交叉引用

本申請要求2014年6月16日提交的英國專利申請no:1410693.4的權(quán)益，該專利申請通過引用全文并入本文。

背景技術(shù)：

選擇性剪接可能是人類轉(zhuǎn)錄物組中的常見現(xiàn)象。內(nèi)含子保留是選擇性剪接的一個實例，其中部分加工的mrna在經(jīng)歷部分剪接后保持保留至少一個內(nèi)含子。在一些情況下，部分加工的mrna中保留的內(nèi)含子的存在可以阻止或減少功能性蛋白質(zhì)的翻譯。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及減少或防止轉(zhuǎn)錄物(例如，部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物)中的內(nèi)含子保留以及治療或預防與非故意的內(nèi)含子保留有關(guān)的疾病的方法。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種預防或治療受試者的疾病的方法，其包括降低基因轉(zhuǎn)錄物中內(nèi)含子保留的發(fā)生率，其中所述疾病是由所述基因轉(zhuǎn)錄物中的所述內(nèi)含子保留所引起的缺陷性蛋白質(zhì)表達所誘導。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括將多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含seqidno:46或與seqidno:46具有至少95％同一性的區(qū)域或者由其組成。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括將多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含seqidno:46或與seqidno:46具有至少95％同一性的區(qū)域或者由其組成。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括將多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含seqidno:3或與seqidno:3具有至少95％同一性的區(qū)域或者由其組成。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少95％同一性的序列互補的序列或由其組成。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種多核酸聚合物，其對于包含seqidno:46或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域，或者包含與seqidno:46具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種多核酸聚合物，其對于包含seqidno:3或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域，或者包含與seqidno:3具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種多核酸聚合物，其對于多核酸聚合物的區(qū)域(其中所述區(qū)域包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一互補的序列或由其組成)；或者任選地，包含與seqidno:47至434具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種多核酸聚合物，其包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少95％同一性的核酸序列或由其組成：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合；和任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種多核酸聚合物，其包含與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少95％同一性的核酸序列或由其組成；和任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種藥物組合物，其包含與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交的多核酸聚合物，其中所述靶序列在兩個g四鏈體之間，其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。在一些情況下，所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的所述保留內(nèi)含子雜交。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種藥物組合物，其包含與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件包含第一ccc基序，并且其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

在一些情況下，所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件還包含第二ccc基序。在一些情況下，所述第一ccc基序距所述第二ccc基序約3個或更多個核苷酸堿基。在一些情況下，所述多核酸聚合物與包含cccag或aggcc基序的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種藥物組合物，其包含與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序不形成g四鏈體，并且其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

在一些情況下，所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含吡啶核苷酸。在一些情況下，所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含兩個連續(xù)的吡啶核苷酸。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種藥物組合物，其包含與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，并且其中所述結(jié)合基序形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

在一些情況下，所述多核酸聚合物還能夠使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)失穩(wěn)定。在一些情況下，所述遞送載體包含細胞穿透肽或基于肽的納米顆粒。在一些情況下，所述遞送載體通過離子鍵合與所述多核酸聚合物復合。

在一些情況下，所述多核酸聚合物長度為約10至約50，約10至約45，約10至約40，約10至約30，約10至約25或約10至約20個核苷酸。在一些情況下，所述多核酸聚合物的序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％或者100％互補。在一些情況下，所述多核酸聚合物的序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列有4個或更少，3個或更少，2個或更少或1個或更少的錯配。

在一些情況下，所述多核酸聚合物在核苷部分或在磷酸酯部分被修飾。在一些情況下，所述多核酸聚合物包含一個或多個人工核苷酸堿基。在一些情況下，所述一個或多個人工核苷酸堿基包括2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基、2’-脫氧、t-脫氧-2’-氟、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)或2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)修飾的、鎖核酸(lna)、乙烯核酸(ena)、肽核酸(pna)、1’,5’-脫水己糖醇核酸(hna)、嗎啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巰基膦酸酯核苷酸或2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺。在一些情況下，所述多核酸聚合物在所述多核酸聚合物的核苷部分的核糖部分的2’羥基處被修飾。在一些情況下，在2’羥基處的修飾是通過2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基、2’-脫氧、t-脫氧-2’-氟、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)或2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)部分。在一些情況下，將甲基添加到核糖部分的2’羥基以產(chǎn)生2’-o-甲基核糖部分。在一些情況下，將甲氧基乙基添加到核糖部分的2’羥基以產(chǎn)生2’-o-甲氧基乙基核糖部分。在一些情況下，在所述2’羥基處的修飾通過亞甲基與4’碳連接。在一些情況下，核糖環(huán)被六元嗎啉環(huán)替代以產(chǎn)生嗎啉人工核苷酸類似物。在一些情況下，磷酸酯骨架被寡聚甘氨酸樣部分替代以產(chǎn)生肽核酸(pna)。在一些情況下，磷酸酯骨架被巰基或甲基修飾。在一些情況下，5’端、3’端或其組合被修飾。在一些情況下，所述修飾保護所述多核酸聚合物免受受試者中的內(nèi)源性核酸酶影響。在一些情況下，被修飾的多核酸聚合物不誘導rna酶h切割rna或者誘導rna酶h切割rna的能力降低。在一些情況下，所述多核酸聚合物被修飾以提高其穩(wěn)定性。在一些情況下，所述雜交是特異性雜交。

在一些情況下，所述多核酸聚合物與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述mrna轉(zhuǎn)錄物與seqidno:46的至少13個連續(xù)堿基具有至少80％，85％，90％或95％或者具有100％序列同一性。在一些情況下，所述多核酸聚合物與包含seqidno:46的至少10個連續(xù)堿基的mrna轉(zhuǎn)錄物雜交。在一些情況下，所述多核酸聚合物與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述mrna轉(zhuǎn)錄物與選自seqidno:6，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:15，seqidno:18，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:27，seqidno:30，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:45或其組合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％的序列同一性。在一些情況下，所述多核酸聚合物與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述mrna轉(zhuǎn)錄物與seqidno:3具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％序列同一性。在一些情況下，所述多核酸聚合物與選自seqidno:4，seqidno:5，seqidno:7，seqidno:8，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:16，seqidno:17，seqidno:19，seqidno:20，seqidno:22，seqidno:23，seqidno:25，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:31，seqidno:32，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:37，seqidno:38，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:43，和seqidno:44或其組合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％或者100％序列同一性，并且任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。在一些情況下，所述多核酸聚合物與選自seqidno:1、seqidno:2或其組合的序列具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％或具有100％序列同一性，并且任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。在一些情況下，所述多核酸聚合物與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述mrna轉(zhuǎn)錄物與選自seqidno:47-434或其組合的序列的至少13個連續(xù)堿基具有至少80％，85％，90％或95％序列同一性。

在一些情況下，所述多核酸聚合物是合成的多核酸聚合物。

在一些情況下，包含所述多核酸聚合物的所述藥物組合物用于靜脈內(nèi)或皮下施用。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種用于治療有需要的患者的疾病或病癥的組合物，其包括向所述患者施用本文公開的藥物組合物。在一些情況下，所述疾病或病癥與蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)或者特征為缺陷性剪接。在一些情況下，所述疾病或病癥是遺傳性疾病。在一些情況下，患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含含有外顯子的基因拷貝的基因組，所述外顯子在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。在一些情況下，患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含含有外顯子組的基因拷貝的基因組，所述外顯子組在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。在一些情況下，患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含所述基因的缺陷拷貝的基因組，其不能產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。在一些情況下，所述疾病或病癥是糖尿病。在一些情況下，所述疾病或病癥是癌癥。在一些情況下，所述用途的組合物還包括選擇用于治療與蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)的疾病或病癥的受試者，其包括(a)確定所述受試者是否患有與所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)的疾病或病癥；和(b)如果所述受試者患有與所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)的疾病或病癥，則向所述受試者施用權(quán)利要求42-82的藥物組合物。在一些情況下，所述用途的組合物還包括選擇用于治療特征為缺陷性剪接的疾病或病癥的受試者，其包括(a)確定所述受試者是否患有特征為缺陷性剪接的疾病或病癥；和(b)如果所述受試者患有特征為缺陷性剪接的疾病或病癥，則向所述受試者施用權(quán)利要求42-82的藥物組合物。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種治療有需要的受試者中特征為蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損的疾病或病癥的方法，其包括：(a)向所述受試者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含：誘導提高部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中內(nèi)含子剪除的治療劑；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體；其中所述受試者具有部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池，所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物能夠編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的拷貝，并且所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物各自包含抑制所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的翻譯的至少一個保留內(nèi)含子；和(b)使所述受試者的靶細胞與所述治療劑接觸，以誘導所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池的一部分經(jīng)歷剪接而從所述部分中的每個所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物去除所述至少一個保留內(nèi)含子，從而產(chǎn)生完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物，其中所述完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物被翻譯以表達所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的拷貝，這治療所述疾病或病癥。

在一些情況下，所述治療劑引起所述細胞中一種或多種剪接蛋白復合物的激活，以從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池的部分中的每個所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物去除所述至少一個保留內(nèi)含子。在一些情況下，所述治療劑抑制調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。在一些情況下，所述治療劑激活調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。在一些情況下，所述治療劑結(jié)合調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。在一些情況下，所述治療劑結(jié)合所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶多核苷酸序列。在一些情況下，所述治療劑是多核酸聚合物。在一些情況下，所述治療劑是小分子。

在一些情況下，所述藥物組合物是本文描述的藥物組合物。

在一些情況下，所述蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損包括所述蛋白質(zhì)全長功能形式的亞常態(tài)生產(chǎn)。在一些情況下，所述蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損是由于不存在所述蛋白質(zhì)全長功能形式的表達，或者所述蛋白質(zhì)全長功能形式的表達水平足夠低以引起所述疾病或病癥。在一些情況下，所述蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損包括不存在所述蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，或者產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的缺陷形式。在一些情況下，所述蛋白質(zhì)的缺陷形式是所述蛋白質(zhì)的截短形式、所述蛋白質(zhì)的錯誤折疊形式或具有異常靶結(jié)合的所述蛋白質(zhì)的形式。在一些情況下，治療所述受試者導致所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的表達增加。

在一些方面，本發(fā)明公開了一種誘導部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的加工以去除保留內(nèi)含子而產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)全長功能形式的完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的方法，其包括：(a)將分離的多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，該部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物能夠編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式且包含至少一個保留內(nèi)含子；(b)從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中去除所述至少一個保留內(nèi)含子以產(chǎn)生編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物；和(c)從所述完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物翻譯所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。在一些情況下，所述方法還包括將包含所述分離的多核酸聚合物的藥物組合物施用于有需要的受試者。

在一些情況下，所述蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損與疾病或病癥相關(guān)。在一些情況下，所述疾病或病癥是遺傳性疾病。在一些情況下，患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含含有外顯子的基因拷貝的基因組，所述外顯子在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。在一些情況下，患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含含有外顯子組的基因拷貝的基因組，所述外顯子組在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。在一些情況下，患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含所述基因的缺陷拷貝的基因組，其不能產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。在一些情況下，所述疾病或病癥是糖尿病。在一些情況下，所述疾病或病癥是癌癥。

在一些情況下，所述多核酸聚合物是反義序列。在一些情況下，所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的保留內(nèi)含子雜交。在一些情況下，所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交。在一些情況下，所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件包含ccc基序。在一些情況下，所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序不形成g四鏈體。在一些情況下，所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序在兩個g四鏈體之間。在一些情況下，所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序具有第一ccc基序和第二ccc基序。在一些情況下，所述第一ccc基序距所述第二ccc基序約3個或更多個核苷酸堿基。在一些情況下，所述多核酸聚合物的序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％或者100％互補。在一些情況下，所述多核酸聚合物的序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列有4個或更少，3個或更少，2個或更少或者1個或更少的錯配。在一些情況下，所述多核酸聚合物長度為約10至約50，約10至約45，約10至約40，約10至約30，約10至約25或約10至約20個核苷酸。

在一些情況下，所述受試者是真核生物。在一些情況下，所述受試者是選自人、小鼠、大鼠、非人靈長類動物或非靈長類哺乳動物的真核生物。

在一些方面，描述了一種藥物組合物，其包含與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

附圖說明

本發(fā)明的新穎特征在所附權(quán)利要求中具體闡述。通過參考以下詳細描述式以及附圖將獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好理解，所述詳細描述闡述了利用本發(fā)明的原理的說明性實施方，附圖中：

圖1.sso在人胰島素原基因中的位置。(a)ins報道體及其mrna產(chǎn)物的示意圖。sso顯示為外顯子(編號框)下方和內(nèi)含子1(線)下方的黑色水平條；它們的序列在表2中。起始和終止密碼子由箭頭表示。標準(實線)和隱蔽(虛線)剪接顯示在初級轉(zhuǎn)錄物上方；隱蔽剪接位點的名稱為灰色。sso靶向內(nèi)含子1區(qū)段del4-del7在下方圖中顯示。(b)由ins報告基因構(gòu)建體產(chǎn)生的mrna異構(gòu)體(編號1-6)。不產(chǎn)生胰島素原的異構(gòu)體的描述用*標記。

圖2.sso誘導的ins內(nèi)含子1保留的抑制。(a)用指示的sso將ins報告基因構(gòu)建體(icd-f)共轉(zhuǎn)染到hek293細胞中。圖1b中描述的剪接產(chǎn)物在右側(cè)示出。條代表相對于天然轉(zhuǎn)錄物的含內(nèi)含子1的異構(gòu)體的百分比(上圖)或相對于總數(shù)的內(nèi)含子2的隱蔽3’剪接位點的剪接百分比(下圖)。誤差棒表示sd；sc，亂序?qū)φ?scrambledcontrol)；sso-，“無sso”對照。sso的最終濃度為1、3、10和30nm，除了sso6和sso8(10和30nm)。(b)缺乏內(nèi)含子2的隱蔽3ss的克隆中，sso21介導的內(nèi)含子1剪接的促進。rna產(chǎn)物在右側(cè)。(c)在含有和缺乏內(nèi)含子2的隱蔽3’ss的轉(zhuǎn)錄物中，sso21誘導的內(nèi)含子1保留的倍數(shù)變化。在重復的轉(zhuǎn)染中sso21的終濃度為30nm。報告基因構(gòu)建體的名稱在底部。

圖3.靶向隱蔽3’剪接位點的inssso。(a)通過sso6激活內(nèi)含子2的隱蔽3’ss(cr3’ss+126；圖1a)和通過sso8促進外顯子2跳讀。每種sso的濃度為2、10、50和250nm。sso顯示在頂部，剪接產(chǎn)物顯示在右側(cè)，報道體顯示在底部。(b)ins內(nèi)含子2的真實和隱蔽3’ss之間的預測的穩(wěn)定發(fā)夾。由sso6靶向的堿基用星號表示，并且預測的剪接增強子六聚體(右側(cè)列出)用虛線表示。(c)sso4不阻止u2af35耗盡的細胞中其真實對應物(cr3’ss+81)下游的隱蔽3’ss81個堿基對的激活，但誘導外顯子跳讀。cos7細胞中每種sso的最終濃度為5、20和80nm。sirna雙鏈體u2af35ab(77)的最終濃度為70nm。報道體與a圖中相同。

圖4.通過單核苷酸分辨率的反義微行走(microwalk)優(yōu)化內(nèi)含子保留靶。(a)寡核糖核苷酸的位置。用于cd/nmr的微行走sso和寡聚物分別由在初級轉(zhuǎn)錄物下方和上方的水平黑條表示。預測形成rnag-四鏈體的內(nèi)含子1序列以灰色突出顯示。微行走方向由灰色箭頭表示；獲勝寡聚物以黑色突出顯示?？虮硎敬饲皥蟮赖膯魏塑账岫鄳B(tài)性(20)。(b)兩種細胞系中每種微行走sso的內(nèi)含子保留水平。誤差條表示從報道體icd-f的兩個獨立的共轉(zhuǎn)染獲得的sd。

圖5.rna二級結(jié)構(gòu)形成的生物物理表征。(a)在25℃下對于cd1(19聚體)和cd2(20聚體)rna的遠uvcd譜，分別顯示在265和270nm處的橢圓率最大值。(b)在800mhz和298k下記錄的cd1和cd2的1hnmr譜，顯示來自h鍵合的g堿基的共振的特征組。(c)兩種rna的s形cd熔解曲線，分別顯示在56.8±0.2℃和69.0±0.45℃的轉(zhuǎn)換中點。為了清楚起見，兩條曲線已經(jīng)略微相互移動。(d)對于cd1所提出的具有通過短環(huán)序列連接的兩個堆疊的g-四聯(lián)體的平行四鏈體結(jié)構(gòu)(上圖)。cd2的預測發(fā)夾結(jié)構(gòu)顯示在下圖。g→c突變?yōu)榧t色。

圖6.涉及反義靶的四鏈體/發(fā)夾構(gòu)象轉(zhuǎn)換。(a)提出在包含寡核糖核苷酸cd3的富g基序內(nèi)形成的發(fā)夾(黑色)和四鏈體(深藍色)結(jié)構(gòu)之間的示意性平衡。cd4含有cc→uu突變(以*突出顯示)。(b)9-15ppm區(qū)域中的nmr譜顯示對應于氫鍵合堿基的亞氨基質(zhì)子信號。10和12ppm之間的信號是g-四聯(lián)體內(nèi)的hoogsteen氫鍵合的g的特征(q盒)，而>12ppm的信號指示發(fā)夾結(jié)構(gòu)內(nèi)的沃森-克里克a-u和g-c堿基對(h盒)。在cd3中，發(fā)夾h1被明顯填充，但是cd4中的突變使h1失穩(wěn)定，使得h2成為主要物質(zhì)，兩者都與四鏈體結(jié)構(gòu)平衡。(c)兩種可能發(fā)夾的mfold預測，與nmr數(shù)據(jù)一致。(d)通過cc→uu突變在發(fā)夾結(jié)構(gòu)失穩(wěn)定時內(nèi)含子保留的減少。誤差條表示使用報道體icd-c的重復實驗的sd。del5，缺乏區(qū)段del5的icd-c報道體(圖1a)；m1，含有使g-四鏈體和莖-環(huán)失穩(wěn)定的兩個置換(表1a)的報道體。

圖7.針對內(nèi)含子保留鑒別與包含反義靶的前mrna相互作用的蛋白質(zhì)。(a)瞬時轉(zhuǎn)染到hek293t細胞中后野生型和突變報告基因構(gòu)建體(icd-c)的內(nèi)含子保留水平。突變顯示在表1a中。rna產(chǎn)物在右側(cè)。預測的rna四鏈體、發(fā)夾h1/h2以及上游和下游c4運行的存在在凝膠圖下方顯示。誤差棒表示從兩個重復實驗獲得的sd。(b)測試rna的內(nèi)含子保留水平與它們在反義靶上的預測的穩(wěn)定性相關(guān)。(c)使用右側(cè)所示的抗體的下拉試驗的蛋白質(zhì)印跡分析。ne，核提取物；b，僅珠的對照；av3，含胞嘧啶對照rna寡聚物運行和3’ssag(7)。cd5rna的序列顯示在圖4a中。

圖8.dhx36耗盡時富含四鏈體和缺乏四鏈體的小基因的剪接模式。(a)報告基因構(gòu)建體的示意圖。預測的四鏈體由黑色矩形表示；它們的密度示于表1中。對外顯子(盒)編號；正斜線表示f9內(nèi)含子3的縮短(24)。f9和tsc2小基因分別含有影響剪接的分支點置換c.253-25c和c.5069-18c(24)。cr5’ss-104；內(nèi)含子2的真實5’ss上游的隱蔽5’ss104。(b)用針對dhx36的抗體進行的免疫印跡。sc，亂序sirna；c，未處理細胞。誤差棒是兩個轉(zhuǎn)染實驗的sd。(c-e)指示的報道體的內(nèi)含子保留和外顯子跳讀。dhx36sirna的終濃度為50nm。rna產(chǎn)物在右側(cè)示意性地顯示。誤差棒是兩個轉(zhuǎn)染實驗的sd。

具體實施方式

如真核基因的基因含有必須準確地從初級轉(zhuǎn)錄物中去除以產(chǎn)生能夠編碼蛋白質(zhì)的功能性mrna的間插序列或內(nèi)含子(1)。該過程以高度動態(tài)的方式改變mrna組成，利用五種小核rna(snrna)(例如u1、u2、u4、u5和u6)和大量蛋白質(zhì)與前mrna中的保守但簡并的序列的相互依賴的相互作用。特別地，內(nèi)含子可以由核心剪接位點元件限定，所述核心剪接位點元件包含可包含保守gu基序的5’剪接位點、可以終止于不變的ag基序的3’剪接位點(3’ss)、可包含保守腺嘌呤堿基的分支點序列和多聚嘧啶(py)序列。剪接反應可以在u1snrnp與5’ss上的保守gu基序結(jié)合時開始，隨后在分支點的保守腺嘌呤堿基處u2snrnp結(jié)合，和最后是在5’和3’剪接位點附近的u4、u5和u6snrnp相互作用。由snrnp和相應內(nèi)含子形成的復合體可以稱為剪接體。另外的剪接因子如u2小核rna輔助因子1(u2af35)、u2af2(u2af65)和剪接因子1(sf1)可以有助于剪接體組裝和促進剪接事件。

內(nèi)含子剪接通常促進跨種類的mrna累積和蛋白質(zhì)表達(3-5)。這個過程可以通過內(nèi)含子突變或變體而改變，該內(nèi)含子突變或變體也可以削弱偶聯(lián)的基因表達途徑，包括轉(zhuǎn)錄、mrna輸出和翻譯。這通過5’utr中的內(nèi)含子示例，其中改變內(nèi)含子保留的天然變體或突變改變具有上游開放閱讀框(uorf)或其他調(diào)節(jié)基序的轉(zhuǎn)錄物的相對豐度并顯著影響翻譯(6,7)。此外，由于缺陷性剪接(例如內(nèi)含子保留)引起的受損蛋白質(zhì)翻譯已經(jīng)導致疾病的發(fā)生和/或疾病的進展，例如遺傳障礙或病癥(如遺傳性疾病或癌癥)。然而，尚未開發(fā)出在這類情況下使基因表達正?；某晒Φ男蛄刑禺愋圆呗?。

剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸(sso)是通過結(jié)合剪接位點識別或調(diào)節(jié)序列并與順式和反式作用因子競爭其靶標來調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接的反義試劑(8)。它們已經(jīng)顯示為恢復異常剪接、改變現(xiàn)有mrna的相對表達或產(chǎn)生不正常表達的新型剪接變體(8)。通過大量sso修飾(例如2’-o-甲基和2’-o-甲氧基乙基核糖)提高的靶向sso-rna雙鏈體的穩(wěn)定性有利于探索其對于越來越多的人類疾病基因的治療潛力的研究，包括肌肉營養(yǎng)不良中的dmd(9，10)、脊髓性肌萎縮中的smn2(11)、共濟失調(diào)-毛細血管擴張癥中的atm(12)和x連鎖無丙種球蛋白血癥中的btk(13)。雖然這些方法接近于實現(xiàn)其對有限數(shù)量的疾病的臨床潛力(8)，但由突變誘導的異常剪接(14)所導致的>300種孟德爾病癥和越來越多的復雜性狀可能適合于sso介導的基因表達的改正。

1型糖尿病的病因?qū)W具有由人白細胞抗原(hla)和多種修飾性非hla基因座賦予的強遺傳成分(15)。在染色體11上的胰島素原基因(ins)區(qū)域(稱為iddm2)中鑒別到最強的修飾子(modifier)(15)。這一區(qū)域的進一步作圖表明ins是最可能的iddm2靶標(16)，與這種自身抗原在發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用一致(17)。在iddm2處對于這種疾病的遺傳風險已歸因于與易感性和保護性ins單倍型的差異穩(wěn)態(tài)rna水平，可能涉及該基因上游的小衛(wèi)星dna序列(18，19)。然而，對天然存在的ins多態(tài)性的系統(tǒng)性檢驗揭示了沒有小衛(wèi)星序列的報告基因構(gòu)建體中單倍型特異性胰島素原表達水平，其由內(nèi)含子1(7)中稱為ivs1+5ins4(也稱為rs3842740或ins-69)和ivs1-6a/t(rs689，ins-27或hphi+/-)的兩個變體所導致(16，20)。前一個變體激活內(nèi)含子1的隱蔽5’剪接位點，而位于3’剪接位點(3’ss)上游6個核苷酸的后一個變體的腺嘌呤(a)促進內(nèi)含子保留，從而增加具有延伸的5’utr的轉(zhuǎn)錄物的相對豐度(21)。與胸腺嘧啶(t)相比，ivs1-6a/t的a等位基因在體外降低了對嘧啶結(jié)合蛋白的親和力，并使3’ss更依賴于u2小核核糖核蛋白的輔助因子(u2af)(7)(u2結(jié)合、剪接體組裝和3’ss選擇所需的異源二聚體(22))。含內(nèi)含子1的轉(zhuǎn)錄物在從產(chǎn)生胰島素的組織制備的ivs1-6a衍生cdna文庫中過度表現(xiàn)(21)，從核排出(23)，并含有與高等靈長類中內(nèi)含子1的3’ss的弛緩(relaxation)共同進化的短的人亞科特異性uorf(7)。由a等位基因賦予的更低的胰島素原表達可能導致胰島素原肽在胎兒胸腺中的次優(yōu)表現(xiàn)和自身反應性t細胞的不充分負向選擇，最終導致胰腺中產(chǎn)生胰島素的β細胞的自身免疫破壞(7)。

