專利名稱：含有來自乙肝病毒x蛋白的肽抗原的脂質(zhì)體的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及其中含有新型肽抗原的脂質(zhì)體，這些肽抗原在調(diào)節(jié)人體針對乙肝病毒(HBV)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，更具體地說，本發(fā)明涉及對應(yīng)于來自HBV X蛋白中抗原表位的肽類群，這些肽能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對上述病毒的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(“CTL”)或免疫耐受性；本發(fā)明還涉及含有所述肽類群的pH-敏感性脂質(zhì)體，所述肽類群能夠激發(fā)細(xì)胞免疫從而產(chǎn)生特異于上述病毒的CTL。
現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)人體受HBV感染時，會激發(fā)各種生理反應(yīng)來清除該病毒。在這些反應(yīng)中，最重要的反應(yīng)之一就是破壞或清除已受感染的細(xì)胞，最終導(dǎo)致病毒感染的恢復(fù)。已受感染細(xì)胞的破壞離不開另一種被成為CTL的具有細(xì)胞毒性的細(xì)胞。CTL展示細(xì)胞毒性的前提條件是它們必須首先識別入侵病毒蛋白中的一些肽。通常，病毒蛋白在受感染細(xì)胞內(nèi)合成，然后通過細(xì)胞內(nèi)的降解過程轉(zhuǎn)化為含8～15個氨基酸的短肽。因此，當(dāng)上述的一些肽與胞內(nèi)主要組織相容性復(fù)合體(“MHC”)以結(jié)合體的形式出現(xiàn)在細(xì)胞表面時，CTL能夠識別它們從而破壞受感染的細(xì)胞。另一方面，MHC分為Ⅰ類和Ⅱ類MHC，與Ⅱ類MHC相比，已知Ⅰ類MHC在誘導(dǎo)CTL方面發(fā)揮重要作用。但是，有報(bào)道指出在病毒蛋白降解產(chǎn)生的眾多肽中，能夠?yàn)镃TL所識別的蛋白(肽)的位點(diǎn)僅限于其中含有特異性氨基酸序列的肽(參見Fremont，D.等人，《科學(xué)》257919-926(1992)；Matsumura，M.等人，《科學(xué)》257929-934(1992))。
因此，發(fā)現(xiàn)這些特異性位點(diǎn)的氨基酸序列就可以化學(xué)合成并制備出具有相應(yīng)氨基酸序列的肽，所以可以用這些肽人工誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠特異性地識別人體內(nèi)肝炎病毒的CTL或者調(diào)節(jié)免疫抑制等其他免疫應(yīng)答，從而有效地預(yù)防及治療由肝炎病毒誘發(fā)的疾病。
在這些認(rèn)識的基礎(chǔ)上，許多的研究人員都致力于從肝炎病毒蛋白降解產(chǎn)生的肽中發(fā)現(xiàn)能夠?yàn)镃TL所識別的肽的氨基酸序列。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個特異性的氨基酸序列，并預(yù)期會進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)更多的序列。此外，為了將這些肽應(yīng)用于肝炎-相關(guān)疾病的預(yù)防和治療中，就需要同時使用盡可能多的肽，這些肽的效能可能各不相同，這取決于肽的種類。因此，發(fā)現(xiàn)這些肽的氨基酸序列具有十分重要的意義。
現(xiàn)已報(bào)道過能被CTL識別并可用于預(yù)防和治療乙肝的肽主要來自HBV的S(表面抗原)蛋白和C(核心)蛋白。但是，盡管一系列使用轉(zhuǎn)基因小鼠的試驗(yàn)都清楚地揭示出X蛋白與HBV-相關(guān)的肝癌直接有關(guān)(參見Hoyhne等人，EMBO J.，91137-1145(1990)；Kim等人，《自然》，351317-320(1991))，但是至今來自X蛋白的肽還未見報(bào)道，X蛋白是一個HBV的抗原蛋白。
