相關專利申請的交叉引用本申請要求2015年3月2日提交的題目為“經(jīng)修飾的細胞及其用途”的美國臨時專利申請?zhí)?2/126,804的優(yōu)先權，所述臨時專利申請通過全文引用并入本文。本公開涉及經(jīng)修飾的細胞和使用者，尤其涉及用于降低與cart細胞療法相關的免疫耐受性的組合物和方法。
背景技術：
：t細胞療法已經(jīng)證明了用于治療癌癥的療效和治療潛力。然而，它們的使用受到免疫抑制微環(huán)境的存在的限制。免疫抑制微環(huán)境包括由程序性死亡-1(pd-1)與pd-l1配體(pd-l1)之間的相互作用所誘導的免疫耐受性。pd-1是在t細胞和抗原呈遞細胞上的陰性共調節(jié)受體。pd-l1由幾種細胞類型(例如，腫瘤細胞和其它組織細胞)表達，并且表現(xiàn)為由免疫微環(huán)境進行動態(tài)調節(jié)。因此，需要解決由pd-l1誘導的免疫耐受性，以改善t細胞療法的療效。技術實現(xiàn)要素：本公開的實施例涉及一種包含編碼經(jīng)修飾的程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)的核酸序列和編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列的分離的核酸序列。在某些實施例中，經(jīng)修飾的pd-1和car被表達為基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物為單獨的多肽。在一些實施例中，car對存在于癌細胞上的腫瘤抗原是特異性的，并且其中所述癌細胞表達pd-l1。在一些實施例中，腫瘤抗原包含her2、cd19、cd20、cd22、κ輕鏈、cd30、cd33、cd123、cd38、ror1、erbb3/4、egfr、egfrviii、epha2、fap、癌胚抗原、egp2、egp40、間皮素、tag72、psma、nkg2d配體、b7-h6、il-13受體α2、il-11受體α、muc1、muc16、ca9、gd2、gd3、hmw-maa、cd171、lewisy、g250/caix、hla-aimagea1、hla-a2ny-eso-1、psc1、葉酸受體-α、cd44v7/8、8h9、ncam、vegf受體、5t4、胎兒型乙酰膽堿受體、nkg2d配體、cd44v6、tem1、tem8，或者由腫瘤表達的病毒相關抗原。在一些實施例中，與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含一個或多個核苷酸的取代或者缺失。在一些實施例中，與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含多個核苷酸的缺失。在某些實施例中，經(jīng)修飾的pd-1包含seqidno:14的核酸序列。在一些實施例中，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含編碼截斷的pd-1的核酸，所述截斷的pd-1不包括胞內(nèi)結構域。在某些實施例中，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含seqidno:12的核酸序列。在一些實施例中，與野生型pd-1相比，經(jīng)修飾的pd-1包含一個或多個點突變。在某些實施例中，點突變包含野生型pd-1的磷酸化位點的一個或兩個氨基酸點突變。實施例進一步涉及一種包含如上所述的核酸序列的表達載體。在一些實施例中，表達載體是選自由以下組成的群組的病毒載體：逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體。實施例進一步涉及一種包含本公開的表達載體的細胞。在一些實施例中，所述細胞選自由以下組成的群組：t細胞、nk細胞和nkt細胞。實施例進一步涉及一種包含抗腫瘤有效量的人t細胞群的藥物組合物，其中所述人t細胞群包括包含如上所述的分離的核酸序列的人t細胞。在一些實施例中，pd-l1對所述人t細胞群的細胞因子產(chǎn)生的抑制作用小于pd-l1對不包含編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列的至少一部分的人t細胞的細胞因子產(chǎn)生的抑制作用。實施例進一步涉及一種治療人患者的癌癥的方法，該方法包含向人患者施用如本公開中所描述的藥物組合物。實施例進一步涉及一種被工程化以表達經(jīng)修飾的pd-1和嵌合抗原受體(car)的細胞，其中所述經(jīng)修飾的pd-1不包括pd-1的跨膜部分或胞內(nèi)部分，或其組合。在一些實施例中，細胞表達可溶性pd-1，例如以破壞pd-1與pd-l-1的結合。例如，可溶性pd-1沒有粘附到細胞的細胞膜。實施例進一步涉及一種治療和/或抑制受試者的癌癥的方法。該方法包括向受試者施用治療有效量的可溶性受體，所述可溶性受體包括pd-1的胞外結構域。在一些實施例中，可溶性受體結合pd-l1蛋白質，并且可溶性受體破壞癌細胞的pd-1信號傳導和/或破壞pd-1與pd-l1的結合。在某些實施例中，分離的可溶性受體多肽包括seqidno:9的氨基酸殘基20-519。實施例進一步涉及一種包括受體多肽的經(jīng)修飾的細胞，所述受體多肽的胞質結構域被截斷，所述受體多肽是程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)受體多肽、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白質4(ctla-4)受體多肽，或者b和t淋巴細胞衰減因子(btla)受體中的至少一種。實施例進一步涉及一種用于治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括向患有疾病的受試者施用細胞，其中所述細胞經(jīng)遺傳修飾以表達：受體多肽，所述受體多肽的胞質結構域被截斷，所述受體多肽是程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)受體多肽、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白質4(ctla-4)受體多肽，或者b和t淋巴細胞衰減因子(btla)受體中的至少一種；包括特異性抗體的抗原識別結構域和胞內(nèi)結構域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細胞受體，所述特異性抗體與抗原結合。在一些實施例中，所述受體多肽是pd-1受體多肽，并且其中所述pd-1受體多肽的胞質結構域含有基于免疫受體酪氨酸的基序。實施例進一步涉及一種與相應的野生型細胞相比包括減少量的一種或多種受體的經(jīng)修飾的細胞，所述一種或多種受體包括程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白質4(ctla-4)，或者b和t淋巴細胞衰減因子(btla)中的至少一種。實施例進一步涉及一種用于治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括向患有疾病的受試者施用細胞，其中，與相應的野生型細胞相比，所述細胞經(jīng)修飾以表達減少量的一種或多種受體，所述一種或多種受體包括程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白質4(ctla-4)，或者b和t淋巴細胞衰減因子(btla)中的至少一種。在一些實施例中，經(jīng)修飾的細胞進一步包括：包括特異性抗體的抗原識別結構域和胞內(nèi)結構域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細胞受體。在某些實施例中，經(jīng)修飾的細胞進一步包括：包括特異性抗體的抗原識別結構域和胞內(nèi)結構域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細胞受體，所述特異性抗體與抗原結合。在一些實施例中，與相應的野生型細胞相比，經(jīng)修飾的細胞具有一個或多個基因的降低的表達，所述一個或多個基因的降低的表達與一種或多種受體的生物合成途徑或輸送途徑相關。在某些實施例中，經(jīng)修飾的細胞包括一個或多個基因的破壞。在某些實施例中，經(jīng)修飾的細胞包括一個或多個基因的部分或完全缺失。在某些實施例中，經(jīng)遺傳修飾的細胞在人患者體內(nèi)復制。在一些實施例中，經(jīng)修飾的細胞形成人患者的記憶細胞。在這些情況下，經(jīng)修飾的細胞經(jīng)靜脈內(nèi)施用給人患者。在某些實施例中，經(jīng)修飾的細胞持續(xù)存在于人患者內(nèi)。例如，經(jīng)修飾的細胞是自體t細胞。對于另一個實例，細胞可以包括b細胞、t細胞、nk細胞、胚胎細胞或樹突細胞中的至少一種。在一些實施例中，所述疾病可以包括癌癥、免疫缺陷、自身免疫性疾病，或肥胖癥中的至少一種。提供該