本發(fā)明的目的是誘導部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的加工以去除保留內(nèi)含子，從而產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物。另外的目的是在有需要的受試者中治療特征為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損的疾病或病癥和/或特征為缺陷性剪接的疾病或病癥。

本發(fā)明的另一個目的是改正從含有ivs1-6a的前mrna中去除ins內(nèi)含子1的低效率，并將內(nèi)含子保留降低至針對疾病保護性t等位基因所觀察到的水平。本發(fā)明的另一個目的是提供包括特征為不規(guī)則或異常內(nèi)含子保留(或與之相關(guān))的遺傳疾病(包括癌癥)的新治療方法。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種預防或治療受試者的疾病的方法，其包括成熟基因轉(zhuǎn)錄物中內(nèi)含子保留的改正，其中所述疾病由所述基因轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留所引起的缺陷性蛋白質(zhì)表達所誘導。

保留的內(nèi)含子

保留的內(nèi)含子是也可包括外顯子跳讀、選擇性5’剪接位點、選擇性3’剪接位點和互斥外顯子的五種類型的選擇性剪接中的一種。當外顯子被跳過或從加工的mrna中剪切掉時，可以發(fā)生外顯子跳讀，且其可能是最常見的選擇性剪接類型。選擇性5’ss和選擇性3’ss可以表示選擇性剪接位點，例如隱蔽剪接位點或假剪接位點。當剪接后加工的mrna中僅保留兩個外顯子中的一個時，可以出現(xiàn)互斥外顯子。雖然內(nèi)含子保留可能比外顯子跳讀更不常見，但已表明內(nèi)含子保留比以前認識到的更加頻繁地發(fā)生。事實上，desouza小組對21,106個人基因的研究已經(jīng)表明，測試的基因中約15％顯示內(nèi)含子保留(參見galante等人，“detectionandevaluationofintronretentioneventsinthehumantranscriptome”，bioinformatics10：757-765(2004))。此外，moore小組的研究已經(jīng)顯示約35％的人5’-utr和約16％的3’-utr攜帶內(nèi)含子(bicknell等人，“intronsinutrs：whyweshouldstopignoringthem，bioessays34：1025-1034(2012))。因此，內(nèi)含子保留可在編碼區(qū)中、在非編碼區(qū)中、在5’utr處或在3’utr處發(fā)生。在編碼區(qū)中，保留內(nèi)含子可以在框架中編碼氨基酸，或者可以是在可以由于終止密碼子或閱讀框移位而產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)或非功能性蛋白質(zhì)的錯位中。此外，內(nèi)含子可以在兩個外顯子之間、位于5’utr處或位于3’utr處。

與非保留內(nèi)含子相比，保留內(nèi)含子可以被表征為具有較短的序列長度。保留內(nèi)含子的序列長度可以小于5kb，小于4kb，小于3kb，小于2.5kb，小于2kb，小于1.5kb，小于1kb，小于0.5kb，小于0.4kb，小于0.3kb，小于0.2kb或小于0.1kb。

此外，與非保留內(nèi)含子相比，保留內(nèi)含子可以表征為具有約40％至約60％的g/c含量。保留內(nèi)含子的g/c含量可以為約40％，45％，50％，55％或約60％。

保留內(nèi)含子也可以側(cè)鄰弱5’剪接位點、弱3’剪接位點或兩者。弱剪接位點可以指可能需要調(diào)節(jié)蛋白(例如內(nèi)含子剪接增強子)起作用的剪接位點。

此外，保留內(nèi)含子可包含相對于非保留內(nèi)含子較低的ggg基序存在。在一些情況下，ggg基序是內(nèi)含子剪接增強子。

部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物是已經(jīng)經(jīng)歷部分剪接并包含至少一個保留內(nèi)含子的mrna轉(zhuǎn)錄物。所述至少一個內(nèi)含子可以是在5’utr、3’utr內(nèi)，或處于兩個外顯子之間的內(nèi)部位置處。部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物可能不能被翻譯以產(chǎn)生功能性或全長蛋白質(zhì)。

部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物可包含特征為短序列長度的內(nèi)含子。部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物可包含特征為小于3kb，小于2.5kb，小于2kb，小于1.5kb，小于1kb，小于0.5kb，小于0.4kb，小于0.3kb，小于0.2kb或小于0.1kb的序列的內(nèi)含子。

部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物可包含特征為具有約40％至約60％的g/c含量的內(nèi)含子。部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物可包含特征為具有約40％，45％，50％，55％或約60％的g/c含量的內(nèi)含子。

部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物可包含側(cè)鄰弱5’剪接位點、弱3’剪接位點或兩者的內(nèi)含子。

部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物可包含相對于非保留內(nèi)含子具有較低的ggg基序存在的內(nèi)含子。

在一些情況下，一個或多個內(nèi)含子保留在部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中。部分加工的mrna可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個保留內(nèi)含子。

完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物是已經(jīng)經(jīng)歷剪接以去除內(nèi)含子(例如保留內(nèi)含子)并且能夠被翻譯以產(chǎn)生蛋白質(zhì)(例如全長功能性蛋白質(zhì))的轉(zhuǎn)錄物。具有一個或多個保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物可以被剪接從而成為完全加工的mrna。

全長功能蛋白具有與野生型形式的蛋白相同的長度和功能。全長功能蛋白可以是野生型形式的蛋白。全長功能蛋白可以是與野生型蛋白具有相同長度的野生型蛋白的異形體。全長功能蛋白可包含突變，例如氨基酸置換具有相似性質(zhì)的可選氨基酸殘基，使得蛋白質(zhì)的表型(例如，功能)不被突變改變。

具有相似性質(zhì)的示例性氨基酸可包括具有帶電側(cè)鏈的氨基酸：帶正電荷的精氨酸、組氨酸和賴氨酸；或帶負電荷的天冬氨酸和谷氨酸；極性氨基酸殘基：絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；非極性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸；和芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

在一些情況下，部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物導致蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損。蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損可以是蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損，其可包括蛋白質(zhì)全長功能形式的亞常態(tài)生產(chǎn)。蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損可包括蛋白質(zhì)的缺陷形式的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)的缺陷形式可以是蛋白質(zhì)的截短形式、蛋白質(zhì)的錯誤折疊形式或包含異常靶結(jié)合位點的蛋白質(zhì)的形式。

多核酸聚合物

本文所述的多核酸聚合物可用于與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物雜交以啟動保留內(nèi)含子的去除。在一些情況下，多核酸聚合物是反義多核酸聚合物。反義多核酸聚合物可以與具有高g/c含量的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域(例如包含約40％至約60％的區(qū)域)雜交。反義多核酸聚合物可包含高g/c含量，例如約40％至約60％。反義多核酸聚合物可以與在弱5’剪接位點或弱3’剪接位點處、接著弱5’剪接位點或弱3’剪接位點或者其附近的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域雜交。反義多核酸聚合物可以與可包含較低的ggg基序存在的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域雜交。

多核酸聚合物的反義序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的保留內(nèi)含子雜交。反義序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交。內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件可包括內(nèi)含子剪接增強子或內(nèi)含子剪接沉默子。反義序列可以與內(nèi)含子剪接沉默子雜交。內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件可以通過影響剪接體裝配的早期和/或中間步驟來調(diào)節(jié)剪接，例如當u1和u2snrnp在外顯子限定期間或在隨后轉(zhuǎn)換為內(nèi)含子跨越復合物期間在跨外顯子的剪接位點處配對時。示例性內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件可包括多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白(ptb)、u2af65和/或u2af35、hnrnpl和hnrnpa1。

多核酸聚合物可以在內(nèi)含子的5’剪接位點、3’剪接位點、分支點、多聚嘧啶序列或內(nèi)含子增強子處雜交。多核酸聚合物還可以在離5’剪接位點、3’剪接位點、分支點、多聚嘧啶序列或內(nèi)含子增強子約30個堿基、25個堿基、20個堿基、15個堿基、10個堿基或5個堿基的距離處雜交以促進或增強剪接。多核酸聚合物在剪接位點處或剪接位點附近的雜交可以通過向剪接位點募集剪接因子而促進或增強剪接，從而啟動剪接。

多核酸聚合物可以在內(nèi)含子沉默子位點(例如，從頭(denovo)內(nèi)含子沉默子位點)、隱蔽內(nèi)含子剪接位點或假剪接位點處雜交。內(nèi)含子沉默子位點可被抑制剪接反應的沉默子識別。隱蔽內(nèi)含子剪接位點可以通過突變(例如置換、缺失或插入)產(chǎn)生。隱蔽內(nèi)含子剪接位點可以是隱蔽5’剪接位點或隱蔽3’剪接位點。隱蔽內(nèi)含子剪接位點可以是隱蔽5’剪接位點。假剪接位點可以是弱剪接位點，其中其激活可以由標準剪接位點的突變引起。假剪接位點可以是假5’剪接位點或假3’剪接位點。內(nèi)含子沉默子位點處的雜交可以在空間上阻斷沉默子結(jié)合，并且可以從防止剪接體組裝的破壞和剪接體的加工而幫助。在隱蔽內(nèi)含子剪接位點處的雜交可以將相互作用重定向到標準剪接位點，例如標準弱剪接位點。

多核酸聚合物可以與內(nèi)含子的內(nèi)部區(qū)域雜交。內(nèi)含子的內(nèi)部區(qū)域可以不包含剪接位點，例如5’剪接位點(例如，標準、隱蔽或假5’剪接位點)、3’剪接位點(例如，標準、隱蔽或假3’剪接位點)、增強子位點或沉默子位點。多核酸聚合物在內(nèi)部區(qū)域處的雜交可以通過向剪接位點(例如內(nèi)含子增強子位點)募集剪接因子來促進或增強剪接。

多核酸聚合物可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交。內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件可包含ccc基序。反義序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中結(jié)合基序不形成g四鏈體。反義序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中結(jié)合基序在兩個g四鏈體之間。反義序列還可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中結(jié)合基序具有第一ccc基序和第二ccc基序。第一ccc基序可以距第二ccc基序約3個或更多個核苷酸堿基。

多核酸聚合物可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中結(jié)合基序形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。多核酸聚合物還可以能夠使發(fā)夾結(jié)構(gòu)失穩(wěn)定。

多核酸聚合物可以在3’端位置和/或在5’端位置包含吡啶核苷酸。多核酸聚合物還可以在3’端位置和/或5’端位置包含兩個連續(xù)的吡啶核苷酸。

在一些情況下，多核酸聚合物可以是剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸(sso)。剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的保留內(nèi)含子雜交。剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交。

剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸(sso)已經(jīng)廣泛用于抑制外顯子的使用(exonusage)，但尚未開發(fā)出促進整個內(nèi)含子的去除以增加剪接介導的基因表達的反義策略。使用一系列含有人胰島素原基因的剪接報道體，已經(jīng)顯示可以減少結(jié)合源自表達低水平胰島素原的人單倍型的轉(zhuǎn)錄物的sso的ins內(nèi)含子1保留。通過競爭非標準和標準rna結(jié)構(gòu)從5’utr去除弱內(nèi)含子的sso輔助促進有助于開發(fā)基于序列的反義策略以增強基因表達。

術(shù)語“內(nèi)含子保留的改正”理解為改正不規(guī)則或異常的內(nèi)含子保留。改正可以是完全改正或部分改正。改正可包括降低內(nèi)含子保留的發(fā)生率。改正可包括減少異常的內(nèi)含子保留。

在由基因轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留引起的蛋白質(zhì)表達的上下文中提及“缺陷性”可包括不充分的、缺陷的或異常的蛋白質(zhì)表達。

內(nèi)含子保留的改正可包括施用配置為與基因轉(zhuǎn)錄物雜交的多核酸聚合物。內(nèi)含子保留的改正可包括施用配置為與基因轉(zhuǎn)錄物雜交以改變基因轉(zhuǎn)錄物中的更高級結(jié)構(gòu)的多核酸聚合物。內(nèi)含子保留的改正可包括施用配置為與基因轉(zhuǎn)錄物雜交以干擾以下中的一個或多個的多核酸聚合物：經(jīng)典rna結(jié)構(gòu)(莖環(huán))、非經(jīng)典rna結(jié)構(gòu)(g四鏈體)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，與反式作用因子的相互作用和rna-蛋白復合物形成速率。內(nèi)含子保留的改正可包括施用配置為與基因轉(zhuǎn)錄物雜交以干擾(例如阻斷)經(jīng)典(莖環(huán))和/或非經(jīng)典(g四鏈體)rna結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變的多核酸聚合物。多核酸聚合物可以對于包含內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含在哺乳動物中保守的重疊內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含含有短的五聚體至七聚體剪接調(diào)節(jié)基序的內(nèi)含子區(qū)段或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。剪接調(diào)節(jié)基序可包含cccag或aggcc。剪接調(diào)節(jié)基序可包含由yeogw等人(2007)提供的基序中的任一種。plosgenet3：e85和/或voelkerrb,&berglundja(2007)，genomeres17：1023-1033，兩篇文獻通過引用并入本文。靶區(qū)域可以不包含c運行以避免g-四鏈體形成。靶區(qū)域可以不靠近5’和3’剪接位點、多聚嘧啶序列、分支位點和/或超分支區(qū)域。

多核酸聚合物可提供已顯示影響ins內(nèi)含子1和外顯子2剪接的剪接因子(包括tra2、srsf3或u2af35，或其它肽、正義或反義核酸、小分子或其它化學品)的結(jié)合平臺，以促進多核酸聚合物的遞送和/或?qū)⒑怂岚邢虻教囟ńM織、細胞或發(fā)育階段。這樣的反義策略可以幫助減少癌細胞(特別是含有剪接因子基因的體細胞突變的那些)中的普遍內(nèi)含子保留，如首先對于在骨髓增生性疾病中u2af35的鋅指結(jié)構(gòu)域中的特定置換顯示的(76)。這些突變在許多腫瘤中發(fā)生并導致可能有助于惡性生長的剪接缺陷。本發(fā)明可以幫助在攜帶涉及3’剪接位點識別的剪接因子中的突變的顯著部分的癌癥患者中(目前估計為>15％)控制細胞增殖并減少惡性生長(76)。

多核酸聚合物的序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或99.5％互補。多核酸聚合物的序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列100％互補。

多核酸聚合物的序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列有4個或更少的錯配。多核酸聚合物的序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列有3個或更少的錯配。多核酸聚合物的序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列有2個或更少的錯配。多核酸聚合物的序列可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列有1個或更少的錯配。

多核酸聚合物可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列特異性雜交。特異性可以是多核酸聚合物與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列的95％，98％，99％，99.5％或100％的序列互補性。雜交可以在高嚴格的雜交條件下進行。

多核酸聚合物可以對于包含seqidno:46或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少99％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少98％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少95％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少90％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少85％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少80％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少75％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少70％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少65％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少60％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少55％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:46具有至少50％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。

多核酸聚合物可以與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，該mrna轉(zhuǎn)錄物與seqidno:46的至少13個連續(xù)堿基具有至少80％，85％，90％、95％或99％的序列同一性。多核酸聚合物可以與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，該mrna轉(zhuǎn)錄物與seqidno:46的至少13個連續(xù)堿基具有100％的序列同一性。

多核酸聚合物可以對于包含seqidno:3或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少99％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少98％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少95％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少90％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少85％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少80％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少75％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少70％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少65％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少60％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少55％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少50％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。

提及對于轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分反義的可包括至少5個連續(xù)核苷酸或至少10個連續(xù)核苷酸。多核酸聚合物可以對于包含seqidno:46或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少5個連續(xù)核苷酸是反義的。多核酸聚合物可以對于包含seqidno:46或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少10個連續(xù)核苷酸是反義的。多核酸聚合物可以對于包含seqidno:46或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少15個連續(xù)核苷酸是反義的。多核酸聚合物可以對于包含seqidno:46或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少20個連續(xù)核苷酸是反義的。

多核酸聚合物可以與包含seqidno:46的至少10個連續(xù)堿基的mrna轉(zhuǎn)錄物雜交。多核酸聚合物可以與由seqidno:46的至少10個連續(xù)堿基組成的mrna轉(zhuǎn)錄物雜交。

多核酸聚合物可以對于包含選自包括以下的組中任一的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。

多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少99％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少98％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少90％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以與包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少85％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少80％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少75％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少70％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少65％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少63％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少60％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少50％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。

多核酸聚合物可以對于包含選自包括以下的組中任一的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；和seqidno:36或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少99％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；和seqidno:36或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少98％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；和seqidno:36或其組合。多核酸聚合物可以對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少95％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；和seqidno:36或其組合。

多核酸聚合物可以對于包含seqidno:3或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含seqidno:6或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含seqidno:9或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含seqidno:36或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的。

多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:3具有至少99％，至少98％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少63％，至少60％，至少55％或至少50％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:6具有至少99％，至少98％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少63％，至少60％，至少55％或至少50％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:9具有至少99％，至少98％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少63％，至少60％，至少55％或至少50％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與seqidno:36具有至少99％，至少98％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少63％，至少60％，至少55％或至少50％同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的。

多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少99％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少98％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少95％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少90％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少85％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少80％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一種具有至少75％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少70％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少65％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少60％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少55％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。多核酸聚合物可以對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少50％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解尿嘧啶核苷酸可以被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。

多核酸聚合物可包含選自包括以下的組中任一的多核酸聚合物序列或由其組成：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。

多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少99％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少98％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少95％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一種的序列具有至少90％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少85％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少80％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少75％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少70％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少65％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少60％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少55％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少50％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。

多核酸聚合物可包含選自包括以下的組中任一的多核酸聚合物序列或由其組成：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少99％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少98％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少95％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少90％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少85％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少80％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少75％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少70％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少65％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少60％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少55％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少50％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno5；seqinno:7；seqidno:8；seqidno:34；和seqidno:35或其組合。

多核酸聚合物可包含seqidno:1或seqidno:2或者由其組成。多核酸聚合物可包含seqidno:3或seqidno:4或者由其組成。多核酸聚合物可包含seqidno:7或seqidno:8或者由其組成。多核酸聚合物可包含seqidno:34或seqidno:35或者由其組成。

多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少99％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少98％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少95％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少90％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少85％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少80％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少75％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少70％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少65％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:1或seqidno:2具有至少60％同一性的序列或由其組成。

多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少99％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少98％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少95％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少90％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少85％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少80％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少75％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少70％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少65％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:3或seqidno:4具有至少60％同一性的序列或由其組成。

多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少99％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少98％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少95％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少90％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少85％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少80％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少75％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少70％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少65％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:7或seqidno:8具有至少60％同一性的序列或由其組成。

多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少99％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少98％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少95％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少90％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少85％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少80％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少75％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少70％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少65％同一性的序列或由其組成。多核酸聚合物可包含與seqidno:34或seqidno:35具有至少60％同一性的序列或由其組成。

多核酸聚合物可包含選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的多核酸聚合物序列或由其組成。多核酸聚合物可包含選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的多核酸聚合物序列或由其組成，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。

多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少99％同一性。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少99％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少98％同一性。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少98％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少95％同一性。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少95％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少90％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少85％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少80％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少75％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少70％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少65％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少60％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少55％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。多核酸聚合物可包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少50％同一性，其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。

有利地，本發(fā)明鑒別了降低內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄物(例如，內(nèi)含子1保留的轉(zhuǎn)錄物)的相對豐度的sso，并以單核苷酸分辨率描述優(yōu)化的反義靶標。

多核酸聚合物可包含剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸(sso)。多核酸聚合物長度可以為約50個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約45個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約40個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約35個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約30個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約25個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約20個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約19個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約18個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約17個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約16個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約15個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約14個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約13個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約12個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約11個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約10個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約10至約50個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約10至約45個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約10至約40個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約10至約35個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約10至約30個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約10至約25個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約10至約20個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約15至約25個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約15至約30個核苷酸。多核酸聚合物長度可以為約12至約30個核苷酸。

多核酸聚合物(例如sso)可包含rna或dna。多核酸聚合物(例如sso)可包含rna。多核酸聚合物(例如sso)可包含具有與dna或rna等同的互補作用的天然或合成或人工核苷酸類似物或堿基。多核酸聚合物(例如sso)可包含dna、rna和/或核苷酸類似物的組合。核苷酸類似物可包括pna或lna。在另一個實施方式中，核酸(例如sso)可包含pmo或由其組成。

在一些情況下，合成或人工核苷酸類似物或堿基可包含在核糖部分、磷酸酯部分、核苷部分或其組合中的一個或多個處的修飾。

核苷酸類似物或人工核苷酸堿基可構(gòu)成在核糖部分的2’羥基處具有修飾的核酸。修飾可以是2’-o-甲基修飾或2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)修飾。2’-o-甲基修飾可以向核糖部分的2’羥基添加甲基，而2’o-甲氧基乙基修飾可以向核糖部分的2’羥基添加甲氧基乙基。下面圖示說明腺苷分子的2’-o-甲基修飾和尿苷的2’o-甲氧基乙基修飾的示例性化學結(jié)構(gòu)。

2’羥基處的另外的修飾可包括2’-o-氨基丙基糖構(gòu)象，其可以涉及延長的胺基(包含將胺基結(jié)合到2’氧的丙基接頭)。這種修飾可以通過每個糖從胺基引入一個正電荷來中和寡核苷酸分子的磷酸酯來源的總負電荷，并且可以由于其兩性離子性質(zhì)而由此改善細胞攝取性質(zhì)。下文圖示說明2’-o-氨基丙基核苷亞磷酰胺的示例性化學結(jié)構(gòu)。

2’羥基處的另外的修飾可包括鎖定或橋接的核糖構(gòu)象(例如，鎖核酸或lna)，其中也可以涉及4’核糖位置。在該修飾中，在2’碳處結(jié)合的氧分子可以通過亞甲基與4’碳連接，從而形成2’-c,4’-c-氧-亞甲基連接的雙環(huán)核糖核苷酸單體。下文圖示說明lna的化學結(jié)構(gòu)的示例性表示。左側(cè)所示的表現(xiàn)形式突出顯示了lna單體的化學連接性。右側(cè)所示的表現(xiàn)形式突出顯示了lna單體的呋喃糖環(huán)的鎖定的3’-內(nèi)(3e)構(gòu)象。

在2’羥基處的另外的修飾可包括乙烯核酸(ena)，例如2’-4’-亞乙基橋接核酸，其將糖構(gòu)象鎖定為c3’-內(nèi)糖折疊構(gòu)象。ena是同樣包含lna的修飾核酸的橋接核酸類的部分。下文圖示說明ena和橋接核酸的示例性化學結(jié)構(gòu)。

在2’羥基處的再其它的修飾可包括2’-脫氧、t-脫氧-2’-氟、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)或2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)。

核苷酸類似物可以進一步包括嗎啉核苷酸、肽核酸(pna)、甲基膦酸酯核苷酸、巰基膦酸酯核苷酸、2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺、1’,5’-脫水己糖醇核酸(hna)或其組合。嗎啉核苷酸或亞磷二酰胺酯(phosphorodiamidate)嗎啉核苷酸寡聚物(pmo)包括合成分子，其結(jié)構(gòu)通過偏離正常的糖和磷酸酯結(jié)構(gòu)而模擬天然核酸結(jié)構(gòu)。相反，五元核糖環(huán)可以被含有四個碳、一個氮和一個氧的六元嗎啉環(huán)替換。核糖單體可以通過亞磷二酰胺酸酯基團而不是磷酸酯基團連接。這些骨架改變可以去除所有的正電荷和負電荷，從而制得可以在沒有細胞遞送劑(例如帶電寡核苷酸所使用的那些)幫助的情況下穿過細胞膜的嗎啉核苷酸中性分子。