另一方面，當(dāng)磷脂分散在水中時，極性的頭部基團(tuán)朝向水，而疏水的尾部通過疏水作用聚集在一起，自發(fā)地形成雙層球狀密閉囊泡，稱為“脂質(zhì)體”。這樣的脂質(zhì)體已經(jīng)廣泛地用作藥物傳遞系統(tǒng)中的載體以及生物膜的研究模型(參見Lee，J.W.and Kim，H.，Arch.Biochem.Biophys.，297354(1992)；Hahn，K.H.and Kim，H.，生物化學(xué)雜志，110635(1991)；Yun，C.H.and Kim，H.，生物化學(xué)雜志，105406(1989)；Kim，J.and Kim，H.，《生物化學(xué)》，257867(1986)；Kim，J.and Kim，H.，韓國生物化學(xué)雜志，18403(1985))。
最近，已有報(bào)道說脂質(zhì)體可以用于免疫學(xué)領(lǐng)域，從而加速了用脂質(zhì)體作為疫苗或佐劑的載體的研究(參見Rooijen，NV.，《疫苗》，111170(1993))。通常，當(dāng)靜脈內(nèi)注入脂質(zhì)體時，它們很容易被血液中富含的巨噬細(xì)胞(“MO”)捕獲，巨噬細(xì)胞在脂質(zhì)體抗原的加工以及抗原的免疫處理工程中發(fā)揮著重要的作用。
另外，可以用于誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的方法最近已發(fā)展起來，CTL應(yīng)答特異性地針對pH-敏感性脂質(zhì)體中所使用的特定蛋白或肽(參見Readdy，R.等人，免疫方法雜志，141157(1991)；Zhou，F(xiàn).等人，免疫方法雜志，145143(1991)；Nair，S.等人，J.Exp.Med.，175609(1992)；Harding，C.V.等人，免疫學(xué)雜志1472860(1991)；Zhou，F(xiàn).and Huang，L.，《疫苗》，111139(1993))，而且pH-敏感性脂質(zhì)體已被廣泛地用作蛋白或肽抗原的載體及佐劑系統(tǒng)，用來制備亞單位疫苗。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明人已經(jīng)報(bào)道了一種用于制備pH-敏感性脂質(zhì)體的方法，該脂質(zhì)體允許抗癌藥物的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)(參見Choi，M.J.等人，生物化學(xué)雜志，112694(1992))。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，在來自HBVX蛋白的眾多肽中，提供了一系列可被CTL特異性識別的肽。而且，還提供了其中含有來自HBV X蛋白的肽抗原的pH-敏感性脂質(zhì)體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述脂質(zhì)體可以用于開發(fā)上述治療性制劑，該試劑通過激發(fā)細(xì)胞免疫而生成特異于上述HBV肽抗原的CTL，從而達(dá)到預(yù)防和治療HBV-相關(guān)疾病的目的。
因此，本發(fā)明的一個主要目的是提供來自HBV X蛋白的肽抗原，該肽抗原可被CTL識別并對病毒表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。
本發(fā)明的另一個目的是提供pH-敏感性脂質(zhì)體，其中含有上述能夠激發(fā)細(xì)胞免疫的肽抗原。
附圖簡述結(jié)合附圖，可以從下列給出的描述中清楚地理解出本發(fā)明的上述及其他目的和特征，其中


圖1顯示了在T2細(xì)胞表面表達(dá)的MHC Ⅰ類分子的變化，用熒光強(qiáng)度來表示。
圖2圖示了CTL針對T2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
圖3(A)顯示的是用人肝細(xì)胞癌接種的裸鼠的致瘤性。
圖3(B)顯示的是，在以來自HBV X蛋白的肽抗原激發(fā)的CTL處理后裸鼠中的腫瘤清除情況。
發(fā)明詳述基于此前發(fā)現(xiàn)的結(jié)合到MHC Ⅰ類分子上的肽具有特異性的氨基酸序列，從HBV X蛋白的全長氨基酸序列中，測定出具有結(jié)合MHC Ⅰ類分子潛能的肽的序列。也就是說，由于能夠結(jié)合HLA-A2這樣一種人MHC Ⅰ類分子的肽在C-末端或N-端第二位上具有亮氨酸、纈氨酸或異亮氨酸(參見Matsumura，M.等人，《科學(xué)》，257929-934(1992))，所以從HBV X蛋白的全長氨基酸序列中篩選出滿足上述條件的氨基酸序列，在該分子三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，從HBV X蛋白降解后產(chǎn)生的眾多肽中，選擇出具有結(jié)合HLA-A2潛能的肽，即能夠通過結(jié)合人MHCⅠ類分子而激發(fā)CTL應(yīng)答的肽抗原(參見下列表1)。然后，根據(jù)這樣測定出的氨基酸序列，化學(xué)合成出肽。下列表1中給出了來自HBVX蛋白的肽，即X3、X4、XS、X6和X7的氨基酸序列。
