背景
免疫細(xì)胞追蹤，其涉及監(jiān)測免疫細(xì)胞的移動和聚集，可以有效地檢測諸如免疫排斥之類的免疫反應(yīng)(immuneresponse)，其是在已接受器官移植的患者中的功能性衰竭的一種主要原因。
免疫反應(yīng)通常是通過定期地分析活檢樣本(例如心肌內(nèi)膜的活檢樣本)作監(jiān)測，以檢測在與疾病相關(guān)的器官中免疫細(xì)胞(例如t-細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的存在。
此監(jiān)測程序具有多個缺點。首先，作為一種侵入性程序，其趨于造成不利的副作用。再者，其傾于可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果的取樣誤差。此外，其經(jīng)常無法檢測早期急性排斥或者慢性排斥。最后，其是一種昂貴的程序。
免疫細(xì)胞追蹤也可以通過對患者施用用磁性納米粒子預(yù)先標(biāo)記的免疫細(xì)胞而達(dá)成。此方法需要體表外預(yù)標(biāo)記免疫細(xì)胞的冗長步驟。
需要研發(fā)一種簡單且非侵入性方法，其對于追蹤免疫細(xì)胞以檢測疾病的早期病征是敏感的。
概述
本文公開一種使用磁共振成像(“mri”)掃描，利用生物相容性磁性納米粒子(biocompatiblemagneticnanoparticle)的簡單且非侵入性的用于追蹤免疫細(xì)胞的方法。該方法提供出乎意料的高敏感度。
該方法包括以下步驟：(i)鑒別具有與器官(例如心臟、腎臟或淋巴結(jié))相關(guān)的疾病的患者；(ii)提供水性懸浮液(aqueoussuspension)，其不含尺寸大于1000nm的粒子且含有生物相容性磁性納米粒子；(iii)將該水性懸浮液施用到該患者的血流中；和(iv)隨后獲得該器官的磁共振圖像。當(dāng)該圖像顯示高信號斑或低信號斑的存在(例如t2、t2*或擴散加權(quán)的mri顯示低信號斑，或t1加權(quán)的mri顯示高信號斑)時，檢測到免疫反應(yīng)。例如，該疾病是癌癥(例如淋巴瘤)或移植器官(例如心臟或腎臟)的排斥。
在一個實施方案中，該方法被用于檢測免疫排斥，其中步驟(i)是鑒別具有移植器官的患者，并且步驟(iv)是獲得該移植器官的t2-加權(quán)的磁共振圖像。當(dāng)該圖像顯示低信號斑的存在時，則檢測到有免疫排斥。
本文描述的方法使用含有生物相容性磁性納米粒子的造影劑從而利用mri技術(shù)來檢測免疫反應(yīng)。
所述生物相容性磁性納米粒子各自含有超順磁性核心(superparamagneticcore)，該超順磁性核心被一種或多種生物相容性聚合物覆蓋，所述生物相容性聚合物各自具有聚乙二醇基團、硅烷基團以及經(jīng)由共價鍵連接該聚乙二醇基團和該硅烷基團的接頭(連接基，linker)。典型地，這些生物相容性磁性納米粒子各自具有10-1000nm的粒徑(顆粒尺寸，particlesize)和50-400的橫向磁弛豫率(transversemagneticrelaxivityrate)。在一個實例中，它們各自具有15-200nm的粒徑和120至400的橫向磁弛豫率。
通常，該超順磁性核心含有氧化鐵、氧化鈷、氧化鎳或其組合。
在覆蓋所述超順磁性核心的所述生物相容性聚合物的每一個中，聚乙二醇基團通常具有5-1000個氧乙烯單元(oxyetheyleneunit)(例如10-200個氧乙烯單元)，且硅烷基團典型地具有c1-10亞烷基(例如c3-c10亞烷基)。
下文將闡述一個或多個實施方案的細(xì)節(jié)。這些實施方案的其它特征、目的和優(yōu)點將從說明書和權(quán)利要求書變得顯而易見。
詳述
在以下詳細(xì)描述中，為了解釋的目的，闡述大量具體的細(xì)節(jié)以提供對所公開實施方案的詳盡了解。然而，顯而易見的是，在沒有這些具體細(xì)節(jié)的情況下，一個或多個實施方案可以被實施。
本發(fā)明的方法用于使用生物相容性磁性納米粒子追蹤免疫細(xì)胞，所述生物相容性磁性納米粒子各自含有被一種或多種生物相容性聚合物覆蓋的超順磁性核心。