肽核酸(pna)不含糖環(huán)或磷酸酯連接。相反，堿基可以通過寡甘氨酸樣分子連接和適當隔開，因此消除骨架電荷。

磷酸酯骨架的修飾還可包括甲基或巰基修飾，例如甲基膦酸酯核苷酸和。下文圖示說明示例性巰基膦酸酯核苷酸(左)和甲基膦酸酯核苷酸(右)。

此外，示例性的2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺圖示為：

且示例性的己糖醇核酸(或1’,5’-脫水己糖醇核酸(hna))圖示為：

除了核糖部分、磷酸酯骨架和核苷的修飾之外，核苷酸類似物還可以例如在3’或5’端修飾。例如，3’端可包括3’陽離子基團，或者通過用3’-3’連接翻轉(zhuǎn)在3’-端的核苷。在另一個替代方式中，3’-端可以用氨基烷基封閉，例如3’c5-氨基烷基dt。5’-端可以用氨基烷基封閉，例如5’-o-烷基氨基取代基。其他5’綴合物可以抑制5’-3’核酸外切切割。其他3’綴合物可以抑制3’-5’核酸外切切割。

在一些情況下，在與天然多核酸聚合物相比時，本文所述的一種或多種人工核苷酸類似物對核酸酶例如核糖核酸酶(例如rna酶h)、脫氧核糖核酸酶(例如dna酶)或核酸外切酶(例如5’-3’核酸外切酶和3’-5’核酸外切酶具有抗性。在一些情況下，包含2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基、2’-脫氧、t-脫氧-2’-氟、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)或2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)修飾的、lna、ena、pna、hna、嗎啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巰基膦酸酯核苷酸、2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺或其組合的人工核苷酸類似物對核酸酶例如核糖核酸酶(例如rna酶h)、脫氧核糖核酸酶(例如dna酶)或核酸外切酶(例如5’-3’核酸外切酶和3’-5’核酸外切酶)具有抗性。2’-o-甲基修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-o-氨基丙基修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-脫氧修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。t-脫氧-2’-氟修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。lna修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。ena修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。hna修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。嗎啉核苷酸可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。pna可以對核酸酶具有抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。甲基膦酸酯核苷酸修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。巰基膦酸酯核苷酸修飾的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。包含2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如，rna酶h、dna酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。

在一些情況下，相對于等同的天然多核酸聚合物，本文所述的一種或多種人工核苷酸類似物對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。包含2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基、2’-脫氧、t-脫氧-2’-氟、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)或2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)修飾的、lna、ena、pna、hna、嗎啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巰基膦酸酯核苷酸或2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺的一種或多種人工核苷酸類似物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。2’-o-甲基修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。2’-o-氨基丙基修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。2’-脫氧修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。t-脫氧-2’-氟修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。lna修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。ena修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。pna修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。hna修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。嗎啉修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。甲基膦酸酯核苷酸修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。巰基膦酸酯核苷酸修飾的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。包含2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺的多核酸聚合物相對于等同的天然多核酸聚合物可以對其mrna靶具有提高的結(jié)合親和力。提高的親和力可以用較低的kd、較高的熔融溫度(tm)或其組合說明。

在另外的情況下，本文所述的多核酸聚合物可以被修飾以增加其穩(wěn)定性。在多核酸聚合物是rna的實施方式中，多核酸聚合物可以被修飾以增加其穩(wěn)定性。多核酸聚合物可以通過上述修飾中的一種或多種進行修飾而增加其穩(wěn)定性。多核酸聚合物可以在2’羥基位置處被修飾，例如通過2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基、2’-脫氧、t-脫氧-2’-氟、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)或2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)修飾，或者通過鎖定或橋接的核糖構(gòu)象(例如lna或ena)。多核酸聚合物可以通過2’-o-甲基和/或2’-o-甲氧基乙基核糖修飾。多核酸聚合物還可包含嗎啉核苷酸、pna、hna、甲基膦酸酯核苷酸、巰基膦酸酯核苷酸或2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺以增加其穩(wěn)定性。對rna的適合修飾以增加遞送穩(wěn)定性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。

可以使用本領(lǐng)域已知的程序，使用化學合成和/或酶促連接反應來構(gòu)建本文所述的多核酸聚合物。例如，可以使用天然存在的核苷酸或設(shè)計用于增加分子的生物學穩(wěn)定性或增加在多核酸聚合物和靶核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的多樣修飾的核苷酸來化學合成多核酸聚合物。示例性方法可包括在us5,142,047；us5,185,444；wo2009099942；或ep1579015中描述的那些方法。另外的示例性方法可包括在以下文獻中描述的那些：griffey等人，“2’-o-aminopropylribonucleotides:azwitterionicmodificationthatenhancestheexonucleaseresistanceandbiologicalactivityofantisenseoligonucleotides”，j.med.chem.39(26)：5100-5109(1997))；obika等人，“synthesisof2′-o,4′-c-methyleneuridineand-cytidine.novelbicyclicnucleosideshavingafixedc3，-endosugarpuckering".tetrahedronletters38(50):8735(1997)；koizumi，m."enaoligonucleotidesastherapeutics".currentopinioninmoleculartherapeutics8(2)：144-149(2006)；和abramova等人，“noveloligonucleotideanaloguesbasedonmorpholinonucleosidesubunits-antisensetechnologies：newchemicalpossibilities”，indianjournalofchemistry48b：1721-1726(2009)。或者，可以使用其中已經(jīng)以反義方向亞克隆多核苷酸聚合物的表達載體來生物地產(chǎn)生多核酸聚合物(即，從插入的多核酸聚合物轉(zhuǎn)錄的rna將具有對于感興趣的靶多核酸聚合物的反義取向)。

多核酸聚合物可以結(jié)合任何核酸分子(例如另一個反義分子)、肽或其他化學物質(zhì)，以促進多核酸聚合物的遞送和/或?qū)⒑怂岚邢虻教囟ǖ慕M織、細胞類型或細胞發(fā)育階段。多核酸聚合物可以結(jié)合蛋白質(zhì)或rna。束縛于多核酸聚合物的蛋白質(zhì)可包含剪接因子以增強、抑制或調(diào)節(jié)剪接和內(nèi)含子去除。束縛于多核酸聚合物的rna可包含增強、抑制或調(diào)節(jié)剪接和內(nèi)含子去除的適體或任何結(jié)構(gòu)。多核酸聚合物可以是分離的核酸。

多核酸聚合物可以與適合于將多核酸聚合物遞送至細胞的遞送載體綴合或結(jié)合。細胞可以是特定細胞類型或特定發(fā)育階段。遞送載體可以能夠進行位點特異性、組織特異性、細胞特異性或發(fā)育階段特異性的遞送。例如，遞送載體可以是細胞特異性的病毒顆?；蚱涑煞?，或者，遞送載體可以是細胞特異性的抗體顆粒或其成分。多核酸聚合物可以靶向于遞送到胰腺中的β細胞。多核酸聚合物可以靶向于遞送到胸腺細胞。多核酸聚合物可以靶向于遞送到惡性細胞。多核酸聚合物可以靶向于遞送到前惡性細胞(已知在可預見的未來期間發(fā)展成明顯的惡性表型，例如前白血病和骨髓增生異常綜合征或組織病理學上定義的癌前病變或病癥)。

在一個實施方式中，多核酸聚合物可以結(jié)合化學分子(例如非肽或核酸基的分子)，例如藥物。藥物可以是小分子(例如具有小于900da的mw)。

在本發(fā)明的一個實施方式中，遞送載體可包含細胞穿透肽(cpp)。例如，多核酸聚合物可以與cpp結(jié)合或復合。技術(shù)人員應理解，任何適合的cpp都可以與多核酸聚合物綴合以幫助將多核酸聚合物遞送至細胞和/或遞送至細胞中。這樣的cpp可以是boisguérin等人(2015，advanceddrugdeliveryreviewsdoi：10.1016/j.addr.2015.02.008)描述的任何適合的cpp技術(shù)，該文獻通過引用并入本文。用于與多核酸聚合物綴合的適合遞送載體還描述于lochmann等人((europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics58(2004)237-251)，其通過引用并入本文)中。

cpp可以是富含精氨酸和/或賴氨酸的肽，例如，其中肽中的大多數(shù)殘基是賴氨酸或精氨酸。cpp可包含聚-l-賴氨酸(pll)?；蛘撸琧pp可包含聚精氨酸。適合的cpp可以選自包括以下的組：穿膜素(penetratin)；r6-穿膜素(r6-penetratin)；轉(zhuǎn)運素(transportan)；寡聚精氨酸；f-3；b-肽；b-msp；pip肽，例如pip1，pip2a，pip2b，pip5e，pip5f，pip5h，pip5j，pip5k，pip5l，pip5m，pip5n，pip5o，pip6a，pip6b，pip6c，pip6d，pip6e，pip6f，pip6g或pip6h；序列pkkkrkv的肽；penatratin；lys4；space；tat；tat-drbd(dsrna結(jié)合結(jié)構(gòu)域)；(rxr)4；(rff)3rxb；(kff)3k；rgf2；t細胞衍生cpp；pep-3；pegpep-3；mpg-8；mpg-8-chol；pepfect6；p5rhh；r15；和chol-r9；或其功能性變體(例如參見boisguérin等人(2015，advanceddrugdeliveryreviewsdoi：10.1016/j.addr.2015.02.008)。

在一個實施方式中，cpp包含pip肽或由其組成。pip肽可以選自包括pip1，pip2a，pip2b，pip5e，pip5f，pip5h，pip5j；pip5k，pip5l，pip5m，pip5n，pip5o，pip6a，pip6b，pip6c，pip6d，pip6e，pip6f，pip6g和pip6h的組。

在本發(fā)明的一個實施方式中，遞送載體可包含基于肽的納米顆粒(pbn)，其中多個cpp(例如本文所討論的一種或多種適合的cpp)通過電荷相互作用與多核酸聚合物形成復合物。這種納米顆粒的尺寸可以為約50nm至250nm。在一個實施方式中，納米顆粒的尺寸可以為約70-200nm。在另一個實施方式中，納米顆粒的尺寸可以為約70-100nm或125-200nm。

在一個實施方式中，多核酸聚合物可以與遞送載體復合，例如通過離子鍵?；蛘?，多核酸聚合物可以共價結(jié)合于遞送載體。綴合/結(jié)合方法描述于lochmann等人((europeanjournalofpharmaceutics和biopharmaceutics58(2004)237-251)，其通過引用并入本文)中。例如，綴合方法可包括將含有反應性基團(例如-nh2或-sh2)的適合的系鏈(tether)引入到多核酸聚合物并且作為活性中間體在合成后添加遞送載體，例如肽，接著在水性介質(zhì)中進行偶聯(lián)反應。替代方法可包括在單一固相載體上以線性模式進行綴合。

遞送載體和多核酸聚合物可以是硫醇和/或馬來酰亞胺連接的，例如硫醇-馬來酰亞胺連接的。多核酸聚合物和遞送載體的綴合可以是通過點擊化學，例如在待綴合的相應分子上的疊氮基或2’-o-炔丙基官能團和炔基的反應。在一個實施方式中，遞送載體和多核酸聚合物可以通過硫醚橋連接。在另一個實施方式中，遞送載體和多核酸聚合物可以通過二硫橋連接。技術(shù)人員應容易確定用于綴合多核酸聚合物和遞送載體(例如肽)的適合的連接基團或反應。

基因轉(zhuǎn)錄物可以編碼胰島素原?；蜣D(zhuǎn)錄物可以自ins基因轉(zhuǎn)錄。基因轉(zhuǎn)錄物可以源自表達低水平胰島素原的人單倍型。內(nèi)含子可包含ins內(nèi)含子1。

基因轉(zhuǎn)錄物可以轉(zhuǎn)錄自基因或orf，所述基因或orf選自包括以下的基因或orf中的任一種：abcd4；abcf3；acadvl；alkbh6；ap1g2；apex1；arfrp1；athl1；atp1a3；atp5d；atp13a1；bax；bdh2；brd2；c1orf63；c1orf630；c1orf631；c1orf124；c2orf49；c8orf82；c16orf59；caprin2；cdca7；cep164；cep170；clcn7；cpne1；cpsf3l；dcxr；dennd4b；dffa；dis3l2；dnajb12；dpf1；drg2；dsn1；eml3；ewsr1；ewsr10；fgfr4；ftsj1；gbap1；gmppa；gmpr2；gnptg；gorasp1；gpatch4；hgs；hmg20b；iffo1；isyna1；kri1；loc148413；lztr1；man2c1；map4k2；mcoln1；mdp1；mib2；mitd1；mok；mov10；mrpl35；mtmr11；mus81；napepld；nbeal2；ndrg4；ndufb10；nfatc4；nfkbib；nit1；nktr；nprl2；nsun5p1；nudt22；pan2；pddc1；pdlim4；phf1；pik3cd；pitpnm1；ppil2；ppp1r35；ppp4c；pqlc2；prpf39；psme2；ptpmt1；qars；rad52；rhot2；rmnd5b；rnf123；rpl10a；rpp21；rps6kb2；rusc1；scrn2；scyl1；sfr1；sgsm3；sirt7；slc25a3；slc25a3；slc30a7；slc37a4；stk19；stx10；tcf25；tomm40；tp53i3；trim41；trpt1；tsta3；ttc14；ttc140；tubgcp6；u2af1l4；uck1；unc45a；vamp1；vamp10；vars；vps28；wdr24；wdr90；wrap53；ydjc；yipf3；yipf3；zcchc8；zcchc18；zfand1；znf131；znf300；znf317；znf692；znf711；znrd1；zwint或其組合。

術(shù)語“多核酸聚合物”和“核酸”可以互換使用，并且可以指長度為約10至約50個核苷酸的多核酸聚合物。

疾病

本文所述的方法和組合物可用于治療特征為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損的疾病或病癥。本文所述的方法和組合物還可用于治療特征為缺陷性剪接的疾病或病癥。疾病或病癥可以是遺傳障礙或病癥。遺傳障礙或病癥的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損。遺傳障礙或病癥還可以特征為缺陷性剪接。遺傳障礙或病癥可以是遺傳性障礙，或基因組中一個或多個位置內(nèi)的非遺傳缺陷。遺傳性障礙可以是遺傳性疾病。遺傳性疾病的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損。遺傳性疾病的特征可以為缺陷性剪接。患有遺傳性疾病的受試者可以具有可包含含有外顯子的基因拷貝的基因組，所述外顯子在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式?；加羞z傳性疾病的受試者可以具有可包含含有外顯子組的基因拷貝的基因組，所述外顯子組在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式?；加羞z傳性疾病的受試者可以具有可包含基因的缺陷拷貝的基因組，其可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式。

遺傳障礙或病癥可以是基因組中一個或多個位置內(nèi)的非遺傳缺陷。非遺傳缺陷可以是點突變、缺失、插入或閱讀框移位。與非遺傳性缺陷相關(guān)的遺傳障礙或病癥的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損。與非遺傳性缺陷相關(guān)的遺傳障礙或病癥的特征可以為缺陷性剪接。具有非遺傳性缺陷的受試者可以具有可包含含有外顯子的基因拷貝的基因組，所述外顯子在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式。具有非遺傳性缺陷的受試者可以具有可包含含有外顯子組的基因拷貝的基因組，所述外顯子組在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式。具有非遺傳性缺陷的受試者可以具有可包含基因的缺陷拷貝的基因組，其可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式。

遺傳障礙或病癥可以是常染色體顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或多因素或多基因障礙。有時候，遺傳性疾病的特征也可以表征為常染色體顯性、常染色體隱性、x連鎖顯性、x連鎖隱性、y連鎖、線粒體或者多因素或多基因遺傳性疾病。常染色體顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損。常染色體顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因子或多基因障礙的特征可以為缺陷性剪接?；加谐Ｈ旧w顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙的受試者可以具有可包含含有外顯子的基因拷貝的基因組，所述外顯子在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式?；加谐Ｈ旧w顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙的受試者可以具有可包含含有外顯子組的基因拷貝的基因組，所述外顯子組在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式?；加谐Ｈ旧w顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙的受試者可以具有可包含缺陷的基因拷貝的基因組，其可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式。

示例性遺傳性疾病可包括軟骨發(fā)育不全，遺傳性血色素沉著癥，唐氏綜合征，遺傳性球形紅細胞增多癥，泰-薩克斯病，usher綜合征，遺傳性果糖不耐受癥，血友病，肌營養(yǎng)不良(例如杜氏肌營養(yǎng)不良或dmd)，多基因障礙，乳腺癌，卵巢癌，帕金森病，巴爾得-別德爾綜合征，普拉德-威利綜合征，糖尿病，心臟病，關(guān)節(jié)炎，運動神經(jīng)元病，白化病，cri-du-chat綜合征，囊性纖維化，脆性x綜合征，半乳糖血癥，亨廷頓氏病，jackson-weiss綜合征，克蘭費爾特綜合征，克拉伯病，langer-giedion綜合征，萊施-奈恩綜合征，馬方綜合征，肌強直性營養(yǎng)不良，指甲髕骨綜合征，神經(jīng)纖維瘤病，努南綜合征，x三體綜合征，成骨不全，patau綜合征，苯丙酮尿癥，卟啉癥，視網(wǎng)膜母細胞瘤，rett綜合征，鐮狀細胞病，特納綜合征，usher綜合征，vonhippel-lindau綜合征，waardenburg綜合征，wilson病，著色性干皮病，xxxx綜合征或yy綜合征。

示例性遺傳性疾病例如軟骨發(fā)育不全，遺傳性血色素沉著癥，唐氏綜合征，遺傳性球形紅細胞增多癥，泰-薩克斯病，usher綜合征，遺傳性果糖不耐受癥，血友病，肌營養(yǎng)不良(例如杜氏肌營養(yǎng)不良或dmd)，多基因障礙，乳腺癌，卵巢癌，帕金森病，巴爾得-別德爾綜合征，普拉德-威利綜合征，糖尿病，心臟病，關(guān)節(jié)炎，運動神經(jīng)元病，白化病，cri-du-chat綜合征，囊性纖維化，脆性x綜合征，半乳糖血癥，亨廷頓氏病，jackson-weiss綜合征，克蘭費爾特綜合征，克拉伯病，langer-giedion綜合征，萊施-奈恩綜合征，馬方綜合征，肌強直性營養(yǎng)不良，指甲髕骨綜合征，神經(jīng)纖維瘤病，努南綜合征，x三體綜合征，成骨不全，patau綜合征，苯丙酮尿癥，卟啉癥，視網(wǎng)膜母細胞瘤，rett綜合征，鐮狀細胞病，特納綜合征，usher綜合征，vonhippel-lindau綜合征，waardenburg綜合征，wilson病，著色性干皮病，xxxx綜合征或yy綜合征的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或者缺陷性剪接。示例性遺傳性疾病例如軟骨發(fā)育不全，遺傳性血色素沉著癥，唐氏綜合征，遺傳性球形紅細胞增多癥，泰-薩克斯病，usher綜合征，遺傳性果糖不耐受癥，血友病，肌營養(yǎng)不良(例如杜氏肌營養(yǎng)不良或dmd)，多基因障礙，乳腺癌，卵巢癌，帕金森病，巴爾得-別德爾綜合征，普拉德-威利綜合征，糖尿病，心臟病，關(guān)節(jié)炎，運動神經(jīng)元病，白化病，cri-du-chat綜合征，囊性纖維化，脆性x綜合征，半乳糖血癥，亨廷頓氏病，jackson-weiss綜合征，克蘭費爾特綜合征，克拉伯病，langer-giedion綜合征，萊施-奈恩綜合征，馬方綜合征，肌強直性營養(yǎng)不良，指甲髕骨綜合征，神經(jīng)纖維瘤病，努南綜合征，x三體綜合征，成骨不全，patau綜合征，苯丙酮尿癥，卟啉癥，視網(wǎng)膜母細胞瘤，rett綜合征，鐮狀細胞病，特納綜合征，usher綜合征，vonhippel-lindau綜合征，waardenburg綜合征，wilson病，著色性干皮病，xxxx綜合征或yy綜合征可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子的基因拷貝，可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子組的基因拷貝，或者可包含可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式的缺陷基因拷貝。

如上所述，遺傳障礙或病癥可以是常染色體顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙。遺傳障礙或病癥可以是常染色體顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙，其可以是特征為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或缺陷性剪接的障礙。

示例性常染色體顯性障礙可包括亨廷頓氏病，1型神經(jīng)纖維瘤病，2型神經(jīng)纖維瘤病，馬方綜合征，遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌，遺傳性多發(fā)性外生骨疣，結(jié)節(jié)性硬化，血管性血友病或急性間歇性卟啉病。

常染色體顯性障礙例如亨廷頓氏病，1型神經(jīng)纖維瘤病，2型神經(jīng)纖維瘤病，馬方綜合征，遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌，遺傳性多發(fā)性外生骨疣，結(jié)節(jié)性硬化，血管性血友病或急性間歇性卟啉病的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或缺陷性剪接。常染色體顯性障礙例如亨廷頓氏病，1型神經(jīng)纖維瘤病，2型神經(jīng)纖維瘤病，馬方綜合征，遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌，遺傳性多發(fā)性外生骨疣，結(jié)節(jié)性硬化，血管性血友病或急性間歇性卟啉病可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子的基因拷貝，可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子組的基因拷貝，或者可包含可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式的缺陷基因拷貝。

示例性常染色體隱性障礙可包括白化病，中鏈酰基輔酶a脫氫酶缺陷，囊性纖維化，鐮狀細胞病，泰-薩克斯病，尼曼-皮克病，脊髓性肌萎縮或羅伯茨綜合征。

常染色體隱性障礙如白化病，中鏈?；o酶a脫氫酶缺陷，囊性纖維化，鐮狀細胞病，泰-薩克斯病，尼曼-皮克病，脊髓性肌萎縮或羅伯茨綜合征的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或缺陷性剪接。常染色體隱性障礙例如白化病，中鏈酰基輔酶a脫氫酶缺陷，囊性纖維化，鐮狀細胞病，泰-薩克斯病，尼曼-皮克病，脊髓性肌萎縮或羅伯茨綜合征可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子的基因拷貝，可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子組的基因拷貝，或者可包含可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式的缺陷基因拷貝。

示例性x連鎖顯性障礙可包括x連鎖低磷酸鹽血性佝僂病，rett綜合征，2型色素失調(diào)癥，aicardi綜合征或克蘭費爾特綜合征。

x連鎖顯性障礙如x連鎖低磷酸鹽血性佝僂病，rett綜合征，2型色素失調(diào)癥，aicardi綜合征或克蘭費爾特綜合征的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或缺陷性剪接。x連鎖顯性障礙如x連鎖低磷酸鹽血性佝僂病，rett綜合征，2型色素失調(diào)癥，aicardi綜合征或克蘭費爾特綜合征可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子的基因拷貝，可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子組的基因拷貝，或者可包含可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式的缺陷基因拷貝。

示例性x連鎖隱性障礙可包括血友病a，杜氏肌營養(yǎng)不良，萊施-奈恩綜合征或特納綜合征。

x連鎖隱性障礙如血友病a，杜氏肌營養(yǎng)不良，萊施-奈恩綜合征或特納綜合征的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或缺陷性剪接。x連鎖隱性障礙如血友病a，杜氏肌營養(yǎng)不良，萊施-奈恩綜合征或特納綜合征可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子的基因拷貝，可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子組的基因拷貝，或者可包含可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式的缺陷基因拷貝。

示例性y連鎖障礙可包括swyer綜合征或一種形式的色素性視網(wǎng)膜炎(retinitispigmentosa)。

y連鎖障礙如swyer綜合征或色素性視網(wǎng)膜炎的形式的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或缺陷性剪接。y連鎖障礙例如swyer綜合征或色素性視網(wǎng)膜炎的形式可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子的基因拷貝，可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子組的基因拷貝，或者可包含可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式的缺陷基因拷貝。

示例性線粒體疾病可包括leber氏遺傳性視神經(jīng)病。

線粒體疾病如leber氏遺傳性視神經(jīng)病的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或缺陷性剪接。線粒體疾病如leber氏遺傳性視神經(jīng)病可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子的基因拷貝，可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子組的基因拷貝，或者可包含可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式的缺陷基因拷貝。

示例性多因素或多基因障礙可包括心臟病，糖尿病，自身免疫性疾病(例如多發(fā)性硬化)，炎性腸病或癌癥。

多因素或多基因障礙如心臟病，糖尿病，自身免疫性疾病(例如多發(fā)性硬化)，炎性腸病或癌癥的特征可以為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損或缺陷性剪接。多因素或多基因障礙如心臟病，糖尿病，自身免疫性疾病(例如多發(fā)性硬化)，炎性腸病或癌癥可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子的基因拷貝，可包含含有在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時可以編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的外顯子組的基因拷貝，或者可包含可能不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的全長功能形式的缺陷基因拷貝。

在一些情況下，本文所述的組合物和方法用于治療遺傳障礙或病癥(例如遺傳性疾病)。本文所述的組合物和方法可用于治療特征為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損的遺傳障礙或病癥(例如遺傳性疾病)。本文所述的組合物和方法可用于治療特征為缺陷性剪接的遺傳障礙或病癥(例如遺傳性疾病)。

