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利用來(lái)源于藻類(lèi)的生理活性物質(zhì)的藥物、食品或飲料的制作方法

文檔序號(hào):3550909閱讀:364來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):利用來(lái)源于藻類(lèi)的生理活性物質(zhì)的藥物、食品或飲料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及來(lái)源于藻類(lèi)的生理活性物質(zhì)的用途,更具體的說(shuō)涉及以該生理活性物質(zhì)為有效成分的藥物、抗氧化劑、保鮮劑、化妝品、含有該生理活性組合物的功能性食品或飲料,另外還涉及功能性表達(dá)用糖。
背景技術(shù)
近年來(lái),對(duì)于細(xì)胞組織的死亡,所謂細(xì)胞凋亡(也叫做細(xì)胞程序死亡(apoptosis),自然枯萎或細(xì)胞自然死亡)的方式引起了人們的注意。
與病理上細(xì)胞死亡的壞死不同,這種細(xì)胞凋亡是最初就已編入細(xì)胞自身基因的死亡。也就是說(shuō),由某種外部或內(nèi)部的因素引起編有細(xì)胞凋亡程序的基因活化,生物合成程序死亡蛋白質(zhì),另外有時(shí)也引起作為惰性型存在于細(xì)胞內(nèi)的程序死亡蛋白質(zhì)活化。通過(guò)這樣生成的活化型程序死亡蛋白質(zhì)引起細(xì)胞自身分解,導(dǎo)致死亡。
如果能夠在所需的組織、細(xì)胞中使這種細(xì)胞凋亡進(jìn)行表達(dá),則有可能把不需要或有害的細(xì)胞以自然形式由生物體排除,這將具有極為深遠(yuǎn)的意義。
發(fā)明目的人們期待把來(lái)源于瓊脂等藻類(lèi)的低聚糖作為食品原料進(jìn)行開(kāi)發(fā)(食品化學(xué),1988-2,40-44;增刊食品化學(xué)-4,1990年12月,127-131;特開(kāi)平6-38691號(hào)),但尚不清楚其誘發(fā)細(xì)胞凋亡作用等的生理功能。
本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)來(lái)源于天然物、具有誘發(fā)細(xì)胞凋亡作用等生理功能、安全性高的物質(zhì),從而提供以該物質(zhì)作為有效成分的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑等用于對(duì)該化合物具有敏感性疾病的藥物、以該物質(zhì)作為組成成分的功能性飲食品等。
發(fā)明概述如果簡(jiǎn)要的說(shuō)明本發(fā)明,本發(fā)明的第1種實(shí)施方式是用于治療或預(yù)防對(duì)下述化合物具有敏感性的疾病的藥物組合物,它含有從選自式1所示的3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物的化合物,以及還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分。
式1 本發(fā)明的第2種實(shí)施方式是用于改善對(duì)下述化合物敏感的疾病癥狀的飲食品或用于預(yù)防該疾病的飲食品,它含有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物的化合物以及還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物構(gòu)成的。
本發(fā)明的第3種實(shí)施方式是抗氧化劑,其特征在于,它含有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分。
本發(fā)明的第4種實(shí)施方式是飲食品,其特征在于,它含有本發(fā)明的第3種實(shí)施方式的抗氧化劑。
本發(fā)明的第5種實(shí)施方式是抗氧化用糖,它選自從式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中選擇的化合物和含有該化合物的可溶性糖化合物。
本發(fā)明的第6種實(shí)施方式是保鮮劑,其特征在于,它含有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物和含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分。
本發(fā)明的第7種實(shí)施方式是化妝品,其特征在于,它以選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物作為有效成分。
本發(fā)明的第8種實(shí)施方式是酸性飲食品,其特征在于,它含有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物。
本發(fā)明的其他實(shí)施方式是從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種在制備藥物組合物、飲食品、抗氧化劑、保鮮劑或化妝品中的用途。
以下,參照附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
圖面的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1表示用0.12N鹽酸分解瓊脂,將得到的產(chǎn)物用凝膠過(guò)濾的溶出圖。
圖2表示用1N鹽酸分解瓊脂,將得到的產(chǎn)物用凝膠過(guò)濾的溶出圖。
圖3表示瓊脂的酸分解產(chǎn)物的尺寸排阻HPLC色譜圖。
圖4表示細(xì)胞凋亡誘發(fā)性及抗癌性物質(zhì)的質(zhì)譜圖。
圖5表示細(xì)胞凋亡誘發(fā)性及抗癌性物質(zhì)(水合物)的1H-NMR譜圖。
圖6表示細(xì)胞凋亡誘發(fā)性及抗癌性物質(zhì)(醛異構(gòu)體)的1H-NMR譜圖。
圖7表示瓊脂二糖、瓊脂四糖及瓊脂六糖的正相HPLC溶出圖。
圖8表示66.7分鐘的峰的質(zhì)譜圖。
圖9表示78.5分鐘的峰的質(zhì)譜圖。
圖10表示85.5分鐘的峰的質(zhì)譜圖。
圖11表示3,6-脫水-L-半乳糖的質(zhì)譜圖。
圖12表示3,6-脫水-L-半乳糖(水合物)的1H-NMR譜圖。
圖13表示3,6-脫水-L-半乳糖(醛異構(gòu)體)的1H-NMR譜圖。
圖14是表示添加最終濃度為250μM的低聚糖培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間和存活細(xì)胞數(shù)的圖。
圖15是表示添加最終濃度為125μM的低聚糖培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間和存活細(xì)胞數(shù)的圖。
圖16表示在0.5M磷酸中進(jìn)行加熱處理的瓊脂的正相HPLC溶出圖。
圖17表示瓊脂二糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖18表示0.2%瓊脂的0.1M HCl溶液的加熱時(shí)間與瓊脂二糖產(chǎn)量之間的關(guān)系圖。
圖19表示0.2%瓊脂的0.1M枸櫞酸溶液的加熱時(shí)間與瓊脂二糖產(chǎn)量之間的關(guān)系圖。
圖20是表示在500mM枸櫞酸、80℃下,瓊脂低聚糖生成的圖。
圖21是表示在500mM枸櫞酸、95℃下,瓊脂低聚糖生成的圖。
圖22是表示在1200mM乳酸、80℃下,瓊脂低聚糖生成的圖。
圖23是表示在1200mM乳酸、95℃下,瓊脂低聚糖生成的圖。
圖24是表示在1000mM蘋(píng)果酸、80℃下,瓊脂低聚糖生成的圖。
圖25是表示在1000mM蘋(píng)果酸、95℃下,瓊脂低聚糖生成的圖。
圖26是表示在1000mM蘋(píng)果酸、70℃下,瓊脂低聚糖生成的圖。
圖27表示κ-角叉菜膠酸分解產(chǎn)物的正相HPLC色譜圖。
圖28表示細(xì)胞凋亡誘發(fā)性及抗癌性物質(zhì)的質(zhì)譜圖。
圖29表示凋落誘導(dǎo)性及抗癌性物質(zhì)的1H-NMR譜圖。
圖30是表示用cellulofine GCL-25進(jìn)行凝膠過(guò)濾結(jié)果的圖。
圖31是表示用交聯(lián)葡聚糖LH-20凝膠柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾結(jié)果的圖。
圖32表示β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖的質(zhì)譜圖。
圖33表示β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖的1H-NMR譜圖。
圖34表示在ConA引起的淋巴細(xì)胞胚細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變中,瓊脂二糖濃度與3H-胸腺嘧啶核苷攝取量的關(guān)系圖。
圖35表示在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中,瓊脂二糖濃度與3H-胸腺嘧啶核苷攝取量的關(guān)系圖。
圖36是表示添加瓊脂二糖,在各種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。
圖37是表示添加新瓊脂二糖,在各種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。
圖38是表示添加瓊脂鹽酸分解溶液、瓊脂枸櫞酸分解溶液進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。
圖39是表示添加3,6-脫水-D-半乳糖、半乳糖進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。
圖40是表示在各種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。
圖41是表示本發(fā)明低聚糖抗癌活性的圖。
圖42是表示本發(fā)明低聚糖抑制PCA反應(yīng)的圖。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明中式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為3,6-脫水吡喃半乳糖)的醛異構(gòu)體為式2所示化合物。 其水合物是式3所示化合物。 另外,3,6-脫水吡喃半乳糖的2-O-甲基化衍生物是式4表示的化合物。 此外,該甲基化衍生物的醛異構(gòu)體為式5所示化合物。 其水合物為式6所示化合物。 本說(shuō)明書(shū)中式1~6的結(jié)構(gòu)也可以以其他表達(dá)形式表示,式1~6所表示的物質(zhì)也包括這些,此外還包括它們可能的互變異構(gòu)體。另外,式1~6的立體構(gòu)型只要是能夠得到所需活性,并沒(méi)有特別的限定,可以是D-型、L-型或其混合物。
本發(fā)明的可溶性糖化合物并沒(méi)有特別的限定,是含有選自3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物(以下將其總稱(chēng)為“式1~6的化合物”)的可溶性糖化合物,它可以通過(guò)在pH不到7的酸性條件下,將含有至少1種式1~6化合物的物質(zhì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為原料物質(zhì))酸分解和/或酶分解得到,另外,也可以通過(guò)化學(xué)合成方法制得。本發(fā)明的可溶性糖化合物只要是在用時(shí)不會(huì)固化或半固化(凝膠化)的化合物即可,并沒(méi)有特別的限定。因此,含有用時(shí)溶膠化的選自式1~6化合物中的至少1種化合物的糖化合物包括在本發(fā)明的可溶性糖化合物中。另外,在本發(fā)明中優(yōu)選使用的該可溶性糖化合物,例如,是其非還原末端為L(zhǎng)-半乳糖-6-硫酸以外的糖的糖化合物,包括例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物。
為了得到該可溶性糖化合物所使用的原料物質(zhì)沒(méi)有特別的限定,例如瓊脂糖、瓊脂膠、海蘿聚糖、金屬卟啉、角叉菜膠、丹麥瓊脂、hypnean等紅藻的粘性多糖〔共立出版(株)發(fā)行,多糖生化學(xué)1-化學(xué)編-,第314頁(yè)(1969)〕。