所述生物相容性聚合物是生物可降解的且對細(xì)胞是無毒的。含有硅烷的生物相容性聚合物，其可以如下所示被輕易地官能化，是適合用于制備本方法所需的生物相容性磁性納米粒子。
一種示例性生物相容性聚合物具有以下式：
在式(i)中，r是h、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c3-c10環(huán)烷基、c1-c10雜環(huán)烷基、芳基(aryl)、雜芳基(heteroaryl)、c1-c10羰基或c1-c10胺基(aminegroup)；l是接頭；m是1至10；并且n是5至1000。
接頭可以是o、s、si、c1-c6亞烷基、含有兩個羰基和2-20個碳原子的羰基部分(carbonylmoiety)，或具有以下式中的一個的基團：
另一種示例性生物相容性聚合物具有以下式：
在式(ii)中，r1是h、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c3-c10環(huán)烷基、c1-c10雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、c1-c10羰基或c1-c10胺基；r2是h、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c3-c10環(huán)烷基、c1-c10雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；m是1至10(例如3-10)；并且n是5至1000(10-200)。在一個優(yōu)選的實施方案中，r2是h，并且式(ii)中的接頭是
術(shù)語“脂族(aliphatic)”在本文中指的是飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、無環(huán)的、環(huán)狀的或多環(huán)的烴部分。實例包括但不限于烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、環(huán)烷基、亞環(huán)烷基、環(huán)烯基、亞環(huán)烯基、環(huán)炔基和亞環(huán)炔基部分。術(shù)語“烷基”或“亞烷基”指的是飽和的、直鏈或支鏈的烴部分，例如甲基、亞甲基、乙基、亞乙基、丙基、亞丙基、丁基、亞丁基、戊基、亞戊基、己基、亞己基、庚基、亞庚基、辛基、亞辛基、壬基、亞壬基、癸基、亞癸基、十一烷基、亞十一烷基、十二烷基、亞十二烷基、十三烷基、亞十三烷基、十四烷基、亞十四烷基、十五烷基、亞十五烷基、十六烷基、亞十六烷基、十七烷基、亞十七烷基、十八烷基、亞十八烷基、十九烷基、亞十九烷基、二十烷基、亞二十烷基、三十烷基、亞三十烷基。術(shù)語“烯基”指的是含有至少一個雙鍵的直鏈或支鏈的烴部分，如-ch＝ch-ch3和-ch＝ch-ch2-。術(shù)語“炔基”指的是含有至少一個三鍵的直鏈或支鏈的烴部分，如-c≡c-ch3和-c≡c-ch2-。術(shù)語“環(huán)烷基”指的是飽和的、環(huán)狀烴部分，如環(huán)己基和亞環(huán)己基。
術(shù)語“雜脂族(基)(heteroaliphatic)”在本文中指的是含有至少一個雜原子(例如n、o、p、b、s、si、sb、al、sn、as、se和ge)的脂族(基)部分。術(shù)語“雜環(huán)烷基”指的是含有至少一個雜原子的環(huán)烷基部分。術(shù)語“氧脂族(基)”在本文中指的是-o-脂族(基)。氧脂族的實例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基以及叔丁氧基。
術(shù)語“芳基”在本文中指的是c6單環(huán)的、c10雙環(huán)的、c14三環(huán)的、c20四環(huán)的或者c24五環(huán)的芳族環(huán)系統(tǒng)。芳基的實例包括但不限于苯基、亞苯基、萘基、亞萘基、蒽基、亞蒽基、芘基和亞芘基。術(shù)語“雜芳基”在本文中指的是具有一個或多個雜原子(如o、n、s或se)的芳族5-8元單環(huán)、8-12元雙環(huán)、11-14元三環(huán)以及15-20元四環(huán)的環(huán)體系。雜芳基的實例包括但不限于呋喃基、亞呋喃基、芴基、亞芴基、吡咯基、亞吡咯基、噻吩基、亞噻吩基、
