專(zhuān)利名稱：：?jiǎn)我徊ㄩL(zhǎng)的dna測(cè)序裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種DNA測(cè)序裝置，具體是單一波長(zhǎng)的DNA測(cè)序裝置。
背景技術(shù)：
：DNA序列分析是基因組學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的技術(shù)之一，是了解基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。目前使用的DNA序列分析裝置主要是以電泳分離理論為基礎(chǔ)而設(shè)計(jì)的，具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、探測(cè)靈敏、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。Smith等人采用4種熒光試劑標(biāo)記，4光譜通道檢測(cè)系統(tǒng)，首次進(jìn)行了毛細(xì)管電泳激光熒光檢測(cè)的DNA序列分析，Mathies和Kambara等提出另一種測(cè)序裝置，即采用20只毛細(xì)管并列電泳，激光熒光電荷藕合陣列檢測(cè)器(CCD)檢測(cè)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度。Ye皿g等又提出了100只毛細(xì)管陣列電泳裝置，采用CCD檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)IOO只毛細(xì)管的DNA分離樣品，均獲得滿意效果。但上述檢測(cè)裝置有一個(gè)共同點(diǎn)，即是均采用多個(gè)激光光源，對(duì)應(yīng)激發(fā)多個(gè)不同熒光染料的多光子熒光，以實(shí)現(xiàn)DNA序列的毛細(xì)管電泳分離和多光子熒光探測(cè)，因此，價(jià)格十分昂貴，且體積較大，不利于儀器的小型化和固定化；此外，當(dāng)藍(lán)、綠光照射時(shí)，凝膠層、玻璃等的熒光背景較強(qiáng)，影響儀器的靈敏度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明就是提供一種能有效降低系統(tǒng)成本，體積較小且易于固定，靈敏度高的單一波長(zhǎng)的DNA測(cè)序裝置。單一波長(zhǎng)的DNA測(cè)序裝置，包括工作臺(tái)，工作臺(tái)上依次分別設(shè)置有熒光激發(fā)系統(tǒng)，陣列毛細(xì)管系統(tǒng)，熒光探測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，其特征在于所述熒光激發(fā)系統(tǒng)由760-960nm波長(zhǎng)的一個(gè)激光器，及激光器光束位置上設(shè)置的反射鏡，與反射鏡中軸線呈45°的位置設(shè)置有一低倍物鏡和在低倍物鏡光束的垂直線位置上設(shè)置的一觀測(cè)目鏡構(gòu)成。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的不同之處就是是用波長(zhǎng)范圍為760-960nm的一個(gè)激光器取代現(xiàn)有技術(shù)中的多個(gè)激光器，實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā)。所謂多光子激發(fā)熒光，通常情況下，一個(gè)分子或者原子每次只能吸收一個(gè)光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)光強(qiáng)足夠高時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生多光子躍遷，即一次可以吸收多個(gè)光子。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜要比單光子激發(fā)光譜寬闊，這樣，可以用單一波長(zhǎng)的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對(duì)照。所以，可以用一個(gè)激光器取代多個(gè)激光器，同時(shí)激發(fā)四種不同熒光染料的多光子熒光，實(shí)現(xiàn)DNA序列的毛細(xì)管電泳分離和多光子熒光探測(cè)，極大地簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的檢測(cè)系統(tǒng)。采用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光源，可避開(kāi)拉曼散射和瑞利散射，且遠(yuǎn)離發(fā)射光譜，有利于降低背景的噪聲，提高儀器系統(tǒng)的靈敏度。同時(shí)還具有成本低和噪聲低的特點(diǎn)。本發(fā)明包括熒光激發(fā)系統(tǒng)，陣列毛細(xì)管系統(tǒng)，熒光探測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)四大部分。