發(fā)明內(nèi)容以用簡化的形式介紹以下具體實施方式中進一步描述的精選概念。該
發(fā)明內(nèi)容并不旨在標識所要求保護的主題的關鍵特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保護的主題的范圍。附圖說明參照附圖描述具體實施方式。在不同附圖中使用相同的參考數(shù)字表示類似或相同的項目。圖1是示出p0:cd19bbzeta、p1:cd19bbzeta-ires-可溶性pd1、p2:cd19bbzeta-ires-截斷的pd1、p3:cd19bbzeta-ires-點突變pd1、p4:cd19bbzeta-ires-缺失pd1的dna構建體的示意圖。圖2包括圖2a和圖2b，是顯示car和經(jīng)修飾的pd-1在轉導的293t和k562細胞上的表達的一系列圖像。圖2a顯示car在轉導的293t和k562細胞上的表達。圖2b顯示經(jīng)修飾的pd-1在轉導的293t和k562細胞上的表達。圖3包括圖3a至圖3c，是顯示car和經(jīng)修飾的pd-1在原代t細胞上的表達的一系列圖像。圖3a顯示car在轉導的原代t細胞上的表達。圖3b和圖3c顯示經(jīng)修飾的pd-1在轉導的原代t細胞上的表達。圖4包括圖4a和圖4b，是顯示用car和經(jīng)修飾的pd-1轉導的t細胞的細胞毒性的一系列圖像。圖4a顯示每104個t細胞的ifn-γ釋放，所述t細胞用car和經(jīng)修飾的pd-1轉導，其中e：t比例是10：1并且用cd19+細胞培養(yǎng)24小時。圖4b表明，每104個t細胞殺死cd19+細胞，損失t細胞用car和經(jīng)修飾的pd-1轉導，其中e：t比例是10：1并且培養(yǎng)24小時。圖5顯示pd-l1在轉導的nalm6細胞上的表達。圖6包括圖6a和圖6b，是證明經(jīng)修飾的pd-1降低了由pd-l1誘導的免疫耐受性的一系列圖像。圖6a顯示每104個t細胞的ifn-γ釋放，所述t細胞用car和經(jīng)修飾的pd-1轉導，其中e：t比例是10：1并且用cd19+細胞和cd19+/pd-l1+細胞培養(yǎng)24小時。這些結果表明，由pd-l1誘導的細胞毒性的抑制作用在用car和經(jīng)修飾的pd-1轉導的t細胞上降低。圖6b示出與單獨用car轉導的t細胞相比，由pd-l1誘導的細胞毒性的損失在用car和經(jīng)修飾的pd-1轉導的t細胞上降低。具體實施方式概述本公開涉及以下發(fā)現(xiàn)：關于基于cart細胞的療法，由pd-l1誘導的免疫耐受性可以通過經(jīng)遺傳修飾的pd-1在這些t細胞上的表達而降低。在一些實施例中，這些t細胞包括編碼car和經(jīng)遺傳修飾的pd-1的核酸序列，使得經(jīng)修飾的pd-1和car被表達為基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物是這些t細胞上的單獨的多肽。遺傳修飾的實例包括與pd-1的胞內(nèi)部分的表達或功能相關的一個或多個核苷酸的取代或缺失。在一些實施例中，本公開提供了一種t細胞，所述t細胞被工程化以表達抗cd19的car和經(jīng)修飾的pd-1，使得pd-l1對t細胞的細胞因子產(chǎn)生的抑制作用顯著小于pd-l1對不包括編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列的至少一部分的t細胞的細胞因子產(chǎn)生的抑制作用。在一些情況下，car對存在于腫瘤細胞上的腫瘤抗原是特異性的，并且所述腫瘤細胞表達pd-l1。因此，當本公開的工程化t細胞被輸注到患者中時，所述工程化t細胞可以降低由腫瘤細胞的pd-l1誘導的免疫耐受性，并且進一步消除患者體內(nèi)的這些腫瘤細胞。定義除非另有定義，本文所使用的所有技術和科學術語具有如本公開所屬的領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然在本公開的實踐或測試中可以使用與本文描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但是描述了優(yōu)選的方法和材料。對于本公開的目的，下列術語定義如下。本文使用冠詞“一(a)”和“一個(an)”指的是一個或多于一個(即，指的是至少一個)該冠詞的語法對象。舉例來說，“元件”表示一個元件或多于一個元件?！凹s”是指與參考量、水平、值、數(shù)量、頻率、百分比、量綱、大小、用量、重量或長度相比，量、水平、值、數(shù)量、頻率、百分比、量綱、大小、用量、重量或長度的變化高達30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。如本文所使用的，術語“活化”指的是已經(jīng)被充分刺激以誘導可檢測的細胞增殖的t細胞的狀態(tài)。活化也可與誘導的細胞因子產(chǎn)生和可檢測的效應子功能相關。術語“活化的t細胞”尤其指的是正經(jīng)歷細胞分裂的t細胞。術語“抗體”以最廣泛的意義使用，并且具體包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學活性或功能即可。本公開中的抗體可以以多種形式存在，包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、fv、fab和f(ab)2，以及單鏈抗體和人源化抗體(harlow等人，1999年，載于：《使用抗體：實驗室手冊(usingantibodies:alaboratorymanual)》，冷泉港實驗室出版社，紐約；harlow等人，1989年，載于：《抗體：實驗室手冊(antibodies:alaboratorymanual)》，冷泉港，紐約；houston等人，1988年，美國國家科學院院報85:5879-5883；bird等人，1988年，《科學(science)》242:423-426)。“抗體片段”包含全長抗體的一部分，通常包含抗體的抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括：fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。“fv”是包含完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。此片段由一個重鏈和一個輕鏈可變區(qū)結構域通過緊密的、非共價結合的二聚體組成。通過這兩個結構域的折疊發(fā)出提供用于抗原結合的氨基酸殘基并賦予抗體抗原結合特異性的六個高變環(huán)(3個環(huán)各自來自h和l鏈)。但是，甚至單個可變結構域(或者僅僅包括抗原特異的三個互補決定區(qū)(cdr)的fv的一半)也具有識別和結合抗原的能力，盡管親和力比完整結合位點低。如本文所使用的，“抗體重鏈”指的是以它們天然存在的構象存在于所有抗體分子中的兩類多肽鏈中較大的一類。如本文所使用的，“抗體輕鏈”指的是以它們天然存在的構象存在于所有抗體分子中的兩類多肽鏈中較小的一類。κ和λ輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。如本文所使用的，術語“合成抗體”是指利用重組dna技術產(chǎn)生的抗體，例如，如本文所述的由噬菌體表達的抗體。該術語也應當被解釋為指通過編碼抗體的dna分子的合成而產(chǎn)生的抗體，并且所述dna分子表達抗體蛋白質，或表示抗體的氨基酸序列，其中dna或氨基酸序列是利用本領域可用且公知的合成dna或氨基酸序列技術獲得的。如本文所使用的，術語“抗原”被定義為引起免疫應答的分子，所述免疫應答可涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細胞的活化，或這兩者?？乖梢园ㄈ魏未蠓肿?，實際上包括所有蛋白質或肽，或者源自重組或基因組dna的分子。例如，包括編碼引發(fā)免疫應答的蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列的dna因此編碼如本文所使用的術語“抗原”。此外，抗原不一定僅由基因的全長核苷酸序列編碼。進一步地，抗原可以通過生物學樣本產(chǎn)生、合成或衍生，所述生物學樣本包括組織樣本、腫瘤樣本、細胞或生物學流體。如本文所使用的，術語“抗腫瘤作用”指的是與腫瘤體積的減小、腫瘤細胞數(shù)量的減少、轉移數(shù)量的減少、具有腫瘤細胞的受試者的預期壽命的增加，或者與癌性病癥相關的各種生理癥狀的改善相關的生物學效應?！翱鼓[瘤作用”也可由本公開的肽、多核苷酸、細胞和抗體在預防腫瘤首次出現(xiàn)的能力表示。術語“自體抗原”指的是由免疫系統(tǒng)錯誤識別為外源的抗原。自體抗原包括細胞蛋白質、磷蛋白質、細胞表面蛋白質、細胞脂質、核酸、糖蛋白，包括細胞表面受體。術語“自體的”用于描述源自相同個體的物質，所述物質隨后被再次引入到個體中。“同種異體的”用于描述源自相同物種的不同動物的移植物?！爱惙N異體的”用于描述源自不同物種的動物的移植物。如本文所使用的，術語“癌癥”被定義為以畸變細胞的快速和失控生長為特征的疾病。