除非另有規(guī)定，在本文中提及的脂族、雜脂族、氧脂族、烷基、亞烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基以及雜芳基包括取代和未取代部分二者。在環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基上的可能取代基包括但不限于c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基、c3-c20環(huán)烷基、c3-c20環(huán)烯基、c3-c20雜環(huán)烷基、c3-c20雜環(huán)烯基、c1-c10烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、氨基、c1-c10烷基氨基、c2-c20二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、c1-c10烷基磺氨基，芳基磺氨基、c1-c10烷基亞氨基、芳基亞氨基、c1-c10烷基磺亞氨基、芳基磺亞氨基、羥基、鹵代、硫基(thio)、c1-c10烷硫基、芳硫基、c1-c10烷基磺?；⒎蓟酋；Ⅴ；被?、氨基酰基、胺基硫?；Ⅴ０坊?、甲脒基、胍、脲基、硫脲基、氰基、硝基、亞硝基、疊氮基、酰基、硫?；?、酰氧基、羧基和羧酸酯。另一方面，在脂族、雜脂族、氧脂族、烷基、亞烷基、烯基和炔基上的可能取代基包括所有上述除了c1-c10烷基的取代基。環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基也可以彼此稠合。
上述生物相容性聚合物包括聚合物本身、及其鹽和溶劑化物(如果適用)。例如，鹽可以在聚合物上的陰離子和帶正電荷的基團(例如氨基)之間形成。合適的陰離子包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、三氟乙酸鹽、乙酸鹽、蘋果酸鹽、甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽(fumurate)、谷氨酸鹽、葡糖醛酸鹽、乳酸鹽、戊二酸鹽和馬來酸鹽。同樣地，鹽也可以在聚合物上的陽離子和帶負(fù)電荷基團(例如羧酸根)之間形成。合適的陽離子包括鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子和銨陽離子如四甲銨離子。所述聚合物也包括那些含有季氮原子的鹽。溶劑化物指的是在聚合物和藥學(xué)上可接受的溶劑之間形成的復(fù)合物。藥學(xué)上可接受的溶劑的實例包括水、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
以下方案(i)顯示制備含有硅烷的一種示例性生物相容性聚合物的方法。
如方案(i)所示，在堿(例如二甲基氨基吡啶)的存在下，烷氧基-聚乙二醇(分子量2000)與琥珀酸酐反應(yīng)以形成mpeg-cooh，接著使用亞硫酰氯將其轉(zhuǎn)化為mpeg-cocl?；旌蟤peg-cocl與(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷，得到mpeg-硅烷。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用已知方法更改在用來制備生物相容性聚合物的上述方案(i)中所示的方法。參見r.larock，comprehensiveorganictransformations(綜合有機轉(zhuǎn)化)(vch出版社1989)；t.w.greene和p.g.m.wuts，protectivegroupsinorganicsynthesis(有機合成中的保護基)(第三版，johnwiley和sons1999)；l.fieser和m.fieser，fieser，fieserandfieser’sreagentsfororganicsynthesis(費瑟和費瑟試劑用于有機合成)(johnwiley和sons1994)；以及l(fā).paquette編輯，encyclopediaofreagentsfororganicsynthesis(用于有機合成的試劑的百科全書)(johnwiley和sons1995)及其后續(xù)版本。