表1HBV X蛋白降解后產(chǎn)生的肽中可被CTL識別的肽的位置及氨基酸序列
*氨基酸序列根據(jù)IUPAC-IBU命名系統(tǒng)縮寫。
本發(fā)明不僅包括上述9個氨基酸組成的肽，而且還包括在這些肽的N-或C-末端添加1～5個氨基酸得到的肽以及它們的功能等同物。在本發(fā)明中，“功能等同物”一詞可以用來指代在上述肽的氨基酸序列中取代1或2個氨基酸后得到的所有的肽。例如，取代包括下列的氨基酸組合，例如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和，Phe，Tyr。
為了制備出其中含有來自HBV X蛋白的肽抗原的pH-敏感性脂質(zhì)體，按照6∶4～8∶2，最優(yōu)選7∶3的摩爾比混合磷脂酰乙醇胺-β-油?；?γ-棕櫚酰(POPE)和膽甾醇半琥珀酸酯(CHOH)，或者按照3∶3∶4～4∶4∶2，最優(yōu)選3.5∶3.5∶3的摩爾比混合POPE、磷脂酰乙醇胺(PE)和CHOH，最終形成磷脂薄膜。然后，把這些制備得到的脂質(zhì)體加入到含有上述來自HBV X蛋白的肽抗原的緩沖溶液中。在這一點(diǎn)上，通過采用摩爾比為1∶5～1∶25，最優(yōu)選1∶20，來混合一種或多種肽抗原和磷脂而制備出含有上述來自HBV X蛋白的肽抗原的脂質(zhì)體。根據(jù)本發(fā)明制備的pH-敏感性脂質(zhì)體還可以進(jìn)一步包括上限為1摩爾％的單磷酰脂質(zhì)A作為磷脂。
本發(fā)明的脂質(zhì)體囊括了能激發(fā)人CTL應(yīng)答的肽抗原，可用作這些肽的載體的pH-敏感性脂質(zhì)體也能夠激發(fā)出特異性地針對病毒的CTL應(yīng)答，上述被囊括入脂質(zhì)體中的肽來自該病毒。自然地，這已經(jīng)清楚地表明含有上述肽的pH-敏感性脂質(zhì)體能夠激發(fā)人的細(xì)胞免疫。
在描述本發(fā)明肽的氨基酸序列時，采用了按IUPAC-IUB標(biāo)準(zhǔn)縮寫成的單字母符號，具體如下氨基酸符號丙氨酸 A精氨酸 R天冬酰胺N天冬氨酸D半胱氨酸C
谷氨酰胺Q谷氨酸 E甘氨酸 G組氨酸 H異亮氨酸I亮氨酸 L賴氨酸 K甲硫氨酸M苯丙氨酸F脯氨酸 P絲氨酸 S蘇氨酸 T色氨酸 W酪氨酸 Y纈氨酸 V下列實(shí)施例對本發(fā)明做了進(jìn)一步說明，但這不應(yīng)該被理解為對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1對X蛋白中具有結(jié)合MHC分子潛能的肽進(jìn)行測定由于能夠結(jié)合HLA-A2這樣一種人MHC Ⅰ類分子的肽在C-末端或N-端第二位上具有亮氨酸、纈氨酸或異亮氨酸(參見Matsumura，M.等人，《科學(xué)》257929-934(1992))，所以首先從HBV X蛋白的全長氨基酸序列中篩選出滿足上述條件的氨基酸序列，根據(jù)該分子三維結(jié)構(gòu)，最終選擇出具有結(jié)合HLA-A2潛能的肽(參見上述表1)。然后，根據(jù)這樣測定出的氨基酸序列，按照本領(lǐng)域已知常規(guī)方法進(jìn)行所述肽的化學(xué)合成。實(shí)施例2肽的合成以及對它們與MHC分子結(jié)合能力的測定化學(xué)合成來自HBV X蛋白的7個不同的肽，其中包括表1中列出的那些肽，并將它們?nèi)芙庠诹姿猁}緩沖液(下文稱為“PBS”)中。為了研究這些肽能否結(jié)合與CTL誘導(dǎo)相關(guān)的MHC Ⅰ類分子，分別以100、64、32、16、8、4、2和1μg/ml的濃度，將各種肽添加到T2細(xì)胞系，然后在37℃反應(yīng)4小時。然后，用PBS洗滌細(xì)胞以除去未反應(yīng)的肽，加入抗HLA-A2.1(一種人MHC Ⅰ類分子)的BB7.2抗體，然后再在4℃反應(yīng)1小時。再用PBS洗滌細(xì)胞，加入異硫氰酸熒光素(FITC)-偶聯(lián)的抗-小鼠免疫球蛋白抗體，然后于4℃反應(yīng)1小時。然后，用熒光細(xì)胞計(jì)(FACScan，BECTON DICKINSON)測定細(xì)胞的熒光，結(jié)果見圖1。
如圖1所示，發(fā)現(xiàn)在T2細(xì)胞表面上X3、X4、X5、X6和X7等5個肽成功地結(jié)合到MHC Ⅰ類分子上。試驗(yàn)中使用的肽見下列表2。
表2合成肽的氨基酸序列