癌癥細胞可局部蔓延或通過血流和淋巴系統(tǒng)蔓延至身體的其它部位。各種癌癥的實例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。在整個本說明書中，除非上下文另有要求，詞語“包含”和“包括”將被理解為指包括所陳述的步驟或元素或者步驟或元素的集合，但是不排除任何其它步驟或元素或者步驟或元素的集合?！坝伞M成”是指包括并且限于短語“由……組成”之后所描述的內(nèi)容。因此，短語“由……組成”表示所列元素是必要的或強制性的，并且其它元素可以不存在?！盎旧嫌伞M成”是指包括該短語后面列出的任何元素，并且限于對本公開中針對所列元素說明的活性或作用不干擾或無貢獻的其它元素。因此，短語“基本上由……組成”表示所列元素是必要的或強制性的，但是其它元素是任選的，并且根據(jù)它們是否影響所列元素的活性或作用可以存在或不存在。術語“互補的”和“互補”指的是通過堿基配對原則相關的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“a-g-t”與序列“t-c-a”是互補的?；パa可以是“部分的”，其中僅一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對原則進行匹配?；蛘撸怂嶂g可存在“完全”或“總體”的互補。核酸鏈之間的互補程度對核酸鏈之間雜交的效率和強度具有顯著影響?！皩凇笔侵?a)具有與參考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互補的核酸序列或編碼與肽或蛋白質中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或者(b)具有與參考肽或蛋白質中的氨基酸的序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽?！肮泊碳づ潴w”包括特異性結合t細胞上的同源共刺激分子的抗原呈遞細胞(例如，apc、樹突細胞、b細胞等等)上的分子，由此除了通過例如將tcr/cd3復合物與負載有肽的mhc分子結合提供的初級信號之外，還提供介導t細胞應答的信號，所述t細胞應答包括增殖、活化、分化等等。共刺激配體可包括cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、可誘導的共刺激配體(icos-l)、細胞間粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受體、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、結合toll配體受體的激動劑或抗體和與b7-h3特異性結合的配體。共刺激配體也包括，特別是與存在于t細胞上的共刺激分子特異性結合的抗體，諸如cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細胞功能相關抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3，以及與cd83特異性結合的配體?！肮泊碳し肿印敝傅氖桥c共刺激配體特異性結合的t細胞上的同源結合配偶體，由此由t細胞介導共刺激應答，諸如增殖。共刺激分子包括mhci類分子、btla和toll樣受體?！肮泊碳ば盘枴敝傅氖桥c初級信號(諸如tcr/cd3接合)結合導致t細胞增殖和/或關鍵分子的上調或下調的信號。如本文所使用的，術語“疾病”和“病癥”可以互換使用，或者可以是不同的，因為特殊的疾病或病癥可以不具有已知的致病因子(因此不能用病因學解決)，因此其不被公認為疾病而是為不合適的病癥或癥狀，其中臨床醫(yī)師已經(jīng)鑒定出或多或少的特異系列癥狀。如本文所使用的，“疾病”是受試者的一種健康狀態(tài)，其中受試者不能維持體內(nèi)平衡，并且其中如果不改善該疾病，則受試者的健康繼續(xù)惡化。與之相比，受試者中的“紊亂”是一種健康狀態(tài)，其中動物能夠維持體內(nèi)平衡，但是其中動物的健康狀態(tài)與它沒有處于該紊亂相比不太有利。保持不治療，紊亂不一定引起動物健康狀態(tài)的進一步降低。如本文所使用的，術語“有效的”是指足以實現(xiàn)所期望的、預期的或意圖的結果。例如，“有效量”可以是足以產(chǎn)生治療性或預防性益處的化合物的量?！熬幋a”指的是多核苷酸(諸如基因、cdna或mrna)中核苷酸的特異性序列在生物學過程中用作合成其它聚合物和大分子的模板的固有性質，所述聚合物和大分子具有確定的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或確定的氨基酸序列和由其產(chǎn)生的生物學性質。因此，如果對應于基因的mrna的轉錄和翻譯在細胞或其它生物學系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質，則該基因編碼蛋白質。核苷酸序列與mrna序列相同并且通常在序列表中提供的編碼鏈和用作基因或cdna轉錄的模板的非編碼鏈可被稱為編碼那個基因或cdna的蛋白質或其它產(chǎn)物。關于多核苷酸，術語“外源的”指的是在野生型細胞或生物體中并非天然存在但是通常通過分子生物學技術將其引入到細胞中的多核苷酸序列。外源多核苷酸的實例包括載體、質粒，和/或編碼所需蛋白質的人造核酸構建體。對于多核苷酸，術語“內(nèi)源的”或“天然的”指的是可在給定的野生型細胞或生物體中找到的天然存在的多核苷酸序列。同樣，從第一生物體分離并且通過分子生物學技術轉移到第二生物體的特定多核苷酸序列通常被認為相對于所述第二生物體是“外源”多核苷酸。在具體的實施例中，多核苷酸序列可以通過分子生物學技術被“引入”到已包含這樣的多核苷酸序列的微生物中，例如以創(chuàng)建另外的天然存在的多核苷酸序列的一個或多個附加拷貝，并且由此促進所編碼的多肽的過表達。如本文所使用的，術語“表達”被定義為由它的啟動子驅動的特定核苷酸序列的轉錄和/或翻譯。“表達載體”指的是包括重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連接至待表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包括用于表達的足夠的順式作用元件；用于表達的其它元件可由宿主細胞供應或在體外表達系統(tǒng)中供應。表達載體包括本領域已知的所有那些表達載體，諸如并入重組多核苷酸的粘粒、質粒(例如，裸露或包含在脂質體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)?！巴吹摹敝傅氖莾蓚€多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。當兩個比較序列中的位置被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時，例如，如果兩個dna分子的每一個中的位置被腺嘌呤占據(jù)，則所述分子在那個位置上是同源的。兩個序列之間的同源性百分比為兩個序列共有的匹配或同源位置數(shù)除以被比較的位置數(shù)再乘以100所得的函數(shù)。例如,如果兩個序列中10個位置中的6個是匹配或同源的，則兩個序列是60％同源的。舉例來說，dna序列attgcc和tatggc共有50％的同源性。通常，當兩個序列進行比對給出最大同源性時才進行比較。術語“免疫球蛋白”或“ig”指的是起到抗體作用的一類蛋白質。包括在該類蛋白質中的五個成員為iga、igg、igm、igd和ige。iga為存在于身體分泌物(諸如唾液、淚液、母乳)、胃腸分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初級抗體。igg是最常見的循環(huán)抗體。igm是在多數(shù)受試者的初級免疫應答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、補體結合和其它抗體應答中最有效的免疫球蛋白，并且在抵御細菌和病毒方面是很重要的。igd是不具有已知抗體功能但可用作抗原受體的免疫球蛋白。ige是在暴露于過敏原后，通過引起從肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放介體而介導速發(fā)型超敏反應的免疫球蛋白?！胺蛛x的”是指基本上或實質上不含通常在其天然狀態(tài)下附帶著的成分的物質。例如，如本文所使用的，“分離的多核苷酸”指的是在天然存在的狀態(tài)下被來自其兩側的序列所純化的多核苷酸，例如從正常毗鄰于所述片段的序列所移除的dna片段。可選地，如本文所使用的，“分離的肽”或“分離的多肽”等指的是肽或多肽分子從其天然細胞環(huán)境中的體外分離和/或純化，以及與細胞的其它成分關聯(lián)。在本公開的上下文中，使用下列普遍存在的核酸堿基的縮寫?！癮”指的是腺苷，“c”指的是胞嘧啶，“g”指的是鳥苷，“t”指的是胸苷，以及“u”指的是尿苷。