可用于合成所述生物相容性聚合物的具體路線也可在以下文獻(xiàn)中找到：(a)rist等人，molecules，2005，10，1169-1178，(b)koheler等人，jacs，2004，126，7206-7211；以及(c)zhang等人，biom.mircod.，2004，6∶133-40。
上述的生物相容性聚合物各自可以經(jīng)由共價鍵結(jié)合被涂覆在超順磁性核心(例如氧化鐵納米粒子)上以形成用于造影劑中的生物相容性磁性納米粒子。該超順磁性核心具有8至25nm(例如12至25nm和15至20nm)的粒徑以及120至250(mm·s)-1(例如150至230(mm·s)-1和170至210(mm·s)-1)的r2弛豫(率)。超順磁性核心的制備在本領(lǐng)域是已知的。參見laurent等人，chem.rev.，2008，108，2064-2110。
以下描述的是一種用以制備超順磁性納米粒子的典型方法。首先，將氧化鐵納米粒子懸浮于甲苯中，接著在室溫下將其與mpeg-硅烷攪拌24小時。所得的生物相容性磁性納米粒子是親水性的且可以被萃取至水相，隨后通過超濾進行純化。如此制備的生物相容性磁性納米粒子各自具有120至250(mm·s)-1(例如150至230(mm·s)-1和170至210(mm·s)-1)的r2弛豫(率)。
上述生物相容性磁性納米粒子可以配制到造影劑中，其可以口服施用。造影劑的實例包括乳劑、水性懸浮液、分散液和溶液。如需要，可添加某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。
生物相容性磁性納米粒子可以施用到患者中以標(biāo)記免疫細(xì)胞(體內(nèi))，如以下實施例中所述。不同于施用利用納米粒子預(yù)先標(biāo)記的免疫細(xì)胞(體內(nèi))，在沒有免疫細(xì)胞下施用生物相容性磁性納米粒子明顯地具有較少操作步驟以及較少監(jiān)管障礙的優(yōu)點。
不受任何理論拘束，所述生物相容性磁性納米粒子在施用至移植患者后，會被免疫細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞)攝入，其在免疫反應(yīng)發(fā)生時會在器官處聚集。換言之，如此標(biāo)記的免疫細(xì)胞可輕易地通過t1、t2、t2*或擴散加權(quán)的mri來監(jiān)測，其如t1加權(quán)的mri圖像中的高信號斑(hyperintensespot)所示，或者如t2、t2*或擴散加權(quán)的mri圖像中的低信號斑(hypointensespot)所示。進行t1、t2*或擴散加權(quán)的mri的程序與在mol.imagingbiol.，2011，13(5)，825-839中報道的進行t2加權(quán)的mri的程序相似
上述的生物相容性磁性納米粒子，當(dāng)施用至患者時，對于用于追蹤免疫細(xì)胞以監(jiān)測免疫反應(yīng)的mri展現(xiàn)出出乎意料的高敏感度。
以下的具體實施例應(yīng)解釋為僅為舉例說明性的，而不以任何方式顯示本公開內(nèi)容的其余部分。在沒有進一步的闡述下，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于在本文中的描述而將本發(fā)明的實施例利用至充分程度。本文中引述的所有出版物以其整體并入本文。
生物相容性氧化鐵納米粒子的制備
這些實施方案的兩種生物相容性氧化鐵納米粒子依據(jù)以下所描述的程序制備。
氧化鐵核心的制備