另外,含有這些多糖的物質(zhì)也包含在原料物質(zhì)中。例如作為瓊脂糖、瓊脂膠的原料,可以使用石花菜科的石花菜、鬼石花菜、Gelidiumpacificum、Gelidium subcostatum、Pterocladia tenuis、Acanthopeltisjaponica等,Gracilariaceae科的Gracilaria verrucosa、Gracilaria gigas等、Ceramiaceae科的Ceramium kondio、Campylaephora hypnaeoides等、其他紅藻類(lèi),通常是數(shù)種藻類(lèi)配合作為原料使用。原料藻類(lèi)通常使用在太陽(yáng)下干燥后的干燥物質(zhì),本發(fā)明中可以使用新鮮藻類(lèi)及干燥后的藻類(lèi)。另外也可以使用在干燥時(shí)邊噴水邊漂白的所謂漂白原藻。
用熱水提取原料藻類(lèi)后,通過(guò)冷卻能夠得到“石花菜凝膠”。將該“石花菜凝膠”通過(guò)冷凍脫水或擠壓脫水除去水分,干燥得到瓊脂。不管瓊脂的原料藻類(lèi)是哪種,可以使用棒狀、帶狀、板狀、絲狀、粉末狀等各種形態(tài)的物質(zhì)。通常,瓊脂含有約70%的瓊脂糖和約30%的瓊脂膠,進(jìn)一步精制,可以制得含有更高純度瓊脂糖的物質(zhì)。精制瓊脂糖可以使用從低精制度到高精制度的各種瓊脂糖含量的物質(zhì)。
原料物質(zhì)中包含上述瓊脂的原料藻類(lèi)、石花菜凝膠、瓊脂、精制瓊脂糖、精制瓊脂膠、在其制備過(guò)程中得到的中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物。
瓊脂糖是以交替結(jié)合的D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖為主要結(jié)構(gòu)骨架的多糖,D-半乳糖的1位和3,6-脫水-L-半乳糖的4位以β-糖甙鍵結(jié)合,另外3,6-脫水-L-半乳糖的1位和D-半乳糖的3位以α-糖甙鍵結(jié)合。α-1,3鍵通過(guò)稀酸能夠進(jìn)行溫和的水解,以及通過(guò)α-瓊脂糖酶〔Carbohydr.Res.、第66卷、第207頁(yè)(1978)〕能夠進(jìn)行水解,另外,β-1,4鍵通過(guò)β-瓊脂糖酶能夠有選擇的進(jìn)行水解。
另外,角叉菜膠是杉海苔科、紅翎菜科、Hypneaceae科等紅藻類(lèi)中含有的多糖,已知有κ-角叉菜膠、λ-角叉菜膠、η-角叉菜膠。
κ-角叉菜膠具有在D-半乳糖-4-硫酸的1位和3,6-脫水-D-半乳糖的4位以β-糖甙鍵結(jié)合,另外在3,6-脫水-L-半乳糖的1位和D-半乳糖-4-硫酸的3位以α-糖甙鍵結(jié)合而交替重復(fù)的基本結(jié)構(gòu)骨架。λ-角叉菜膠是D-半乳糖的1位和D-半乳糖-2,6-二硫酸的4位以β-糖甙鍵結(jié)合,另外D-半乳糖-2,6-二硫酸的1位和D-半乳糖的3位以α-糖甙鍵結(jié)合,而具有交替重復(fù)的基本骨架。角叉菜膠可以用作食品的凝膠化劑。
用化學(xué)的、物理的和/或酶的方法將上述原料物質(zhì)進(jìn)行部分分解得到的物質(zhì)也包括在本發(fā)明的原料物質(zhì)中。
化學(xué)分解方法例如在酸性至中性下進(jìn)行水解,物理分解方法例如用電磁波及超音波照射,酶分解方法例如采用水解酶(如瓊脂糖酶、角叉菜膠酶等)進(jìn)行水解。
原料物質(zhì)在酸性至中性時(shí)的分解條件,只要是具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)性、抗癌性、抑制活性氧產(chǎn)生活性、抑制一氧化氮(以下稱(chēng)為NO)產(chǎn)生作用等抗氧化活性或免疫調(diào)節(jié)活性的式1~6化合物;含有這些化合物中至少1種的可溶性糖化合物,例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為角叉菜二糖)及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物;以及其非還原末端為L(zhǎng)-半乳糖-6-硫酸以外的糖,而在還原末端含有選自式1~6化合物的糖化合物的生成條件即可,沒(méi)有特別的限定。
例如,將原料物質(zhì)溶解或懸濁于酸中,通過(guò)使之發(fā)生反應(yīng),則生成本發(fā)明使用的選自式1~6的化合物中的化合物、含有這些化合物中至少1種的可溶性糖化合物。另外,通過(guò)在反應(yīng)時(shí)進(jìn)行加熱,可以縮短生成選自式1~6的化合物以及含有這些化合物中至少1種的可溶性糖化合物所必需的反應(yīng)時(shí)間。
溶解或懸濁原料物質(zhì)(例如瓊脂糖或含有瓊脂糖的物質(zhì))的酸的種類(lèi)沒(méi)有特別的限定,可以使用鹽酸、硫酸、硝酸等無(wú)機(jī)酸,枸櫞酸、甲酸、乙酸、乳酸、抗壞血酸等有機(jī)酸,以及陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、陽(yáng)離子交換纖維、陽(yáng)離子交換膜等固體酸。
酸的濃度也沒(méi)有特別的限定,可以使用0.0001~5N的濃度,優(yōu)選0.001~1N的濃度。另外,反應(yīng)溫度也沒(méi)有特別的限定,可以設(shè)定為0~200℃,優(yōu)選20~130℃。另外,反應(yīng)時(shí)間也沒(méi)有特別的限定,可以設(shè)定為數(shù)秒~數(shù)日。酸的種類(lèi)和濃度、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間可以根據(jù)作為原料的含有選自式1~6化合物中至少1種化合物的物質(zhì)(例如瓊脂糖、角叉菜膠等)的種類(lèi),以及作為目的產(chǎn)物的選自式1~6的化合物、含有這些化合物的糖化合物的產(chǎn)量,作為目的產(chǎn)物的在還原末端具有選自式1~6的化合物的可溶性糖化合物的聚合度適當(dāng)選擇。一般,選擇強(qiáng)酸、高濃度酸、高溫比選擇弱酸、低濃度酸、低溫可以加速酸分解反應(yīng)的進(jìn)行。
另外,使用固體酸的場(chǎng)合,一般使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂比弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的分解反應(yīng)效率好。再者,當(dāng)原料物質(zhì)的使用量越多、作用溫度越高,酸分解反應(yīng)進(jìn)行的越快。
例如,將瓊脂懸濁在0.1N鹽酸中達(dá)到10重量%,在100℃加熱溶解13分鐘,除去不溶物,得到本發(fā)明使用的糖化合物溶液,該糖化合物溶液即使冷卻,在其冰點(diǎn)也不發(fā)生凝膠化。如果采用凝膠過(guò)濾HPLC、正相HPLC等方法對(duì)該溶液中含有的糖類(lèi)進(jìn)行分析,幾乎見(jiàn)不到高分子糖類(lèi),大部分已分解到可溶性的10個(gè)糖以下的糖化合物。同樣,固定酸的場(chǎng)合,將市售強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的Na型1重量份用1N鹽酸調(diào)節(jié)成H型后,加入到79重量份的去離子水中,再加入瓊脂10重量份懸濁,在95℃加熱180分鐘,得到本發(fā)明的糖化合物溶液,該糖化合物溶液即使冷卻,在其冰點(diǎn)也不會(huì)發(fā)生凝膠化。如果采用凝膠過(guò)濾HPLC、正相HPLC等方法對(duì)該溶液中含有的糖類(lèi)進(jìn)行分析,幾乎見(jiàn)不到高分子糖類(lèi),大部分已分解到可溶性的10個(gè)糖以下的糖化合物。
另外,在制備本發(fā)明所使用的在還原末端具有選自式1~6化合物的可溶性糖化合物時(shí),使用枸櫞酸、乳酸、蘋(píng)果酸等有機(jī)酸,通過(guò)酸的濃度在數(shù)10mM~數(shù)M之間適當(dāng)選擇,加熱溫度在70~95℃之間適當(dāng)選擇,加熱時(shí)間在10分鐘~24小時(shí)之間適當(dāng)選擇,生成大量具有生理活性的低聚糖(例如抗氧化用低聚糖)。另外,水解后,維持酸性,不要調(diào)節(jié)為堿性條件下,生成的該生理活性低聚糖具有長(zhǎng)時(shí)間的保存穩(wěn)定性。
作為本發(fā)明使用的選自式1~6的化合物、含有這些化合物中至少1種化合物的可溶性糖化合物,例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物,可以直接使用原料物質(zhì)的分解產(chǎn)物,也可以中和后使用,還可以進(jìn)一步精制后使用。選自式1~6的化合物、在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物,例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等低聚糖,例如,可以以細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性或抗癌活性作為指標(biāo)進(jìn)行精制。作為精制手段可以采用化學(xué)方法、物理方法等公知的精制手段,可以將凝膠過(guò)濾法、采用分子量分離膜的分離法、溶劑提取法、使用離子交換樹(shù)脂等的各種色譜法等公知精制方法組合,對(duì)酸分解產(chǎn)物中生成的作為目的產(chǎn)物的細(xì)胞凋亡誘發(fā)性物質(zhì)——選自式1~6的化合物、含有該化合物中至少1種化合物的可溶性糖化合物進(jìn)行精制。
這樣得到的化合物的結(jié)構(gòu)可以采用質(zhì)量分析法、核磁共振法、測(cè)定紫外吸收光譜、測(cè)定紅外吸收光譜等公知方法進(jìn)行解析。
作為本發(fā)明有效成分1例的瓊脂二糖是D-半乳糖的1位和3,6-脫水-L-半乳糖的4位以β-糖甙鍵結(jié)合形成的2糖。由于3,6-脫水-L-半乳糖的1位是端基異構(gòu)碳,因此存在α型和β型,兩者均包括在本發(fā)明所使用的瓊脂二糖中。
另外,在本發(fā)明中作為有效成分使用的還原末端具有選自式1~6化合物的糖化合物是在該選自式1~6的化合物1位以外的羥基上結(jié)合有糖的物質(zhì),只要具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性、抗癌活性、抑制活性氧產(chǎn)生活性、抑制NO產(chǎn)生活性和/或免疫調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)即可,沒(méi)有特別的限定。例如原料物質(zhì)的分解產(chǎn)物,如瓊脂糖的酸分解產(chǎn)物或α-瓊脂糖酶分解產(chǎn)物的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角叉菜二糖、β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等。另外,例如角叉菜膠的酸分解產(chǎn)物或角叉菜膠酶分解產(chǎn)物,如角叉菜二糖。選自葡萄糖、甘露糖、半乳糖等己糖,木糖、阿拉伯糖、核糖等戊糖,葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸等糖醛酸,葡萄糖胺、半乳糖胺等氨基糖,N-乙?;窠?jīng)氨糖酸等?;?,巖藻糖等去氧糖、其酯、酰胺以及內(nèi)酯中的1個(gè)或多個(gè)糖結(jié)合在選自式1~6的化合物1位以外的羥基上的物質(zhì)也包括在本發(fā)明在還原末端具有選自式1~6化合物的糖化合物中,在還原末端具有選自這些式1~6的化合物的糖化合物,例如,在瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物上結(jié)合有丙酮酸和/或硫酸基的物質(zhì),以及該糖化合物的羥基甲基化得到的物質(zhì)也包括在本發(fā)明的在還原末端具有選自式1~6化合物的糖化合物中。另外,如上所述,本發(fā)明中在還原末端具有選自式1~6化合物的糖化合物優(yōu)選其非還原末端為L(zhǎng)-半乳糖-6-硫酸以外的糖。
由于在還原末端具有3,6-脫水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物的糖化合物其還原末端的化合物1位為端基異構(gòu)碳,因此在還原末端具有該化合物的糖化合物存在α型和β型,在本發(fā)明中兩者均可以用作在還原末端具有3,6-脫水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物的糖化合物。