除非另有說明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互為簡并版本并且編碼相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短語編碼蛋白質或rna的核苷酸序列也可包括內(nèi)含子，在一定程度上編碼蛋白質的核苷酸序列可在某些版本中包含(一個或多個)內(nèi)含子。如本文所使用的，“慢病毒”指的是逆轉錄病毒科的屬。在逆轉錄病毒中，慢病毒是唯一能夠感染非分裂細胞的；它們可以將顯著量的遺傳信息傳遞到宿主細胞的dna中，所以它們是基因傳遞載體的最有效的方法之一。hiv、siv和fiv是慢病毒的所有實例。源自慢病毒的載體提供了實現(xiàn)顯著水平的基因體內(nèi)轉移的工具。如本文所使用的，術語“調節(jié)”是指與缺少治療或化合物的受試者中的應答水平相比，和/或與在另外相同但未治療的受試者中的應答水平相比，介導受試者中的應答水平的可檢測的增加或減少。該術語包括擾亂和/或影響天然信號或應答，由此介導受試者、優(yōu)選人中的有益的治療性應答。當使一核酸與另一核酸序列處于功能性關系時，所述核酸即是“可操作地連接”。例如，如果前序列或分泌前導序列的dna被表達為參與多肽的分泌的前蛋白，則其可操作地連接至所述多肽的dna；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則其可操作地連接至編碼序列；或者如果核糖體結合位點被定位成便于翻譯，則其可操作地連接至編碼序列。通常，“可操作地連接”是指被連接的dna序列是連續(xù)的，并且在分泌前導序列的情況下是連續(xù)的并且處于閱讀相。然而，增強子不一定是連續(xù)的。連接是通過在方便的限制性位點進行接合而實現(xiàn)的。如果不存在此類位點，則根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或連接子。術語“過表達的”腫瘤抗原或腫瘤抗原的“過表達”意在表示相對于在來自組織或器官的正常細胞中的表達水平，腫瘤抗原在來自患者的特異性組織或器官內(nèi)的疾病區(qū)域(如實體腫瘤)的細胞中的異常表達水平?；加刑卣髟谟谀[瘤抗原的過表達的實體腫瘤或惡性血液疾病的患者可以通過本領域中已知的標準測定法來確定。免疫原性組合物的“腸胃外”施用包括，例如，皮下注射(s.c.)、靜脈內(nèi)注射(i.v.)、肌內(nèi)注射(i.m.)、或胸骨內(nèi)注射、或輸液技術。術語“患者”、“受試者”、“個體”等等在本文中可互換使用，并且指的是不論是在體外或原位服從本文所描述的方法的任何動物或其細胞。在某些非限制性實施例中，患者、受試者或個體是人。在一些實施例中，術語“受試者”意在包括可引發(fā)免疫應答的活生物體(例如，哺乳動物)。受試者的實例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。如本文所使用的，敘述“多核苷酸”或“核酸”是指mrna、rna、crna、rrna、cdna或dna。該術語通常指的是長度為至少10個堿基的聚合體形式的核苷酸，所述核苷酸是核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型核苷酸的經(jīng)修飾形式。該術語包括dna和rna的單鏈和雙鏈形式。術語“多核苷酸變體”和“變體”等指的是顯示與參考多核苷酸序列具有基本序列同一性的多核苷酸或在下文定義的低嚴謹性條件下與參考序列雜交的多核苷酸。這些術語還包括通過至少一個核苷酸的添加、缺失或取代而區(qū)別于參考多核苷酸的多核苷酸。因此，術語“多核苷酸變體”和“變體”包括其中一個或多個核苷酸被添加或缺失，或用不同的核苷酸置換的多核苷酸。在這方面，本領域技術人員很好理解的是，可以對參考多核苷酸進行某些改變，包括突變、添加、缺失和取代，由此所改變的多核苷酸保持參考多核苷酸的生物學功能或活性，或者相對于所述參考多核苷酸具有增加的活性(即，優(yōu)化)。多核苷酸變體包括，例如，與本文中所描述的參考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％，以及在之間的所有整數(shù)百分比，例如，90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。術語“多核苷酸變體”和“變體”還包括天然存在的等位基因變體和編碼這些酶的直系同源物?！岸嚯摹薄ⅰ岸嚯钠巍?、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，用來指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成類似物。因此，這些術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物(諸如相應的天然存在的氨基酸的化學類似物)，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化不同的化學反應(即，增加不同的化學反應的速率)的酶多肽，或“酶”。敘述多肽“變體”指的是通過至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或取代而區(qū)別于參考多肽序列的多肽。在某些實施例中，多肽變體通過一個或多個取代基而區(qū)別于參考多肽，所述取代基可以是保守的或非保守的。在某些實施例中，所述多肽變體包含保守性取代基，并且在這方面，本領域中很好理解的是，一些氨基酸可以被改變?yōu)榫哂袕V泛相似性質的其它氨基酸，而不改變多肽的活性性質。多肽變體還包括其中一個或多個氨基酸被添加或缺失，或用不同的氨基酸殘基置換的多肽。如本文所使用的，術語“啟動子”被定義為通過細胞的合成機制，或引入的合成機制識別的dna序列，它是啟動多核苷酸序列的特異性轉錄所必需的。表達“控制序列”指的是在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的dna序列。例如適于原核生物的控制序列包括啟動子，任選地包括操縱子序列和核糖體結合位點。真核細胞已知利用啟動子、多腺苷酸化信號，以及增強子。術語“結合”或“與……相互作用”是指一個分子識別并粘附到樣本或生物體中的特定第二分子，但基本上不識別或粘附到樣本中的其它結構上無關的分子。如本文關于抗體所使用的，術語“特異性結合”是指識別特異性抗原但基本上不識別或結合樣本中的其它分子的抗體。例如，與來自一個物種的抗原特異性結合的抗體也可與來自一個或多個物種的抗原結合。但是，這種交叉物種反應性本身沒有將抗體的類別改變?yōu)樘禺愋缘?。在另一個實例中，與抗原特異性結合的抗體也可與不同等位基因形式的抗原結合。然而，這種交叉反應性本身沒有將抗體的類別改變?yōu)樘禺愋缘?。在一些情況下，術語“特異性結合”或“特異性地結合”可以在提及抗體、蛋白質或肽與第二化學物種的相互作用時使用，用于指所述相互作用依賴于化學物種上特定結構(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體通常識別和結合特異性蛋白質結構而不是蛋白質。如果抗體對表位“a”是特異性的，則在包含標記的“a”和抗體的反應中，包含表位a(或游離的、未標記的a)的分子的存在將降低與抗體結合的標記的a的量?！翱扇苄允荏w”是不與細胞膜結合的受體多肽?？扇苄允荏w是缺乏跨膜結構域和胞質結構域的最常見的配體結合受體多肽?？扇苄允荏w可包括附加的氨基酸殘基，諸如用于多肽的純化或為多肽與底物粘附提供位點的親和標簽，或免疫球蛋白恒定區(qū)序列。許多細胞表面受體具有天然存在的由蛋白水解產(chǎn)生的可溶性對應物。當可溶性受體多肽缺乏分別提供膜錨定或信號轉導的足夠的跨膜和胞內(nèi)多肽區(qū)段的部分時，它們被認為是基本上不含跨膜和胞內(nèi)多肽區(qū)段?！敖y(tǒng)計學上顯著的”是指結果不太可能是偶然發(fā)生的。統(tǒng)計顯著性可通過本領域已知的任何方法來確定。通常使用的顯著性測量值包括p值，它是在無效假設是真的情況下所觀察到的事件將發(fā)生的頻率或概率。如果獲得的p值小于顯著性水平，則無效假設被拒絕。在簡單的情況下，顯著性水平被限定在0.05或更小的p值?！跋陆档摹被颉皽p少的”或“更少的”量通常是“統(tǒng)計學上顯著的”或生理學上顯著的量，并且可以包括是本文中描述的量或水平的約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在之間和在1以上的所有整數(shù)和小數(shù)點，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的下降。術語“刺激”是指通過將刺激分子(例如，tcr/cd3復合物)與其同源配體結合而誘導的初級應答，由此介導信號轉導事件，諸如經(jīng)tcr/cd3復合物的信號轉導。刺激可介導某些分子的改變的表達，諸如tgf-β的下調和/或細胞骨架結構的再組織等等?！按碳し肿印敝傅氖桥c存在于抗原呈遞細胞上的同源刺激配體特異性結合的t細胞上的分子?！