*氨基酸序列根據(jù)IUPAC-IBU分子系統(tǒng)縮寫。
試驗(yàn)中所使用的T2細(xì)胞系在肽的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中出現(xiàn)紊亂，因而使MHC Ⅰ類分子與肽不能正確結(jié)合而產(chǎn)生不穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)，因而導(dǎo)致正常生長溫度37℃培養(yǎng)過程中MHC分子的低水平表達(dá)。但是，當(dāng)在含有能結(jié)合MHC分子的肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)T2細(xì)胞時，這些肽與T2細(xì)胞表面上的MHC分子結(jié)合從而增強(qiáng)了MHC分子的穩(wěn)定性，這樣導(dǎo)致MHC分子表達(dá)量的增加。由于有了這些知識，所以通過測定BB7.2抗體與細(xì)胞表面的結(jié)合程度，就可以分析出特定肽與T2細(xì)胞表面MHC分子的結(jié)合水平。實(shí)施例3測定CTL對肽的識別特定肽與MHC分子結(jié)合并不能證明該肽已被CTL識別。因此，為了研究實(shí)施例2中用于測定結(jié)合MHC的肽是否真正被能在人體內(nèi)識別HBV的CTL所識別，做了進(jìn)一步的試驗(yàn)。
也就是說，從普通的血液供體中采集抗-HBV抗體陽性(ELISA得到的數(shù)值1.0或更大)的血樣并離心收獲血細(xì)胞。除去血細(xì)胞中的紅細(xì)胞后，向留下的白細(xì)胞中，按10μg/ml的濃度加入上述的肽，然后在CO2溫箱中37℃溫育，溫箱中CO2濃度恒定在5％。培養(yǎng)2天后，向培養(yǎng)基中加入10個單位的白介素-2，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3天。然后，用絲裂霉素C滅活具有同樣MHC的血細(xì)胞，并將其加入培養(yǎng)基中作為刺激細(xì)胞。接著向培養(yǎng)基中加入上述的肽和白介素-2，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞7天。然后測定血細(xì)胞是否識別并破壞了表面具有特定肽的T2細(xì)胞，下面的表3及圖2中分別給出了這些結(jié)果。
Table 3肽-特異性T細(xì)胞針對被合成肽致敏的靶細(xì)胞所表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性
*CTL與靶細(xì)胞之比按照下列描述測定培養(yǎng)后的血細(xì)胞對T2細(xì)胞的破壞向T2細(xì)胞加入100μg/ml的肽，然后于37℃反應(yīng)3小時。然后充分洗滌細(xì)胞以除去未反應(yīng)的肽，加入放射性標(biāo)記后的鉻酸鈉(Cr51)，在CO2溫箱中于37℃反應(yīng)2小時。然后，將它們用RPMI培養(yǎng)液充分洗滌以除去未反應(yīng)的鉻酸鈉，再按一定比例與用PBS洗過的血細(xì)胞混合，并于37℃在CO2溫箱中反應(yīng)4小時。收集反應(yīng)后的培養(yǎng)基，測量γ射線的強(qiáng)度，從而測定出血細(xì)胞針對T2細(xì)胞，即靶細(xì)胞所表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性。
從上述的表3中可以看出，研究發(fā)現(xiàn)X3、X4、X5、X6、X7和P5被培養(yǎng)后的血細(xì)胞識別，其中P5是作為陽性對照的已知肽(參見Nayersina，R.等人，免疫學(xué)雜志，1504659-4671(1993))，這一結(jié)果表明本發(fā)明實(shí)施例中使用的試驗(yàn)方法是穩(wěn)定的。實(shí)施例4含有肽抗原的pH-敏感性脂質(zhì)體的制備將由POPE/CHOH(摩爾比為7∶3)或者POPE/PE/CHOH(摩爾比為3.5∶3.5∶3)組成的磷脂加入到玻璃小瓶并溶解到有機(jī)溶劑中。然后，向小瓶中導(dǎo)入氮?dú)猓敝列∑恐行纬芍|(zhì)薄膜。然后把要被囊括的含肽緩沖液(pH 8.0)加入到脂質(zhì)薄膜以實(shí)現(xiàn)充分水合，劇烈振蕩制備出多層囊泡(“MLV”)，用超聲處理MLV，從中制備出單層囊泡(“SUV”)。將這樣得到的SUV在室溫下溫育2～12個小時，用液氮快速冷凍上述的SUV，然后室溫下緩慢融化，重復(fù)上述操作3～4次，制備出含有肽的脂質(zhì)體。因此，以1∶20的摩爾比混合肽和磷脂，最終制備成脂質(zhì)體。在此實(shí)例中，使用的肽是來自HBV X蛋白的肽抗原，并且能夠通過結(jié)合MHC Ⅰ類分子激發(fā)CTL應(yīng)答(見上述表1)。