另外,只要具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性、抗癌活性、抑制活性氧產(chǎn)生活性、抑制NO產(chǎn)生活性等抗氧化活性和/或免疫調(diào)節(jié)活性等生理活性,其分子量沒(méi)有特別的限定。
本發(fā)明所使用的選自式1~6的化合物、在還原末端具有該化合物的糖化合物其還原末端的化合物當(dāng)然也可以使用α型、β型、醛異構(gòu)體、水合物型的混合物以及D-型、L-型的混合物等。
因此,本發(fā)明所使用的選自式1~6的化合物、在還原末端具有該化合物的糖化合物具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性、抗癌活性、抑制活性氧產(chǎn)生活性、抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生活性、抑制NO產(chǎn)生活性等抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗過(guò)敏活性,按照本發(fā)明首先可以提供含有從選自式1~6的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分用于治療或預(yù)防對(duì)這些化合物中的至少1種具有敏感性疾病的藥物組合物,例如這些疾病的治療藥或預(yù)防藥。
對(duì)這些化合物具有敏感性的疾病包括需要誘發(fā)細(xì)胞凋亡的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧產(chǎn)生的疾病、需要抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生的疾病、需要抑制NO產(chǎn)生的疾病、或需要免疫調(diào)節(jié)的疾病,例如過(guò)敏性疾病等,本發(fā)明的治療用或預(yù)防用藥物組合物可以制成細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑、抗癌劑、活性氧產(chǎn)生抑制劑、過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生抑制劑、一氧化氮產(chǎn)生抑制劑等抗氧化劑、抗炎劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗過(guò)敏劑等。
例如,本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑對(duì)于排除自身免疫疾病患者的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞、癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等有效,可以使細(xì)胞凋亡在所需的組織、細(xì)胞中表達(dá),使不需要或有害的細(xì)胞以自然的形式從生物體內(nèi)排除。對(duì)本發(fā)明細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑有效的疾病例如全身性紅斑狼瘡、免疫介在性腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、膠原病等自身免疫疾病、風(fēng)濕等。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑可以用于細(xì)胞凋亡誘發(fā)方法,該方法對(duì)于細(xì)胞凋亡誘發(fā)機(jī)理的闡明、細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑、細(xì)胞凋亡誘發(fā)抑制劑的篩選等是有用的。
另外,本發(fā)明細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑帶來(lái)的細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用可以被Caspase抑制劑抑制,例如IL-1β掩蔽酶抑制劑V〔Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-氟甲基酮,寶酒造社生產(chǎn)〕,因此認(rèn)為是依賴(lài)于Caspase的細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞死亡。
由于該Caspase在各種細(xì)胞死亡時(shí)首先上升,其過(guò)剩表達(dá)引起細(xì)胞死亡,肽抑制劑或抑制蛋白質(zhì)CrmA、p35導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制、脫去Caspase-1、Caspase-3的小鼠正??梢?jiàn)的細(xì)胞凋亡的一部分得到抑制,因而說(shuō)明該Caspase作為細(xì)胞凋亡重要的介質(zhì)發(fā)揮作用〔生化學(xué),第70卷,第14~21頁(yè)(1998)〕。也就是說(shuō),在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中半胱氨酸蛋白酶Caspase被活化,分解核或細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)。Caspase首先作為前體被合成,然后通過(guò)剪切變成活化型??刂圃揅aspase的活化可以決定細(xì)胞的生死。在哺乳類(lèi)動(dòng)物中存在10種以上的Caspase,通過(guò)上位的Caspase對(duì)下位的Caspase進(jìn)行剪切使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解活性呈雪崩式增加〔細(xì)胞工學(xué),第17卷,第875~880頁(yè)(1998)〕。相反,半胱氨酸蛋白酶Caspase的抑制劑如果抑制其剪切活性,則可以終止依賴(lài)于Caspase的細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞死亡。
另外,本發(fā)明使用的化合物可以有效抑制氧化物,例如活性氧的產(chǎn)生,所以該化合物作為有效成分的活性氧產(chǎn)生抑制劑等抗氧化劑可以有效治療或預(yù)防由于活性氧的產(chǎn)生和/或過(guò)剩引起的疾病。
活性氧可以大致分為游離基和非游離基的活性氧。游離基類(lèi)活性氧中包括羥游離基、羥基過(guò)氧游離基、過(guò)氧游離基、烷氧游離基、二氧化氮(NO2)、NO、thylradical、超氧化物。另一方面,非游離基類(lèi)活性氧中包括單線態(tài)氧、過(guò)氧化氫、氫過(guò)氧化脂質(zhì)、次氯酸、臭氧、過(guò)氧亞硝酸。均與多種病態(tài)有關(guān),例如各種炎癥性疾病、糖尿病、癌、動(dòng)脈硬化、神經(jīng)疾病、缺血再灌流障礙等。
在生物體內(nèi)通過(guò)幾條通路不斷生產(chǎn)低濃度的活性氧。它們?cè)谏砩暇豢杀苊馐怯删€粒體等電子傳遞系統(tǒng)溢出的過(guò)氧化物、過(guò)氧化氫、銅或鐵等過(guò)渡金屬作為催化劑產(chǎn)生的羥游離基、中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞等生成的由于預(yù)防感染的次氯酸、精氨酸分解生成的NO等。相對(duì)于這些活性氧的生成,生物體具有作為活性氧消除系統(tǒng)的酶、低分子化合物,保持生成和消除的平衡。但是,當(dāng)這些通路由于某種原因被活化,或相反消除系統(tǒng)被惰性化,則導(dǎo)致活性氧生成系統(tǒng)相對(duì)于消除系統(tǒng)占優(yōu)勢(shì)的場(chǎng)合,從而生物體遭到氧化的障礙。這種狀態(tài)稱(chēng)為氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外,不僅生物體內(nèi)平衡偏移,而且大氣或食品等生物體外的物質(zhì),也常常會(huì)使生物體遭受氧化應(yīng)激反應(yīng),因此,在日常生活中氧化應(yīng)激反應(yīng)是不可避免的。
也就是說(shuō),氧化應(yīng)激反應(yīng)如上所述與各種疾病有關(guān),生物體常常出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的疾病或疾病惡化。因此,對(duì)于這種氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的疾病的預(yù)防、治療或防止惡化,本發(fā)明的抗氧化劑(例如活性氧產(chǎn)生抑制劑)也是有效的。
另外,氧化應(yīng)激反應(yīng)必然與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)相連,一旦該反應(yīng)生成過(guò)氧化脂質(zhì)游離基,將進(jìn)一步進(jìn)行反應(yīng)。這里產(chǎn)生的4-羥基-2-壬烯醛(HNE)是以谷胱甘肽或蛋白質(zhì)作為特異性靶的毒性醛。該HNE與蛋白質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物可以在各種病態(tài)組織中檢測(cè)出,考慮是否是與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的疾病的誘發(fā)因子。因此,含有可以抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基生成的本發(fā)明使用的抗氧化物質(zhì)的抗氧化劑可以有效預(yù)防或治療氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的老化疾病。
NO是來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞的血管平滑肌松弛因子(EDRF)的主體〔Nature,第327卷,第524~526頁(yè)(1987)〕。按照本發(fā)明,可以提供必須抑制NO產(chǎn)生的疾病的治療劑或預(yù)防劑。
在本發(fā)明中,必須抑制NO產(chǎn)生的疾病沒(méi)有特別的限定,例如毒性休克或采用某種細(xì)胞因子治療引起的全身性血壓降低、血壓應(yīng)答降低、自身免疫疾病、炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎癥性腸疾病、血管機(jī)能障礙、病因性血管擴(kuò)張、組織損傷、心臟血管系統(tǒng)貧血、痛感敏感、腦缺血、伴有血管形成的疾病、癌等,包括特表平9-504524號(hào)、特表平9-505288號(hào)、特表平8-501069號(hào)、特表平8-512318號(hào)、特表平6-508849號(hào)各公報(bào)中記載的疾病。
由L-精氨酸和氧生成L-瓜氨酸和NO的NO合成酶(NOS)中包括經(jīng)常表達(dá)的cNOS和誘導(dǎo)型的iNOS。在巨噬細(xì)胞中,iNOS通過(guò)細(xì)胞毒素或細(xì)胞因子(LPS、INF-γ等)的刺激被誘導(dǎo),生成NO。iNOS自身對(duì)于維持生物體系是必需存在的。但是,另一方面,已知由于各種原因?qū)е略诒匾陨线^(guò)剩表達(dá)并產(chǎn)生過(guò)剩的NO,則會(huì)引起各種疾病。
本發(fā)明人通過(guò)采用蛋白質(zhì)印跡測(cè)定的蛋白質(zhì)水平、采用RT-PCR測(cè)定的信使RNA水平,來(lái)確認(rèn)選自式1~6的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物,例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖可以抑制該iNOS的表達(dá)。也就是說(shuō),本發(fā)明所使用的化合物通過(guò)抑制由于各種因素引起過(guò)剩表達(dá)生成過(guò)剩的NO的iNOS表達(dá),可有效治療和預(yù)防必須抑制NO產(chǎn)生的疾病。
本發(fā)明的化合物可抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO,因此能有效治療、預(yù)防巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO引起的疾病、炎癥、癌等。另外,本發(fā)明使用的糖化合物可抑制NO的產(chǎn)生,但對(duì)于誘發(fā)NO產(chǎn)生的物質(zhì)LPS、INF-γ沒(méi)有拮抗抑制。通過(guò)預(yù)先加入本發(fā)明使用的糖化合物,可見(jiàn)抑制NO產(chǎn)生的效果增強(qiáng),本發(fā)明的化合物作為抑制抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生的預(yù)防劑是非常有效的。