按碳づ潴w”指的是當存在于抗原呈遞細胞(例如，apc、樹突細胞、b-細胞等等)上時，可與t細胞上的同源結合配偶體(在本文中被稱為“刺激分子”)特異性結合的配體，由此介導t細胞的初級應答，包括活化、免疫應答的開始、增殖等等。刺激配體在本領域中是公知的，并且尤其包括負載有肽的mhci類分子、抗-cd3抗體、超激動劑抗-cd28抗體，以及超激動劑抗-cd2抗體。如本文所使用的，“基本上純化的”細胞為基本上不含其它細胞類型的細胞?；旧霞兓募毎仓傅氖且呀?jīng)與在其天然存在狀態(tài)下與其正常相關聯(lián)的其它細胞類型分離的細胞。在一些情況下，基本上純化的細胞群指的是均質細胞群。在其它情況下，該術語僅僅指的是已經(jīng)與在其天然狀態(tài)下與其自然相關聯(lián)的細胞分離的細胞。在一些實施例中，細胞在體外培養(yǎng)。在其它實施例中，細胞不在體外培養(yǎng)。如本文所使用的，術語“治療的”表示治療和/或預防。治療作用通過疾病狀態(tài)的抑制、緩和或根除而獲得。術語“治療有效量”指的是將引發(fā)由研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)師所尋求的組織、系統(tǒng)或受試者的生物學或醫(yī)學應答的受試者化合物的量。術語“治療有效量”包括當施用化合物時足以預防被治療的紊亂或疾病的跡象或癥狀中的一個或多個的發(fā)展，或在一定程度上減輕被治療的紊亂或疾病的跡象或癥狀中的一個或多個的化合物的量。治療有效量將根據(jù)化合物、疾病和其嚴重性、以及待治療的受試者的年齡、重量等而變化。如本文所使用的術語，“治療”疾病是指降低受試者經(jīng)歷的疾病或紊亂的至少一種跡象或癥狀的頻率或嚴重性。如本文所使用的，術語“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”指的是外源核酸被轉移或引入到宿主細胞中的過程?！稗D染的”或“轉化的”或“轉導的”細胞是已經(jīng)由外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。所述細胞包括原代受試者細胞及其子代。如本文所使用的，短語“在轉錄控制下”或“可操作地連接”是指啟動子在相對于多核苷酸的正確位置和朝向上，以控制通過rna聚合酶進行的轉錄的開始和多核苷酸的表達?！拜d體”為包括分離的核酸，并且可用于將分離的核酸傳遞至細胞內(nèi)部的物質組合物。很多載體在本領域中是已知的，包括線性多核苷酸、與離子或兩性分子化合物相關的多核苷酸、質粒和病毒。因此，術語“載體”包括自主復制的質粒或病毒。該術語也應當被解釋為包括便于將核酸轉移到細胞中的非質粒和非病毒化合物，例如聚賴氨酸化合物、脂質體等等。病毒載體的實例包括但不限于，腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體等等。例如，慢病毒是復雜的逆轉錄病毒，其中，除了常見的逆轉錄病毒基因gag、pol和env之外，其還包含具有調節(jié)或結構功能的其它基因。慢病毒載體在本領域中是公知的。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺陷病毒：hiv-1、hiv-2和猿猴免疫缺陷病毒：siv。慢病毒載體通過將大多的hiv的致病基因剔除而產(chǎn)生，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef被刪除使得載體具有生物安全性。范圍：在整個本公開中，本公開的各個方面可以以范圍格式給出。應當理解，范圍格式的描述僅是為了方便和簡潔，并且不應當被解釋為對本公開的范圍的硬性限制。因此，范圍的描述應被認為具有具體公開的所有可能的子范圍以及處于那個范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例如，范圍的描述諸如從1至6應被認為具有具體公開的子范圍諸如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及那個范圍內(nèi)的單個數(shù)值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范圍的寬度如何，這一點都是適用的。本公開涉及分離的核酸序列、包括分離的核酸序列的載體、包括分離的核酸序列的細胞和使用這些細胞治療癌癥的方法。組合物和治療應用本文的實施例涉及一種包括編碼經(jīng)修飾的程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)的核酸序列和編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列的分離的核酸序列。在一些實施例中，經(jīng)修飾的pd-1和car被表達為基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物是單獨的多肽。在這些情況下，car對存在于癌細胞上的腫瘤抗原是特異性的，并且所述癌細胞表達pd-l1。car是通常包括胞外結構域和胞內(nèi)結構域的分子。胞外結構域包括靶特異性結合元件。胞內(nèi)結構域(例如胞質結構域)包括共刺激信號傳導區(qū)和ζ鏈部分。共刺激信號傳導區(qū)指的是包括共刺激分子的胞內(nèi)結構域的car的一部分。共刺激分子為淋巴細胞針對抗原的有效應答所需要的細胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。在car的胞外結構域與跨膜結構域之間，可并入間隔結構域。如本文所使用的，術語“間隔結構域”通常指起到將跨膜結構域連接至多肽鏈的胞外結構域或胞質結構域的作用的任何寡肽或多肽。間隔結構域可包括高達300個氨基酸，優(yōu)選地10至100個氨基酸并且最優(yōu)選地25至50個氨基酸。在一些實施例中，在本公開中的car的靶特異性結合元件可以識別腫瘤抗原。腫瘤抗原是由引發(fā)免疫應答，特別是t-細胞介導的免疫應答的腫瘤細胞產(chǎn)生的蛋白質。腫瘤抗原在本領域中是公知的，并且包括例如神經(jīng)膠質瘤相關抗原、癌胚抗原(cea)、β-人絨毛膜促性腺激素、α-胎蛋白(afp)、凝集素-反應性afp、甲狀腺球蛋白、rage-1、mn-caix、人端粒酶逆轉錄酶、ru1、ru2(as)、腸道羧酸酯酶、muthsp70-2、m-csf、前列腺酶、前列腺特異性抗原(psa)、pap、ny-eso-l、lage-la、p53、prostein、psma、her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、中性白細胞彈性蛋白酶、埃甫蛋白b2、cd22、胰島素生長因子(igf)-i、igf-ii、igf-i受體和間皮素。在一些實施例中，腫瘤抗原包括her2、cd19、cd20、cd22、κ輕鏈、cd30、cd33、cd123、cd38、ror1、erbb3/4、egfr、egfrviii、epha2、fap、癌胚抗原、egp2、egp40、間皮素、tag72、psma、nkg2d配體、b7-h6、il-13受體α2、il-11受體α、muc1、muc16、ca9、gd2、gd3、hmw-maa、cd171、lewisy、g250/caix、hla-aimagea1、hla-a2ny-eso-1、psc1、葉酸受體-α、cd44v7/8、8h9、ncam、vegf受體、5t4、胎兒型乙酰膽堿受體、nkg2d配體、cd44v6、tem1、tem8，或者由腫瘤表達的病毒相關抗原。在一些實施例中，本公開的car的抗原結合元件以cd19為靶點。在一些情況下，本公開的car的抗原結合元件包括抗cd19scfv，所述抗cd19scfv包括在seqidno:1中列出的氨基酸序列。在一些實施例中，本公開的car的跨膜結構域包括cd8或cd9跨膜結構域。在一些實施例中，本公開的car的胞內(nèi)結構域包括4-1bb(cd137)或cd28的胞內(nèi)結構域。pd-1，cd28家族的一個成員，是具有包含單個免疫球蛋白(ig)樣的可變結構域的胞外結構域和包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序的胞內(nèi)結構域的1型跨膜蛋白質。pd-1在活化的t細胞、b淋巴細胞、自然殺傷細胞、樹突細胞和活化的單核細胞上表達。pd-1與其配體pd-l1和pd-l2之間的相互作用導致t細胞耗盡、失活和細胞凋亡。耗盡的t淋巴細胞喪失產(chǎn)生促炎細胞因子(包括il-2、腫瘤壞死因子α和干擾素-γ)的能力。由不同組織進行的pd-l1的表達介導外周免疫耐受性，并且pd-1/pd-l1的活化限制持續(xù)的免疫/炎癥應答后的組織損傷。pd-1表達的腫瘤浸潤淋巴細胞與受損的抗腫瘤作用和pd-1的上調相關，而pd-l1與幾個腫瘤類型的結果相關。實施例涉及一種包括編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列和編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列的分離的核酸序列。