熒光激發(fā)系統(tǒng)提供高功率激發(fā)光，并聚焦在毛細(xì)管上，同時(shí)實(shí)現(xiàn)不同熒光試劑的多光子激發(fā)；陣列毛細(xì)管系統(tǒng)由方形毛細(xì)管并排構(gòu)成，在高壓電源的驅(qū)動(dòng)下，實(shí)現(xiàn)4種不同熒光標(biāo)記的DNA堿基對(duì)序列的分離；熒光探測(cè)系統(tǒng)通過(guò)4個(gè)通道探測(cè)四種不同熒光試劑的多光子激發(fā)的熒光；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，通過(guò)自動(dòng)控制收集熒光并處理，最終得到DNA序列。圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖2是利用本發(fā)明對(duì)6種熒光染料分子的分離圖譜圖；圖3是用本發(fā)明對(duì)DNA質(zhì)粒樣本的分離圖譜圖。圖中l(wèi)-工作臺(tái)，2-激光器，3-反射鏡，4-低倍物鏡，5-觀測(cè)目鏡，6-陣列毛細(xì)管，7-熒光收集物鏡，8-四通道熒光過(guò)濾輪，9-光纖陣列探測(cè)器，10-光電二極管，ll-數(shù)據(jù)采集卡，12-計(jì)算機(jī)，13-控制器。具體實(shí)施例方式圖1中示出的是構(gòu)成本發(fā)明的熒光激發(fā)系統(tǒng)、陣列毛細(xì)管系統(tǒng)、熒光探測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中各儀器之間按光路順序排列的相對(duì)位置及構(gòu)成情況。本發(fā)明包括在工作臺(tái)1上設(shè)置的熒光激光系統(tǒng)，它由長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光源即波長(zhǎng)范圍為760-960nm的激光器2，反射鏡3，數(shù)值孔徑為0.22-0.45的低倍物鏡4，觀測(cè)目鏡5構(gòu)成。激光器2實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā)，反射鏡設(shè)置在激光器的光束位置上，低倍物鏡設(shè)置在與反射鏡中軸線呈45。的位置，觀測(cè)目鏡則設(shè)置在與低倍物鏡所發(fā)光束的垂直線上；所述毛細(xì)管系統(tǒng)是陣列毛細(xì)管6，它可以采用單根方形毛細(xì)管或多根方形毛細(xì)管并排組成；所述熒光探測(cè)系統(tǒng)由熒光收集物鏡7，四通道熒光過(guò)濾輪8，光纖陣列探測(cè)器9和光電二極管10構(gòu)成，熒光收集物鏡和上述觀測(cè)目鏡分別設(shè)置在陣列毛細(xì)管兩側(cè)，四通道熒光過(guò)濾輪設(shè)置在熒光收集物鏡之后，光纖陣列探測(cè)器和光電二極管均設(shè)置在四通道熒光過(guò)濾輪的后部。所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集處理硬件和處理軟件，其中硬件包括數(shù)據(jù)采集卡11、計(jì)算機(jī)12和控制器13，該控制器分別連接計(jì)算機(jī)和四通道熒光過(guò)濾輪，并對(duì)四通道熒光過(guò)濾輪進(jìn)行控制。本發(fā)明的工作過(guò)程是激光器提供長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光源，實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā)，反射鏡將激光束反射經(jīng)低倍物鏡垂直照射在陣列毛細(xì)管上，實(shí)現(xiàn)高通量、高效率分離，并通過(guò)觀測(cè)目鏡實(shí)現(xiàn)聚焦于毛細(xì)管正中心；熒光收集物鏡收集來(lái)自陣列毛細(xì)管的熒光后，經(jīng)過(guò)四通道熒光過(guò)濾輪，過(guò)濾掉環(huán)境散雜光，熒光信號(hào)為光纖陣列探測(cè)器所探測(cè)，并在光電二極管中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換，光信號(hào)變成電流信號(hào)；計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)采集卡收集到光電二極管電流信號(hào)后，進(jìn)一步放大和濾波，數(shù)據(jù)采集卡收集的信號(hào)，結(jié)合控制器對(duì)四通道熒光過(guò)濾輪的控制信號(hào)，運(yùn)用相應(yīng)軟件計(jì)算并處理出DNA序列。具體實(shí)驗(yàn)操作要求1、毛細(xì)管處理①多種熒光染料分離每次進(jìn)樣前分別以0.lmol/LHC1、0.lmol/L氫氧化鈉、水和25mmol/L硼砂pH9.50溶液，高壓沖洗未涂層石英毛細(xì)管(57cmX75ym)10min;②DNA分離每次進(jìn)樣前分別以0.lmol/LHC1、0.lmol/L氫氧化鈉、水和2%HEC/lXTBE/20mmol/L高壓沖洗未涂層石英毛細(xì)管(57cmX75ym)10min，再用1XPVA對(duì)處理后的毛細(xì)管進(jìn)行表面改性；③分離高壓20KV。