下面對制備到的脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性和pH-敏感性進(jìn)行研究，與傳統(tǒng)的pH-敏感性脂質(zhì)體相比，本發(fā)明的脂質(zhì)體經(jīng)乙醇處理后僅出現(xiàn)輕微的破壞，脂質(zhì)體內(nèi)容物僅有極少的滲漏(1)物理穩(wěn)定性的測定向脂質(zhì)體溶液中加入乙醇，此時通過測量濁度的變化來測定如上制備的脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性。由于乙醇處理能破壞脂質(zhì)體，導(dǎo)致濁度減小，所以可以通過測量400nm的吸光度來測定出脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)含有本發(fā)明所述肽的脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性高于傳統(tǒng)的pH-敏感性脂質(zhì)體。
(2)pH-敏感性的測定將下述物質(zhì)囊括入含有所述肽的脂質(zhì)體中12.5mM 8-氨基亞萘基-1，3，6-三磺酸二鈉鹽(ANTS)、45mM對二甲苯雙吡啶鎓溴化物(DPX)、68mM NaCl和10mM HEPES緩沖溶液(pH 8.0)，用SephadexG-50柱(1x20cm)層析除去未被囊括的ANTS和DPX，只收集脂質(zhì)體溶液。用Vaskovsky′s方法(參見Vaskovsky，V.E.，Kostetsky，E.Y.andVasendin，I.M.，色譜學(xué)雜志，114129(1975))測定出脂質(zhì)體中磷脂的濃度。
在測定pH-敏感性的試驗(yàn)中，把通過柱體的脂質(zhì)體溶液的熒光強(qiáng)度定義為“0％滲漏度”把經(jīng)Triton X-100破壞后脂質(zhì)體溶液的滲漏度定義為“100％滲漏度”。向2ml pH值各不相同(7.5、6.9、6.4、5.9、5.4、4.9和4.5)的緩沖溶液中加入濃縮后的脂質(zhì)體(30μM)，于37℃靜置30分鐘。然后，通過測量熒光，測定出pH-敏感性。在此實(shí)驗(yàn)中，用分光熒光計(jì)(FP-777，JASCO，Japan)在360nm激發(fā)波長和545nm發(fā)射波長處測量熒光。
結(jié)果表明，與作為對照的常規(guī)pH-敏感性脂質(zhì)體相比(～80％)，含有本發(fā)明所述肽的脂質(zhì)體表現(xiàn)出脂質(zhì)體內(nèi)容物滲漏度較低(～20％)。實(shí)施例5用含肽的pH-敏感性脂質(zhì)體誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為了研究作為肽的載體的pH-敏感性脂質(zhì)體是否能激發(fā)特異性地針對作為肽來源的病毒的CTL應(yīng)答，制備囊括有合成肽的pH-敏感性脂質(zhì)體，以系列方式進(jìn)行細(xì)胞毒性研究。由于能夠結(jié)合HLA-A2這樣一種人MHC Ⅰ類分子的肽的細(xì)胞免疫應(yīng)該使用人源抗體來研究，所以使用來自HIV和HCV蛋白并能結(jié)合小鼠MHC Ⅰ類分子的肽(參見下列表4)進(jìn)行間接試驗(yàn)。在這一點(diǎn)上，使用由POPE/CHOH(摩爾比為7∶3)組成的磷脂組合物所制備出的含有所述肽的pH-敏感性脂質(zhì)體。然后，用脂質(zhì)體免疫小鼠，從小鼠體內(nèi)分離出T淋巴細(xì)胞，測定識別Cr51標(biāo)記的靶細(xì)胞后T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
表4來自HIV和HCV蛋白的可被中和抗體和小鼠CTL識別的肽的氨基酸序列*
*氨基酸序列根據(jù)IUPAC-IBU分子系統(tǒng)縮寫。