本文所述的組合物和方法還可用于治療遺傳障礙或病癥，例如常染色體顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙。本文所述的組合物和方法可用于治療特征為蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損的常染色體顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙。本文所述的組合物和方法可用于治療特征為缺陷性剪接的常染色體顯性障礙、常染色體隱性障礙、x連鎖顯性障礙、x連鎖隱性障礙、y連鎖障礙、線粒體疾病或者多因素或多基因障礙。

在一些情況下，疾病或病癥包括肌營養(yǎng)不良，脊髓性肌萎縮(sma)，共濟失調(diào)-毛細血管擴張，x連鎖性無丙種球蛋白血癥，糖尿病或癌癥。

肌營養(yǎng)不良是可削弱肌肉骨骼系統(tǒng)并可阻礙運動的一組肌肉疾病。其可通過進行性骨骼肌無力，肌肉蛋白質(zhì)缺乏，以及肌肉細胞和組織的死亡來表征。一種常見的肌營養(yǎng)不良形式可以是杜氏肌營養(yǎng)不良(dmd)。另外的肌營養(yǎng)不良形式可包括becker型、肢帶型、先天性、面肩肱型、肌強直性、眼咽型、遠端型和emery-dreifuss型肌營養(yǎng)不良。

脊髓性肌萎縮(sma)是常染色體隱性障礙，其是兒童死亡的最常見的遺傳原因之一。該疾病的主要特征可以是脊髓運動神經(jīng)元的進行性喪失，導致骨骼肌去神經(jīng)，伴隨后續(xù)的自主肌肉的弱化、萎縮和麻痹。sma基因座可以映射到含有幾個基因的染色體5q13上～500kb的復雜反向重復序列。sma的主要原因可以是位于反向重復序列內(nèi)的運動神經(jīng)元存活基因(smn1)的端?？截惖募兒蟻G失。也可以轉(zhuǎn)錄反向重復序列的著絲?？截悆?nèi)的重復基因(smn2)，但是smn2基因不完全補償smn1功能的喪失。

共濟失調(diào)-毛細血管擴張(a-t)或路易斯-巴爾綜合征是罕見的神經(jīng)退行性遺傳性疾病。術(shù)語“共濟失調(diào)”是指協(xié)調(diào)不良，并且術(shù)語“毛細血管擴張”是指小的擴張血管。這兩個術(shù)語描述了這種疾病的特征。at可損害小腦和可能造成運動和協(xié)調(diào)受損的大腦的另外區(qū)域。at還可削弱免疫系統(tǒng)，從而增加感染，并可損害dna修復，從而增加癌癥的風險。a-t可以與基因atm中的缺陷相關(guān)聯(lián)，基因atm負責管理對多種形式的應激的細胞反應。

x連鎖無丙種球蛋白血癥，也稱為x連鎖低丙種球蛋白血癥、xla、布魯頓型無丙種球蛋白血癥、布魯頓綜合征或性連鎖無丙種球蛋白血癥，是可以影響身體抵抗感染的能力的x連鎖遺傳障礙。xla患者缺乏成熟b細胞，且因此缺乏抗擊感染的必要抗體。布魯頓氏酪氨酸激酶(btk)可以與介導b細胞發(fā)育和成熟相關(guān)，并且btk基因可以與xla相關(guān)。

糖尿病(dm)(通常稱為糖尿病)是特征為長時間的高血糖水平的一組代謝疾病。糖尿病的癥狀包括體重減輕、多尿或排尿增加、多飲或口渴增加及多食或饑餓增加。糖尿病可以分為四類：1型、2型、妊娠糖尿病和其他特定類型的糖尿病。1型糖尿病可以通過胰腺中胰島的胰島素產(chǎn)生β細胞的損失表征，其導致胰島素缺乏。2型糖尿病可以通過胰島素抵抗表征，其也可以與胰島素分泌減少結(jié)合。妊娠糖尿病可能類似于2型糖尿病，并且可以涉及不充足的胰島素分泌與反應性的組合。其他特定類型的糖尿病可包括糖尿病前期、成人隱匿性自身免疫性糖尿病(lada)和先天性糖尿病。

癌癥可以是實體瘤或血液惡性腫瘤。實體瘤可以是肉瘤或癌瘤。肉瘤可以是骨、軟骨、脂肪肌肉、血管或造血組織的癌癥。示例性肉瘤可包括腺泡狀橫紋肌肉瘤，腺泡狀軟組織肉瘤、成釉細胞瘤、血管肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、軟組織透明細胞肉瘤、去分化脂肪肉瘤、硬纖維瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細胞腫瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤、上皮樣纖維肉瘤、上皮樣血管內(nèi)皮瘤、上皮樣肉瘤、鼻腔神經(jīng)膠質(zhì)瘤、尤因肉瘤、腎外橫紋肌樣瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、巨細胞腫瘤、血管外皮細胞瘤、嬰兒纖維肉瘤、炎性成肌纖維細胞瘤、卡波西肉瘤、骨平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、骨脂肪肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤(mfh)、骨的惡性纖維性組織細胞瘤(mfh)、惡性間質(zhì)瘤、惡性外周神經(jīng)鞘瘤、間葉性軟骨肉瘤、粘液纖維肉瘤、粘液樣脂肪肉瘤、粘液炎性成纖維細胞肉瘤、具有血管周圍上皮樣細胞分化的瘤、骨肉瘤、骨旁骨肉瘤、具有血管周圍上皮樣細胞分化的瘤、骨膜骨肉瘤、多形性脂肪肉瘤、多形性橫紋肌肉瘤、pnet/骨外尤因腫瘤、橫紋肌肉瘤、圓細胞脂肪肉瘤、小細胞骨肉瘤、孤立性纖維性腫瘤、滑膜肉瘤、毛細血管擴張性骨肉瘤。

癌瘤可以是自上皮細胞發(fā)生的癌癥。示例性癌瘤可包括腺癌，鱗狀細胞癌，腺鱗癌，間變性癌，大細胞癌，小細胞癌，肛門癌，闌尾癌，膽管癌癥(即膽管癌)，膀胱癌，腦腫瘤，乳腺癌，子宮頸癌，結(jié)腸癌，未知原發(fā)癌(cup)，食管癌，眼癌，輸卵管癌，胃腸道癌，腎癌，肝癌，肺癌，成神經(jīng)管細胞瘤，黑色素瘤，口腔癌，卵巢癌，胰腺癌，甲狀旁腺疾病，陰道癌，垂體瘤，前列腺癌，直腸癌，皮膚癌，胃癌，睪丸癌，喉癌，甲狀腺癌，子宮癌，陰道癌或外陰癌。

血液惡性腫瘤是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，并且可包括基于t細胞和基于b細胞的惡性腫瘤。示例性血液惡性腫瘤可包括骨髓性白血病，骨髓增生性腫瘤，非特指型外周t細胞淋巴瘤(ptcl-nos)，間變性大細胞淋巴瘤，血管免疫母細胞淋巴瘤，皮膚t細胞淋巴瘤，成人t-細胞白血病/淋巴瘤(atll)，母細胞性nk細胞淋巴瘤，腸病型t細胞淋巴瘤，血腫性(hematosplenic)γ-δt細胞淋巴瘤，成淋巴細胞淋巴瘤，鼻nk/t-細胞淋巴瘤，治療相關(guān)t細胞淋巴瘤，慢性淋巴細胞性白血病(cll)，小淋巴細胞性淋巴瘤(sll)，高風險cll，非cll/sll淋巴瘤，前淋巴細胞性白血病(pll)，濾泡性淋巴瘤(fl)，彌漫性大b細胞淋巴瘤(dlbcl)，套細胞淋巴瘤(mcl)，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，多發(fā)性骨髓瘤，結(jié)外邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤，淋巴結(jié)邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，非伯基特高級b細胞淋巴瘤，原發(fā)性縱隔b細胞淋巴瘤(pmbl)，免疫母細胞性大細胞淋巴瘤，前體b淋巴母細胞性淋巴瘤，b細胞幼淋巴細胞性白血病，淋巴漿細胞性淋巴瘤，脾邊緣區(qū)淋巴瘤，漿細胞骨髓瘤，漿細胞瘤，縱隔(胸腺)大b細胞淋巴瘤，血管內(nèi)大b細胞淋巴瘤，原發(fā)性滲出性淋巴瘤或淋巴樣肉芽腫病。

在一些情況下，本文所述的組合物和方法用于治療肌營養(yǎng)不良，脊髓性肌萎縮(sma)，共濟失調(diào)-毛細血管擴張，x連鎖無丙種球蛋白血癥，糖尿病或癌癥。本文所述的組合物和方法可用于治療肌營養(yǎng)不良，脊髓性肌萎縮(sma)，共濟失調(diào)-毛細血管擴張，x連鎖無丙種球蛋白血癥，糖尿病或癌癥，其中疾病或障礙與蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)。本文所述的組合物和方法可用于治療肌營養(yǎng)不良，脊髓性肌萎縮(sma)，共濟失調(diào)-毛細血管擴張，x連鎖無丙種球蛋白血癥，糖尿病或癌癥，其中疾病或障礙特征為缺陷性剪接。

疾病可以是由導致整個內(nèi)含子在成熟轉(zhuǎn)錄物中保留的突變所引起的任何遺傳病癥。疾病可以是糖尿病。疾病可以是i型糖尿病。疾病可以是ii型糖尿病。在另一個實施方式中，疾病可以是癌癥。癌癥可以是髓性白血病或骨髓增生性腫瘤。癌癥可以維持促進識別3’剪接位點的任何剪接體成分中的突變。多核酸聚合物可以用于增加具有殘留β-細胞活性的受試者中的內(nèi)源性表達。多核酸聚合物可用于增加胰島素原在其他糖尿病患者中的表達，包括接受移植的β細胞的那些患者。多核酸聚合物可以用作含有編碼u2成分的基因中的突變的惡性腫瘤(例如，>20％的髓性白血病)的反義療法。

在疾病是糖尿病的實施方式中，降低內(nèi)含子保留的發(fā)生率可以是在受試者的胎兒發(fā)育期間。例如，可以對懷孕母親施用多核酸聚合物，以減少胎兒中的內(nèi)含子保留。

受試者可以是真核生物。受試者可以是哺乳動物。受試者可以是人類。受試者可以是非人靈長類。受試者可以是非靈長類哺乳動物，例如大鼠，小鼠，雪貂，狗，貓或豬。受試者可以是胎兒，例如人類胎兒。

該方法可包括在治療前確定疾病病理是否由基因轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留所引起的步驟。該確定可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何適合的試驗或遺傳分析。

在一些情況下，使用基于核酸的技術(shù)例如原位雜交和rt-pcr在核酸水平進行檢測。測序技術(shù)可包括下一代測序技術(shù)，例如helicostrue單分子測序(tsms)(harrist.d.等人，(2008)science320：106-109)；454測序(roche)(margulies，m.等人，2005，nature，437,376-380)；solid技術(shù)(appliedbiosystems)；solexa測序(illumina)；pacificbiosciences的單分子實時(smrt^tm)技術(shù)；納米孔測序(sonigv和mellera.(2007)clinchem53：1996-2001)；半導體測序(iontorrent；personalgenomemachine)；dna納米球測序；使用來自doversystems(polonator)的技術(shù)的測序，以及在測序之前不需要擴增或另外轉(zhuǎn)化天然dna的技術(shù)(例如，pacificbiosciences和helicos)，例如基于納米孔的策略(例如oxfordnanopore，geniatechnologies和nabsys)。測序技術(shù)還可包括sanger測序，maxam-gilbert測序，鳥槍法測序，橋式pcr，基于質(zhì)譜的測序，基于微流體的sanger測序，基于顯微術(shù)的測序，rnap測序或基于雜交的測序。

感興趣的基因轉(zhuǎn)錄物的測序還可包括擴增步驟。示例性擴增方法包括但不限于聚合酶鏈反應(pcr)，基于核酸序列的擴增(nasba)，自維持的序列復制(3sr)，環(huán)介導的等溫擴增(lamp)，鏈置換擴增(sda)，全基因組擴增，多重置換擴增，鏈置換擴增，解旋酶依賴性擴增，切口酶擴增反應，重組聚合酶擴增，逆轉(zhuǎn)錄pcr，連接介導的pcr或甲基化特異性pcr。

可用于獲得核酸序列的另外的方法包括例如全基因組rna表達陣列，酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)，基因組測序，從頭測序，pacificbiosciencessmrt測序，免疫組織化學(ihc)，免疫細胞化學(icc)，質(zhì)譜，串聯(lián)質(zhì)譜，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tofms)，原位雜交，熒光原位雜交(fish)，顯色原位雜交(cish)，銀原位雜交(sish)，數(shù)字pcr(dpcr)，逆轉(zhuǎn)錄pcr，定量pcr(q-pcr)，單標記qpcr，實時pcr，ncounter分析(nanostringtechnology)，蛋白質(zhì)印跡法，dna印跡法，sds-page，凝膠電泳和rna印跡法。

在一些情況下，可以使用例如基于免疫沉淀的測定如蛋白質(zhì)印跡法或elisa在蛋白質(zhì)水平進行檢測。另外，方法例如電泳和質(zhì)譜分析也可用于檢測感興趣的蛋白質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括將多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含seqidno:46或任選的與seqidno:46具有至少95％同一性的區(qū)域或由其組成。該區(qū)域可以與seqidno:46具有至少98％或99％同一性。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括將多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含seqidno:3或任選的與seqidno:3具有至少95％同一性的區(qū)域或由其組成。該區(qū)域可以與seqidno:3具有至少98％或99％同一性。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一互補的序列或由其組成。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少95％同一性的序列互補的序列或由其組成。該區(qū)域可包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少98％同一性的序列互補的序列或由其組成。該區(qū)域可包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一具有至少99％同一性的序列互補的序列或由其組成。

細胞可以在體外。細胞可以是離體的。細胞可以是真核細胞或原核細胞。細胞可以是真核細胞。細胞可以是來自人；非人靈長類；或非靈長類哺乳動物如貓，大鼠，小鼠，狗，雪貂或豬的哺乳動物細胞。細胞可以是人細胞，例如來自上皮細胞，結(jié)締組織細胞，激素分泌細胞，神經(jīng)細胞，骨骼肌細胞，血細胞或免疫系統(tǒng)細胞。細胞可以是腫瘤細胞，例如實體瘤細胞或血液惡性腫瘤細胞。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種多核酸聚合物，其對于包含seqidno:46或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域，或者任選地，包含與seqidno:46具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的。該區(qū)域可以與seqidno:46具有至少98％或99％同一性。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種多核酸聚合物，其對于包含seqidno:3或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域，或者任選地，包含與seqidno:3具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的。該區(qū)域可以與seqidno:3具有至少98％或99％同一性。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種多核酸聚合物，其對于多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的，其中所述區(qū)域包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一互補的序列或由其組成。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種多核酸聚合物，其對于多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的，其中所述區(qū)域包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一互補的序列或由其組成；或者任選地，包含與seqidno:47至434具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域。該區(qū)域可以與seqidno:47至434具有至少98％或99％同一性。

提及對于多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分反義的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解為是指至少5個連續(xù)核苷酸的區(qū)域。提及對于多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分反義的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解為是指至少10個連續(xù)核苷酸的區(qū)域。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了多核酸聚合物，其包含選自包括以下的組中任一的核酸序列或由其組成：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了多核酸聚合物，其包含與選自包括以下的組中任一種的序列具有至少99％同一性的核酸序列或由其組成：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了多核酸聚合物，其包含與選自包括以下的組中任一種的序列具有至少98％同一性的核酸序列或由其組成：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了多核酸聚合物，其包含與選自包括以下的組中任一種的序列具有至少95％同一性的核酸序列或由其組成：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了多核酸聚合物，其包含選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一種的核酸序列或由組成。應理解尿嘧啶核苷酸可以被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了多核酸聚合物，其包含與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少99％同一性的核酸序列或由其組成。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了多核酸聚合物，其包含與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少98％同一性的核酸序列或由其組成。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了多核酸聚合物，其包含與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少95％同一性的核酸序列或由其組成。應理解尿嘧啶核苷酸可以被胸腺嘧啶核苷酸置換(例如，具有這樣的序列的rna的dna形式)。

多核酸聚合物可以是分離的多核酸聚合物。多核酸聚合物可以與適合于將多核酸聚合物遞送至細胞的遞送載體綴合或結(jié)合。遞送載體可以能夠進行位點特異性、組織特異性或細胞特異性的遞送。例如，遞送載體可以是細胞特異性的病毒顆粒或其成分，或者，遞送載體可以是細胞特異性的抗體顆?；蚱涑煞帧６嗪怂峋酆衔锟梢园邢蛴谶f送到胰腺中的β細胞。多核酸聚合物可以靶向于遞送到胸腺細胞。多核酸聚合物可以靶向于遞送到惡性細胞。多核酸聚合物可以被修飾以增加其穩(wěn)定性。在多核酸聚合物是rna的實施方式中，多核酸聚合物可以被修飾以增加其穩(wěn)定性。多核酸聚合物可以通過2’-o-甲基和2’-o-甲氧基乙基核糖修飾。對于rna的增加遞送穩(wěn)定性的適合修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。

多核酸聚合物可以是質(zhì)粒載體的部分。多核酸聚合物可以是病毒載體的部分。多核酸聚合物可以在病毒載體上編碼。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包含本發(fā)明的多核酸聚合物的載體。載體可包括病毒載體。病毒載體可包括腺相關(guān)病毒載體。載體可包括將多核酸聚合物靶向于惡性細胞或特定細胞類型的任何病毒。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包含或結(jié)合于本發(fā)明的多核酸聚合物的遞送載體。遞送載體可包括基于脂質(zhì)的納米顆粒；陽離子細胞穿透肽(cpp)；或直鏈或支鏈陽離子聚合物；或生物綴合物，例如膽固醇，膽汁酸，脂質(zhì)，肽，聚合物，蛋白質(zhì)或適體，其與多核酸聚合物綴合用于細胞內(nèi)遞送和/或改善的穩(wěn)定性。遞送載體可以細胞或組織特異性的或者發(fā)育階段特異性的。遞送載體可包含抗體或其部分。抗體可以對感興趣的細胞上的細胞表面標志物是特異性的，以將多核酸聚合物遞送到特定細胞。例如，根據(jù)jihoonjeong等人(journalofcontrolledrelease107(2005)562-570)，其通過引用并入本文，抗體可包含用于將非病毒多核酸聚合物靶向遞送到胰島β細胞的抗gad抗體。例如，抗gad抗體通過peg接頭將抗gadfab’片段與pei綴合(pei-peg-fab’)。其他特異性抗體可以用于這樣的綴合以將多核酸聚合物遞送到靶向組織。

藥物組合物/制劑、給藥和治療方案

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種治療特征為蛋白質(zhì)功能形式的產(chǎn)生受損的疾病或病癥的治療劑，其包括向受試者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含誘導提高部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中內(nèi)含子剪除的治療劑；其中所述受試者具有部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池，所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物能夠編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的拷貝并且所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物各自包含抑制所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的翻譯的至少一個保留內(nèi)含子；和使所述受試者的靶細胞與所述治療劑接觸，以誘導所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池的一部分經(jīng)歷剪接而從所述部分中的每個所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物去除所述至少一個保留內(nèi)含子，從而產(chǎn)生完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物，其中所述完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物翻譯以表達所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的拷貝，這治療所述疾病或病癥。

治療劑可以引起細胞中一種或多種剪接蛋白復合物的激活，以從部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池的一部分中的每個部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物去除至少一個保留內(nèi)含子。治療劑可以抑制調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。治療劑可以激活調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。治療劑可以與調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)相互作用或結(jié)合。治療劑可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶多核苷酸序列相互作用或結(jié)合。在一些實施方式中，治療劑可以是多核酸聚合物，例如本文所述的多核酸聚合物。在一些實施方式中，治療劑可以是小分子。

小分子可以是小于900道爾頓的分子，并且可以在細胞中啟動一個或多個剪接蛋白復合物以從部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池的一部分中的每個部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物去除至少一個保留內(nèi)含子。小分子可以抑制調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。小分子可以激活調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。小分子可以與調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)相互作用或結(jié)合，或者可以與部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶多核苷酸序列相互作用或結(jié)合。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包含本發(fā)明的多核酸聚合物的組合物。組合物可以是藥學上可接受的組合物。組合物可包含藥學上可接受的載體。組合物可包含另外的活性劑，例如藥物或前藥。組合物可包含不同多核酸聚合物(例如sso)的組合用于治療。

除了多核酸聚合物之外，組合物還可包含至少一種另外的生物活性分子。生物活性分子可以是藥物或前藥。生物活性分子可包含核酸或氨基酸。生物活性分子可包含小分子(例如<900道爾頓的分子)。

本文所述的藥物組合物可包含多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述靶序列在兩個g四鏈體之間，其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。本文所述的藥物組合物也可包含多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件包含第一ccc基序，并且其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。此外，本文所述的藥物組合物可包含多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序不形成g四鏈體，并且其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

本文所述的藥物組合物還可包含多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，并且其中所述結(jié)合基序形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

本文所述的藥物制劑可以通過多種施用途徑(包括但不限于胃腸外(例如靜脈內(nèi)，皮下，肌內(nèi))，口服，鼻內(nèi)，含服，局部，直腸或經(jīng)皮施用途徑)施用于受試者。在一些情況下，本文所述的藥物組合物配制用于胃腸外(例如靜脈內(nèi)，皮下，肌內(nèi))施用。在另外的情況下，本文所述的藥物組合物配制用于口服施用。在又另外的情況下，本文所述的藥物組合物配制用于鼻內(nèi)施用。

本文所述的藥物制劑可包括但不限于水性液體分散體，自乳化分散體，固溶體，脂質(zhì)體分散體，氣溶膠，固體劑型，粉末，速釋制劑，控釋制劑，快速熔融制劑，片劑，膠囊劑，丸劑，延釋制劑，延長釋放制劑，脈沖釋放制劑，多顆粒制劑以及混合的速釋和控釋制劑。

藥物制劑可包含載體或載體材料，其可包括藥劑學中任何常用的賦形劑，并且應當基于與本文公開的組合物的相容性和期望劑型的釋放曲線性質(zhì)來選擇。示例性載體材料包括例如粘合劑，懸浮劑，崩解劑，填充劑，表面活性劑，增溶劑，穩(wěn)定劑，潤滑劑，潤濕劑，稀釋劑等。藥學上相容的載體材料可包括但不限于阿拉伯膠，明膠，膠體二氧化硅，甘油磷酸鈣，乳酸鈣，麥芽糊精，甘油，硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，膽固醇，膽固醇酯，酪蛋白酸鈉，大豆卵磷脂，?；悄懰?，磷脂酰膽堿，氯化鈉，磷酸三鈣，磷酸氫二鉀，纖維素和纖維素偶聯(lián)物，糖硬脂酰乳酸鈉，卡拉膠，單甘油酯，甘油二酯，預膠化淀粉等。參見，例如remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第十九版(easton，pa.：mackpublishingcompany，1995)；hoover，johne.,remington’spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.,easton，pennsylvania1975；liberman，h.a.和lachman，l.,eds.,pharmaceuticaldosageforms，marceldecker，newyork，n.y.,1980；和pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，第七版(lippincottwilliams&wilkins1999)。

藥物制劑可包含分散劑和/或粘度調(diào)節(jié)劑，其可包括控制藥物在液體介質(zhì)中的擴散和均一性的材料或者造粒方法或共混方法。在一些實施方式中，這些試劑還促進涂層或侵蝕基質(zhì)的效率。示例性擴散促進劑/分散劑包括例如親水性聚合物，電解質(zhì)，60或80，peg，聚乙烯吡咯烷酮(pvp；商業(yè)上稱為)和基于碳水化合物的分散劑，例如羥丙基纖維素(例如hpc，hpc-sl和hpc-l)，羥丙基甲基纖維素(例如hpmck100，hpmck4m，hpmck15m和hpmck100m)，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，乙酸硬脂酸羥丙基甲基纖維素(hpmcas)，非晶纖維素，硅酸鎂鋁，三乙醇胺，聚乙烯醇(pva)，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)，具有環(huán)氧乙烷和甲醛的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物(也稱為泰洛沙泊)，泊洛沙姆(例如pluronics和其是環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物)；和泊洛沙胺(例如tetronic也稱為poloxamine其是從環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷順序添加到乙二胺獲得的四官能嵌段共聚物(basfcorporation，parsippany，n.j.))，聚乙烯吡咯烷酮k12，聚乙烯吡咯烷酮k17，聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s-630)，聚乙二醇，例如聚乙二醇可具有約300至約6000、或約3350至約4000或約7000至約5400的分子量，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，聚山梨酯-80，海藻酸鈉，樹膠，例如黃蓍膠和阿拉伯膠，瓜爾膠，黃原膠類，包括黃原膠，糖，纖維素材料，例如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚山梨酯-80，海藻酸鈉，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚維酮，卡波姆，聚乙烯醇(pva)，海藻酸鹽，殼聚糖及其組合。增塑劑如纖維素或三乙基纖維素也可用作分散劑。特別適用于脂質(zhì)體分散體和自乳化分散體的分散劑是二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿，來自蛋的天然磷脂酰膽堿，來自蛋的天然磷脂酰甘油，膽固醇和肉豆蔻酸異丙酯。