實(shí)驗(yàn)前，毛細(xì)管需要先進(jìn)行高壓平衡10分鐘。2、進(jìn)樣方式①多種熒光染料進(jìn)樣采用虹吸進(jìn)樣，15cmX60s;②DNA進(jìn)樣電動(dòng)進(jìn)樣，-6kVX10s。3、DNA樣本衍生化反應(yīng)P1和P2為5'端FITC修飾。4、實(shí)驗(yàn)步驟41)熒光檢測(cè)系統(tǒng)調(diào)節(jié)好，將熒光焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)方形毛細(xì)管中央。2)高壓平衡毛細(xì)管10分鐘；3)調(diào)節(jié)計(jì)算機(jī)，控制器和四通道熒光過(guò)濾輪處于工作狀態(tài)，同時(shí)使檢測(cè)系統(tǒng)，毛細(xì)管系統(tǒng)等處于工作狀態(tài)。4)進(jìn)樣檢測(cè)。為了論證本發(fā)明，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)1、單一波長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)激發(fā)波長(zhǎng)不同的多種熒光試劑的同時(shí)激發(fā)。6種熒光染料分子的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)如表l，如果采用單光子激發(fā)則需要多種波長(zhǎng)的激光器，也就說(shuō)要同時(shí)實(shí)現(xiàn)6種熒光染料分子的同時(shí)激發(fā)，需要多個(gè)波段的激光器。本發(fā)明采用單一波長(zhǎng)可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)激發(fā)和收集。實(shí)驗(yàn)成功地表明本發(fā)明同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種染料分子的激發(fā)，并實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管電泳分離和熒光探測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。表l6種熒光染料分子的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、采用本發(fā)明對(duì)DNA樣本進(jìn)行了多光子熒光電泳分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。實(shí)驗(yàn)表明可以對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序。權(quán)利要求單一波長(zhǎng)的DNA測(cè)序裝置，包括工作臺(tái)，工作臺(tái)上依次分別設(shè)置有熒光激發(fā)系統(tǒng)，陣列毛細(xì)管系統(tǒng)，熒光探測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，其特征在于所述熒光激發(fā)系統(tǒng)由760-960nm波長(zhǎng)的一個(gè)激光器，及激光器光束位置上設(shè)置的反射鏡，與反射鏡中軸線呈45°的位置設(shè)置的一低倍物鏡和在低倍物鏡光束的垂直線位置上設(shè)置的一觀測(cè)目鏡構(gòu)成。全文摘要單一波長(zhǎng)的DNA測(cè)序裝置，包括工作臺(tái)，工作臺(tái)上依次分別設(shè)置有熒光激發(fā)系統(tǒng)，陣列毛細(xì)管系統(tǒng)，熒光探測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所述熒光激發(fā)系統(tǒng)由760-960nm波長(zhǎng)的一個(gè)激光器，及激光器光束位置上設(shè)置的反射鏡，與反射鏡中軸線呈45°的位置設(shè)置的一低倍物鏡和在低倍物鏡光束的垂直線位置上設(shè)置的一觀測(cè)目鏡構(gòu)成；本發(fā)明用一個(gè)激光器取代現(xiàn)有測(cè)序儀的多個(gè)激光器，同時(shí)激發(fā)四種不同熒光染料的多光子熒光，實(shí)現(xiàn)DNA序列的毛細(xì)管電泳分離和多光子熒光探測(cè)，極大地簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的檢測(cè)系統(tǒng)，具有靈敏度高、儀器成本低、噪聲低、體積小等特點(diǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101748207SQ20081023671公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月9日優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日發(fā)明者司佑全,張少武,李艷生,王秀章,陳勝,黃燕霞申請(qǐng)人:湖北師范學(xué)院