ml三角瓶中裝50-120ml發(fā)酵液；搖床轉(zhuǎn)速100-300rpm，溫度15。C-32。C，時間2-5天。5、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的發(fā)酵制備方法，其特征在于第一階段搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過程為將3-15ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2P040.3-0.8g/L、NaN033隱8g/L、MgS040.2-2.0g/L、CaCl20.2-2.0g/L，其余為自來水，pH5.0-8.0;搖床轉(zhuǎn)速100-300rpm，溫度20。C-32。C，培養(yǎng)4-8天；第一階段發(fā)酵罐培養(yǎng)過程為將200-900ml種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，裝液量為4-7L，發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖30-130g/L、酵母粉2-7g/L、K2P040.3-0.8g/L、NaN033-8g/L、MgS040.2-2.0g/L、CaCl20.2-2.0g/L，其余為自來水，pH5.0-8.0;攪拌轉(zhuǎn)速100-300rpm，溫度20。C-32。C，時間4-8天。6、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的發(fā)酵制備方法，其特征在于第二階段搖瓶或第二階段10L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)過程為向第一階段發(fā)酵培養(yǎng)4-8天后的發(fā)酵液中，加入下列物質(zhì)乙醇20-120g/L，硝酸鉀1.0-6.0g/L，氯化牽丐0.2-2.0g/L、pH4.0-7.5;培養(yǎng)條件:溫度0-18。C，時間3-10天，搖床轉(zhuǎn)速或發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速0-100rpm。7、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的發(fā)酵制備方法，其特征在于步驟(4)中，油脂的提取方法將低溫發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液進行抽濾，收集濕菌體，5(TC-9(TC烘干，然后仔細研磨，再用石油醚萃取兩次，每克干菌體用5-10ml石油醚萃取，每次3-6小時，減壓回收石油醚得到含EPA的油脂。全文摘要本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉(Pythiumsp.)HUST-RBB12菌種CCTCCNo.M208247，利用該菌種生產(chǎn)高產(chǎn)量的具有重要生理活性的二十碳五烯酸(EPA)油脂。采用本發(fā)明方法所制得的油脂含有6％～15％的二十碳五烯酸殘基，且二十碳五烯酸產(chǎn)量高達2.1g/L，高于目前國內(nèi)外已報道的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的最高產(chǎn)量，同時，本發(fā)明方法所制得的油脂不含有二十二碳六烯酸(DHA)殘基，故有利于含EPA油脂的分離純化和獨立使用。該方法生產(chǎn)的二十碳五烯酸油脂的成本低、操作簡單，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12N1/14GK101434908SQ200810236810公開日2009年5月20日申請日期2008年12月10日優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日發(fā)明者余龍江,盧美歡,周蓬蓬,敏朱,范志永申請人:華中科技大學(xué)