藥物制劑可包含ph調(diào)節(jié)劑或緩沖劑，其可包括酸，例如乙酸，硼酸，檸檬酸，乳酸，磷酸和鹽酸；堿，例如氫氧化鈉，磷酸鈉，硼酸鈉，檸檬酸鈉，乙酸鈉，乳酸鈉和三羥甲基氨基甲烷；和緩沖劑，例如檸檬酸鹽/葡萄糖，碳酸氫鈉和氯化銨。這樣的酸、堿和緩沖劑以將組合物的ph維持在可接受范圍內(nèi)所需的量被包含。

藥物制劑還可包含使組合物的滲透壓達到可接受范圍所需的量的一種或多種鹽。這樣的鹽可包括具有鈉，鉀或銨陽離子和氯離子，檸檬酸根，抗壞血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氫根，硫酸根，硫代硫酸根或亞硫酸氫根陰離子的鹽；適合的鹽包括氯化鈉，氯化鉀，硫代硫酸鈉，亞硫酸氫鈉和硫酸銨。

藥物制劑還可包含稀釋劑，因其可提供更穩(wěn)定的環(huán)境而也可用于使化合物穩(wěn)定。溶解在緩沖溶液中的鹽(其也可以提供ph控制或維持)可以用作本領(lǐng)域中的稀釋劑，包括但不限于磷酸鹽緩沖鹽溶液。在某些情況下，稀釋劑增加組合物體積以幫助壓縮或為均勻摻合物產(chǎn)生足夠體積而用于膠囊填充。這樣的化合物可包括例如乳糖，淀粉，甘露醇，山梨醇，葡萄糖，微晶纖維素，如磷酸氫鈣，二水合磷酸氫二鈣；磷酸三鈣，磷酸鈣；無水乳糖，噴霧干燥的乳糖；預膠化淀粉，可壓縮糖，如di-(amstar)；甘露醇，羥丙基甲基纖維素，乙酸硬脂酸羥丙基甲基纖維素，蔗糖基稀釋劑，糖粉(confectioner’ssugar)；一水合硫酸二氫鈣，二水合硫酸鈣；三水合乳酸鈣，葡萄糖結(jié)合劑(dextrates)；水解谷物固體，直鏈淀粉；粉末纖維素，碳酸鈣；甘氨酸，高嶺土；甘露醇，氯化鈉；肌醇，膨潤土等。

藥物制劑可包含促進物質(zhì)分解或崩解的崩解試劑或崩解劑。術(shù)語“崩解”可包括當與胃腸液接觸時劑型的溶解和分散。崩解劑的實例可包括淀粉，例如天然淀粉(如玉米淀粉或馬鈴薯淀粉)，預膠化淀粉(如national1551或)，或淀粉羥乙酸鈉(如或)，纖維素(如木材產(chǎn)品)，甲基結(jié)晶纖維素(例如ph101，ph102，ph105，p100，ming和solka-)，甲基纖維素，交聯(lián)羧甲基纖維素或交聯(lián)纖維素(如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(ac-di-)，交聯(lián)羧甲基纖維素，或交聯(lián)的交聯(lián)羧甲纖維素)，交聯(lián)淀粉(如淀粉羥乙酸鈉)，交聯(lián)聚合物(如交聯(lián)聚維酮，交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)，海藻酸鹽(如海藻酸或海藻酸的鹽，如海藻酸鈉)，粘土(如hv(硅酸鎂鋁))，樹膠(如瓊脂，瓜爾膠，刺槐豆膠，卡拉亞膠，果膠或黃蓍膠)，淀粉羥乙酸鈉，膨潤土，天然海綿，表面活性劑，樹脂(如陽離子交換樹脂)，柑橘渣，月桂基硫酸鈉，與淀粉組合，等。

藥物制劑可包含填充劑，例如乳糖，碳酸鈣，磷酸鈣，磷酸氫鈣，硫酸鈣，微晶纖維素，纖維素粉末，葡萄糖，葡萄糖結(jié)合劑，葡聚糖，淀粉，預膠化淀粉，蔗糖，木糖醇，乳糖醇，甘露醇，山梨醇，氯化鈉，聚乙二醇等。

藥物制劑可包含調(diào)味劑和/或甜味劑，例如阿拉伯膠糖漿，安賽蜜k，阿力甜，茴香，蘋果，阿斯巴甜，香蕉，巴伐利亞奶油，漿果，黑醋栗，黃油硬糖味的棕色糖漿(butterscotch)，檸檬酸鈣，樟腦，焦糖，櫻桃，櫻桃乳脂，巧克力，肉桂，泡泡糖，柑橘，柑橘榨汁(citruspunch)，柑橘乳脂，棉花糖，可可，可樂，冷櫻桃，冷柑橘，環(huán)璜酸鹽，cylamate，葡萄糖，桉樹，丁香油酚，果糖，水果榨汁，生姜，甘草亭酸酯，甘草(甘草)糖漿，葡萄，葡萄柚，蜂蜜，異麥芽酮糖醇，檸檬，酸橙，檸檬乳脂，甘草酸單銨(monoammoniumglyrrhizinate)麥芽酚，甘露醇，楓樹，棉花糖，薄荷醇，薄荷乳脂，混合漿果，新橙皮苷dc，紐甜，橙，梨，桃，胡椒薄荷，胡椒薄荷乳脂，粉，樹莓，根汁，朗姆酒，糖精，黃樟素，山梨醇，綠薄荷，綠薄荷乳脂，草莓，草莓乳脂，甜葉菊，三氯蔗糖，蔗糖，糖精鈉，糖精，阿斯巴甜，安賽蜜鉀，甘露醇，踝蛋白，木糖醇(sylitol)，三氯蔗糖，山梨醇，瑞士奶油，塔格糖，柑桔，索馬甜，百果糖，香草，核桃，西瓜，野櫻桃，冬青，木糖醇或這些調(diào)味成分的任何組合，例如茴芹-薄荷醇，櫻桃-茴芹，肉桂-橙，櫻桃-肉桂，巧克力-薄荷，蜂蜜-檸檬，檸檬-酸橙，檸檬-薄荷，薄荷醇-桉樹，橙-奶油，香草-薄荷及其混合物。

潤滑劑和助流劑也可包含在本文所述的藥物制劑中，其可以防止、減少或抑制材料的粘附或摩擦。示例性的潤滑劑可包括例如硬脂酸，氫氧化鈣，滑石，硬脂基富馬酸鈉，烴如礦物油，或氫化植物油如氫化大豆油高級脂肪酸及其堿金屬和堿土金屬鹽如鋁，鈣，鎂，鋅，硬脂酸，硬脂酸鈉，甘油，滑石，蠟，硼酸，苯甲酸鈉，乙酸鈉，氯化鈉，亮氨酸，聚乙二醇(例如peg-4000)或甲氧基聚乙二醇如carbowax^tm，油酸鈉，苯甲酸鈉，山崳酸甘油酯，聚乙二醇，月桂基硫酸鎂或鈉，膠體二氧化硅如syloid^tm，cab-o-淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性劑等。

增塑劑可以是用于使微包封材料或薄膜包衣軟化以使它們較不易碎的化合物。適合的增塑劑包括例如聚乙二醇如peg300，peg400，peg600，peg1450，peg3350和peg800，硬脂酸，丙二醇，油酸，三乙基纖維素和三醋酸甘油酯。增塑劑還可以用作分散劑或潤濕劑。

增溶劑可包括化合物，如三醋酸甘油酯，檸檬酸三乙酯，油酸乙酯，辛酸乙酯，月桂基硫酸鈉，多庫酯鈉(sodiumdoccusate)，維生素etpgs，二甲基乙酰胺，n-甲基吡咯烷酮，n-羥乙基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素，羥丙基環(huán)糊精，乙醇，正丁醇，異丙醇，膽固醇，膽汁鹽，聚乙二醇200-600，三縮四乙二醇，二乙二醇單乙醚，丙二醇和二甲基異山梨醇等。

穩(wěn)定劑可包括化合物，如任何抗氧化劑，緩沖劑，酸，防腐劑等。

懸浮劑可包括化合物，如聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮k12，聚乙烯吡咯烷酮k17，聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)，聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有約300至約6000、或約3350至約4000或約7000至約5400的分子量，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，乙酸硬脂酸羥甲基纖維素，聚山梨酯-80，羥乙基纖維素，海藻酸鈉，樹膠，如黃蓍膠和阿拉伯膠，瓜爾膠，黃原膠類，包括黃原膠，糖，纖維素材料，如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，羥丙基甲基纖維素，羥乙基纖維素，聚山梨酯-80，海藻酸鈉，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚維酮等。

表面活性劑可包括化合物，如月桂基硫酸鈉，多庫酯鈉，tween60或80，三醋酸甘油酯，維生素etpgs，脫水山梨醇單油酸酯，聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯，聚山梨醇酯，泊洛沙姆，膽汁鹽，單硬脂酸甘油酯，環(huán)氧乙烷和丙烯的共聚物氧化物，例如(basf)等。另外的表面活性劑可包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯聚醇(octoxynol)10，辛苯聚醇40。有時，可包含表面活性劑以增強物理穩(wěn)定性或用于其它目的。

粘度增強劑可包括例如甲基纖維素，黃原膠，羧甲基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，乙酸硬脂酸羥丙基甲基纖維素，鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素，卡波姆，聚乙烯醇，海藻酸鹽，阿拉伯膠，殼聚糖及其組合。

潤濕劑可包括化合物，如油酸，單硬脂酸甘油酯，脫水山梨醇單油酸酯，脫水山梨醇單月桂酸酯，油酸三乙醇胺，聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯，多庫酯鈉，油酸鈉，月桂基硫酸鈉，多庫酯鈉，三醋酸甘油酯，吐溫80，維生素etpgs，銨鹽等。

可注射制劑

適合于肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)注射的制劑可包括生理學上可接受的無菌水性或非水性溶液，分散體，懸浮液或乳液，以及用于重構(gòu)成無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。適合的水性和非水性載體(carrier)，稀釋劑，溶劑或媒介(vehicle)的實例包括水，乙醇，多元醇(丙二醇，聚乙二醇，甘油，克列莫佛等)，其適合的混合物，植物油(如橄欖油)和可注射有機酯，如油酸乙酯?？梢岳缤ㄟ^使用包衣例如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需粒度以及通過使用表面活性劑來保持適當?shù)牧鲃有?。適合于皮下注射的制劑還可以含有添加劑，如防腐劑，潤濕劑，乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如尼泊金酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸等確保防止微生物生長。包含等滲劑，例如糖、氯化鈉等，也可以是期望的。可注射藥物形式的延長吸收可以通過使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)。

對于靜脈內(nèi)注射，本文所述的化合物可以配制在水溶液中，優(yōu)選配制在生理學相容的緩沖液如hank氏溶液、ringer氏溶液或生理鹽水緩沖液中。對于經(jīng)粘膜施用，在制劑中使用適合于待滲透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的。對于其他胃腸外注射，適合的制劑可包括水性或非水性溶液，優(yōu)選用生理相容的緩沖劑或賦形劑。這樣的賦形劑通常是本領(lǐng)域已知的。

腸胃外注射可包括濃注(bolusinjection)或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以以單位劑型存在，例如在安瓿或多劑量容器中，具有加入的防腐劑。本文所述的藥物組合物可以是適合于作為在油性或水性媒介中的無菌懸浮液、溶液或乳液胃腸外注射的形式，并且可以含有配制劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于胃腸外施用的藥物制劑包括水溶性形式的活性化合物的水性溶液。此外，活性化合物的懸浮體可以制備為適宜的油性注射懸浮體。適合的親脂性溶劑或媒介包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸浮體可以含有增加懸浮體粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，懸浮體還可以含有適合的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度以允許制備高度濃縮的溶液的試劑?；蛘撸钚猿煞挚梢允怯糜谠谑褂们坝眠m合的媒介(例如無菌無熱原水)重構(gòu)的粉末形式。

口服制劑

用于口服使用的藥物制備物可以通過將一種或多種固體賦形劑與一種或多種本文所述的化合物混合，任選地研磨所得混合物，并且在需要時在加入適合的助劑后加工顆?；旌衔镆垣@得片劑或糖丸核而獲得。適合的賦形劑可包括例如填充劑，如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇；纖維素制備物，例如玉米淀粉，小麥淀粉，稻米淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃蓍膠，甲基纖維素，微晶纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉；或其它，如聚乙烯吡咯烷酮(pvp或聚維酮)或磷酸鈣。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)的交聯(lián)羧甲纖維素鈉，聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或者海藻酸或其鹽，如藻酸鈉。

糖丸核可以具有適合的包衣。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，其可以任選地含有阿拉伯膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆凝膠，聚乙二醇和/或二氧化鈦，漆溶液和適合的有機溶劑或溶劑混合物。染料或顏料可以添加到片劑或糖丸包衣中用于識別或表征不同的活性化合物劑量的組合。

固體劑型可以是片劑形式(包括懸浮片劑，快熔片劑，咬-崩解片劑，快速崩解片劑，泡騰片劑或囊片)，丸劑，粉末劑(包括無菌包裝粉末、可分配粉末或泡騰粉末)，膠囊(包括軟或硬膠囊，例如由動物來源的明膠或植物來源的hpmc制成的膠囊或“淋灑膠囊(sprinklecapsule)”)，固體分散體，固溶體，可生物侵蝕劑型，控釋制劑，脈沖釋放劑型，多顆粒劑型，粒劑，顆粒劑或氣霧劑。在另外的情況下，藥物制劑是粉末形式。在又一些情況下，藥物制劑是片劑形式，包括但不限于快熔片劑。另外，本文所述的藥物制劑可以作為單膠囊或多膠囊的劑型施用。在一些情況下，藥物制劑以兩個、三個或四個膠囊或片劑施用。

藥物固體劑型可包含本文所述的組合物和一種或多種藥學上可接受的添加劑，例如相容的載體，粘合劑，填充劑，懸浮劑，調(diào)味劑，甜味劑，崩解劑，分散劑，表面活性劑，潤滑劑，著色劑，稀釋劑，增溶劑，濕潤劑，增塑劑，穩(wěn)定劑，滲透促進劑，潤濕劑，消泡劑，抗氧化劑，防腐劑或其一種或多種組合。在又一些方面，使用標準包衣程序，例如在remington’spharmaceuticalsciences，第20版(2000)中描述的那些。

用于固體劑型的適合的載體可包括但不限于阿拉伯膠，明膠，膠體二氧化硅，甘油磷酸鈣，乳酸鈣，麥芽糊精，甘油，硅酸鎂，酪蛋白酸鈉，大豆卵磷脂，氯化鈉，磷酸三鈣，磷酸氫二鉀，硬脂酰乳酸鈉，卡拉膠，甘油單酯，甘油二酯，預膠化淀粉，羥丙基甲基纖維素，乙酸硬脂酸羥丙基甲基纖維素，蔗糖，微晶纖維素，乳糖，甘露醇等。

用于固體劑型的適合的填充劑可包括但不限于乳糖，碳酸鈣，磷酸鈣，磷酸氫鈣，硫酸鈣，微晶纖維素，纖維素粉末，葡萄糖，葡萄糖結(jié)合劑，葡聚糖，淀粉，預膠化淀粉，羥丙基甲基纖維素(hpmc)，羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，乙酸硬脂酸羥丙基甲基纖維素(hpmcas)，蔗糖，木糖醇，乳糖醇，甘露醇，山梨醇，氯化鈉，聚乙二醇等。

粘合劑賦予固體口服劑型制劑以粘結(jié)性：對于粉末填充的膠囊制劑，它們有助于栓塞形成，其可以填充到軟殼或硬殼膠囊中，并且對于片劑制劑，它們確保片劑在壓縮后保持完整，并且?guī)椭_保在壓縮或填充步驟之前的混合均勻性。適合用作本文所述的固體劑型中的粘合劑的材料包括但不限于羧甲基纖維素，甲基纖維素(例如)，羥丙基甲基纖維素(例如hypromelloseusppharmacoat-603)，乙酸硬脂酸羥丙基甲基纖維素(aqoatehs-lf和hs)，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素(例如)，乙基纖維素(例如)和微晶纖維素(例如)，微晶葡萄糖，直鏈淀粉，硅酸鎂鋁，多糖酸，膨潤土，明膠，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物，交聯(lián)聚維酮，聚維酮，淀粉，預膠化淀粉，黃蓍膠，糊精，糖，如蔗糖(例如)，葡萄糖，葡萄糖，糖蜜，甘露醇，山梨醇，木糖醇(例如)，乳糖，天然或合成樹膠，如阿拉伯膠，黃蓍膠，印度膠(ghattigum)，isapol殼的粘膠，淀粉，聚乙烯吡咯烷酮(例如cl，cl，xl-10，和k-12)，落葉松阿拉伯半乳聚糖，聚乙二醇，蠟，海藻酸鈉等。

用于固體劑型中的適合的潤滑劑或助流劑可包括但不限于硬脂酸，氫氧化鈣，滑石，玉米淀粉，硬脂基富馬酸鈉，堿金屬和堿土金屬鹽，如鋁，鈣，鎂，鋅，硬脂酸，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，硬脂酸鋅，蠟，硼酸，苯甲酸鈉，乙酸鈉，氯化鈉，亮氨酸，聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇，如carbowax^tm，peg4000，peg5000，peg6000，丙二醇，油酸鈉，山崳酸甘油酯，棕櫚酰硬脂酸甘油酯，苯甲酸甘油酯，月桂基硫酸鎂或月桂基硫酸鈉等。

用于固體劑型的適合的稀釋劑可包括但不限于糖(包括乳糖，蔗糖和葡萄糖)，多糖(包括葡萄糖結(jié)合劑和麥芽糊精)，多元醇(包括甘露醇，木糖醇和山梨醇)，環(huán)糊精等。

用于固體劑型的適合的潤濕劑可包括例如油酸，單硬脂酸甘油酯，脫水山梨醇單油酸酯，脫水山梨醇單月桂酸酯，油酸三乙醇胺，聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯，季銨化合物(例如polyquat)，油酸鈉，月桂基硫酸鈉，硬脂酸鎂，多庫酯鈉，三醋酸甘油酯，維生素etpgs等。

用于固體劑型的適合的表面活性劑可包括例如十二烷基硫酸鈉，脫水山梨醇單油酸酯，聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯，聚山梨酯，泊洛沙姆，膽汁鹽，單硬脂酸甘油酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物，例如(basf)等。

用于固體劑型的適合的懸浮劑可包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮k12，聚乙烯吡咯烷酮k17，聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30，聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有約300至約6000、或約3350至約4000或約7000至約5400的分子量，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，聚山梨酯-80，羥乙基纖維素，海藻酸鈉，樹膠，例如黃蓍膠和阿拉伯膠，瓜爾膠，黃原膠類，包括黃原膠，糖，纖維素材料，例如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，羥丙基甲基纖維素，羥乙基纖維素，聚山梨酯-80，海藻酸鈉，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚維酮等。

用于固體劑型的適合的抗氧化劑包括例如丁基化羥基甲苯(bht)，抗壞血酸鈉和生育酚。

用于口服施用的液體制劑劑型可以是選自包括但不限于藥學上可接受的水性口服分散體，乳液，溶液，酏劑，凝膠劑和糖漿劑的組的水性懸浮體。參見，例如singh等人，encyclopediaofpharmaceuticaltechnology，第2版，第754-757頁(2002)。另外，液體劑型可包含添加劑，例如：(a)崩解劑；(b)分散劑；(c)潤濕劑；(d)至少一種防腐劑，(e)粘度增強劑，(f)至少一種甜味劑和(g)至少一種調(diào)味劑。在一些實施方式中，水性分散體可以進一步包含結(jié)晶抑制劑。

本文所述的水性懸浮體和分散體可以在如usp藥師藥典(2005版，第905章)中定義的均勻狀態(tài)保持至少4小時。均質(zhì)性應通過與確定整個組合物的均質(zhì)性一致的取樣方法來確定。在一個實施方式中，可以通過持續(xù)小于1分鐘的物理攪拌將水性懸浮體再懸浮成均勻的懸浮體。在另一個方面，可以通過持續(xù)小于45秒的物理攪拌將水性懸浮體再懸浮成均勻的懸浮體。在又一個方面，可以通過持續(xù)小于30秒的物理攪拌將水性懸浮體再懸浮成均勻的懸浮體。在又一個實施方式中，不需要攪拌來維持均勻的水性分散體。

在另一個方面，劑型可包括微包封制劑。在一些實施方式中，一種或多種另外的相容性材料存在于微包封材料中。示例性材料包括但不限于ph調(diào)節(jié)劑，侵蝕促進劑，消泡劑，抗氧化劑，調(diào)味劑和載體材料，如粘合劑，懸浮劑，崩解劑，填充劑，表面活性劑，增溶劑，穩(wěn)定劑，潤滑劑，潤濕劑和稀釋劑。

可用于延遲包含本文所述化合物的制劑的釋放的示例性微包封材料包括但不限于羥丙基纖維素醚(hpc)，例如或nissohpc，低取代羥丙基纖維素醚(l-hpc)，羥丙基甲基纖維素醚(hpmc)，如seppifilm-lc，metolosesr，-e，opadryys，primaflo，benecelmp824和benecelmp843，甲基纖維素聚合物，如-a，乙酸硬脂酸羥丙基甲基纖維素aqoat(hf-ls，hf-lg，hf-ms)和乙基纖維素(ec)及其混合物，如e461，-ec，聚乙烯醇(pva)，如opadryamb，羥乙基纖維素，如羧甲基纖維素和羧甲基纖維素(cmc)的鹽，如-cmc，聚乙烯醇和聚乙二醇共聚物，如kollicoat單甘油酯(myverol)，甘油三酯(klx)，聚乙二醇，改性食品淀粉，丙烯酸聚合物和丙烯酸聚合物與纖維素醚的混合物，如epo，l30d-55，fs30dl100-55，l100，s100，rd100，e100，l12.5，s12.5，ne30d和ne40d，乙酸纖維素鄰苯二甲酸酯，sepifilms，如hpmc和硬脂酸的混合物，環(huán)糊精，以及這些材料的混合物。

增塑劑可包括聚乙二醇，例如peg300，peg400，peg600，peg1450，peg3350和peg800，硬脂酸，丙二醇，油酸和三醋酸甘油酯，其摻入到微包封材料中。在另外的實施方式中，用于延遲藥物組合物釋放的微包封材料來自usp或國家處方集(nf)。在又一些實施方式中，微包封材料是klucel。在再一些實施方式中，微包封材料是甲基纖維素。

微包封組合物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法配制。這樣的已知方法包括例如噴霧干燥法，旋轉(zhuǎn)圓盤-溶劑法，熱熔融法，噴霧冷卻法，流化床，靜電沉積，離心擠出，旋轉(zhuǎn)懸浮分離，液-氣或固氣界面處聚合，壓力擠出，或噴霧溶劑萃取浴。除了這些之外，還可以使用幾種化學技術(shù)，例如復合凝聚，溶劑蒸發(fā)，聚合物-聚合物不相容性，液體介質(zhì)中的界面聚合，原位聚合，液體中干燥和液體介質(zhì)中的去溶劑化。此外，也可以使用其它方法，例如輥壓，擠出/滾圓，凝聚或納米顆粒涂布。

鼻內(nèi)制劑

鼻內(nèi)制劑是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如美國專利號4,476,116和6,391,452中。使用本領(lǐng)域中已知的苯甲醇或其它適合的防腐劑、碳氟化合物和/或其它增溶劑或分散劑，根據(jù)上述和本領(lǐng)域公知的其它技術(shù)制備的包含本文所述組合物的制劑制備為在鹽水中的溶液。參見，例如ansel，h.c.等人，pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，第六版(1995)。優(yōu)選地，用適合的無毒的藥學上可接受的成分制備這些組合物和制劑。這些成分是制備鼻用劑型的技術(shù)人員已知的，并且這些成分中的一些可以在本領(lǐng)域的標準參考書，remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，2005中找到。適合載體的選擇高度取決于期望的鼻用劑型(例如溶液，懸浮體，軟膏劑或凝膠劑)的確切性質(zhì)。除活性成分外，鼻用劑型通常還含有大量的水。也可以存在少量的其它成分，例如ph調(diào)節(jié)劑，乳化劑或分散劑，防腐劑，表面活性劑，膠凝劑或緩沖劑和其它穩(wěn)定和增溶劑。鼻用劑型應與鼻分泌物等滲。