1HIV gp120中第315-329位的氨基酸序列2HIV gp120中第304-329位的氨基酸序列3HCV核心蛋白中第131～138位的氨基酸序列就HIV而言，用含有R15K或T26K的pH-敏感性脂質(zhì)體免疫Balb/C小鼠，加強(qiáng)免疫后第4周，切割出小鼠的脾，用勻漿器將其勻化到2ml RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基中。取2ml上述勻漿加入到2ml菲可(ficoll)中，1，500rpm離心30分鐘。分離出位于菲可和細(xì)胞培養(yǎng)基之間的T淋巴細(xì)胞，加入到15ml RPMI-10培養(yǎng)基中，以1000rpm離心，并用RPMI-10培養(yǎng)基洗滌3次。將上述T淋巴細(xì)胞按5x106/ml的濃度稀釋到24孔-培養(yǎng)板中，加入免疫過的肽抗原至終濃度為2μM。然后在CO2溫箱中37℃溫育，其中CO2濃度恒定在5％。培養(yǎng)3天后，用作效應(yīng)器細(xì)胞。就HCV而言，用含有D8L肽抗原的脂質(zhì)體免疫5周齡的C57BL/6小鼠，然后用上述方法分離T淋巴細(xì)胞，用作效應(yīng)器細(xì)胞。另一方面，用具有與Balb/C小鼠相同MHC Ⅰ類分子的p815細(xì)胞(ATCC TIB64)作為HIV的靶細(xì)胞，用具有與C57BL/6小鼠相同MHC Ⅰ類分子的RMA細(xì)胞(參見Hosken，NA.and Bevan，M.J.，J.Exp.Med.，175719(1992))或EL4細(xì)胞(ATCC TIB39)作為HCV的靶細(xì)胞。
向每種靶細(xì)胞中加入100μM免疫肽，37℃反應(yīng)16小時，用RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌2遍。然后向細(xì)胞中加入放射性標(biāo)記的鉻酸鈉(Cr51)，在CO2溫箱中于37℃反應(yīng)2小時，反應(yīng)后，用RPMI細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞充分洗滌，并按下表5所示的各種混合比例與用磷酸鹽緩沖液洗滌過的效應(yīng)器細(xì)胞混合，然后再在CO2溫箱中于37℃反應(yīng)4小時。收集反應(yīng)后的培養(yǎng)基，測量γ射線強(qiáng)度，從而測定出效應(yīng)器細(xì)胞針對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性(參見表5)。
從表5中可以看出，從用R15K、T26K和D8L肽抗原免疫后的小鼠脾中分離到的效應(yīng)器細(xì)胞能夠識別和殺死靶細(xì)胞。而且，還發(fā)現(xiàn)采用pH-敏感性脂質(zhì)體，用使用了能激發(fā)CTL應(yīng)答的肽抗原免疫小鼠時，能夠誘導(dǎo)出可產(chǎn)生特異于病毒的CTL的細(xì)胞免疫。
表5針對靶細(xì)胞的肽-特異性CTL的細(xì)胞毒性
*靶細(xì)胞與效應(yīng)器細(xì)胞之比使用含來自HIV和HCV蛋白的肽的pH-敏感性脂質(zhì)體誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，從這種間接試驗(yàn)中可以清楚地看出含有來自HBV X蛋白的肽抗原的脂質(zhì)體能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，而細(xì)胞免疫又誘導(dǎo)人CTL應(yīng)答，這是由于來自HBV X蛋白的肽抗原能誘導(dǎo)人體內(nèi)CTL應(yīng)答(見實(shí)施例3)，而且含有這種肽的pH-敏感性脂質(zhì)體也能激發(fā)針對作為肽來源的病毒的CTL應(yīng)答。實(shí)施例6用HBx特異性T細(xì)胞根除人肝細(xì)胞癌又來自HBV X蛋白(即，HBx肽)的肽抗原激發(fā)的CTL是如何根除腫瘤的，下面就此進(jìn)行了研究以1x107～2x107不同的細(xì)胞數(shù)量將人肝癌細(xì)胞皮下接種以Balb/C為基礎(chǔ)的裸鼠，在該裸鼠上進(jìn)行致瘤性試驗(yàn)。3天后可檢測到腫瘤，5天后，按1.5x108細(xì)胞數(shù)目，將用HBx肽激發(fā)的CTL過繼轉(zhuǎn)移到以有腫瘤建成的小鼠的尾靜脈中(參見圖3(A))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理2天后腫瘤開始減小，處理后第4天腫瘤完全消失(參見圖3(B))。圖3(A)和3(B)中，(-●-)和(-▲-)分別代表用2x107和1x106個腫瘤細(xì)胞接種，T.P.代表CTL處理的時間點(diǎn)。