在一些實施例中，與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列可以包括一個或多個核苷酸的取代或缺失。在某些實施例中，與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包括一個或多個核苷酸的缺失。例如，經(jīng)修飾的pd-1是包括seqidno:14的核酸序列的人pd-1。在一些實施例中，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包括編碼截斷的pd-1的核酸，所述截斷的pd-1不包括胞內(nèi)結構域。例如，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包括seqidno:12的核酸序列。在一些實施例中，與野生型pd-1相比，經(jīng)修飾的pd-1包括一個或多個點突變。在某些實施例中，點突變可以包括野生型pd-1的磷酸化位點的一個或兩個氨基酸點突變。例如，氨基酸點突變包括酪氨酸殘基223和/或酪氨酸殘基248的點突變。本公開的實施例進一步涉及一種包括編碼car和經(jīng)修飾的pd-1的序列的dna構建體。在一些實施例中，car可以包括cd3-ζ、cd28、4-1bb等的任意組合。例如，本公開的car包括抗cd19scfv、人cd8鉸鏈和跨膜結構域，以及人4-1bb和cd3ζ信號傳導結構域。在一個實施例中，本公開的car包括在seqidno:1中列出的核酸序列。在一些實施例中，內(nèi)部核糖體進入位點(ires)元件用于產(chǎn)生多基因或多順反子信息。例如，ires元件可以將編碼car的核酸序列和編碼各種經(jīng)修飾的pd-1(見表1)中的一種的核酸序列連接起來。編碼所需分子的核酸序列可以使用本領域中已知的重組方法獲得，例如使用標準技術通過從表達基因的細胞篩選文庫、通過從已知包括基因的載體衍生該基因，或者通過直接從含有基因的細胞或組織中分離該基因而獲得?？蛇x地，也可以合成而非克隆生產(chǎn)感興趣的基因。本公開的實施例進一步涉及將本發(fā)明的dna插入其中的載體。從逆轉錄病毒(例如慢病毒)衍生的載體是實現(xiàn)長期的基因轉移的合適的工具，因為它們允許轉基因的長期、穩(wěn)定的整合及其在子細胞中的繁殖。與從致癌性逆轉錄病毒(例如鼠白血病病毒)衍生的載體相比，慢病毒載體具有附加優(yōu)點，在于因為它們能轉導非增殖細胞，例如肝細胞。它們也具有低免疫原性的附加優(yōu)點。編碼car和經(jīng)修飾的pd-1的天然或合成的核酸的表達通常通過將編碼car多肽或其部分的核酸可操作地連接至一個或多個啟動子，以及將所述構建體整合到表達載體中來實現(xiàn)。所述載體可適合于復制和整合真核生物。典型的克隆載體包含轉錄和翻譯終止子、起始序列和用于調節(jié)所需的核酸序列的表達的啟動子。在美國專利號us8,906,682中提供了與編碼car和經(jīng)修飾的pd-1并且將基因轉移到哺乳動物細胞中的表達合成核酸有關的附加信息，所述專利全文引入作為參考。實施例進一步涉及表達car和經(jīng)修飾的pd-1的經(jīng)遺傳修飾的細胞(例如，t細胞)。在一些實施例中，將顯性陰性pd-1引入t細胞中，使得顯性陰性pd-1抑制由腫瘤細胞的pd-l1誘導的野生型pd-1活性。在某些實施例中，經(jīng)遺傳修飾的t細胞表達非功能性pd-1。例如，經(jīng)遺傳修飾的t細胞表達不包括胞內(nèi)結構域、不包括胞內(nèi)結構域和跨膜結構域，或包括如在本公開中所描述的點突變的pd-1分子。在一些實施例中，腫瘤細胞的pd-l1對本公開的經(jīng)遺傳修飾的t細胞的細胞因子產(chǎn)生的抑制作用小于pd-l1對不包括編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列的至少一部分的t細胞的細胞因子產(chǎn)生的抑制作用。例如，pd-l1對本公開的經(jīng)遺傳修飾的t細胞的細胞因子產(chǎn)生的抑制作用足以減少pd-l1對不包括編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列的至少一部分的t細胞的細胞因子產(chǎn)生的抑制作用的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。在一些實施例中，經(jīng)遺傳修飾的t細胞包括編碼與野生型pd-1相比具有一個或多個點突變的經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列。例如，所述點突變包含野生型pd-1的磷酸化位點的一個或兩個氨基酸點突變。在某些實施例中，經(jīng)遺傳修飾的t細胞包括編碼經(jīng)修飾的pd-1且與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比包括一個或多個核苷酸的缺失的核酸序列。例如，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含seqidno:12或seqidno:14的核酸序列。實施例進一步涉及用于治療患者的疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本公開的工程化細胞。各種疾病可以根據(jù)本發(fā)明的方法加以治療，所述疾病包括癌癥，諸如卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌和白血病。在一些實施例中，所述方法包括向人患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包括抗腫瘤有效量的人t細胞群，其中所述人t細胞群包括包含如在本公開中所描述的核酸序列的人t細胞?？芍委煹陌┌Y包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤，以及血管化的腫瘤。癌癥可包括非實體腫瘤(諸如血液性腫瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括實體腫瘤。利用本公開的car治療的癌癥的類型包括但不限于癌、胚細胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、以及惡性腫瘤,例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人腫瘤/癌癥和小兒腫瘤/癌癥。血液性癌癥為血液或骨髓的癌癥。血液性(或血源性)癌癥的實例包括白血病，包括急性白血病(諸如急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓細胞性白血病、前髓細胞性白血病、骨髓單核單核細胞性白血病、單核細胞性白血病和紅白血病)、慢性白血病(諸如慢性髓細胞(粒細胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細胞白血病)、真性紅細胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(不活躍形式和高等級形式)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合征、多毛細胞白血病和脊髓發(fā)育不良。實體腫瘤為通常不包含囊腫或液體區(qū)的組織的異常腫塊。實體腫瘤可為良性或惡性的。不同類型的實體腫瘤以形成它們的細胞類型命名(諸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。實體腫瘤(諸如肉瘤和癌)的實例包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴類惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和cns腫瘤(諸如神經(jīng)膠質瘤(諸如腦干神經(jīng)膠質瘤和混合性神經(jīng)膠質瘤)、成膠質細胞瘤(也稱為多形性成膠質細胞瘤)、星形細胞瘤、cns淋巴瘤、生殖細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤和腦轉移瘤)。通常，如本文所述的活化和擴增的細胞可以用于治療和預防免疫受損的個體出現(xiàn)的疾病。特別地，本公開的工程化細胞用于治療癌癥。在某些實施例中，本公開的細胞用于治療處于發(fā)展成癌癥的風險中的患者。因此，本公開提供用于治療或預防癌癥的方法，所述方法包含向需要其的受試者施用治療有效量的本公開的工程化t細胞。本公開的工程化t細胞可被單獨施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其它成分(諸如il-2或其它細胞因子或細胞群)結合施用。簡單地說，本公開的藥物組合物可包括如本文所述的靶細胞群，與一種或多種藥學或生理學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑結合。