對于吸入施用，本文所述的可以是氣溶膠、輕霧或粉末的形式。本文所述的藥物組合物使用適合的推進劑，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它適合的氣體，以來自加壓包裝或噴霧器的氣霧劑噴霧形式方便地遞送。在加壓氣溶膠的情況下，可以通過提供閥以遞送計量的量來確定劑量單元?？梢耘渲评?僅舉例而言)用于吸入器或吹入器的明膠的膠囊和藥筒，含有本文所述化合物與適合的粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

治療方案

可以施用組合物用于治療應用或作為維持治療，例如對于緩解期的患者。組合物可以每天一次，每天兩次，每天三次或更多次施用。組合物可以每日，每天，每隔一天，一周5天，每周一次，每隔一周，每月兩周，每月三周，每月一次，每月兩次，每月三次或者更多次施用。組合物可以施用至少1個月，2個月，3個月，4個月，5個月，6個月，7個月，8個月，9個月，10個月，11個月，12個月，18個月，2年，3年或更多。

在其中患者狀態(tài)確實改善的情況下，根據(jù)醫(yī)生的判斷，化合物的施用可以連續(xù)給予；或者，所施用的藥物的劑量可以暫時減少或暫時中止一段時間(即“藥物假期”)。藥物假期的長度可以在2天和1年之間變化，包括(僅舉例而言)2天，3天，4天，5天，6天，7天，10天，12天，15天，20天，28天，35天，50天，70天，100天，120天，150天，180天，200天，250天，280天，300天，320天，350天或365天。藥物假期期間的劑量減少可以是10％-100％，包括(僅舉例而言)10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。

一旦已經(jīng)發(fā)生患者病癥改善，如果需要，施用維持劑量。隨后，可以隨癥狀將施用的劑量或頻率或兩者減少至保持改善的疾病、障礙或病癥的水平。然而，患者可能在任何癥狀復發(fā)后需要長期間歇性治療。

將對應于這樣的量的給定試劑的量將根據(jù)以下因素而變化，例如具體化合物、疾病的嚴重性、需要治療的受試者或宿主的特性(例如，體重)，但是仍然可以以本領(lǐng)域已知的方式根據(jù)病例周圍的具體情況常規(guī)確定，包括例如所施用的具體藥劑、給藥途徑和所治療的受試者或宿主。期望的劑量可以以單一劑量或作為同時(或在短時間內(nèi))或以適當?shù)拈g隔施用的分開的劑量方便地存在，例如每天兩個、三個、四個或更多個亞劑量。

本文所述的藥物組合物可以是適合于單次施用精確劑量的單位劑型。在單位劑型中，將制劑分成含有適量的一種或多種化合物的單位劑量。單位劑量可以是含有離散量的制劑的包裝的形式。非限制性實例是包裝的片劑或膠囊劑，以及小瓶或安瓿中的粉劑。水性懸浮體組合物可包裝在單劑量、不可再封閉的容器中?；蛘?，可以使用多劑量、可再封閉容器，在這種情況下，通常在組合物中包含防腐劑。僅舉例而言，用于胃腸外注射的制劑可以存在于單位劑型(其包括但不限于安瓿)或多劑量容器中，含有加入的防腐劑。

上述范圍僅僅是提示性的，因為關(guān)于個體治療方案的變量的數(shù)量很大，并且這些推薦值的顯著偏離并不罕見。這樣的劑量可以根據(jù)大量變量而改變，不限于所用的化合物的活性、待治療的疾病或病癥、施用模式、個體受試者的需要、所治療的疾病或病癥的嚴重性以及醫(yī)生的判斷。

這樣的治療方案的毒性和治療功效可以在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏型ㄟ^標準藥學程序測定，包括但不限于測定ld50(對群體的50％致死的劑量)和ed50(在群體的50％中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，并且其可以表示為ld50和ed50之間的比率。表現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。從細胞培養(yǎng)試驗和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于制定用于人的劑量范圍。這樣的化合物的劑量優(yōu)選在具有最小毒性的循環(huán)濃度范圍(包括ed50)內(nèi)。劑量可以在該范圍內(nèi)變化，取決于所采用的劑型和所使用的施用途徑。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種選擇進行治療的受試者的方法，其包括確定所述受試者是否患有由基因轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留所引起的缺陷性蛋白質(zhì)表達所誘導的疾病，其中在陽性確認后，選擇所述受試者待進行治療；和任選地治療所述受試者。

治療可包括改正基因轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留。治療可包括將根據(jù)本發(fā)明的多核酸聚合物與基因轉(zhuǎn)錄物雜交，以誘導從基因轉(zhuǎn)錄物去除內(nèi)含子。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了使用反義多核酸聚合物通過癌細胞中內(nèi)含子保留的改正而使基因表達正?；挠猛?。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于治療或預防疾病的根據(jù)本發(fā)明的多核酸聚合物、根據(jù)本發(fā)明的組合物、根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的遞送載體。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于生產(chǎn)治療或預防疾病的藥物的根據(jù)本發(fā)明的多核酸聚合物、根據(jù)本發(fā)明的組合物、根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的遞送載體。

疾病可以是糖尿病或癌癥。

在提及多核酸聚合物序列時，技術(shù)人員應理解序列中可以容許一個或多個置換，任選地，序列中可以容許兩個置換，使得其維持與靶序列雜交的能力，或者在置換是在靶序列中的情況下，維持被識別為靶序列的能力。提及序列同一性，可以使用標準/默認參數(shù)通過blast序列比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)測定。例如，序列可以具有99％同一性并且仍然發(fā)揮根據(jù)本發(fā)明的作用。在另外的實施方式中，序列可以具有98％同一性并且仍然發(fā)揮根據(jù)本發(fā)明的作用。在另一個實施方式中，序列可以具有95％同一性并且仍然發(fā)揮根據(jù)本發(fā)明的作用。

當提及減少或改正內(nèi)含子保留時，減少可以是完全的，例如100％，或者可以是部分的。減少可以是臨床上顯著的。減少/改正可以是相對于未治療的受試者中的內(nèi)含子保留水平，或者是相對于類似受試者的群體中的內(nèi)含子保留的量。相對于平均受試者或治療前的受試者，減少/改正可以是少至少10％的內(nèi)含子保留。相對于平均受試者或治療前的受試者，減少/改正可以是少至少20％的內(nèi)含子保留。相對于平均受試者或治療前的受試者，減少/改正可以是少至少40％的內(nèi)含子保留。相對于平均受試者或治療前的受試者，減少/改正可以是少至少50％的內(nèi)含子保留。相對于平均受試者或治療前的受試者，減少/改正可以是少至少60％的內(nèi)含子保留。相對于平均受試者或治療前的受試者，減少/改正可以是少至少80％的內(nèi)含子保留。相對于平均受試者或治療前的受試者，減少/改正可以是少至少90％的內(nèi)含子保留。

試劑盒/制品

本文提供了與本文所述的一種或多種方法一起使用的試劑盒和制品。試劑盒可含有本文所述的多核酸聚合物中的一種或多種，例如識別為seqidno:1，seqidno:2，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:7，seqidno:8，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:16，seqidno:17，seqidno:19，seqidno:20，seqidno:22，seqidno:23，seqidno:25，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:31，seqidno:32，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:37，seqidno:38，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:43或seqidno:44的多核酸聚合物。試劑盒還可含有一種或多種對于本文所述的多核酸聚合物反義的多核酸聚合物，例如，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:15，seqidno:18，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:27，seqidno:30，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:45，seqidno:46或seqidno:47-434。試劑盒可以進一步含有構(gòu)成和遞送多核酸聚合物所必需的試劑和緩沖劑。

試劑盒還可包括被分隔以接收一個或多個容器(例如小瓶、管等)的載體、包裝或容器，每個容器包含待用于本文所述的方法中的單獨部件之一，例如多核酸聚合物和試劑。適合的容器包括例如瓶，小瓶，注射器和試管。容器可以由各種材料形成，例如玻璃或塑料。

本文提供的制品含有包裝材料。藥用包裝材料的實例包括但不限于瓶，管，袋，容器，瓶以及適合于所選擇的制劑和預期的施用和治療模式的任何包裝材料。

試劑盒通常包括列出內(nèi)容物的標簽和/或使用說明，以及具有使用說明的包裝插頁。通常也將包括一組說明。

技術(shù)人員應理解，在適當?shù)那闆r下，本發(fā)明的一個實施方式或方面的任選的特征可適用于本發(fā)明的其它實施方式或方面。

現(xiàn)將參照附圖，僅舉例而言，更詳細地描述本發(fā)明的實施方式。

實施例

這些實施例僅提供用于說明目的，而非限制本文提供的權(quán)利要求的范圍。

實施例1

大多數(shù)真核基因含有必須準確地從初級轉(zhuǎn)錄物中去除以產(chǎn)生能夠編碼蛋白質(zhì)的功能性mrna的間插序列或內(nèi)含子(1)。該過程以高度動態(tài)的方式改變mrna組成，其利用五種小核rna和大量蛋白質(zhì)與前mrna中保守但簡并的序列的相互依賴的相互作用(2)。內(nèi)含子剪接通常促進跨種類的mrna累積和蛋白質(zhì)表達(3-5)。這個過程可以通過內(nèi)含子突變或變體而改變，這也可以削弱偶聯(lián)的基因表達途徑，包括轉(zhuǎn)錄、mrna輸出和翻譯。這通過5’非翻譯區(qū)(5’utr)中的內(nèi)含子而最好地示例，其中改變內(nèi)含子保留的天然變體或突變改變具有上游開放閱讀框(uorf)或其他調(diào)節(jié)基序的轉(zhuǎn)錄物的相對豐度并顯著影響翻譯(6，7)。然而，尚未開發(fā)出在這類情況下使基因表達正?；某晒Φ男蛄刑禺愋圆呗浴?/p>

剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸(sso)是通過結(jié)合剪接位點識別或調(diào)節(jié)序列并與順式和反式作用因子競爭其靶標來調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接的反義試劑(8)。它們已經(jīng)顯示為恢復異常剪接、改變現(xiàn)有mrna的相對表達或產(chǎn)生不正常表達的新型剪接變體(8)。通過大量sso修飾(例如2’-o-甲基和2’-o-甲氧基乙基核糖)提高靶向sso-rna雙鏈體的穩(wěn)定性促進了探索其對于越來越多的人類疾病基因的治療潛力的研究，包括肌肉營養(yǎng)不良中的dmd(9，10)、脊髓性肌萎縮中的smn2(11)、共濟失調(diào)-毛細血管擴張癥中的atm(12)和x連鎖無丙種球蛋白血癥中的btk(13)。雖然這些方法接近于實現(xiàn)其對有限數(shù)量的疾病的臨床潛力(8)，但由突變誘導的異常剪接(14)所導致的>300種孟德爾病癥和越來越多的復雜性狀可能適合于sso介導的基因表達的改正。

1型糖尿病的病因?qū)W具有由人白細胞抗原(hla)和多種修飾性非hla基因座賦予的強遺傳成分(15)。在染色體11上的胰島素原基因(ins)區(qū)域(稱為iddm2)中鑒別到最強的修飾子(15)。這一區(qū)域的進一步作圖表明ins是最可能的iddm2靶標(16)，與這種自身抗原在發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用一致(17)。在iddm2處對于這種疾病的遺傳風險已歸因于與易感性和保護性ins單倍型的差異穩(wěn)態(tài)rna水平，可能涉及該基因上游的小衛(wèi)星dna序列(18，19)。然而，對天然存在的ins多態(tài)性的系統(tǒng)性檢驗揭示了沒有小衛(wèi)星序列的報告基因構(gòu)建體中單倍型特異性胰島素原表達水平，其由內(nèi)含子1(7)中稱為ivs1+5ins4(也稱為rs3842740或ins-69)和ivs1-6a/t(rs689，ins-27或hphi+/-)的兩個變體所導致(16，20)。前一個變體激活內(nèi)含子1的隱蔽5’剪接位點，而位于3’剪接位點(3’ss)上游6個核苷酸的后一個變體的腺嘌呤(a)促進內(nèi)含子保留，從而增加具有延伸的5’utr的轉(zhuǎn)錄物的相對豐度(21)。與胸腺嘧啶(t)相比，ivs1-6a/t的a等位基因在體外降低了對嘧啶結(jié)合蛋白的親和力，并使3’ss更依賴于u2小核核糖核蛋白的輔助因子(u2af)(7)(u2結(jié)合、剪接體組裝和3’ss選擇所需的異源二聚體(22))。含內(nèi)含子1的轉(zhuǎn)錄物在從產(chǎn)生胰島素的組織制備的ivs1-6a衍生cdna文庫中過度表現(xiàn)(21)，從核排出(23)，并含有與高等靈長類中內(nèi)含子1的3’ss的弛緩共同進化的短的人亞科特異性uorf(7)。由a等位基因賦予的更低的胰島素原表達可能導致胰島素原肽在胎兒胸腺中的次優(yōu)表現(xiàn)和自身反應性t細胞的不充分負向選擇，最終導致胰腺中產(chǎn)生胰島素的β細胞的自身免疫破壞(7)。然而，尚未嘗試改正從含有ivs1-6a的前mrna中去除ins內(nèi)含子1的低效率，并將內(nèi)含子保留降低至針對疾病保護性t等位基因所觀察到的水平。

本研究開始尋找在前mrna中增加ins內(nèi)含子1剪接效率并抑制剪接沉默子或誘餌剪接位點以增強胰島素原表達的sso。鑒別了降低內(nèi)含子1保留的轉(zhuǎn)錄物的相對豐度的sso，證明以單核苷酸分辨率描述優(yōu)化的反義靶標，并且顯示了鄰近反義靶序列的平行g(shù)-四鏈體的形成以及結(jié)合該區(qū)域的蛋白質(zhì)的鑒別的證據(jù)。

材料和方法

反義寡核苷酸

sso購自mwgbiotech(德國)。所有sso和亂序?qū)φ站哂性诘诙颂俏恢脦в?’-o-甲基核糖核苷酸的全長硫代磷酸酯骨架。除了inssso及其亂序版本之外，我們使用靶向其它人類基因的sso作為另外的對照控制，如(13)所述。每個sso的位置如圖1a所示，且其序列見表2。

剪接報告基因構(gòu)建體

此前報道了稱為ic的攜帶1型糖尿病相關(guān)單倍型的野生型剪接報道體(7,21)。每個構(gòu)建體都含有所有ins外顯子和完整的內(nèi)含子，但最后的外顯子的長度不同。使用引物d-c、d-f和d-b克隆ic報道體；icd-b缺乏內(nèi)含子2的隱蔽3’ss。與icd-c相比，剪接至該位點的異構(gòu)體的相對豐度對于icdf較低(7,21)。為了測試靶向內(nèi)含子1的隱蔽5’剪接位點的sso，通過在rs3842740處的4-nt插入修飾ic構(gòu)建體，以產(chǎn)生稱為icivs1+5ins4的報道體。此前報道了tsc2和f9構(gòu)建體(24)。質(zhì)粒在大腸桿菌菌株dh5α中擴增，并使用wizardplussvminiprep試劑盒(promega，usa)提取質(zhì)粒dna。它們的插入片段進行完全地測序以確認14個基因內(nèi)天然變體中每一個的身份，并排除不期望的突變。

細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

在dulbecco氏改良eagle培養(yǎng)基、10％胎牛血清和青霉素/鏈霉素(lifetechnologies，usa)中培養(yǎng)人胚腎293(hek293)、人肝細胞肝癌hepg2和非洲綠猴cos7細胞。如(13)所述，根據(jù)制造商的建議使用jetprime(polyplus，usa)進行瞬時轉(zhuǎn)染。如此前報道的(7，25)，用兩次小干擾rna(sirna)u2af35ab攻擊來通過rna干擾(rnai)下調(diào)u2af35以誘導內(nèi)含子1的隱蔽3’ss；靶向dhx36的sirna雙鏈體如所述的(26)。在添加sso和/或報道體之前24小時應用第二次攻擊。在加入報告基因構(gòu)建體之后24小時收獲細胞培養(yǎng)物。

剪接產(chǎn)物分析

用tri試劑提取總rna，并用dna酶(lifetechnologies，usa)處理。使用寡(dt)15引物和莫洛尼鼠病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(promega，usa)逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cdna。如此前報道的(7)，用載體特異性引物pl3和靶向3’utr的引物e的組合進行聚合酶鏈反應(pcr)。在聚丙烯酰胺凝膠上分離pcr產(chǎn)物，并如所述的(27)測量其信號強度。通過sanger核苷酸測序證實每種mrna異構(gòu)體的身份。

圓二色性和核磁共振譜

用于圓二色性(cd)和核磁共振(nmr)的寡核糖核苷酸購自thermoscientific，根據(jù)制造商的說明去保護，凍干并儲存在-20℃下。通過在milliq水或kcl緩沖液(100mmkcl，10mmk2hpo4/kh2po4，ph7.0，milliq水)中重懸浮至2-4μm的終濃度，從脫鹽的凍干樣品制備儲備溶液。使用配備有l(wèi)td6g循環(huán)水浴(grantinstruments，uk)和熱電溫度控制器(melcor，usa)的pistar-180分光光度計(appliedphotophysicsltd，surrey，uk)獲得cd譜。將樣品在小室中加熱至95℃總共15分鐘，然后通過使樣品冷卻至室溫最少4小時時間來將樣品退火。使用1cm路徑長度的無應變石英比色杯在215-340nm波長范圍內(nèi)并在指示溫度下記錄cd譜。以1nm間隔記錄數(shù)據(jù)點。使用3nm的帶寬，并且在使得能夠自適應采樣的情況下在每個點獲取5000計數(shù)。每條跡線顯示為三次掃描的平均值(±sd)。在對應于折疊的四倍體物質(zhì)的帶最大值的265nm處獲得cd溫升。使用5至99℃的范圍，以0.5℃的間隔獲得點，在0.5℃的增量之間時間步長為120-180s。點以10,000計數(shù)獲得，并使得能夠自適應采樣。比較加熱和冷卻研究以檢查滯后和總體可逆性。使用具有三重共振冷凍探針的brukeravanceiii譜儀在800mhz下收集nmr譜(1h)。使用標準bruker采集參數(shù)。使用topspin(3.0版)收集數(shù)據(jù)并在ccpn分析(2.1版)中處理。

拉下實驗和蛋白質(zhì)印跡法

使用megashortscripttmt7(lifetechnologies，usa)以及用引物5’-attaatacgactcactatagggctcagggttccagg和5’-tgcagcagggaggacg和作為模板的所示質(zhì)粒的dna擴增的t7標記的pcr產(chǎn)物進行體外轉(zhuǎn)錄。所示的合成rna購自eurofinsuk。500pmol的每種rna用5mmm-高碘酸鈉處理，并結(jié)合于己二酸二酰肼瓊脂糖珠(adipicaciddehydrazide)(sigma，usa)。具有結(jié)合的rna的珠在2ml的2mnacl中洗滌3次，并在緩沖液d(20mmhepes-koh，ph7，6.5％體積/體積甘油，100mmkcl，0.2mmedta，0.5mm二硫蘇糖醇)中洗滌3次，與hela核提取物和具有終濃度為0.5mg/ml的肝素的緩沖液d一起溫育。用緩沖液d洗滌未結(jié)合的蛋白質(zhì)5次。在10％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過考馬斯藍染色和/或?qū)τ谙跛崂w維素膜進行印跡分析。

如所述的(7)進行蛋白質(zhì)印跡分析。抗體購自sigma(hnrnpe1/e2，產(chǎn)品號r4155，u2af65，產(chǎn)品號u4758，和sfrs2，產(chǎn)品號s2320)，abcam(dhx36，產(chǎn)品號ab70269)和millipore(sc35，克隆1sc-4f11)。由教授douglasblack，ucla提供針對hnrnpf和hnrnph的抗血清。

質(zhì)譜分析

在胰蛋白酶消化后，將樣品冷凍干燥，并用25μl5％acn/0.1％甲酸重懸浮用于質(zhì)譜(ms)。通過lc/ms/ms使用surveyorlc系統(tǒng)和lcqdecaxpplus(thermoscientific)對肽進行分析。使用massmatrix文件轉(zhuǎn)換工具(2.0版；http://www.massmatrix.net)將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換成mascot通用文件，以輸入到mascot搜索算法(matrixscience)中。

酶學結(jié)構(gòu)探測

使用有限的v1rna酶(ambion)、t1rna酶(ambion)和s1核酸酶(fermentas)消化進行的rna二級結(jié)構(gòu)測定已在其他地方詳細描述(28)。簡而言之，將來自插入(ins)和缺失(del)前mrna的rna的1μg試樣在30℃下在100μl中用0.002urna酶v1、0.05urna酶t1和19us1核酸酶消化10分鐘。使用無酶試樣作為對照(c)。使用在5’端用[32p]-atp標記的反義引物，根據(jù)標準方案將切割的rna逆轉(zhuǎn)錄。

結(jié)果

促進5’utr中弱內(nèi)含子的前mrna剪接的反義寡核苷酸

為了鑒別能夠減少ins內(nèi)含子1的保留并增加剪接介導的翻譯增強的sso，我們設(shè)計了一系列2’-o-甲基修飾的硫代磷酸酯sso，在hek293細胞中單獨地共表達每個sso與攜帶單倍型ic的剪接報告基因構(gòu)建體，并檢查外源mrna產(chǎn)物的相對豐度(圖1a和b)。報道體中的ic單倍型沒有小衛(wèi)星序列，并且包含總共14個多態(tài)性位點(7，20)，包括rs689的a等位基因。該等位基因抑制內(nèi)含子1剪接，并且與更常見的t等位基因相比產(chǎn)生較低的胰島素原水平(21)。在這些序列此前的系統(tǒng)性缺失分析(7)中顯示出外顯子包含或內(nèi)含子保留的最明顯改變的區(qū)域中選擇靶向內(nèi)含子1和外顯子2的sso。外顯子3中的sso位于內(nèi)含子2的真實3’ss和下游126nt的強競爭性隱蔽3’ss之間，以鑒別改變其使用的前mrna基序(圖1a)。在hek293細胞中測試的15個inssso的初始集合中，11個顯示mrna異構(gòu)體的相對豐度的可再現(xiàn)的改變(表2)。內(nèi)含子1保留通過單寡核糖核苷酸sso21顯著減少(p<0.01，mann-whitney秩和檢驗；圖2a)。sso21靶向內(nèi)含子1的位置59-74，包括此前發(fā)現(xiàn)在缺失后賦予內(nèi)含子保留的最大減少的基序(稱為del5)(7)。由sso21誘導的內(nèi)含子保留水平的降低是劑量依賴性的(圖2a)，并且也在hepg2細胞和黑臉綠猴(chlorocebusaethiops)cos7細胞中觀察到，與使用輔助剪接序列的剪接體成分的普遍存在的表達和高度進化保守性相一致(1，2)。除了減少內(nèi)含子1保留，sso21促進內(nèi)含子2的隱蔽3’ss(圖2a)。然而，對于其它inssso和亂序?qū)φ?圖3和表2)也觀察到這種效應，表明非特異性的相互作用。為了證實sso21誘導的內(nèi)含子1剪接的增強不被內(nèi)含子2的隱蔽3’ss促進，我們與缺少該位點并且僅保留外顯子3的前89個核苷酸的較短報道體共轉(zhuǎn)染該sso。圖2b顯示sso21能夠以與具有較長外顯子3的報道體相同的程度促進內(nèi)含子1剪接。相反，對于缺少del5區(qū)段的報道體，沒有觀察到sso21誘導的內(nèi)含子保留的減少。除了內(nèi)含子保留，對于5個sso(包括在內(nèi)含子1的隱蔽3’ss下游結(jié)合的sso8)觀察到外顯子2跳讀的增加(cr3’ss+81；圖1和3c，表2)。這種隱蔽3’ss通過rnai介導的u2af的小亞基(u2af35)的耗盡而誘導，并且在缺少u2af35的細胞中不通過橋接寡核糖核苷酸(sso4)逆轉(zhuǎn)；而是觀察到外顯子2跳讀(圖3c)。u2af35的耗盡也抑制內(nèi)含子2的隱蔽3’ss?？偟膩碚f，鑒別了在幾種靈長類細胞系中減少ins內(nèi)含子1保留的單個sso。