在25℃下在三頸燒瓶中以300rpm攪拌fecl2·4h2o(11.6g；0.058摩爾)、fecl3·6h2o(11.6g；0.096摩爾)和水(400ml)的混合物。以47μl/sec的速率將氫氧化鈉溶液(2.5n；170ml)加入至該燒瓶，獲得11-12的ph值。在25℃下在三頸燒瓶中以300rpm攪拌fecl2·4h2o(11.6g；0.058摩爾)、fecl3·6h2o(11.6g；0.096摩爾)和水(400ml)的混合物。以47μl/sec的速率將氫氧化鈉溶液(2.5n；170ml)添加至該燒瓶，獲得11-12的ph值。隨后，加入油酸(20ml)并攪拌30分鐘，接著加入6nhcl溶液以調(diào)整ph值至1。通過過濾，收集從混合物沉淀出的氧化鐵核心，且用水清洗4-5次以除去過量的油酸。然后將其在真空下干燥以用于如下所述的與生物相容性聚合物偶聯(lián)。
生物相容性聚合物mpeg-硅烷-750和mpeg-硅烷-2000的制備
生物相容性聚合物mpeg-硅烷-750依據(jù)以下所描述的程序制備。
允許300g(0.4摩爾)的甲氧基-peg(mpeg，分子量750)、琥珀酸酐(48g；0.48摩爾)和4-二甲基氨基-吡啶(dmap；19.5g；0.159摩爾)的混合物在1000-ml圓底燒瓶中在真空下(20托)靜置2小時。將600ml的甲苯加入至該混合物，然后將其在30℃攪拌一天以形成mpeg-cooh。
隨后，以1ml/min的速率加入36ml(0.48摩爾)的亞硫酰氯并將混合物攪拌2至3個小時。之后，以1ml/min的速率加入333.8ml(2.4摩爾)的三乙胺以獲得大約6～7的ph。在冷卻至室溫后，將含有mpeg-cocl的混合物與94.5ml(0.4摩爾)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷在室溫下反應(yīng)至少8小時以得到mpeg-硅烷-750。
在將9l的異丙基乙醚加入至該反應(yīng)混合物之后，mpeg-硅烷-750沉淀。通過過濾收集固體產(chǎn)物，再溶解于500ml的甲苯中，并以5000rpm離心5分鐘以收集上清液，向其中加入9l的異丙基乙醚。將褐色油狀液體與異丙基乙醚分離，且在真空下干燥以獲得生物相容性聚合物mpeg-硅烷-750。
生物相容性聚合物mpeg-硅烷-2000依據(jù)上述相同的程序制備，其中使用800g(0.4摩爾)的甲氧基-peg(mpeg，分子量2000)、琥珀酸酐(48g；0.48摩爾)和4-二甲基氨基-吡啶(dmap；19.5g；0.159摩爾)的混合物。
將mpeg-硅烷-750和mpeg-硅烷-2000各自與氧化鐵核心偶聯(lián)
將如此獲得的生物相容性聚合物mpeg-硅烷-750和mpeg-硅烷-2000(250g)各自懸浮于1-1.2l的含有如上述制備的10g氧化鐵核心的甲苯溶液中。將該懸浮液攪拌24小時，接著加入水(1.5l)以萃取。萃取的水性溶液用超濾裝置過濾，用水清洗，然后濃縮至100ml，以獲得生物相容性氧化鐵納米粒子懸浮液。不管是否從mpeg-硅烷-750或mpeg-硅烷-2000制備，將氧化鐵納米粒子指定為itrast。
生物相容性氧化鐵納米粒子(itrast)的表征
如此獲得的生物相容性磁性納米粒子itrast的透射電子顯微鏡(tem)圖像使用jeoljem-2100f場發(fā)射透射電子顯微鏡獲取。這些圖像顯示itrast具有尺寸為10-12nm的氧化鐵核心。
橫向弛豫(率)(r2)以及縱向(r1)弛豫(率)依據(jù)在美國申請公開2012/0329129以及molimagingbiol，chen等人，2011，13，825-839中所描述的程序確定。itrast被確定具有205.3±2.3(mm·s)-1的r2以及18.6±0.5(mm·s)-1的r1。
檢測移植中巨噬細(xì)胞的移動和聚集
用于追蹤移植器官中的巨噬細(xì)胞的研究是依據(jù)下述程序進行。
大鼠中的心臟移植
使用異位工作心臟模型(heterotopicworking-heartmodel)的操作程序描述于pnas，2006，103(6)：1852-1857。近交系brownnorway(bn；rt1n)大鼠和darkagouti(da；rt1a)大鼠從harlanlaboratoriesinc.獲得(indianapolis，in)。在不同品系的大鼠之間(da→bn)的同種異體移植導(dǎo)致排斥，而在相同品系的大鼠之間(da→da或bn→bn)的同系移植不引起排斥。根據(jù)在j.heartlungtransplant.，1998，17，754-760以及j.hearttransplant.，1990，9，587-593中描述的指南，組織病理學(xué)地確定心臟移植物的排斥等級。