這樣的組合物可包括：緩沖液，諸如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等等；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或氨基酸，諸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如edta或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；以及防腐劑。本公開的組合物優(yōu)選配制成用于靜脈內(nèi)施用。本公開的藥物組合物可以以適于待治療(或預防)的疾病的方式施用。施用的量和頻率將由以下因素確定，諸如患者的病癥、以及患者疾病的類型和嚴重度，盡管適當?shù)膭┝靠捎膳R床試驗確定。當指出“免疫學有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤抑制有效量”或“治療量”時，待施用的本公開的組合物的精確量可由醫(yī)師通過考慮個體的年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移的程度，以及患者(受試者)的狀態(tài)的差異而確定?？梢愿爬ǖ卣f：包含本文所描述的t細胞的藥物組合物可以以104至109個細胞/kg體重的劑量，優(yōu)選105至106個細胞/kg體重的劑量施用,包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值。t細胞組合物也可以以這些劑量多次施用。所述細胞可以通過使用免疫療法中通常已知的輸液技術施用(參見例如rosenberg等人，新英格蘭醫(yī)學雜志319:1676，1988年)。對于特殊患者的最佳劑量和治療方案可由醫(yī)學領域技術人員通過監(jiān)測患者的疾病跡象并相應地調節(jié)治療容易地確定。在某些實施例中，可能期望向受試者施用活化的t細胞，并且隨后重新抽取血液(或進行單采血液成分術)，根據(jù)本公開活化來自其中的t細胞，并且將這些活化和擴增的t細胞再輸給患者。該過程可每幾周進行多次。在某些實施例中，t細胞可通過10cc至400cc的血液抽取來進行活化。在某些實施例中，t細胞通過20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取來進行活化。不受理論所束縛，利用這種多次血液抽取/多次再輸液方案可選出某些t細胞群。受試者組合物的施用可以以任何方便的方式進行，包括通過霧化吸入、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可經(jīng)皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個實施例中，本公開的t細胞組合物通過皮內(nèi)或皮下注射施用給患者。在另一個實施例中，本公開的t細胞組合物優(yōu)選地通過i.v.注射施用。t細胞的組合物可被直接注射到腫瘤、淋巴結或感染部位中。在本公開的某些實施例中，利用本文所描述的方法或本領域已知的其它方法活化和擴增的細胞(其中t細胞被擴增至治療水平)與任何數(shù)量的相關治療方式結合(例如，在其之前、同時或之后)施用給患者，所述相關治療方式包括但不限于用試劑進行治療，諸如抗病毒療法、西多福韋和白細胞介素-2、阿糖胞苷(也稱為ara-c)或對ms患者的那他珠單抗治療或對牛皮癬患者的依法利珠單抗治療或對pml患者的其它治療。在進一步的實施例中，本公開的t細胞可與以下各項結合使用：化療、輻射、免疫抑制劑(諸如環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和fk506)、抗體，或其它免疫燒蝕劑(諸如campath、抗-cd3抗體或其它抗體療法、細胞毒素、氟達拉濱、環(huán)孢菌素、fk506、雷帕霉素、麥考酚酸、類固醇類、fr901228、細胞因子和輻射。這些藥物抑制鈣依賴性的磷酸酶鈣調磷酸酶(環(huán)孢菌素和fk506)或抑制對生長因子誘導的信號傳導重要的p70s6激酶(雷帕霉素)。(liu等人，《細胞(cell)》66:807-815，1991；henderson等人，《免疫(immun.)》73:316-321，1991年；bierer等人，《免疫學新觀點(curr.opin,immun.)》5:763-773，1993年；isoniemi(同上))。在進一步的實施例中，本公開的細胞組合物與骨髓移植、利用化療劑(諸如氟達拉濱)的t細胞燒蝕療法、外部光束放射療法(xrt)、環(huán)磷酰胺，或抗體(諸如okt3或campath)結合(例如，在其之前、同時或之后)施用給患者。在另一個實施例中，本公開的細胞組合物在b-細胞燒蝕療法(諸如與cd20反應的試劑，例如rituxan)之后進行施用。例如，在一個實施例中，受試者可經(jīng)歷高劑量化療的標準治療，之后進行外周血液干細胞移植。在某些實施例中，在移植后，受試者接受本公開的擴增的免疫細胞的輸注。在一個附加的實施例中，擴增的細胞在外科手術之前或之后施用。施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療病癥的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據(jù)本領域接受的實踐實施。例如，campath的劑量對于成人患者通常將在1至約100mg的范圍中，通常每天施用，持續(xù)1至30天。盡管在一些情況下可以使用高達40mg/天的較大劑量，但優(yōu)選的日劑量為1至10mg/天(在美國專利號6,120,766中描述，所述專利全文引入作為參考)。在美國專利號us8,906,682中提供了關于使用工程化t細胞治療癌癥的方法的其它信息，所述專利全文引入作為參考。實施例進一步涉及治療和/或抑制受試者的癌癥的方法。該方法包括向受試者施用治療有效量的可溶性受體，所述可溶性受體包括pd-1的胞外結構域。在一些實施例中，所述可溶性受體結合pd-l1蛋白質，并且可溶性受體破壞癌細胞的pd-1信號傳導和/或破壞pd-1與pd-l1的結合。在某些實施例中，分離的可溶性受體多肽包括seqidno:9的氨基酸殘基20-519。“可溶性受體”是不與細胞膜結合的受體多肽。可溶性受體是缺乏跨膜結構域和胞質結構域的最常見的配體結合受體多肽?？扇苄允荏w可包括附加的氨基酸殘基，諸如用于多肽的純化或為多肽與底物粘附提供位點的親和標簽，或免疫球蛋白恒定區(qū)序列。許多細胞表面受體具有天然存在的由蛋白水解產(chǎn)生的可溶性對應物。當可溶性受體多肽缺乏分別提供膜錨定或信號轉導的足夠的跨膜和胞內(nèi)多肽區(qū)段的部分時，它們被認為是基本上不含跨膜和胞內(nèi)多肽區(qū)段。實施例進一步涉及包括受體多肽的經(jīng)修飾的細胞，所述受體多肽的胞質結構域被截斷，所述受體多肽是程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)受體多肽、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白質4(ctla-4)受體多肽，或者b和t淋巴細胞衰減因子(btla)受體的至少一種。實施例進一步涉及一種用于治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括向患有疾病的受試者施用細胞，其中所述細胞經(jīng)遺傳修飾以表達：受體多肽，所述受體多肽的胞質結構域被截斷，所述受體多肽是程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)受體多肽、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白質4(ctla-4)受體多肽，或者b和t淋巴細胞衰減因子(btla)受體的至少一種；以及包括特異性抗體的抗原識別結構域和胞內(nèi)結構域的嵌合抗原受體(car)或者經(jīng)修飾的或野生型t細胞受體，所述特異性抗體與抗原結合。在一些實施例中，所述受體多肽是pd-1受體多肽，并且其中所述pd-1受體多肽的胞質結構域含有基于免疫受體酪氨酸的基序。實施例進一步涉及相比于相應的野生型細胞包括減少量的一種或多種受體的經(jīng)修飾的細胞，所述一種或多種受體包括程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白質4(ctla-4)，或者b和t淋巴細胞衰減因子(btla)中的至少一種。實施例進一步涉及一種用于治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括向患有疾病的受試者施用細胞，其中，與相應的野生型細胞相比，所述細胞經(jīng)修飾以表達減少量的一種或多種受體，所述一種或多種受體包括程序性細胞死亡蛋白質1(pd-1)、細胞毒性t淋巴細胞相關蛋白質4(ctla-4)，或者b和t淋巴細胞衰減因子(btla)中的至少一種。