在單核苷酸水平上內(nèi)含子保留靶標的優(yōu)化

有趣的是，設(shè)計為靶向del5區(qū)段的其他sso不減少內(nèi)含子1保留，除了sso20的小的作用(圖1a和2a)。為了測試在sso21側(cè)翼的核苷酸的重要性并且為了以單堿基分辨率對最佳靶標作圖，在該區(qū)域進行詳細的反義微行走。ins報道體單獨地與sso21的5’和3’的另外18個16聚體結(jié)合的1-9個核苷酸將共轉(zhuǎn)染到hek293細胞中，并檢查其rna產(chǎn)物。內(nèi)含子1保留最受sso21和在每個方向上移位1-2個核苷酸的sso抑制(圖4)。與初始篩選一致，在四個c的上游運行中靶向多于一個胞嘧啶的sso(c4，參見sso1和sso2，圖1a)不是有效的(sso21-3r至sso21-10r，圖4)。在相反的方向，靶向通常在內(nèi)含子剪接增強子中發(fā)現(xiàn)(29-31)的連續(xù)g的sso增加內(nèi)含子保留。因此，用于減少ins內(nèi)含子1的保留的最佳反義靶標以單核苷酸分辨率映射到此前通過整個內(nèi)含子的系統(tǒng)性缺失分析鑒別為最抑制的區(qū)域(7)。

內(nèi)含子保留的反義靶標與平行rna四鏈體相鄰

注意到靶標夾在預測形成穩(wěn)定的rna鳥嘌呤(g)四鏈體的兩個內(nèi)含子區(qū)段之間(內(nèi)含子1核苷酸36-61和78-93；圖4a中突出顯示)。這些結(jié)構(gòu)通過堆疊由以循環(huán)的hoogsteen氫鍵排布方式組織的四個g組成的g-四分體(g-quartet)來產(chǎn)生(32)，并且已經(jīng)涉及重要的細胞過程，包括復制、重組、轉(zhuǎn)錄、翻譯(33，34)和rna加工(35-39)。為了測試它們是否在體外形成，將源自該區(qū)域的合成核糖核苷酸用于已經(jīng)廣泛用于體外表征dna和rna四鏈體結(jié)構(gòu)的cd譜分析中(40-43)。在25℃下在215和330nm之間記錄的下游19聚體的cd譜(稱為cd1)在265nm處顯示強正橢圓率，且在約240nm處具有負強度，指示平行四鏈體(圖5a)。為了確認四鏈體而非其他穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)基序的存在，在5℃和95℃下記錄uv吸收譜。在兩個溫度處(低于和高于熔化轉(zhuǎn)變點)的uv吸收差異光譜顯示在～295nm處的特征性增色位移及在240nm和280nm處的雙重最大值，提供體外形成穩(wěn)定的平行鏈rna四鏈體的證據(jù)。這通過cd1的1hnmr研究證實(圖5b)，其顯示在10和12ppm之間的信號的特征性包絡(luò)，對應于g-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)內(nèi)的hoogsteenh鍵合的g。通過cd進行的熱穩(wěn)定性測量產(chǎn)生高度可逆的s形合作性解開轉(zhuǎn)變，tm＝56.8±0.2℃(圖5c)。圖5d(上圖)顯示19聚體到通過1-4個核苷酸的相對短的環(huán)序列連接的兩個堆疊的g-四聯(lián)體的可能排列。

ins內(nèi)含子1中剪接抑制序列的構(gòu)象轉(zhuǎn)變模型

源自反義靶標上游的區(qū)域的合成20聚體的cd(稱為cd2)也顯示出穩(wěn)定結(jié)構(gòu)形成的證據(jù)，給出以270nm為中心的更寬的吸收包絡(luò)和s形熱解開轉(zhuǎn)變(tm＝69.0±0.45℃；圖5a)。與下游寡聚cd1不同，在熱示差譜中沒有發(fā)現(xiàn)uv中的增色位移。然而，不同于cd1的在12和14ppm之間的1hnmr譜中的一組明確的尖銳信號顯示雙鏈rna特征性的沃森-克里克h-鍵合堿基對的形成(圖5b)。使用mfold的重疊內(nèi)含子區(qū)段的二級結(jié)構(gòu)預測表明前mrna形成穩(wěn)定的局部莖-環(huán)；其中一個通過增加內(nèi)含子1保留的g→c突變(稱為g2；圖5d，下圖)而進一步穩(wěn)定(7)。位于更下游且使四鏈體結(jié)構(gòu)失穩(wěn)定的另一個g→c置換(稱為g3)(圖5d，上圖)也抑制內(nèi)含子剪接(7)。最后，在單核苷酸多態(tài)性處含有a或g的cd2寡核苷酸(圖4a和(20))顯示非常相似的cd譜，具有明確的解鏈轉(zhuǎn)變和tm值，表明g和a等位基因形成相同的結(jié)構(gòu)。

為了進一步測試內(nèi)含子剪接中標準和非標準結(jié)構(gòu)之間的暫時平衡的重要性，使用了cd、nmr和誘變實驗的組合(圖6)。合成包含內(nèi)含子保留靶標的5’端的寡核糖核苷酸cd3，并預測莖-環(huán)/四鏈體(圖4a和6a)。還合成了突變形式的cd4，其攜帶兩個c→u轉(zhuǎn)變，這使發(fā)夾失穩(wěn)定，但保持四鏈體的穩(wěn)定性。在轉(zhuǎn)染到hek293細胞中的ic報告基因構(gòu)建體中也引入相同的突變。cd3的nmr譜揭示了平衡的g-四聯(lián)體和標準堿基配對發(fā)夾結(jié)構(gòu)(稱為h1和h2)兩者的信號共存(圖6b和c)。通過向含有100mmkcl的緩沖溶液中加入2mm和然后6mmmgcl2來研究mg²⁺對四鏈體和發(fā)夾之間的構(gòu)象平衡的影響。如bugaut等人(57)所報道的，構(gòu)象平衡沒有被在kcl的存在下加入mg²⁺而顯著地擾亂。因此，我們觀察到rna發(fā)夾和四鏈體結(jié)構(gòu)在模擬其中k⁺和mg²⁺離子以高濃度存在的細胞環(huán)境的環(huán)境中的形成。cd熔解曲線顯示寬的轉(zhuǎn)變(tm＝79.9℃)，與具有不同穩(wěn)定性的多個構(gòu)象狀態(tài)一致。cd4中的cc→uu突變導致h1的nmr信號丟失(圖6b)，并且tm降低13℃，這與更穩(wěn)定的發(fā)夾h1的選擇性去穩(wěn)定化一致，導致與四鏈體平衡的h2群體的增加。瞬時轉(zhuǎn)染顯示cc→uu突變改善內(nèi)含子1剪接，而預測使四鏈體和發(fā)夾兩者失穩(wěn)定的稱為m1的突變僅具有小的影響(圖6d，表1a)。

為了研究這些結(jié)構(gòu)的平衡如何更系統(tǒng)地影響內(nèi)含子剪接，制備了一系列突變的構(gòu)建體以使預測的四鏈體、h1/h2結(jié)構(gòu)和兩個胞嘧啶運行失穩(wěn)定/保持(表1a)。它們的轉(zhuǎn)錄物顯示內(nèi)含子保留水平的顯著性差異(圖7；p＝0.0001，基于秩的kruskal-wallis單因素anova)。首先，g-四鏈體的消除增加內(nèi)含子1保留，其通過除去每個胞嘧啶運行而被進一步增強(比較突變4-6與野生型，p＝0.0004)。這些突變似乎對內(nèi)含子保留具有累加效應(比較野生型與突變1或9；3相對于2和4相對于5)。其次，在不存在g-四鏈體的情況下增加的內(nèi)含子保留不通過去除h1和h2而改變，但它們的消除增強了外顯子跳讀(比較突變4對于6的異構(gòu)體2)。第三，當僅存在兩個c4運行中的一個時，h1的去除稍微改善內(nèi)含子1剪接(比較8與9)，這和內(nèi)含子保留與所測試的rna的預測穩(wěn)定性之間統(tǒng)計學顯著的相關(guān)性一致(圖7b)。內(nèi)含子剪接的效率因此由平衡的標準和非標準結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)象轉(zhuǎn)變控制。

表1a.在質(zhì)粒構(gòu)建體中改變預測的rnag四鏈體、莖環(huán)和兩個胞嘧啶運行的ins內(nèi)含子1突變

在獲勝sso靶向的區(qū)域中的蛋白質(zhì)-rna相互作用

為了鑒別與包含反義靶標和/或相關(guān)的標準和非標準結(jié)構(gòu)的rna相互作用的蛋白質(zhì)，使用野生型和從t7標記的pcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄的del5rna、代表靶序列的合成rna(cd5)和稱為av3的含有3’sscag的對照寡聚物進行拉下實驗。蛋白質(zhì)印跡顯示野生型和del5轉(zhuǎn)錄物兩者都結(jié)合hnrnpf/h，但是對于cd5不存在該結(jié)合(圖7c)。與僅有珠的對照相比，這些蛋白質(zhì)也通過來自野生型和del5rna的下拉凝膠的差異染色片段的ms/ms分析檢測。針對srsf2的兩種抗體，其在幾種sr蛋白中顯示出對于推定的結(jié)合活性的最高評分，未能檢測任何特異性相互作用(圖7c)。盡管對于del5，來自構(gòu)成哺乳動物細胞中主要的聚(c)結(jié)合活性(44)的hnrnpe1/e2的信號高于背景(圖7c)，但在缺乏hnrnpe1/e2的細胞中沒有觀察到內(nèi)含子保留的變化。

在dhx36耗盡時富g和貧g報道體的剪接模式

rnag-四鏈體結(jié)合解旋酶dhx36，其能夠?qū)⑺逆滙wrna轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的雙鏈體，并且是hela細胞中四鏈體分解活性的主要來源(26，45)。dhx36與atm前mrna中的內(nèi)含子剪接增強子交聯(lián)(46)，并且可以解開terc的5’區(qū)域內(nèi)的四鏈體結(jié)構(gòu)(26)。為了測試dhx36耗盡是否可以影響ins剪接，將貧和富g-四鏈體的報道體瞬時轉(zhuǎn)染(圖8a，表1)到耗盡的細胞中。選擇對照構(gòu)建體以給出剪接產(chǎn)物的近似相等的表現(xiàn)，其通過使分支位點弱化而實現(xiàn)(24)，從而提供靈敏的離體剪接試驗。然而，盡管存在有效的dhx36耗盡(圖8b)，但在短或長的構(gòu)建體中均沒有看到ins內(nèi)含子1保留的統(tǒng)計學顯著的改變，我們也沒有在貧g和富g對照中觀察到大的變化(圖8c-e)。這些結(jié)果與此前在dhx36耗盡細胞中下調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中四鏈體序列的顯著富集的缺乏(47)及不存在對敲低的atm反應相一致(46)。

ins內(nèi)含子1的群體特異性隱蔽5’剪接位點的sso誘導抑制

除rs689外，ins內(nèi)含子1剪接受到位于天然5’ss附近的rs3842740處的多態(tài)性ttgc插入的影響(21)。這種插入存在于所有非洲人染色體的四分之一中，但在白種人的ic單倍型上不存在(20)。該插入激活下游的隱蔽5’(圖1a)，將所得mrna的5’utr進一步延伸26個核苷酸并抑制胰島素原表達(7，21)。為了測試新的5’ss是否可以被sso有效抑制，將相同的插入引入到ic構(gòu)建體中以及與稱為sso10的橋連寡核糖核苷酸共表達的野生型和突變報道體中。盡管隱蔽剪接受到抑制，但內(nèi)含子1的標準剪接即使在高sso10濃度下也不完全恢復，最可能是通過該插入而弱化的真實5’ss的次優(yōu)識別的結(jié)果。

為了在存在和不存在該插入的情況下獲得對5’utr序列的折疊的初步了解，使用用單鏈和雙鏈特異性rna酶進行的部分rna消化進行酶學結(jié)構(gòu)探測。對于野生型rna檢測的總體切割位置和強度與mfold預測總體上一致，其中兩個主要莖環(huán)區(qū)域(sl1和sl2)被幾個內(nèi)部凸起中斷。結(jié)構(gòu)探測和mfold預測都表明在rs3842740處的插入延伸了在sl1中的中央凸起，因為與sl1的其余部分和sl2相比，該區(qū)域中t1和s1切割的數(shù)量增加。最后，轉(zhuǎn)錄物不在顯示四鏈體體外形成的區(qū)域中被rna酶v1消化。

討論

ins內(nèi)含子1的剪接沉默子中的反義內(nèi)含子保留靶標

在此，顯示了首次使用反義技術(shù)減少成熟轉(zhuǎn)錄物中整個內(nèi)含子的保留并且使用sso改變單倍型依賴性ins表達。通過內(nèi)含子1的系統(tǒng)性誘變(7)和通過宏觀(圖1)和微行走(圖4)策略，促進補償rs689處的a等位基因?qū)τ行na加工的不利影響的獲勝sso的鑒別。有趣的是，靶序列含有串聯(lián)cag(g/c)基序，其類似于3’ss共有序列(consensus)(圖4)。這樣的“假受體”此前實驗性地涉及剪接位點抑制(27)，并且在剪接沉默子中過度表現(xiàn)。例如，這兩個四聚體在高可信的102個內(nèi)含子剪接沉默子中更常見(49)，并且在通過隨機10聚體的熒光激活篩選鑒別的109個增強子中耗盡(50)。在quepasa剪接沉默子中，yag基序也比預期的更加頻繁(51)，表明它們是保留靶標的重要功能成分。中間胞嘧啶序列也可以發(fā)揮重要作用，因為quepasa沉默子中的c4運行的頻率比預期的高～2倍。這些基序也在通過在相對于所測試的3’ss的-62/-51位置處插入的序列的系統(tǒng)性篩選所鑒別的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件的4％中發(fā)現(xiàn)(52)。這項研究鑒別了稱為iss22的元件(aaatagaggccccag)，其與最佳內(nèi)含子保留靶sfi共同具有3’九聚體(下劃線)。然而，不同于av3的最佳3’ss識別序列，我們進行的與蛋白質(zhì)印跡法偶聯(lián)的拉下實驗僅顯示對于u2af65非常弱(如果有)的結(jié)合(圖7c)。

rna加工控制中四鏈體與發(fā)夾之間的構(gòu)象轉(zhuǎn)變

反義靶標正好在潛在g-四鏈體形成rna的上游鑒別，其結(jié)構(gòu)隨后通過cd和nmr分析證實(圖1a和5)。rna四鏈體比其dna對應物更穩(wěn)定，已經(jīng)越來越多地涉及rna代謝的調(diào)節(jié)(33，34，41，42)，并為藥物開發(fā)提供了獨特的途徑(53)。2-四分體四鏈體在熱力學上比其3-或4-四分體對應物更不穩(wěn)定，并且可能在動力學上更易變化，但它們?nèi)匀槐憩F(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性，并且可以用于響應于細胞環(huán)境在四鏈體和非四鏈體結(jié)構(gòu)之間更加順應和動態(tài)的切換(54-56)。獲勝sso可以阻斷與反式作用因子的相互作用，改變更高級的結(jié)構(gòu)，rna-蛋白復合物形成的速率，或者損害2-四分體四鏈體與h1/h2之間的構(gòu)象轉(zhuǎn)變(圖5)。最近已經(jīng)對于自始未預測的四鏈體描述了類似的轉(zhuǎn)變(57)，提高了富g的內(nèi)含子1中另外的序列可能參與反義靶標附近的平衡的可能性，可能涉及多個四鏈體基序和競爭性莖-環(huán)。

顯示在hnrnpf/h耗盡后增加的內(nèi)含子1保留和對hnrnpf/h過表達的相反作用的結(jié)合(圖7c)和功能實驗(7)表明這些蛋白質(zhì)與該內(nèi)含子中的關(guān)鍵剪接輔助序列相互作用。與此前結(jié)論是hnrnpf直接結(jié)合rna四鏈體的報道(58)相反，已經(jīng)顯示hnrnpf通過排他地結(jié)合單鏈g序列阻止rna四鏈體形成(59)?；陟`長類基因組的預測表明大多數(shù)推定的四鏈體可能折疊成標準結(jié)構(gòu)(60)。這些蛋白質(zhì)降低前mrna占據(jù)，推測促進四鏈體形成(59)，并潛在地降低剪接效率。

偶聯(lián)的剪接和翻譯基因表達控制中的rna四鏈體

rna四鏈體在～8.0％的5’utr中被預測，并且被提出其充當通用的翻譯抑制劑(60，61)。ins內(nèi)含子1被弱剪接并且是u2af35依賴性的(7)，并且顯著部分的含內(nèi)含子1的轉(zhuǎn)錄物被從細胞核輸出(23)。這表明由cd1形成的rnag-四鏈體可以影響這些mrna的翻譯，其含有對人亞科具有特異性的三氨基酸uorf(7)。該uorf明顯抑制胰島素原表達，并且正好位于幾個堿基對的下游，提示g-四鏈體可通過隔離uorf來促進翻譯的概念。內(nèi)部核糖體進入位點的活性需要功能性2-四分四鏈體(54)。

表1.報告基因構(gòu)建體中預測的rnag-四鏈體的密度

^a如所述的(78)計算非重疊四鏈體序列的長度及其g評分。

剪接位點選擇中的依賴性的反義策略

除了標準mrna異構(gòu)體4之外，已經(jīng)在從來自產(chǎn)生胰島素的組織的cdna文庫中得到的表達序列標簽數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了異構(gòu)體2、3和6(圖1b)(21)。這表明由報告基因構(gòu)建體產(chǎn)生的隱蔽剪接位點在體內(nèi)被識別，并且我們的單倍型依賴性報道體系統(tǒng)在培養(yǎng)的細胞中精確地重現(xiàn)這些事件，不管細胞是否表達內(nèi)源性胰島素。除了抑制保留內(nèi)含子1的轉(zhuǎn)錄物之外，最佳sso增加了外顯子3的隱蔽3’ss的利用(圖2)。這種不期望的作用可以通過相鄰外顯子和內(nèi)含子的剪接的協(xié)同來解釋，其此前針對個體基因和在全局上觀察到(63-67)。此外，g豐富的下游轉(zhuǎn)錄起始位點已經(jīng)與rna聚合酶ii暫停位點相關(guān)聯(lián)(68)。雖然內(nèi)含子2的兩個強競爭的3’ss可能響應于影響rna折疊的非特異性信號(圖3，表2)，但其可能緩解觀察到的依賴性并在連接的剪接位點處使用sso組合減少隱蔽3’ss激活并檢查其協(xié)同作用或拮抗作用，從而受益于使用與小基因相反的全基因構(gòu)建體。

多功能反義寡核苷酸以減少ins內(nèi)含子1的保留

自從首次使用2’-o-甲基-硫代磷酸酯sso(69)，這種類型的化學修飾已經(jīng)成功地用于許多體外和體內(nèi)應用(9，10，70)。為了進一步微調(diào)mrna異構(gòu)體的表達，可以設(shè)計優(yōu)化的sso以將適合的反式作用剪接因子束縛到它們的靶序列上(11，71)。該體系的明顯候選物是u2af35，因為內(nèi)含子1由于高等靈長類中3’ss的馳緩而是弱的，并且由rs689處的a等位基因進一步削弱，這使得該內(nèi)含子是高度u2af35依賴性的(圖3)(7)。除了u2af35之外，未來的雙功能或多功能反義策略可以采用此前顯示影響ins內(nèi)含子1和外顯子2剪接的剪接因子(例如tra2β或srsf3)的結(jié)合平臺(7)。tra2β可能結(jié)合sso6靶標，其與末端環(huán)中有效的gaa剪接增強子形成預測的穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖3b)。srsf3是內(nèi)含子2的隱蔽3’ss的抑制所需要的(7)，并且結(jié)合具有共有序列(a/u)c(a/u)(a/u)c的富嘧啶序列(72)。與srsf3的rna識別基序相互作用的cauc基序(73)正好存在于隱蔽3’ss的上游。

使人類遺傳疾病中的內(nèi)含子保留水平正?；?/p>

這些結(jié)果提供了使用非遺傳方式補償來自易感1型糖尿病的單倍型的較低效的剪接和較低ins表達的機會。

常見變體例如rs689在很大程度上造成了復雜性狀(包括自身免疫性疾病)的遺傳性(74)，但它們的功能和結(jié)構(gòu)后果在很大程度上是未知的。如果優(yōu)化的inssso可以被安全和有效地引入到發(fā)育的胸腺中，這種途徑可以提供新型預防方法以促進對1型糖尿病中的主要自身抗原的耐受性。對于這樣的干預，最明顯的候選者是在hla和ins基因座兩者處疾病易感性等位基因純合的受影響兒童的母親。這樣的基因型與兄弟姐妹的極高疾病風險相關(guān)(75)。除了1型糖尿病的初步預防之外，未來基于sso的治療可能應用于在診斷時具有顯著的殘留β-細胞活性的患者以及適合接受β-細胞移植的患者，并且可以受益于增加的來自移植細胞的胰島素原表達的內(nèi)含子介導的增強。還可以設(shè)想通過利用多功能sso靶向多個剪接調(diào)節(jié)基序，通過內(nèi)含子剪接和胰島素原表達更顯著的增強對其它糖尿病患者使用這種治療模式。sso可以在胸腺上皮細胞和13-細胞中具有效用，其可以提供用于測試它們對外源和內(nèi)源胰島素原表達的影響的更自然的系統(tǒng)。最后，類似的反義策略可以幫助減少由剪接因子基因的體細胞突變導致的癌細胞中的普遍內(nèi)含子保留，如骨髓增生性疾病中u2af35的鋅指結(jié)構(gòu)域中的特定置換所說明的(76)。

在惡性細胞中減少內(nèi)含子保留

使用來自復制的、polya選擇的樣品的rnaseq數(shù)據(jù)選擇優(yōu)先保留在u2af缺陷型hek293細胞中的一組146個內(nèi)含子序列，然后在基因組瀏覽器中檢查每個內(nèi)含子保留事件。這些序列使用repeatmasker的靈敏版本(可從http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/webrepeatmasker獲得)進行重復掩蔽。因為用于減少ins內(nèi)含子1保留的最佳反義靶標[kralovicovaj等人，(2014).nucleicacidsresdoi：10.1093/nar/gku507，公布于2014年6月17日]與在哺乳動物中保守的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件重疊[yeogw等人，(2007).plosgenet3：e85]，包括cccag、aggcc(kralovicova等人，2014中的圖4)，含有這些短的五聚體至七聚體基序的內(nèi)含子區(qū)段中的反義靶標和獨立來源的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)基序組[voelkerrb，&berglundja(2007).genomeres17：1023-1033]被選擇，從而增加了寡核苷酸與這些靶標相互作用以影響rna加工的機會。靶序列經(jīng)歷常規(guī)反義寡核苷酸設(shè)計，包括去除含有c運行的序列以避免g-四鏈體形成。5’和3’剪接位點兩者、多聚嘧啶序列、分支位點和超分支區(qū)域的附近也被避免。該選擇產(chǎn)生388個化合物的集合(表3)，覆蓋u2af敏感性內(nèi)含子總長度的～15％并且代表所有人內(nèi)含子序列的～0.001％。因此，使這組寡核苷酸靶區(qū)域?qū)τ趗2依賴性內(nèi)含子的剪接抑制性序列富集，其沒有從維持u2途徑中的突變或缺失的惡性細胞中的輔助因子獲得足夠的幫助。

胰島素相關(guān)序列

候選sso序列

注：用“*”標記的候選者是在圖4中討論的獲勝寡聚物

cd5

rna形式-cugcagagcuggggccug(seqidno:1)

dna形式-ctgcagagctggggcctg(seqidno:2)

結(jié)合caggccccagcucugcag(seqidno:3)

sso21*

rna形式-ugcagagcuggggccu(seqidno:4)

dna形式-tgcagagctggggcct(seqidno:5)

結(jié)合aggccccagcucugca(seqidno:6)

sso21-2r*

rna形式-gcagagcuggggccug(seqidno:7)

dna形式-gcagagctggggcctg(seqidno:8)

結(jié)合caggccccagcucugc(seqidno:9)

sso21-3r

rna形式-cagagcuggggccugg(seqidno:10)

dna形式-cagagctggggcctgg(seqidno:11)

結(jié)合ccaggccccagcucug(seqidno:12)

sso21-4r

rna形式-agagcuggggccuggg(seqidno:13)

dna形式-agagctggggcctggg(seqidno:14)

結(jié)合cccaggccccagcucu(seqidno:15)

sso21-5r

rna形式-gagcuggggccugggg(seqidno:16)

dna形式-gagctggggcctgggg(seqidno:17)

結(jié)合ccccaggccccagcuc(seqidno:18)

sso21-6r

rna形式-agcuggggccuggggu(seqidno:19)

dna形式-agctggggcctggggt(seqidno:20)

結(jié)合accccaggccccagcu(seqidno:21)

sso21-7r

rna形式-gcuggggccugggguc(seqidno:22)

dna形式-gctggggcctggggtc(seqidno:23)

結(jié)合gaccccaggccccagc(seqidno:24)

sso21-8r

rna形式-cuggggccuggggucc(seqidno:25)

dna形式-ctggggcctggggtcc(seqidno:26)

結(jié)合ggaccccaggccccag(seqidno:27)

sso21-9r

rna形式-uggggccuggggucca(seqidno:28)

dna形式-tggggcctggggtcca(seqidno:29)