本發(fā)明的NO產(chǎn)生抑制劑對(duì)于NO產(chǎn)生機(jī)理研究、NO作用機(jī)理研究是有用的,另外也可以用于篩選與NO產(chǎn)生機(jī)理有關(guān)的物質(zhì)。
對(duì)于實(shí)體瘤的增大,血管的形成是必需的,血管內(nèi)皮增殖因子/血管通透性亢進(jìn)因子(VEGF)在該過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在各種癌細(xì)胞中通過(guò)NO誘導(dǎo)產(chǎn)生VEGF。本發(fā)明的NO產(chǎn)生抑制劑通過(guò)抑制產(chǎn)生NO,也可以抑制癌細(xì)胞中VEGF產(chǎn)生,結(jié)果抑制了癌組織周?chē)难苌伞H绻驯景l(fā)明的NO產(chǎn)生抑制劑投給癌細(xì)胞移植到皮下使之形成實(shí)體瘤的小鼠,則癌組織周?chē)苌刹怀浞?,最終癌脫落。
亞硝基胺是在仲胺中帶有亞硝基的一組化合物,已知有數(shù)百種,其大多數(shù)通過(guò)損傷DNA使動(dòng)物發(fā)生癌變。亞硝基胺對(duì)于人的癌變也有很大的聯(lián)系,通常在胃中通過(guò)亞硝酸鹽與胺反應(yīng)生成。NO即使在pH中性的生理?xiàng)l件下也與胺反應(yīng)生成亞硝基胺。另外,在免疫學(xué)上與癌有很大關(guān)系的肝吸蟲(chóng)感染患者或肝硬化患者中NO的產(chǎn)生亢進(jìn)。因此,投給本發(fā)明的NO產(chǎn)生抑制劑,通過(guò)防止NO產(chǎn)生亢進(jìn),特別是可以預(yù)防高?;颊叩陌┳?。如上所述,本發(fā)明的NO產(chǎn)生抑制劑具有2步抗癌作用,即抑制癌變和抑制癌組織中血管生成。
另外,NO可以誘發(fā)作為炎癥性病變特征的浮腫,即誘發(fā)血管通透性亢進(jìn)〔Madea等,Japanese Journal of Cancer Research,第85卷,第331~334頁(yè)(1994)〕,還可以使炎癥介質(zhì)前列腺素類(lèi)的生物合成亢進(jìn)〔Salvemini等,Proceedngs of National Academy of Sciences USA,第90卷,第7240~7244頁(yè)(1993)〕。另一方面,NO與過(guò)氧化物游離基迅速反應(yīng),生成過(guò)氧亞硝酸離子,認(rèn)為過(guò)氧亞硝酸離子也引起炎癥性細(xì)胞、組織障礙。
活化的免疫細(xì)胞進(jìn)入臟器,釋放出細(xì)胞因子時(shí),誘導(dǎo)產(chǎn)生NO。胰島素依賴(lài)型糖尿病是胰島β細(xì)胞被特異性破壞引起的疾病,據(jù)說(shuō)是由NO引起的破壞。另外,伴有慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕、變形性關(guān)節(jié)風(fēng)濕、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、貝切特氏病的關(guān)節(jié)炎患者病變部位的關(guān)節(jié)液中比相同患者的正常關(guān)節(jié)或健康人關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液中含有的NO濃度高。如果將本發(fā)明的NO產(chǎn)生抑制劑投給患者,可以抑制病變部位產(chǎn)生NO,使癥狀得到改善。
在腦缺血中以及再灌流后NO的產(chǎn)生增加,隨之使腦組織受到損傷。本發(fā)明的NO產(chǎn)生抑制劑投給腦缺血時(shí)的患者,可減輕腦組織的損傷,改善預(yù)后。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑具有抑制淋巴細(xì)胞胚細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變反應(yīng)的作用、抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等的免疫調(diào)節(jié)作用,本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑作為這些免疫系統(tǒng)、免疫因子異常引起的疾病的治療劑或預(yù)防劑是有效的。
這里,淋巴細(xì)胞胚細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變反應(yīng)是指促細(xì)胞分裂劑與淋巴細(xì)胞表面的受體結(jié)合,使淋巴細(xì)胞活化,促進(jìn)其分裂、增殖的反應(yīng)?;旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)是指通過(guò)將由同種異類(lèi)動(dòng)物得到的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng),由于主要組織適合抗原不一致誘發(fā)淋巴細(xì)胞活化,促進(jìn)淋巴細(xì)胞分裂、增殖的反應(yīng)。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑可以抑制這些反應(yīng),特別有效的治療或預(yù)防淋巴細(xì)胞異??哼M(jìn)引起的自身免疫疾病,例如慢性腎炎、潰瘍性大腸炎、I型糖尿病、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕等慢性疾病,另外也可以有效抑制移植片排斥反應(yīng)。
用IgE抗體致敏的肥大細(xì)胞通過(guò)抗原的結(jié)合,誘導(dǎo)去粒,釋放出化學(xué)介質(zhì)。其I型,也就是即時(shí)型過(guò)敏反應(yīng)在以哮喘、特應(yīng)性皮炎為代表的過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要作用,抑制從肥大細(xì)胞釋放化學(xué)介質(zhì)的物質(zhì)對(duì)于治療和預(yù)防這些過(guò)敏性疾病是非常有效的。
作為I型過(guò)敏反應(yīng)模型的大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)(PCA)是從肥大細(xì)胞的去粒開(kāi)始,然后釋放顆粒中含有的組胺、5-羥色胺等化學(xué)介質(zhì),引起血管通透性亢進(jìn),最后在皮膚局部造成色素滲漏的反應(yīng)。該模型目前作為體內(nèi)抗過(guò)敏劑的評(píng)價(jià)模型使用最廣泛。
選自式1~6化合物的化合物及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物具有抑制PAC的作用,按照本發(fā)明,還可以提供以從選自式1~6化合物的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分的抗過(guò)敏藥。
這種抗過(guò)敏反應(yīng)藥對(duì)于通過(guò)抑制I型過(guò)敏反應(yīng)可以治療的疾病,例如支氣管哮喘、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性鼻炎、花粉病、蕁麻疹、接觸性皮炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎等的治療、預(yù)防非常有效。
上述本發(fā)明的治療用或預(yù)防用藥物組合物,例如細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑,能夠以從選自式1~6化合物的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分,通過(guò)將其與公知的藥用載體組合制成制劑而制造的。
一般,將這些化合物與可藥用的液體或固體載體組合,而且必要時(shí)添加溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑等,能夠制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊等固體劑型,常用溶液劑、懸濁劑、乳劑等液體制劑。另外,也可以制成在使用前通過(guò)添加適當(dāng)載體成為液態(tài)的干燥制品。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑能夠采用口服制劑及注射劑、輸液劑等非口服制劑中的任意一種方式給藥。
藥用載體可以根據(jù)上述給藥方式及劑型進(jìn)行選擇,口服制劑的場(chǎng)合,可以使用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無(wú)機(jī)鹽等。另外,當(dāng)制備口服制劑時(shí),也可以進(jìn)一步加入粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、流動(dòng)性促進(jìn)劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面,非口服制劑的場(chǎng)合,可以按照常規(guī)方法,通過(guò)將本發(fā)明的有效成分——具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)性的糖化合物溶解或懸濁在注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀釋劑中,必要時(shí)加入滅菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、止痛劑等制備。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑可以根據(jù)制劑形態(tài)采用適當(dāng)給藥途徑給藥。給藥方法也沒(méi)有特別的限定,可以?xún)?nèi)用、外用和注射。注射劑可以通過(guò)例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等給藥,外用制劑中也包括栓劑等。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑的給藥量根據(jù)其制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及其適用患者的年齡、體重、癥狀等適當(dāng)設(shè)定,并不是一定的,但一般在制劑中含有有效成分的量是成人每天10μg~200mg/kg。當(dāng)然,由于給藥量隨各種條件改變,所以有時(shí)以低于上述給藥量的量給藥,有時(shí)有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥物除直接口服給藥外,也可以添加到任意的飲食品中,使之進(jìn)行日常攝取。
本發(fā)明的抗癌劑,能夠以從選自式1~6化合物的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分,將其與公知的藥用載體組合制成制劑而制造的??拱﹦┑闹苽淇梢园凑丈鲜黾?xì)胞凋亡誘發(fā)劑的制備方法進(jìn)行。
抗癌劑可以根據(jù)制劑形態(tài)采用適當(dāng)?shù)慕o藥途徑給藥。給藥方法也沒(méi)有特別的限定,可以?xún)?nèi)用、外用及注射。注射劑可以通過(guò)例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等給藥,外用制劑中也包括栓劑等。
抗癌劑的給藥量可以根據(jù)其制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及其適用患者的年齡、體重、癥狀等適當(dāng)設(shè)定,并不是一定的,但一般在制劑中含有有效成分的量為成人1日10μg~200mg/kg。當(dāng)然,由于給藥量隨各種條件改變,有時(shí)會(huì)以低于上述給藥量的量給藥,有時(shí)則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥物除直接口服給藥外,也可以添加到任意飲食品中,使之進(jìn)行日常攝取。