在一些實施例中，經(jīng)修飾的細胞進一步包括：包括特異性抗體的抗原識別結構域和胞內(nèi)結構域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細胞受體。在某些實施例中，經(jīng)修飾的細胞進一步包括：包括特異性抗體的抗原識別結構域和胞內(nèi)結構域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細胞受體，所述特異性抗體與抗原結合。在一些實施例中，與相應的野生型細胞相比，經(jīng)修飾的細胞具有一個或多個基因的降低的表達，所述一個或多個基因的降低的表達與一種或多種受體的生物合成途徑或輸送途徑或其組合相關聯(lián)。在某些實施例中，經(jīng)修飾的細胞包括一個或多個基因的破壞。在某些實施例中，經(jīng)修飾的細胞包括一個或多個基因的部分或完全缺失。在某些實施例中，經(jīng)遺傳修飾的細胞在人患者體內(nèi)復制。在一些實施例中，經(jīng)修飾的細胞形成人患者的記憶細胞。在這些情況下，經(jīng)修飾的細胞經(jīng)靜脈內(nèi)施用給人患者。在某些實施例中，經(jīng)修飾的細胞持續(xù)存在人患者中。例如，經(jīng)修飾的細胞是自體t細胞。對于另一個實例，細胞可以包括b細胞、t細胞、nk細胞、胚胎細胞或樹突細胞中的至少一種。在一些實施例中，所述疾病可以包括癌癥、免疫缺陷、自身免疫性疾病，或肥胖癥中的至少一種。實例通過參考以下實例進一步描述本公開。提供這些實例僅用于說明的目的，且并非旨在限制，除非另有說明。因此，本公開不應當以任何方式被解釋為限于以下實例，而是應當被解釋為包括由于本文所提供的教導而變得明顯的任何和所有變化。實例1car和pd-1在hek293t和k562細胞上的表達生成編碼由腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進入序列分離的cd19car和經(jīng)修飾的pd-1的慢病毒載體(參見通過引用并入本文中的《t細胞的包含cd137信號轉導結構域介導增強的存活率的嵌合受體和增加的抗白血病療效的體內(nèi)分子療法(chimericreceptorscontainingcd137signaltransductiondomainsmediateenhancedsurvivaloftcellsandincreasedantileukemicefficacyinvivomoleculartherapy)》，第17卷，第8期，1453–1464，2009年8月)。圖1和表1中提供了編碼car和經(jīng)修飾的pd-1的dna構建體的信息。在表1-3中列出了這些構建體和模塊的總結。表1dna構建體和編碼模塊hek293t和k562細胞用慢病毒載體轉導。進行流式細胞獲取并分析以確定car和pd-1在這些細胞中的表達。如圖2a和圖2b所示，keck293t和k562細胞表達car(參見圖2a中的方框)和pd-1(參見圖2b中的方框)。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc；弗吉尼亞州馬納薩斯)獲得hek293t和k562細胞。與細胞培養(yǎng)物、慢病毒載體的構建，以及流式細胞術有關的技術可以在通過引用并入本文中的以下文獻中找到：《t細胞的包含cd137信號轉導結構域介導增強的存活率的嵌合受體和增加的抗白血病療效的體內(nèi)分子療法，第17卷，第8期，1453–1464，2009年8月，所述文獻通過引用并入本文。表2各種構建體的序列標識符seqidno:#標識符seqidno:1p0(核酸序列)seqidno:2p1(核酸序列)seqidno:3p2(核酸序列)seqidno:4p3(核酸序列)seqidno:5p4(核酸序列)seqidno:6ires元件(核酸序列)seqidno:7pdl1-ires-egfp(核酸序列)seqidno:8pd-1信號肽(氨基酸序列)seqidno:9pd-1胞外結構域(氨基酸序列)seqidno:10pd-1跨膜結構域(氨基酸序列)seqidno:11p1：添加的親水性鏈段seqidno:12p2：pd-1胞內(nèi)結構域殘基(氨基酸序列)seqidno:13p3：pd-1胞內(nèi)結構域殘基(氨基酸序列)seqidno:14p4：pd-1胞內(nèi)結構域殘基(氨基酸序列)seqidno:15p2：pd-1胞內(nèi)結構域的移除部分(氨基酸序列)seqidno:16p4：pd-1胞內(nèi)結構域的移除部分(氨基酸序列)實例2car和pd-1在原代t細胞上的表達從患者獲得原代t細胞。所獲得的原代t細胞用慢病毒載體轉導。進行流式細胞獲取并分析以確定car和pd-1在原代t細胞中的表達。如圖3a、圖3b和圖3c所示，原代t細胞表達car(參見圖3a中的方框)和pd-1(參見圖3b和圖3c中的方框)。與細胞培養(yǎng)物、慢病毒載體的構建，以及流式細胞術有關的技術可以在以下文獻中找到：《利用包含cd28和cd137結構域的經(jīng)遺傳重新靶向的人t細胞控制大的、所建立的腫瘤異種移植物(controloflarge，establishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumantcellscontainingcd28andcd137domains)》，3360–3365pnas，2009年3月3日，第106卷，第9期，所述文獻通過引用并入本文。表3序列實例3細胞毒性t淋巴細胞測定在該測定中，通過將用效應子細胞培養(yǎng)的靶細胞(即，轉導的t細胞)的存活率與用陰性對照細胞培養(yǎng)的靶細胞(即，非轉導的t細胞)的存活率進行比較來測定對靶細胞(即，k562-cd19)的細胞毒性。將靶細胞和效應子細胞或陰性對照細胞培養(yǎng)約24小時，其中靶細胞與效應子細胞或陰性對照細胞之間的數(shù)量比為約10：1。測定靶細胞的存活率和轉導的t細胞和非轉導的t細胞的ifn-γ的產(chǎn)生。如圖4a和圖4b所示，含有編碼car和各種pd-1的核酸序列的轉導的t細胞能夠釋放ifn-γ并且殺死cd19細胞。所有的誤差條代表標準偏差。與細胞培養(yǎng)物、細胞毒性t淋巴細胞測定的構建有關的技術可以在以下文獻中找到：《利用包含cd28和cd137結構域的經(jīng)遺傳重新靶向的人t細胞控制大的、所建立的腫瘤異種移植物(controloflarge，establishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumantcellscontainingcd28andcd137domains)》，3360–3365pnas，2009年3月3日，第106卷，第9期，所述文獻通過引用并入本文。實例4pd-l1-ires-egfpnalm-6細胞系的構建生成編碼pd-l1-ires-egfp(seqidno:7)的慢病毒載體。nalm-6細胞用慢病毒載體轉導為moi為30或moi為100的t細胞。進行流式細胞獲取并分析以確定car和pd-1在這些細胞中的表達。如圖5所示，nalm-6pd-l1表達pd-l1。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc；弗吉尼亞州馬納薩斯)獲得nalm-6細胞。與細胞培養(yǎng)物、慢病毒載體的構建，以及流式細胞術有關的技術可以在以下文獻中找到：《利用mrna工程t細胞治療小鼠的晚期白血病。人類基因療法(treatmentofadvancedleukemiainmicewithmrnaengineeredtcells。humangenetherapy)》，22:1575–1586(2011年12月),所述文獻通過引用并入本文。實例5由pd-l1誘導的細胞毒性的抑制作用在用car和經(jīng)修飾的pd-1轉導的t細胞上降低將靶細胞(即，表達pd-l1的nalm-6或nalm-6)和各種效應子細胞(即，轉導的t細胞)或陰性對照細胞(即，非轉導的t細胞)培養(yǎng)約24小時，其中靶細胞與效應子細胞或陰性對照細胞的數(shù)量比為約10：1。測定轉導的t細胞的ifn-γ產(chǎn)生。如圖6a和圖6b所示，cart細胞的ifn-γ產(chǎn)生降低，這表明pd-l1在nalm-6細胞上的表達造成細胞毒性損失。進一步地，與不包括經(jīng)修飾的pd-1的cart細胞相比，由pd-l1誘導的細胞毒性的損失在用經(jīng)修飾的pd-1轉導的cart細胞上下降。例如，用car和具有點突變的pd-1(即，p3)轉導的t細胞的細胞毒性的損失為約22％，其比不包括經(jīng)修飾的pd-1(即，p0)的cart細胞低43％。這表明，由pd-l1誘導的細胞毒性的抑制作用在用car和經(jīng)修飾的pd-1轉導的t細胞上降低。所有的誤差條代表標準偏差。與細胞培養(yǎng)物、細胞毒性t淋巴細胞測定的構建有關的技術可以在以下文獻中找到：《t細胞的包含cd137信號轉導結構域介導增強的存活率的嵌合受體和增加的抗白血病療效的體內(nèi)分子療法》，第17卷，第8期，1453–1464，2009年8月，所述文獻通過引用并入本文。當前第1頁12