結(jié)合uggaccccaggcccca(seqidno:30)

sso21-10r

rna形式-ggggccugggguccag(seqidno:31)

dna形式-ggggcctggggtccag(seqidno:32)

結(jié)合cuggaccccaggcccc(seqidno:33)

sso21-14f*

rna形式-cugcagagcuggggcc(seqidno:34)

dna形式-ctgcagagctggggcc(seqidno:35)

結(jié)合ggccccagcucugcag(seqidno:36)

sso21-15f

rna形式-gcugcagagcuggggc(seqidno:37)

dna形式-gctgcagagctggggc(seqidno:38)

結(jié)合gccccagcucugcagc(seqidno:39)

sso21-16f

rna形式-ugcugcagagcugggg(seqidno:40)

dna形式-tgctgcagagctgggg(seqidno:41)

結(jié)合ccccagcucugcagca(seqidno:42)

sso21-17f

rna形式-cugcugcagagcuggg(seqidno:43)

dna形式-ctgctgcagagctggg(seqidno:44)

結(jié)合cccagcucugcagcag(seqidno:45)

前mrna轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的序列(例如，用于結(jié)合sso)

cuggaccccaggccccagcucugcagcag(seqidno:46)

表2

¹，刪除的區(qū)段(del)的序列在圖2中示出

癌癥相關(guān)序列

下表(表3)的序列也可以具有替代尿嘧啶殘基的胸腺嘧啶殘基(例如，dna形式)。下表的每個序列都可以是本發(fā)明的多核酸聚合物的實施方式。下表(表3)中“化合物名稱”下提到的每個基因或orf都可包含用于改正內(nèi)含子保留的基因靶標。

表3

雖然本文已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，這樣的實施方式僅以示例的方式提供。在不背離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到許多變化、改變和替代。應當理解，在實踐本發(fā)明時可以采用本文所述的本發(fā)明的實施方式的各種替代方案。旨在以下權(quán)利要求限定本發(fā)明的范圍，并且旨在由此涵蓋這些權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。

所述的具體方法、組合物和試劑盒可以變化。還應當理解，本文使用的術(shù)語僅僅是出于描述特定實施方式的目的，而非旨在作出限制，因為本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求限制。

當提供值時，可以理解，每個值可以表示為“約”特定值或范圍?！凹s”還可包括準確的量。例如，“約5μl”可以表示“約5μl”或“5μl”。通常，術(shù)語“約”可包括預期在所記載的值的10％內(nèi)的量。

本文使用的章節(jié)標題僅僅是出于組織的目的，并且不應被解釋為限制所描述的主題內(nèi)容。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語可以具有與所要求保護的主題內(nèi)容所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文的描述僅僅是示例性和說明性的，并且不限制所要求保護的任何主題內(nèi)容。在本申請中，除非另有特別說明，單數(shù)的使用可包括復數(shù)。除非上下文另有明確規(guī)定，如在本說明書和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”可包括復數(shù)指示物。在本申請中，除非另有說明，“或”的使用可以表示“和/或”。此外，術(shù)語“包括”以及其他形式(例如“包括”、“包含”和“包括的”)的使用不是限制性的。

通過引用并入

本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請都通過引用整體并入本文，其程度如同每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埍痪唧w地和單獨地指明被通過引用并入。

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權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.一種預防或治療受試者的疾病的方法，其包括成熟基因轉(zhuǎn)錄物中內(nèi)含子保留的改正，其中所述疾病是由所述基因轉(zhuǎn)錄物中的所述內(nèi)含子保留所引起的缺陷性蛋白質(zhì)表達所誘導。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中內(nèi)含子保留的改正包括施用配置為與所述基因轉(zhuǎn)錄物雜交的多核酸聚合物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中內(nèi)含子保留的改正包括施用多核酸聚合物，所述多核酸聚合物配置為與所述基因轉(zhuǎn)錄物雜交并且配置為干擾以下的一個或多個：經(jīng)典rna結(jié)構(gòu)(莖環(huán))、非經(jīng)典rna結(jié)構(gòu)(g四鏈體)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，與反式作用因子的相互作用，和rna-蛋白復合物形成速率。

4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物對于包含內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。

5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物對于包含seqidno:46或與seqidno:46具有至少95％同一性的序列或者由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。

6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物對于包含seqidno:3或與seqidno:3具有至少95％同一性的序列或者由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域的至少一部分是反義的。

7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物對于包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域是反義的：seqidno:3；seqidno:6；seqidno:9；seqidno:12；seqidno:15；seqidno:18；seqidno:21；seqidno:24；seqidno:27；seqidno:30；seqidno:33；seqidno:36；seqidno:39；seqidno:42；seqidno:45或其組合。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物對于包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中任一序列具有至少95％同一性的序列互補的序列或由其組成的轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域是反義的。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括以下的組中任一的序列具有至少95％同一性：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合；和任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至4或8中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少95％同一性；和任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。

11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物的長度為約10至約30個核苷酸。

12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物被修飾以增加其穩(wěn)定性。

13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物被束縛于蛋白質(zhì)或適體，其中所述蛋白質(zhì)是增強、抑制或調(diào)節(jié)剪接和內(nèi)含子去除的剪接因子。

14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物與適合于將所述多核酸聚合物遞送到細胞或組織和/或遞送到細胞或組織中的遞送載體綴合或結(jié)合。

15.根據(jù)權(quán)利要求1至7、9或11至14中任一項所述的方法，其中所述基因轉(zhuǎn)錄物編碼胰島素原。

16.根據(jù)權(quán)利要求1至4、8或10至14中任一項所述的方法，其中所述基因轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄自基因或orf，所述基因或orf選自包括以下的基因或orf中的任一：abcd4、abcf3；acadvl；alkbh6；ap1g2；apex1；arfrp1；athl1；atp1a3；atp5d；atp13a1；bax；bdh2；brd2；c1orf63；c1orf630；c1orf631；c1orf124；c2orf49；c8orf82；c16orf59；caprin2；caskin2；cdca7；cep164；cep170；clcn7；cpne1；cpsf3l；dcxr；dennd4b；dffa；dis3l2；dnajb12；dpf1；drg2；dsn1；eml3；ewsr1；ewsr10；fgfr4；ftsj1；gbap1gmppa；gmpr2；gnptg；gorasp1；gpatch4；hgs；hmg20b；iffo1isyna1；kri1；loc148413；lztr1；man2c1；map4k2；mcoln1；mdp1；mib2；mitd1；mok；mov10；mrpl35；mtmr11；mus81；napepld；nbeal2；ndrg4ndufb10；nfatc4；nfkbib；nit1；nktr；nprl2；nsun5p1；nudt22；pan2；pddc1；pdlim4；phf1；pik3cd；pitpnm1；ppil2；ppp1r35；ppp4c；pqlc2；prpf39；psme2；ptpmt1；qars；rad52；rhot2；rmnd5b；rnf123；rpl10a；rpp21；rps6kb2rusc1；scrn2；scyl1；sfr1；sgsm3；sirt7；slc25a3；slc30a7；slc37a4；stk19；stx10；tcf25；tomm40；tp53i3；trim41；trpt1；tsta3；ttc14；ttc140；tubgcp6；u2af1l4uck1；unc45a；vamp1；vamp10；vars；vps28；wdr24；wdr90；wrap53；ydjc；yipf3；zcchc8；zcchc18；zfand1；znf131；znf300znf317；znf692；znf711；znrd1；zwint或其組合。

17.根據(jù)權(quán)利要求1至7、9或10至15中任一項所述的方法，其中所述疾病是糖尿病。

18.根據(jù)權(quán)利要求1至4、8或10至14或16中任一項所述的方法，其中所述疾病是癌癥。

19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法還包括在治療前確定疾病病理是否由基因轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留所引起的步驟。

20.一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括將多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含seqidno:46或與seqidno:46具有至少95％同一性的區(qū)域或由其組成。

21.一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括將多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含seqidno:3或與seqidno:3具有至少95％同一性的區(qū)域或由其組成。

22.一種調(diào)節(jié)細胞中的內(nèi)含子剪接的方法，其包括使多核酸聚合物與前mrna的區(qū)域雜交，其中所述區(qū)域包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中的任一具有至少95％同一性的序列互補的序列或由其組成。

23.一種多核酸聚合物，其對于包含seqidno:46或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域或者包含與seqidno:46具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的。

24.一種多核酸聚合物，其對于包含seqidno:3或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域或者包含與seqidno:3具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的。

25.一種多核酸聚合物，其對于多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的，其中所述區(qū)域包含與包括seqidno:47至434或其組合的序列組中的任一互補的序列或由其組成；或者任選地，對于包含與seqidno:47至434具有至少95％序列同一性的序列或由其組成的多核酸聚合物的區(qū)域的至少一部分是反義的。

26.一種多核酸聚合物，其包含與選自包括以下的組中任一的序列具有至少95％同一性的多核酸聚合物序列或由其組成：seqidno:1；seqidno:2；seqidno:4；seqidno:5；seqidno:7；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:11；seqidno:13；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:23；seqidno:25；seqidno:26；seqidno:28；seqidno:29；seqidno:31；seqidno:32；seqidno:34；seqidno:35；seqidno:37；seqidno:38；seqidno:40；seqidno:41；seqidno:43；和seqidno:44或其組合；和任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。

27.一種多核酸聚合物，其包含多核酸聚合物序列或由其組成，所述多核酸聚合物序列與選自包括seqidno:47至434或其組合的組中任一的序列具有至少95％同一性；和任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。

28.根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項所述的多核酸聚合物，其中所述多核酸聚合物與適合于將所述多核酸聚合物遞送至細胞的遞送載體綴合或結(jié)合。

29.一種載體，其包含權(quán)利要求23至27中任一項所述的多核酸聚合物。

30.一種遞送載體，其包含或結(jié)合于權(quán)利要求23至27中任一項所述的多核酸聚合物。

31.一種組合物，其包含權(quán)利要求23至28中任一項所述的多核酸聚合物、或根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體、或根據(jù)權(quán)利要求30所述的遞送載體。

32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其還包含另外的生物活性分子。

33.一種選擇進行治療的受試者的方法，其包括確定所述受試者是否患有由基因轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子保留所引起的缺陷性蛋白質(zhì)表達所誘導的疾病，其中在陽性確認后，選擇所述受試者待用根據(jù)權(quán)利要求23至28中任一項所述的多核酸聚合物、或根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體、或根據(jù)權(quán)利要求30所述的遞送載體、或根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的組合物進行治療；和任選地治療所述受試者。

34.反義多核酸聚合物通過癌細胞中內(nèi)含子保留的改正而使基因表達正?；挠猛尽?/p>

35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述基因轉(zhuǎn)錄物是內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件。

36.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件在兩個g四鏈體之間。

37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件包含第一ccc基序。

38.權(quán)利要求37的方法，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件還包含第二ccc基序。

39.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件還包含cccag或aggcc基序。

40.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件不形成g四鏈體。

41.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物與所述基因轉(zhuǎn)錄物特異性雜交。

42.一種藥物組合物，其包含：

多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述靶序列在兩個g四鏈體之間，其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和

藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

43.權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的所述保留內(nèi)含子雜交。

44.一種藥物組合物，其包含：

多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件包含第一ccc基序，并且其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和

藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

45.權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件還包含第二ccc基序。

46.權(quán)利要求45所述的藥物組合物，其中所述第一ccc基序距所述第二ccc基序約3個或更多個核苷酸堿基。

47.權(quán)利要求42-46中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與包含cccag或aggcc基序的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交。

48.一種藥物組合物，其包含：

多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序不形成g四鏈體，并且其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和

藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

49.權(quán)利要求42-48中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含吡啶核苷酸。

50.權(quán)利要求42-49中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物在3’端位置和/或在5’端位置包含兩個連續(xù)的吡啶殘基。

51.一種藥物組合物，其包含：

多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，并且其中所述結(jié)合基序形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述多核酸聚合物能夠誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和

藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

52.一種藥物組合物，其包含：

多核酸聚合物，其與編碼蛋白質(zhì)且包含保留內(nèi)含子的部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列雜交，其中所述多核酸聚合物誘導所述保留內(nèi)含子從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中剪切掉；和

藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體。

53.權(quán)利要求51所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物還能夠使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)失穩(wěn)定。

54.根據(jù)權(quán)利要求42-53中任一項所述的藥物組合物，其中所述遞送載體包含細胞穿透肽或基于肽的納米顆粒。

55.權(quán)利要求42-54中任一項所述的藥物組合物，其中所述遞送載體通過離子鍵合與所述多核酸聚合物復合。

56.權(quán)利要求42-55中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物長度為約10至約50，約10至約45，約10至約40，約10至約30，約10至約25或約10至約20個核苷酸。

57.權(quán)利要求42-56中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物的序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％互補或100％互補。

58.權(quán)利要求42-57中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物的序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列有4個或更少，3個或更少，2個或更少或者1個或更少的錯配。

59.權(quán)利要求42-58中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物在核苷部分或在磷酸酯部分被修飾。

60.權(quán)利要求42-59中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物包含一個或多個人工核苷酸堿基。

61.權(quán)利要求59或60所述的藥物組合物，其中所述一個或多個人工核苷酸堿基包括2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基、2’-脫氧、t-脫氧-2’-氟、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)或2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)修飾的、鎖核酸(lna)、乙烯核酸(ena)、肽核酸(pna)、1’,5’-脫水己糖醇核酸(hna)、嗎啉核苷酸、甲基膦酸酯核苷酸、巰基膦酸酯核苷酸或2’-氟n3-p5’-亞磷酰胺。

62.權(quán)利要求61所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物在所述多核酸聚合物的核苷部分的核糖部分的2’羥基處被修飾。

63.權(quán)利要求62所述的藥物組合物，其中在所述2’羥基處的修飾是通過2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基、2’-脫氧、t-脫氧-2’-氟、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)或2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)部分。

64.權(quán)利要求63所述的藥物組合物，其中將甲基添加到所述核糖部分的2’羥基以產(chǎn)生2’-o-甲基核糖部分。

65.權(quán)利要求63所述的藥物組合物，其中將甲氧基乙基添加到所述核糖部分的2’羥基以產(chǎn)生2’-o-甲氧基乙基核糖部分。

66.權(quán)利要求63所述的藥物組合物，其中在所述2’羥基處的修飾通過亞甲基與4’碳連接。

67.權(quán)利要求59-61中任一項所述的藥物組合物，其中所述核糖環(huán)被六元嗎啉環(huán)替代以產(chǎn)生嗎啉人工核苷酸類似物。

68.權(quán)利要求59-61中任一項所述的藥物組合物，其中磷酸酯骨架被寡聚甘氨酸樣部分替代以產(chǎn)生肽核酸(pna)。

69.權(quán)利要求59-61中任一項所述的藥物組合物，其中磷酸酯骨架通過巰基或甲基修飾。

70.權(quán)利要求59-69中任一項所述的藥物組合物，其中5’端、3’端或其組合被修飾。

71.權(quán)利要求59-70中任一項所述的藥物組合物，其中所述修飾保護所述多核酸聚合物免受受試者中的內(nèi)源性核酸酶影響。

72.權(quán)利要求59-71中任一項所述的藥物組合物，其中修飾的多核酸聚合物不誘導rna酶h切割rna或者誘導rna酶h切割rna的能力降低。

73.權(quán)利要求59-72中任一項所述的組合物，其中所述多核酸聚合物被修飾以提高其穩(wěn)定性。

74.權(quán)利要求42-73中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述mrna轉(zhuǎn)錄物與seqidno:46的至少13個連續(xù)堿基具有至少80％，85％，90％或95％或者具有100％序列同一性。

75.權(quán)利要求42-73中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與包含seqidno:46的至少10個連續(xù)堿基的mrna轉(zhuǎn)錄物雜交。

76.權(quán)利要求42-73中所述任一項的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述mrna轉(zhuǎn)錄物與選自seqidno:6，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:15，seqidno:18，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:27，seqidno:30，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:45或其組合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％的序列同一性。

77.權(quán)利要求42-73中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述mrna轉(zhuǎn)錄物與seqidno:3具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％的序列同一性。

78.權(quán)利要求42-73中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與選自seqidno:4，seqidno:5，seqidno:7，seqidno:8，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:16，seqidno:17，seqidno:19，seqidno:20，seqidno:22，seqidno:23，seqidno:25，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:31，seqidno:32，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:37，seqidno:38，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:43，和seqidno:44或其組合的序列具有至少63％，70％，80％，90％或95％或者100％的序列同一性，并且任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。

79.權(quán)利要求42-73中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與選自seqidno:1、seqidno:2或其組合的序列具有至少55％，60％，70％，80％，90％或95％或者具有100％序列同一性，并且任選地其中尿嘧啶核苷酸被胸腺嘧啶核苷酸置換。

80.權(quán)利要求42-73中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物與mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述mrna轉(zhuǎn)錄物與選自seqidno:47-434或其組合的序列的至少13個連續(xù)堿基具有至少80％，85％，90％或95％序列同一性。

81.權(quán)利要求42-80中任一項所述的藥物組合物，其中所述雜交是特異性雜交。

82.權(quán)利要求42-81中任一項所述的藥物組合物，其中所述多核酸聚合物是合成的多核酸聚合物。

83.權(quán)利要求42-82中任一項所述的藥物組合物，其中包含所述多核酸聚合物的所述藥物組合物靜脈內(nèi)或皮下施用。

84.一種用于治療有需要的患者的疾病或病癥的組合物，其包括向所述患者施用權(quán)利要求42-83所述的藥物組合物。

85.如權(quán)利要求84所述的用途的組合物，其中所述疾病或病癥與蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)或者特征為缺陷性剪接。

86.如權(quán)利要求84或85所述的用途的組合物，其中所述疾病或病癥是遺傳性疾病。

87.如權(quán)利要求86所述的用途的組合物，其中患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含含有外顯子的基因拷貝的基因組，所述外顯子在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。

88.如權(quán)利要求86所述的用途的組合物，其中患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含含有外顯子組的基因拷貝的基因組，所述外顯子組在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。

89.如權(quán)利要求86所述的用途的組合物，其中患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含所述基因的缺陷拷貝的基因組，其不能產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。

90.如權(quán)利要求84-89中任一項所述的用途的組合物，其中所述疾病或病癥是糖尿病。

91.如權(quán)利要求84-89中任一項所述的用途的組合物，其中所述疾病或病癥是癌癥。

92.如權(quán)利要求84-91中任一項所述的用途的組合物，其還包括選擇用于治療與蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)的疾病或病癥的受試者，其包括：

a)確定所述受試者是否患有與所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)的疾病或病癥；和

b)如果所述受試者患有所述與所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生受損相關(guān)的疾病或病癥，則向所述受試者施用權(quán)利要求42-83所述的藥物組合物。

93.如權(quán)利要求84-91中任一項所述的用途的組合物，其還包括選擇用于治療特征為缺陷性剪接的疾病或病癥的治療的受試者，其包括：

a)確定所述受試者是否患有特征為所述缺陷性剪接的疾病或病癥；和

b)如果所述受試者患有所述特征為所述缺陷性剪接的疾病或病癥，則向所述受試者施用權(quán)利要求42-83所述的藥物組合物。

94.一種治療有需要的受試者中特征為蛋白質(zhì)的全長功能形式的產(chǎn)生受損的疾病或病癥的方法，其包括：

a)向所述受試者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含：

誘導提高部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中內(nèi)含子剪除的治療劑；和

藥學上可接受的賦形劑和/或遞送載體；

其中所述受試者具有部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池，所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物能夠編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的拷貝，并且所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物各自包含抑制所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的翻譯的至少一個保留內(nèi)含子；和

b)使所述受試者的靶細胞與所述治療劑接觸，以誘導所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池的一部分經(jīng)歷剪接以從所述部分中的每個部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物去除所述至少一個保留內(nèi)含子，從而產(chǎn)生完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物，其中所述完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物翻譯為表達所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的拷貝，這治療所述疾病或病癥。

95.權(quán)利要求94所述的方法，其中所述治療劑引起所述細胞中一種或多種剪接蛋白復合物的激活，以從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的池的所述部分中的每個所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物去除所述至少一個保留內(nèi)含子。

96.權(quán)利要求94或95所述的方法，其中所述治療劑抑制調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。

97.權(quán)利要求94-96中任一項所述的方法，其中所述治療劑激活調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。

98.權(quán)利要求94-97中任一項所述的方法，其中所述治療劑結(jié)合調(diào)節(jié)內(nèi)含子剪接活性的蛋白質(zhì)。

99.權(quán)利要求94-98中任一項所述的方法，其中所述治療劑結(jié)合所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶多核苷酸序列。

100.權(quán)利要求94-99中任一項所述的方法，其中所述治療劑是多核酸聚合物。

101.權(quán)利要求94-100中任一項所述的方法，其中所述治療劑是小分子。

102.權(quán)利要求94-101中任一項所述的方法，其中所述藥物組合物是權(quán)利要求42-83所述的藥物組合物。

103.權(quán)利要求94-102中任一項所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損包括所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的亞常態(tài)生產(chǎn)。

104.權(quán)利要求94-103中任一項所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損是由于不存在所述蛋白質(zhì)全長功能形式的表達，或者所述蛋白質(zhì)全長功能形式的表達水平足夠低以引起所述疾病或病癥。

105.權(quán)利要求94-104中任一項所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損包括不存在所述蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，或者產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的缺陷形式。

106.權(quán)利要求105所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)的缺陷形式是所述蛋白質(zhì)的截短形式、所述蛋白質(zhì)的錯誤折疊形式或具有異常靶結(jié)合的所述蛋白質(zhì)的形式。

107.權(quán)利要求94-106中任一項所述的方法，其中治療所述受試者導致所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的表達增加。

108.一種誘導部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的加工以去除保留內(nèi)含子而產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)的全長功能形式的完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的方法，其包括：

a)將分離的多核酸聚合物與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物能夠編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式且包含至少一個保留內(nèi)含子；

b)從所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物中去除所述至少一個保留內(nèi)含子以產(chǎn)生編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式的完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物；和

c)從所述完全加工的mrna轉(zhuǎn)錄物翻譯所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。

109.權(quán)利要求108所述的方法，其還包括將包含所述分離的多核酸聚合物的藥物組合物施用于有需要的受試者。

110.權(quán)利要求108或109所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)全長功能形式的產(chǎn)生受損與疾病或病癥相關(guān)。

111.權(quán)利要求108-110中任一項所述的方法，其中所述疾病或病癥是遺傳性疾病。

112.權(quán)利要求108-111中任一項所述的方法，其中患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含含有外顯子的基因拷貝的基因組，所述外顯子在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。

113.權(quán)利要求108-111中任一項所述的方法，其中患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含含有外顯子組的基因拷貝的基因組，所述外顯子組在適當?shù)剞D(zhuǎn)錄為完全加工的mrna時編碼所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。

114.權(quán)利要求108-111中任一項所述的方法，其中患有所述遺傳性疾病的受試者具有包含所述基因的缺陷拷貝的基因組，其不能產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的全長功能形式。

115.權(quán)利要求108-114中任一項所述的方法，其中所述疾病或病癥是糖尿病。

116.權(quán)利要求108-114中任一項所述的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥。

117.權(quán)利要求108-116中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物是反義序列。

118.權(quán)利要求108-117中任一項所述的方法，其中所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的保留內(nèi)含子雜交。

119.權(quán)利要求108-118中任一項所述的方法，其中所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件雜交。

120.權(quán)利要求119所述的方法，其中所述內(nèi)含子剪接調(diào)節(jié)元件包含ccc基序。

121.權(quán)利要求108-120中任一項所述的方法，其中所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序不形成g四鏈體。

122.權(quán)利要求108-121中任一項所述的方法，其中所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序在兩個g四鏈體之間。

123.權(quán)利要求108-122中任一項所述的方法，其中所述反義序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合基序雜交，其中所述結(jié)合基序具有第一ccc基序和第二ccc基序。

124.權(quán)利要求123所述的方法，其中所述第一ccc基序距所述第二ccc基序約3個或更多個核苷酸堿基。

125.權(quán)利要求101-124中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物的序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列至少60％，70％，80％，90％或95％或者100％互補。

126.權(quán)利要求108-125中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物的序列與所述部分加工的mrna轉(zhuǎn)錄物的靶序列有4個或更少，3個或更少，2個或更少或者1個或更少的錯配。

127.權(quán)利要求108-126中任一項所述的方法，其中所述多核酸聚合物長度為約10至約50，約10至約45，約10至約40，約10至約30，約10至約25或約10至約20個核苷酸。

128.權(quán)利要求108-127中任一項所述的方法，其中所述受試者是真核生物或原核生物。

129.權(quán)利要求94-127中任一項所述的方法，其中所述受試者是選自人、小鼠、大鼠、非人靈長類動物或非靈長類哺乳動物的真核生物。