另外,作為本發(fā)明的抗氧化劑、活性氧產(chǎn)生抑制劑、過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生抑制劑、NO產(chǎn)生抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或抗過(guò)敏劑可以按照上述細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑的制備方法制備,用量、用法按照上述細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑使用即可。
也就是說(shuō),抗氧化劑、活性氧產(chǎn)生抑制劑、過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生抑制劑、NO產(chǎn)生抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或抗過(guò)敏劑可以根據(jù)制劑形態(tài)采用適當(dāng)給藥途徑給藥。給藥方法也沒(méi)有特別的限定,可以?xún)?nèi)用、外用及注射。注射劑可以通過(guò)例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等給藥,外用制劑中也包括栓劑等。
抗氧化劑、活性氧產(chǎn)生抑制劑、過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生抑制劑、NO產(chǎn)生抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或抗過(guò)敏劑的給藥量,根據(jù)其制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及其適用患者的年齡、體重、癥狀等適當(dāng)設(shè)定,并不是一定的,但一般在制劑中含有有效成分的量是成人1日10μg~200mg/kg。當(dāng)然,由于給藥量隨各種條件改變,有時(shí)以低于上述給藥量的量給藥,有時(shí)則有必要時(shí)超出上述范圍。本發(fā)明的藥物除直接口服給藥外,也可以添加到任意飲食品,使之進(jìn)行日常攝取。
其次,本發(fā)明的飲食品是含有、添加和/或稀釋有從選自式1~6化合物的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物,例如選自原料物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下得到的酸分解產(chǎn)物和/或酶分解產(chǎn)物生成的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物中的至少1種化合物,從而形成的食品或飲料,通過(guò)其細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用、抗癌作用、抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)作用等,對(duì)于從選自式1~6化合物的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種具有敏感性的疾病,例如需要誘發(fā)細(xì)胞凋亡的疾病、癌癥、需要抑制活性氧產(chǎn)生的疾病、需要抑制NO產(chǎn)生的疾病、需要免疫調(diào)節(jié)的疾病、過(guò)敏性疾病等癥狀的改善、預(yù)防非常有效。
本發(fā)明的食品或飲料的制備方法并沒(méi)有特別的限定,可以采用烹飪、加工及經(jīng)常使用的食品或飲料的制備方法,制造的食品或飲料中含有從選自式1~6化合物的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物,例如選自原料物質(zhì)在PH不到7的酸性條件下通過(guò)酸分解和/或酶分解生成的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種化合物作為有效成分即可。
本發(fā)明的飲食品并沒(méi)有特別的限定,例如可以是谷類(lèi)制品(如小麥粉制品、淀粉制品、預(yù)混合制品、面條類(lèi)、通心粉類(lèi)、面包類(lèi)、豆醬類(lèi)、蕎麥面類(lèi)、小麥麩面包、大米面、明膠面、包裝米餅等)、油脂制品(如可塑性油脂、油炸用油、色拉油、蛋黃醬、調(diào)味品等)、大豆制品(如豆腐類(lèi)、醬、納豆等)、肉類(lèi)制品(如火腿、腌肉、壓縮火腿、香腸等)、水產(chǎn)制品(如冷凍魚(yú)肉、魚(yú)糕、魚(yú)卷、魚(yú)肉蒸餅、油炸魚(yú)丸、汆魚(yú)丸、壽司、魚(yú)肉火腿、香腸、木松魚(yú)、魚(yú)卵制品、水產(chǎn)品罐頭、用調(diào)料煮的魚(yú)等)、乳制品(如原料乳、乳酪、酸乳、奶油、干酪、煉乳、奶粉、冰淇凌等)、蔬菜·水果制品(如膏類(lèi)、果醬類(lèi)、腌制類(lèi)、果汁、蔬菜飲料、混合飲料等)、甜食類(lèi)(如巧克力、餅干、甜的小面包、蛋糕、年糕點(diǎn)心、米制點(diǎn)心等)、醇飲料(如日本酒、中國(guó)酒、葡萄酒、威士忌酒、白酒、伏特加酒、白蘭地酒、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清涼醇飲料、水果酒、利口酒等)、嗜好飲料(如綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等)、調(diào)味品(如醬油、調(diào)味汁、醋、料酒等)、罐裝·瓶裝·袋裝食品(如牛肉飯、豬肉飯、紅豆飯、咖哩飯、其他各種烹飪好的食品)、半干燥或濃縮食品(如肝的糊狀物、其他spread、蕎麥·面條的湯、濃縮湯類(lèi))、干燥食品(如方便面、方便咖哩飯、速溶咖啡、果汁粉、湯粉、方便醬湯、烹飪好的食品、調(diào)制好的飲料、烹飪好的湯等)、冷凍食品(如素?zé)?、茶碗蒸飯、烤鱔魚(yú)、漢堡包、燒麥、餃子、各種面條、水果雞尾酒等)、固體食品、液體食品(如湯等)、香辛料類(lèi)等農(nóng)業(yè)·林業(yè)制品、畜牧業(yè)制品、水產(chǎn)制品等。
本發(fā)明的飲食品中,含有、添加和/或稀釋有從選自式1~6化合物的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物,例如選自原料物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下通過(guò)酸分解和/或酶分解生成的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物中的至少1種以上的化合物,只要含有可以表達(dá)其生理功能的所必要量即可,對(duì)其形狀沒(méi)有特別限定,也包括片狀、顆粒狀、膠囊狀等可以口服攝取的形狀。
3,6-脫水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物以及在還原末端具有該化合物的糖化合物,其半縮醛環(huán)容易開(kāi)環(huán),在末端容易成為醛。這個(gè)醛與3,6-脫水吡喃半乳糖的醛異構(gòu)體的醛容易與對(duì)于醛具有反應(yīng)活性的化合物,例如氨基酸等親核物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),發(fā)生反應(yīng)了的式1~6化合物或糖化合物,例如低聚糖,最終成為沒(méi)有還原末端的選自式1~6的化合物的狀態(tài)。因而失去了選自式1~6的化合物以及在還原末端具有該化合物的低聚糖所具有的各種生理活性。也就是說(shuō),在飲料或食品中,為了保持選自式1~6的化合物以及選自在還原末端具有該化合物的糖化合物穩(wěn)定,就必須使對(duì)這些醛具有反應(yīng)活性的化合物的摩爾濃度保持比這些醛的摩爾濃度低。
因而,在制造本發(fā)明的食品或飲料時(shí),通過(guò)控制以前不進(jìn)行控制的對(duì)這些醛具有反應(yīng)活性的化合物量,使得在實(shí)質(zhì)上不減少?gòu)倪x自式1~6的化合物以及在還原末端具有該化合物的低聚糖中選擇的化合物,從而可以提供這些化合物含量高的食品或飲料。
另外,發(fā)現(xiàn)選自式1~6化合物的化合物以及在還原末端具有該化合物的糖化合物在其還原末端的該選自式1~6的化合物在酸性條件下是穩(wěn)定,因此在本發(fā)明的食品或飲料的制備方法中,其全部過(guò)程均在酸性條件下進(jìn)行,通過(guò)將得到的食品或飲料制成酸性食品或酸性飲料,從而可以提供從選自式1~6的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物含量高的酸性食品或酸性飲料。
在制備本發(fā)明酸性食品或酸性飲料的過(guò)程中,對(duì)酸分解原料物質(zhì)的酸的種類(lèi)沒(méi)有特別的限定,可以使用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸,從得到的瓊脂酸分解產(chǎn)物的風(fēng)味考慮優(yōu)選有機(jī)酸分解的產(chǎn)物,通過(guò)適當(dāng)使用有機(jī)酸,可以得到具有新型風(fēng)味的酸分解產(chǎn)物。作為有機(jī)酸,可以根據(jù)目的進(jìn)行選擇,可以單獨(dú)使用,也可以同時(shí)使用2種以上。作為有機(jī)酸,優(yōu)選例如乙酸、枸櫞酸、蘋(píng)果酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸等。分解條件并沒(méi)有特別的限定,但作為有機(jī)酸,例如使用枸櫞酸時(shí),原料物質(zhì)例如瓊脂,通過(guò)在60~103℃,優(yōu)選90~105℃下,進(jìn)行酸分解3~300分鐘,優(yōu)選30~200分鐘,可以改變有機(jī)酸的酸味,得到具有良好味覺(jué)平衡、緩和舌感、平緩酸味的組合物。有機(jī)酸的量為0.05~30重量%,優(yōu)選0.2~10重量%,加熱處理使從選自式1~6化合物的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物的含量達(dá)到1~20重量%(優(yōu)選5~15重量%)的產(chǎn)物是具有較好酸味的酸味料。得到的酸味料在清涼飲料、酸性調(diào)料、酸性食品等的制造中非常有用。
本發(fā)明的酸性食品或酸性飲料是大量含有具有生理活性的從選自式1~6化合物的化合物以及具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物,例如原料物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下通過(guò)酸分解和/或酶分解生成的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物,由于它們具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用、抗癌作用等生理功能,通過(guò)對(duì)其進(jìn)行攝取可以達(dá)到預(yù)防癌變、抑制癌癥等效果的食品或飲料。也就是說(shuō),本發(fā)明的酸性食品或酸性飲料是對(duì)從選自式1~6的化合物以及具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物具有敏感性的疾病具有改善作用或預(yù)防作用的健康食品或飲料,特別是可有效保持胃腸健康的食品或飲料。
另外,本發(fā)明從選自式1~6的化合物以及具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物,例如原料物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下通過(guò)酸分解和/或酶分解生成的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物具有抑制活性氧產(chǎn)生作用、抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生作用等抗氧化活性,可以作為用于抗氧化用食品的抗氧化劑或用于抗氧化用飲料的抗氧化劑,如活性氧產(chǎn)生抑制劑、過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生抑制劑、NO產(chǎn)生抑制劑等,用于制備抗氧化用食品或抗氧化用飲料。