在心臟移植后1天，將每只大鼠靜脈注射3mg/kg的itrast納米粒子。觀察到巨噬細(xì)胞不均勻地分布在急性排斥的大鼠心臟中。出乎意料地，在手術(shù)后第6天進行的體內(nèi)mri表明用itrast納米粒子標(biāo)記的巨噬細(xì)胞在該同種異體移植心臟處聚集。
組織病理學(xué)確認(rèn)心外膜至心內(nèi)膜發(fā)展模式。更具體地，隨著排斥隨時間發(fā)展，巨噬細(xì)胞浸潤朝向心肌膜的內(nèi)部擴展。
在來自在體內(nèi)mri之后所收獲的心臟移植物的組織上進行h&e和perl的鐵染色。這些移植物的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析顯示由perl的鐵染色所描繪的含有鐵的細(xì)胞與巨噬細(xì)胞譜系ed1+細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。如通過h&e染色所揭示的，這些含有鐵的細(xì)胞在具有更大侵入性免疫細(xì)胞浸潤和中斷的心肌膜完整性的區(qū)域中與ed1+巨噬細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。
在豬中的腎臟移植
將主要組織相容性復(fù)合體(mhc)-錯配的豬用高劑量的他克莫司(tacrolimus)處理12天。然后將腎臟同種異體移植物(n＝5)移植到這些豬中。如預(yù)期的，在第14天，所有經(jīng)分離的腎臟同種異體移植物被排斥，如相比于第0天，血清肌酸酐濃度加倍。
在腎臟移植后1天，將每只豬靜脈注射3mg/kg或6mg/kg的itrast粒子。在第3、6、9、12和16天，通過體內(nèi)mri出乎意料地檢測到在被排斥的腎臟中聚集的由納米尺寸的itrast標(biāo)記的巨噬細(xì)胞。
事實上，還發(fā)現(xiàn)相比于血清肌酸酐，在3mg/kg和6mg/kg的itrast分別在第9天和第6天增強在皮質(zhì)附近的低信號斑，表明所有分離的腎臟的免疫排斥。
追蹤在淋巴結(jié)上的巨噬細(xì)胞
根據(jù)以下所顯示的程序研究itrast以檢測淋巴結(jié)的形態(tài)變化。
在前爪誘發(fā)使用b16-f10細(xì)胞的小鼠黑素瘤轉(zhuǎn)移模型。在腫瘤發(fā)展期間施用itrast(2、4和6mgfe/kg)至這些小鼠，且在該itrast施用之后，通過mrit2、t2*和擴散加權(quán)成像(即t2wi、t2*wi、dwi)重復(fù)地評價這些動物。
發(fā)現(xiàn)腫瘤階段顯著地影響標(biāo)記結(jié)果。當(dāng)靜脈給予劑量為4mgfe/kg的itrast時，在具有早期腫瘤的動物的前哨淋巴結(jié)和隨后淋巴結(jié)中出乎意料地觀察到短暫標(biāo)記。當(dāng)腫瘤達(dá)到晚期時，在這些淋巴結(jié)中的短暫信號的程度減弱。組織學(xué)確認(rèn)早期腫瘤為非轉(zhuǎn)移性的，而晚期腫瘤為轉(zhuǎn)移性的。
其它實施方案
在本說明書中公開的所有特征可以任意組合予以結(jié)合。在本說明書中公開的各個特征可被用于相同、等同或相似目的的備選特征所替代。因此，除非另有明確說明，公開的各個特征僅為寬泛系列的等同或相似特征的實例。
根據(jù)以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定所描述的實施方案的必要特性，且在不背離其精神和范圍的情況下，可以作出多種改變和修改以使其適合于多種用途和情形。因此，其它實施方案也在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯的是，可以對所公開的實施方案做出多種修改和變化。意圖的是，本說明書和實施例僅被認(rèn)為是例示性的，其中公開內(nèi)容的真實范圍由所附權(quán)利要求及其等同替換所指定。