上述內(nèi)容清楚地表明，本發(fā)明提供了pH-敏感性脂質(zhì)體，其中含有對應(yīng)于來自HBV X蛋白中抗原表位的肽類群，這些肽能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對上述病毒的CTL或?qū)ι鲜霾《井a(chǎn)生免疫耐受，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生針對HBV的細(xì)胞免疫。由于X3、X4、X5、X6和X7等來自X蛋白的肽抗原能夠激活可識別人體內(nèi)出現(xiàn)的HBV抗原的CTL，而且也能被CTL識別，所以含有來自HBV X蛋白肽抗原的pH-敏感性脂質(zhì)體可以用于開發(fā)上述能用來預(yù)防和治療HBV-相關(guān)疾病的治療性制劑。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名牧巖生命工學(xué)研究所等(B)街道駒城面寶寧里341番地(C)城市京畿道龍仁市(D)州不適用(E)國家韓國(F)郵政編碼(ZIP)449-910(G)電話號碼02～741-0611(H)傳真0331-281-6622(ⅱ)發(fā)明名稱含有來自乙肝病毒X蛋白的肽抗原的脂質(zhì)體(ⅲ)序列數(shù)目10(ⅳ)電腦可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)電腦IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0.Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)
(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1His Leu Ser Leu Ary Gly Leu Phe Val15(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Val Leu His Lys Ary Thr Leu Gly Leu15(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅰ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala15(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu1 5(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe Val Leu15(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源
(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6Val Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala15(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸～(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7Thr Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala15(2)SEQ ID NO8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物HIV(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 10Gly Lys15(2)SEQ ID NO9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物HIV(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile1 5 10Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys15 20 25(2)SEQ ID NO10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈形無關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)無關(guān)(ⅱ)分子類型肽(ⅵ)最初來源(A)微生物HCV(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu1權(quán)利要求