也就是說(shuō),通過(guò)本發(fā)明提供含有從選自式1~6的化合物以及具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分的抗氧化劑,特別是飲食品用的抗氧化劑。
本發(fā)明抗氧化劑的劑型并沒(méi)有特別的限定,可以根據(jù)作為添加對(duì)象的飲食品種類(lèi)按照常規(guī)方法,制成粉末狀、糊狀、乳化物等適當(dāng)劑型,含有選自本發(fā)明所使用的化合物以及糖化合物的化合物作為有效成分的抗氧化用飲食品,可以通過(guò)使用本發(fā)明的抗氧化劑簡(jiǎn)便制備。
另外,按照本發(fā)明可以提供從選自式1~6的化合物以及具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的抗氧化用糖。例如,該抗氧化用糖可以由原料物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下作為酸分解產(chǎn)物和/或酶分解產(chǎn)物得到。另外,可以使用其精制產(chǎn)品、部分精制產(chǎn)品。作為原料物質(zhì)可以單獨(dú)使用或同時(shí)使用2種以上,例如來(lái)源于紅藻類(lèi)的原料物質(zhì),如瓊脂、瓊脂糖、角叉菜膠等。并沒(méi)有特別的限定,但是,作為具有代表性的抗氧化用糖,可例示的有,含有選自式1~6化合物的化合物的可溶性糖化合物,例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等抗氧化用糖。
本發(fā)明的抗氧化用糖可以有效除去生物體內(nèi)的氧化物質(zhì)(如活性氧),或抑制其產(chǎn)生,該抗氧化用糖對(duì)于由于活性氧產(chǎn)生或過(guò)剩引起的疾病,可有效改善癥狀或預(yù)防。
如上所述,在生物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)相對(duì)于消除系統(tǒng)占有優(yōu)勢(shì)時(shí),由于生物體遭到氧化引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)與各種疾病有關(guān),生物體常常由于氧化應(yīng)激反應(yīng)引起疾病或疾病惡化。因此,為了預(yù)防、治療這類(lèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的疾病,或防止惡化,希望每天攝取適量的抗氧化物質(zhì)。為了每天攝取適當(dāng)?shù)牧?,希望從飲食品中攝取,含有、稀釋和/或添加有本發(fā)明抗氧化用糖制成的飲食品作為抗氧化用食品或抗氧化用飲料,以及作為抗氧化應(yīng)激反應(yīng)食品或抗氧化應(yīng)激反應(yīng)飲料是非常有用的。
由本發(fā)明使用的化合物及糖化合物選擇的化合物也具有保濕性,能夠以其至少1種化合物作為有效成分,制備抗便秘藥、抗便秘用食品、抗便秘用飲料。
另外,按照本發(fā)明還可以提供以在還原末端具有選自式1~6化合物的可溶性糖化合物,例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等低聚糖為有效成分的化妝品。該糖化合物例如能夠由原料物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下作為酸分解產(chǎn)物和/或酶分解產(chǎn)物得到。另外,也可以使用其精制產(chǎn)品、部分精制產(chǎn)品。作為原料物質(zhì),可以單獨(dú)使用或同時(shí)使用2種以上,例如來(lái)源于紅藻類(lèi)的原料物質(zhì),如瓊脂、瓊脂糖、角叉菜膠等。
作為化妝品,能夠以上述化合物作為有效成分,制成面霜、乳液、洗液、洗面奶、粉包等基礎(chǔ)化妝品,口紅、粉底等化妝用化妝品,浴液、肥皂等。另外,對(duì)頭發(fā)也有效,可以制成頭發(fā)滋補(bǔ)劑、洗頭液、固發(fā)乳液、吹發(fā)用制劑、發(fā)乳、發(fā)套等頭發(fā)制品及洗發(fā)劑、染發(fā)劑、頭發(fā)護(hù)理劑等頭發(fā)用化妝用品等護(hù)發(fā)產(chǎn)品?;瘖y品中的含量可以根據(jù)其美白作用、保濕作用、抗氧化作用適當(dāng)決定。化妝品中的其它成分可以使用普通化妝品中所添加的物質(zhì)。另外,美白作用、保濕作用可以按照常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定,例如可以根據(jù)特開(kāi)平8-310937號(hào)公報(bào)記載的方法進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明的化妝品由于對(duì)皮膚具有美白作用、保濕作用、抗氧化作用、抑制活性氧產(chǎn)生作用、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)作用,對(duì)頭發(fā)具有保濕作用、抗氧化作用、抑制活性氧產(chǎn)生作用、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)作用等而顯示優(yōu)良的性質(zhì)。
另外,按照本發(fā)明還可以提供以從選自式1~6的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物,例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等低聚糖作為有效成分的保鮮劑。該化合物例如能夠由原料物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下作為酸分解產(chǎn)物和/或酶分解產(chǎn)物得到。另外,也可以使用其精制產(chǎn)品、部分精制產(chǎn)品。原料物質(zhì)可以單獨(dú)使用或同時(shí)使用2種以上,例如來(lái)源于紅藻類(lèi)的含有選自式1~6化合物的物質(zhì),如瓊脂、瓊脂糖、角叉菜膠等。
從選自式1~6化合物的化合物以及在還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物,例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物具有抗氧化作用、保鮮作用、抑制酪氨酸酶活性的作用,能夠以其作為有效成分按照公知的制劑方法,制備可以有效防止食品變色、腐敗、氧化等的食品保鮮劑。本發(fā)明的保鮮劑對(duì)于保持各種食品、新鮮食品、加工食品等的味道及鮮度非常有效。
確認(rèn)本發(fā)明中使用的從選自式1~6的化合物以及具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的化合物,即使以1g/kg的給藥量給小鼠口服或腹腔給藥,均沒(méi)有急性毒性。
以下,結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明,但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1(1)將市售的瓊脂粉末(和光純藥公司生產(chǎn))400mg懸浮在1N鹽酸20ml中,用微波爐加熱溶解。冷卻溶液,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4,添加384mg的枸櫞酸,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3。向該水溶液中加入水至40ml,120℃下處理4小時(shí)。用氫氧化鈉將該酸分解液調(diào)節(jié)為pH6.5,用0.2μm(Corning公司生產(chǎn))濾器過(guò)濾。
采用含有56℃下處理30分鐘的牛胎兒血清10%的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司生產(chǎn)),在37℃下培養(yǎng)的人前骨髓性白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CCL-240),培養(yǎng)后將該細(xì)胞懸濁于相同的培養(yǎng)基中達(dá)到2500個(gè)/90μl。將該懸濁液分別以每孔90μl注入96孔板中,對(duì)于各個(gè)懸濁液,分別添加10μl的上述酸分解液、上述酸分解液的10倍稀釋物和水,在37℃、5%二氧化碳存在下培養(yǎng),培養(yǎng)開(kāi)始后24小時(shí)及48小時(shí)用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)后,采用“細(xì)胞凋亡試驗(yàn)記錄”〔秀潤(rùn)社,田沼靖一主編,第156頁(yè)(1994)〕中的MTT法,加入5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑翁溴化物(Sigma公司生產(chǎn))的磷酸緩沖食鹽水溶液10μl,再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),加入含有0.04 N鹽酸的2-丙醇100μl,充分?jǐn)嚢?,測(cè)定590nm處的吸光度,比較由測(cè)得的吸光度計(jì)算出的存活細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果,添加上述酸分解液及其10倍稀釋液的培養(yǎng)基中與添加水的相比存活細(xì)胞數(shù)顯著減少。另外,死細(xì)胞中能夠觀察到細(xì)胞凋亡小體。
(2)將瓊脂粉末400mg懸浮在1N的鹽酸20ml中,用微波爐加熱溶解,配制酸分解液。冷卻溶液后,添加50mM的枸櫞酸緩沖液(pH3)20ml,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)為pH6.5,用0.2μm濾器(Corning公司生產(chǎn))過(guò)濾,得到酸分解液。
將該酸分解液及該酸分解液的10倍稀釋液按照與上述實(shí)施例1-(1)相同的方法測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制活性及細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性。結(jié)果,該酸分解液也具有與實(shí)施例1-(1)記載的酸分解液幾乎相同的癌細(xì)胞增殖抑制活性及細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性。
(3)將瓊脂粉末400mg懸浮在1N的鹽酸40ml中,在沸水浴上溶解,得到溶液。將該溶液分成八等分,分別在沸水浴上保持0、30、60、90、120、180、210分鐘后,冷卻,用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)為pH6.5。
將各處理液按照與上述實(shí)施例1-(1)相同的方法測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制增殖活性及細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性。結(jié)果,0分鐘及30分鐘的處理液顯示與實(shí)施例1-(1)記載的酸分解液相同的活性,而60分鐘以上的處理液則不具有這兩種活性。
(4)分別將300mg的瓊脂粉末懸浮在30ml的1、0.5、0.25、0.13、0.063、0.031、0.016、0.0078N的鹽酸中,在沸水浴上保持10分鐘,制成溶液。冷卻該溶液后,用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)為pH6.5。
將各處理液按照與上述實(shí)施例1-(1)相同的方法測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制增殖活性及細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性。結(jié)果,由1N(pH0.05)至0.063N(pH1.3)的鹽酸處理液顯示與實(shí)施例1-(1)記載的酸分解液相同的活性。在鹽酸濃度低于0.063N時(shí),隨著鹽酸濃度降低活性減小,但即使在0.0078N的鹽酸處理液中也能夠檢測(cè)出這兩種活性。
(5)分別將400mg的瓊脂粉末添加到40ml的1N鹽酸及0.12N鹽酸中,在沸水浴上保持10分鐘,制成溶液。用2N氫氧化鈉將該溶液中和至pH6.5后,使用具有含10%乙醇的0.2M NaCl的CellulofineGCL-25作為洗脫液進(jìn)行凝膠過(guò)濾。接著對(duì)各洗脫液,按照與上述實(shí)施例1-(1)相同的方法測(cè)定其對(duì)于HL-60細(xì)胞的抑制增殖活性及細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性。另外增殖抑制活性作為相對(duì)活性如下所述進(jìn)行測(cè)定。
添加各洗脫液,將HL-60細(xì)胞培養(yǎng)3天,按照實(shí)施例1-(1)記載的MTT法求得590nm處的吸光度(Abs T)。
添加用于凝膠過(guò)濾的洗脫液代替洗脫液,培養(yǎng)HL-60細(xì)胞,按照實(shí)施例1-(1)記載的MTT法求得590nm處的吸光度(Abs C)。
相對(duì)活性AbsC-AbsT圖1表示瓊脂0.12N鹽酸分解產(chǎn)物的凝膠過(guò)濾洗脫圖。圖中縱軸表示用苯酚硫酸法測(cè)定的洗脫液中的糖含量(吸光度480nm白色圓圈)或相對(duì)活性(黑色圓圈),橫軸表示流份號(hào)(每1流份12ml)。
圖2表示瓊脂1N鹽酸分解產(chǎn)物的凝膠過(guò)濾洗脫圖。圖中縱軸表示用苯酚硫酸法測(cè)定的洗脫液中的糖含量(吸光度480nm白色圓圈)或相對(duì)活性(黑色圓圈),橫軸表示流份號(hào)(每1流份12ml)。
如圖1、圖2所示,瓊脂的酸分解產(chǎn)物具有抑制癌細(xì)胞增殖的活性,另外在死細(xì)胞中能夠觀察到細(xì)胞凋亡小體。
分別合并圖1中流份號(hào)為51~64的洗脫液、及流份號(hào)為65~84的洗脫液,配制用于誘發(fā)細(xì)胞凋亡和/或用于抗癌的糖化合物。
分別合并圖2中流份號(hào)為60~78的洗脫液、及流份號(hào)為79~95的洗脫液,制成用于誘發(fā)細(xì)胞凋亡和/或用于抗癌的糖化合物。實(shí)施例2(1)將市售的瓊脂(Agar Noble,Difo公司生產(chǎn))1g懸浮于0.1N鹽酸100ml中,用微波爐加熱直到沸騰使之溶解。冷卻到室溫,調(diào)節(jié)為pH6后,用Cosmonice濾器(Nacalai Tesque公司生產(chǎn))過(guò)濾,將其濾液2ml采用以下逆相HPLC分離。
柱TSK-gel ODS 80Ts(20mm×250mm,Toso(東ソ)公司生產(chǎn))TSK guard column ODS-80Ts(20mm×50mm,Toso公司生產(chǎn))移動(dòng)相0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液流速9ml/分檢測(cè)215nm處的吸光度分別在各洗脫峰收集,在減壓下干固后,溶解于300μl水中。將各流分過(guò)濾滅菌,向96孔微孔板中每孔加入10μl。向其中加入含有5000個(gè)HL-60細(xì)胞(ATCC CCL-240)的含10%牛胎兒血清(Gibco公司生產(chǎn))的RPMI 1640培養(yǎng)基(Nissui公司生產(chǎn))90μl,在5%二氧化碳存在下,在37℃培養(yǎng)48小時(shí)。用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)后,加入5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑翁溴化物磷酸緩沖食鹽水溶液10μl,再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),加入含有0.04N鹽酸的2-丙醇100μl,充分?jǐn)嚢?,?90nm處測(cè)定吸光度,以其作為細(xì)胞增殖度。
結(jié)果在添加了8.26分鐘的峰處收集的流分的組中,可以觀察到細(xì)胞凋亡小體,與添加水的對(duì)照組相比,在590nm處的吸光度低,抑制了細(xì)胞增殖。
(2)將實(shí)施例2-(1)記載的在8.26分鐘的峰處收集的流份100μl采用下述尺寸排阻HPLC色譜法進(jìn)行分離。
柱TSK-gelα-2500(7.8mm×300mm,Toso公司生產(chǎn))TSK guard columnα(6mm×40mm,Toso公司生產(chǎn))移動(dòng)相0.01%TFA水溶液流速0.8ml/分檢測(cè)示差折射計(jì)采用尺寸排阻HPLC色譜法的分離圖如圖3所示。也就是說(shuō),圖3是瓊脂酸分解產(chǎn)物的尺寸排阻HPLC色譜圖,橫軸表示洗脫時(shí)間(分),縱軸表示示差折射計(jì)的輸出量。
分別收集分離得到的各峰,在減壓條件下干固。將各流份溶解于水使之達(dá)到10mg/ml,過(guò)濾滅菌后,按照上述實(shí)施例2-(1)的方法測(cè)定細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性和抑制癌細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果,在洗脫時(shí)間為8.87分鐘和9.40分鐘的峰具有這兩種活性。
將洗脫時(shí)間為8.87分鐘的物質(zhì)與洗脫時(shí)間為9.40分鐘的物質(zhì)溶解于磷酸緩沖食鹽水,在37℃下放置1小時(shí)后,同樣用尺寸排阻HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果,任何一種試樣均可見(jiàn)洗脫時(shí)間8.87分鐘和9.40分鐘的峰,且峰面積的比幾乎相同。因此,確認(rèn)在磷酸緩沖水溶液狀態(tài)下,洗脫時(shí)間為8.87分鐘與9.40分鐘的物質(zhì)處于平衡狀態(tài)。
將在洗脫時(shí)間8.87分鐘和9.40分鐘的峰處收集的流份合并,在減壓條件下干固,得到具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性的物質(zhì)。
(3)采用DX302質(zhì)量分析計(jì)(日本電子公司生產(chǎn))對(duì)實(shí)施例2-(2)記載的具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性的物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量分析。使用甘油作為基質(zhì),用陰離子方式進(jìn)行測(cè)定。FAB-MSm/z 323[M-H]-415[M+甘油-H]-507[M+2甘油-H]-其結(jié)果如圖4所示。也就是說(shuō),圖4是具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性的物質(zhì)的質(zhì)譜圖,橫軸表示m/z值,縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度(%)。
測(cè)定由實(shí)施例2-(2)得到的細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性物質(zhì)的核磁共振光譜。核磁共振裝置采用JNM-A500(日本電子公司生產(chǎn))。1H-NMRδ3.36(1H,dd,J=8.0,10.0Hz)、3.51(1H,dd,J=3.0,10.0Hz)、3.56(1H,m)、3.58(1H,m)、3.63(1H,m)、3.67(1H,m)、3.70(1H,dd,J=3.0,10.0Hz)、3.77(1H,d,J=3.0Hz)、3.83(1H,dd,J=4.5,10.0Hz)、3.93(1H,dd,J=5.0,3.5Hz)、4.23(1H,m)、4.25(1H,m)、4.41(1H,d,J=8.0Hz)、4.85(1H,d,J=6.0Hz)將試樣溶解于重水,HOD的化學(xué)位移值為4.65ppm。13C-NMRδ61.9、69.4、71.5、73.37、73.42、73.8、76.0、76.1、83.7、86.5、90.7、103.3將試樣溶解于重水,二氧六環(huán)的化學(xué)位移值為67.4ppm。
圖5表示細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性物質(zhì)的1H-NMR光譜圖。在圖5中,橫軸表示化學(xué)位移值(ppm),縱軸表示信號(hào)強(qiáng)度。
另外,將試樣溶解于重二甲基亞砜,并測(cè)定1H-NMR光譜。
1H-NMRδ9.60(1H,醛的H)圖6表示細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性物質(zhì)在重二甲基亞砜溶劑中的1H-NMR光譜。在圖6中,橫軸表示化學(xué)位移值(ppm),縱軸表示信號(hào)強(qiáng)度。
根據(jù)這些質(zhì)量分析、1H-NMR、13C-NMR的解析結(jié)果,鑒定實(shí)施例2-(2)記載的細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性物質(zhì)為瓊脂二糖。另外,通過(guò)在重二甲基亞砜溶劑中的1H-NMR表明瓊脂二糖還原末端的3,6-脫水半乳糖在非水溶劑中主要以開(kāi)環(huán)后的醛異構(gòu)體存在。另外,通過(guò)重水溶劑中的1H-NMR表明在水溶液中作為醛異構(gòu)體的水合物存在。
以上結(jié)果表明實(shí)施例2-(2)得到的細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性物質(zhì)為瓊脂二糖。
(4)將實(shí)施例2-(2)得到的細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌性物質(zhì),即瓊脂二糖溶解于水中,使之達(dá)到0.78mg/ml,在96孔微孔板的每孔中加入10μl,按照上述實(shí)施例2-(1)記載的方法測(cè)定細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性和抑制癌細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果,在光學(xué)顯微鏡中可見(jiàn)細(xì)胞凋亡小體,與添加水的對(duì)照組相比,添加瓊脂二糖的組抑制細(xì)胞增殖約86%。也就是說(shuō),瓊脂二糖在78μg/ml的濃度下對(duì)HL-60細(xì)胞可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。實(shí)施例3(1)將市售的瓊脂(Agar Noble)2.5g懸浮于0.1N HCl 50ml中,在100℃下加熱13分鐘使之溶解。冷卻至室溫,用NaOH中和到pH中性附近后,用Cosmonice濾器(Nacalai Tesque公司生產(chǎn))過(guò)濾,用以下正相HPLC進(jìn)行分離。
柱TSK-gel Amide-80(21.5mm×300mm,Toso公司生產(chǎn))溶劑A90%乙腈水溶液溶劑B50%乙腈水溶液流速5ml/分洗脫由溶劑A到溶劑B的直線濃度梯度(80分鐘)→溶劑B(20分鐘)檢測(cè)195nm處的吸光度試樣處理量2ml分別收集保留時(shí)間為66.7分鐘、78.5分鐘和85.5分鐘的峰,進(jìn)行質(zhì)量分析,確認(rèn)這些物質(zhì)分別為瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂六糖。采用上述HPLC反復(fù)分離8次,在減壓條件下干固,得到122mg瓊脂二糖、111mg瓊脂四糖和55mg瓊脂六糖。
其結(jié)果如圖7~圖10所示。也就是說(shuō),圖7表示瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂六糖的正相HPLC洗脫圖,橫軸表示保留時(shí)間(分鐘),縱軸表示195nm處的吸光度。圖8表示66.7分鐘的峰的質(zhì)譜圖,橫軸表示m/z值,縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度(%)。圖9是78.5分鐘的峰的質(zhì)譜圖,橫軸表示m/z值,縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度(%)。圖10是85.5分鐘的峰的質(zhì)譜圖,橫軸表示m/z值,縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度(%)。
(2)在實(shí)施例3-(1)所得瓊脂二糖的100mM水溶液450μl中加入10倍濃度的磷酸緩沖食鹽水(寶酒造公司生產(chǎn),T900)50μl和10單位/μl的β-半乳糖甙酶(Sigma公司生產(chǎn),G5635)磷酸緩沖食鹽水溶液50μl混合,在37℃使之反應(yīng)1小時(shí)。