1．一種來自乙肝病毒X蛋白的肽，這種肽被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識別而表現(xiàn)出針對乙肝病毒的細(xì)胞毒性，所述肽的氨基酸序列為(SEQ ID NO1)H L S L R G L F V
2．一種來自乙肝病毒X蛋白的肽，這種肽被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識別而表現(xiàn)出針對乙肝病毒的細(xì)胞毒性，所述肽的氨基酸序列為(SEQ ID NO2)V L H K R T L G L
3．一種來自乙肝病毒X蛋白的肽，這種肽被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識別而表現(xiàn)出針對乙肝病毒的細(xì)胞毒性，所述肽的氨基酸序列為(SEQ ID NO3)A M S T T D L E A
4．一種來自乙肝病毒X蛋白的肽，這種肽被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識別而表現(xiàn)出針對乙肝病毒的細(xì)胞毒性，所述肽的氨基酸序列為(SEQ ID NO4)C L F K D W E E L
5．一種來自乙肝病毒X蛋白的肽，這種肽被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識別而表現(xiàn)出針對乙肝病毒的細(xì)胞毒性，所述肽的氨基酸序列為(SEQ ID NO5)E I R L K V F V L
6．一種含有肽抗原的pH-敏感性脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體通過按5∶1～25∶1的摩爾比將磷脂和一種或多種肽混合制備而成，所述肽來自乙肝病毒X蛋白并且可被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識別而表現(xiàn)出針對乙肝病霉的細(xì)胞霉性。
7．權(quán)利要求6的pH-敏感性脂質(zhì)體，其中所述肽抗原選自HLSLRGLFV，VLHKRTLGL，AMSTTDLEA，CLFKDWEEL和EIRLKVFVL。
8．權(quán)利要求6的pH-敏感性脂質(zhì)體，其中所述磷脂含有50％或更多的磷脂酰乙醇胺-β-油酰基-γ-棕櫚酰。
9．權(quán)利要求6的pH-敏感性脂質(zhì)體，其中所述磷脂是通過以6∶4～8∶2的摩爾比將磷脂酰乙醇胺-β-油酰基-γ-棕櫚酰和膽甾醇半琥珀酸酯混合而制備的。
10．權(quán)利要求9的pH-敏感性脂質(zhì)體，其中所述磷脂通過進(jìn)一步包括上限為1摩爾％的單磷酰脂質(zhì)A制備而成。
11．權(quán)利要求6的pH-敏感性脂質(zhì)體，其中所述磷脂是通過以3∶3∶4～4∶4∶2的摩爾比將磷脂酰乙醇胺-β-油?；?γ-棕櫚酰、磷脂酰乙醇胺和膽甾醇半琥珀酸酯混合而制備的。
12．權(quán)利要求11的pH-敏感性脂質(zhì)體，其中所述磷脂通過進(jìn)一步包括上限為1摩爾％的單磷酰脂質(zhì)A制備而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及其中含有新型肽抗原的脂質(zhì)體,這些肽抗原在調(diào)節(jié)人體針對乙肝病毒(HBV)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用,更具體地說,本發(fā)明涉及對應(yīng)于來自HBVX蛋白中抗原表位的肽類群,這些肽能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對上述病毒的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(“CTL”)或免疫耐受:本發(fā)明還涉及含有所述肽類群的pH－敏感性脂質(zhì)體,所述肽類群能夠激發(fā)細(xì)胞免疫從而產(chǎn)生特異于上述病毒的CTL。由于X3、X4、X5、X6和X7等來自X蛋白的肽抗原能夠激活可識別人體內(nèi)出現(xiàn)的HBV抗原的CTL,而且也能被CTL識別,所以上述脂質(zhì)體可以用于開發(fā)能用來預(yù)防和治療HBV－相關(guān)疾病的治療性制劑。
文檔編號C07K14/02GK1286696SQ98813201
公開日2001年3月7日 申請日期1998年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月19日
發(fā)明者金泰演, 李起永, 張珍洙, 趙誠惟, 黃琉炅, 崔明俊, 鄭弘錫 申請人:牧巖生命工學(xué)研究所