在該反應(yīng)液中加入5ml的1-丁醇∶乙醇=1∶1混合溶液后,通過(guò)離心除去不溶物。采用柱色譜法用硅膠BW-300SP(3×50cm,富士Silysia化學(xué)公司生產(chǎn))處理該液體,以1-丁醇∶乙醇∶水=5∶5∶1作為洗脫液,用壓縮機(jī)加壓至0.3kg/cm2,進(jìn)行分離。以1流份7ml進(jìn)行分流,取各流份的一部分,用薄層色譜法進(jìn)行分析,確認(rèn)14號(hào)至17號(hào)的流份中含有高純度的3,6-脫水-L-半乳糖。合并這些流份,在加壓下干燥固化,得到3,6-脫水-L-半乳糖3.8mg。通過(guò)質(zhì)量分析法和核磁共振法確認(rèn)該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
結(jié)果如圖11~圖13所示。也就是說(shuō),圖11是3,6-脫水-L-半乳糖的質(zhì)譜圖,橫軸表示m/z值,縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度(%)。圖12是326-脫水-L-半乳糖在重水溶劑中的1H-NMR光譜圖,圖13是其在重二甲基亞砜溶劑中的1H-NMR光譜圖,橫軸表示化學(xué)位移值(ppm),縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
對(duì)于3,6-脫水-L-半乳糖,在重二甲基亞砜溶劑中的1H-NMR光譜顯示在9.60ppm處有醛的氫的信號(hào),表明在非水溶劑中作為開(kāi)環(huán)的醛異構(gòu)體存在,另外從重水中1H-NMR光譜表明在水溶液中是作為其醛異構(gòu)體的水合物存在。實(shí)施例4(1)將實(shí)施例3所得3,6-脫水-L-半乳糖的20mM水溶液用無(wú)菌水稀釋2倍、4倍和8倍,按照實(shí)施例2-(1)記載的方法測(cè)定細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性和抑制癌細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果,添加3,6-脫水-L-半乳糖的2倍稀釋液的組(終濃度為1mM)可以觀察到細(xì)胞凋亡小體,在590nm處的吸光度達(dá)到添加水的對(duì)照組的2分之1以下。
(2)將實(shí)施例3-(1)所得瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂六糖的50mM水溶液過(guò)濾滅菌,用無(wú)菌水稀釋到2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍。按照實(shí)施例2-(1)記載的方法測(cè)定這些稀釋液對(duì)于各種細(xì)胞抑制其增殖的活性。所用的細(xì)胞和培養(yǎng)基示于表1和表2中。
表1細(xì)胞培養(yǎng)基人前骨髓性白血病細(xì)胞 含有10%牛胎兒血清(Gibco公司HL-60(ATCC CCL 240) 生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基(Nissui公司生產(chǎn))人末梢淋巴細(xì)胞 同上RPMI1778(ATCC CCL 156)小鼠單核細(xì)胞 含有10%牛胎兒血清的DMEM培養(yǎng)RAW264.7(ATCC TIB 71)基(Nissui公司生產(chǎn))人胃癌細(xì)胞 含有10%牛胎兒血清的RPMI1640MKN45(理研g(shù)en bank, 培養(yǎng)基RCB1001)人肝癌細(xì)胞含有10%牛胎兒血清的DMEM培養(yǎng)HepG2(ATCC HB 8065) 基人結(jié)腸腺癌細(xì)胞含有10%牛胎兒血清的McCOY′SHT-29(ATCC HTB38) 培養(yǎng)基(Bio Whittaker公司生產(chǎn))人結(jié)腸腺癌細(xì)胞同上HCT116(ATCC CCL-247)纖維肉瘤 含有10%牛胎兒血清的D-MEN培HT-1080(ATCC CCL-121) 養(yǎng)基(Bio Whittaker公司生產(chǎn))表2細(xì)胞培養(yǎng)基成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 含有10%牛胎兒血清的D-MEN培A-172(ATCC CRL1620) 養(yǎng)基人乳癌細(xì)胞 含有10%牛胎兒血清的DMEM培養(yǎng)MCF7(ATCC HTB-22) 基人乳癌細(xì)胞 含有10%牛胎兒血清的RPMI1640T-47D(ATCC HTB-133) 培養(yǎng)基人膀胱癌細(xì)胞含有10%牛胎兒血清的McCOY’ST24(ATCC HTB-4) 培養(yǎng)基人子宮頸部癌細(xì)胞含有10%牛胎兒血清的DMEM培養(yǎng)HeLa S3(ATCC CCL-22)基人肺癌細(xì)胞 同上A549(ATCC CCL-185)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 含有10%牛胎兒血清的RPMI1640WiDr(ATCC CCL-218) 培養(yǎng)基該結(jié)果表明瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂六糖對(duì)于這些細(xì)胞具有抑制增殖的活性。其結(jié)果如表3所示。另外,表3中的數(shù)字表示590nm處的吸光度與對(duì)照組相比達(dá)到2分之1以下的組中所添加的稀釋液的稀釋倍率,1倍稀釋相當(dāng)于細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度5mM。其次,對(duì)于瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂六糖,以590nm處的吸光度變化為基礎(chǔ),計(jì)算出顯示50%增殖抑制率的濃度(IC50),如表4所示。表3細(xì) 胞 瓊脂二糖 瓊脂四糖 瓊脂六糖HL-60 32 64 64RPMI178864 128128RAW264.716 32 32MKN45 8 16 16HepG2 8 8 16HT-29 8 16 32HCT116 16 32 32HT-1080 8 16 16A-172 16 16 16MCF716 16 16T-47D 16 16 16T24 8 8 8HeLa S3 8 8 16A5498 8 16WiDr8 8 16表4IC50(μM)細(xì)胞瓊脂二糖瓊脂四糖瓊脂六糖HL-60 170 97 78RPMI1788 44 28 22RAW264.7 179 133 109MKN45 344 196 166HepG2 652 413 430HT-29 622 208 144HCT116244 158 136HT-1080 317 216 185A-172 289 185 151MCF7 274 276 238T-47D 210 183 158T24 352 399 365HeLa S3 353 400 334A549 570 494 279WiDr 405 399 334實(shí)施例5將市售的瓊脂5g懸浮于0.1N HCl 50ml中,在100℃下加熱13分鐘使之溶解。將冷卻到室溫后,用NaOH中和到pH中性附近的本發(fā)明的加熱處理液2ml供給到填充有用水洗滌后的活性炭(60-150目,Nacalai Tesque公司生產(chǎn),079-21)的柱子(10×255mm)中處理該加熱處理液。用200ml水洗滌后,依次用2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、35%、40%、45%和50%的乙醇水溶液各200ml洗脫。
將各洗脫流份在加壓條件下濃縮10倍,于硅膠板60F254(Merck公司生產(chǎn))上點(diǎn)樣,用1-丁醇∶乙醇∶水=5∶5∶1展開(kāi)后,用苔黑酚試劑〔將400mg苔黑素一水合物(Nacalai Tesque公司生產(chǎn))溶解于22.8ml硫酸,加水至200ml得到的物質(zhì)〕噴霧,觀察斑點(diǎn)。
結(jié)果,在5%和7.5%乙醇水溶液洗脫流份中含有瓊脂二糖的純度較高,在15%和17.5%乙醇水溶液洗脫流份中含有瓊脂四糖的純度較高,在22.5%和25%乙醇水溶液洗脫流份中含有瓊脂六糖純度較高,在27.5%和30%乙醇水溶液洗脫流份中含有瓊脂八糖純度較高。實(shí)施例6實(shí)施例5得到的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖和瓊脂八糖(以下有時(shí)將這些低聚糖稱(chēng)為瓊脂低聚糖)溶解于水中使之達(dá)到2.5mM和1.25mM,過(guò)濾滅菌。將HL-60細(xì)胞懸浮于含有10%牛胎兒血清的RPMI1640培養(yǎng)基中使之達(dá)到2.5×105個(gè)/4.5ml,添加上述各低聚糖水溶液0.5ml,在5%二氧化碳存在下,在37℃培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。取一部分細(xì)胞培養(yǎng)液,加入錐蟲(chóng)藍(lán),用顯微鏡觀察,測(cè)定存活細(xì)胞數(shù)。結(jié)果,各組與添加水的組(對(duì)照組)相比存活細(xì)胞數(shù)均減少,可以觀察到細(xì)胞凋亡小體。
其結(jié)果如圖14、圖15所示。也就是說(shuō),圖14是表示添加最終濃度為250μM的低聚糖培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間和存活細(xì)胞數(shù)的圖,圖15是表示添加最終濃度為125μM的低聚糖培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間和存活細(xì)胞數(shù)的圖。在圖14和圖15中,橫軸表示培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí)),縱軸表示存活細(xì)胞數(shù)(×105/5ml),黑圓圈(●)表示添加水(對(duì)照),菱形(◇)表示添加瓊脂二糖,白圓圈(○)表示添加瓊脂四糖,三角形(△)表示添加瓊脂六糖,正方形(□)表示添加瓊脂八糖。實(shí)施例7(1)將κ-角叉菜膠(Sigma公司生產(chǎn),C-1263)或λ-角叉菜膠(和光純藥公司生產(chǎn),038-14252)0.2g懸濁于0.1N HCl 20ml中,在95℃加熱10分鐘。用1NNaOH中和后,用水稀釋1.5倍、2.25倍、3.38倍和5.06倍,按照實(shí)施例2-(1)的方法測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制活性。結(jié)果,添加了κ-角叉菜膠加熱物1.5倍、2.25倍和3.38倍稀釋液的組以及添加了λ-角叉菜膠加熱物1.5倍和2.25倍稀釋液的組,其590nm處的吸光度達(dá)到添加水的對(duì)照組的2分之1以下,另外可見(jiàn)細(xì)胞凋亡小體。
(2)將市售瓊脂(Agar Noble)、瓊脂糖L03(寶酒造公司生產(chǎn))以及市售的棒狀瓊脂分別懸濁于0.1N HCl中使之達(dá)到1%,在100℃加熱15分鐘。將該加熱液冷卻后,用1N NaOH中和,之后用水稀釋2倍、4倍、8倍和16倍,按照實(shí)施例2-(1)的方法測(cè)定對(duì)于HL-60細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制活性。結(jié)果,添加了瓊脂和瓊脂糖酸分解產(chǎn)物2~8倍稀釋液的組和添加了棒狀瓊脂酸分解產(chǎn)物2倍、4倍稀釋液的組,其590nm處的吸光度達(dá)到添加水的對(duì)照組的2分之1以下,另外可見(jiàn)細(xì)胞凋亡小體。
采用正相HPLC對(duì)上述酸分解產(chǎn)物分別進(jìn)行分析時(shí),各分解產(chǎn)物均可以檢測(cè)出以瓊脂二糖為主的瓊脂低聚糖。實(shí)施例8(1)將市售瓊脂懸浮于下述酸的水溶液中,使其濃度達(dá)到1%。0.5M、1M或2M枸櫞酸;0.1M、0.5M、1M或2M硝酸;0.1M或0.5M硫酸;0.1M、0.5M或1M磷酸;0.1M鹽酸。
用微波爐將這些瓊脂懸濁液加熱到溶解后,用NaOH中和,用蒸餾水稀釋到2、4、8、16或32倍,按照實(shí)施例2-(1)記載的方法測(cè)定對(duì)于HL-60細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性和抑制癌細(xì)胞增殖的活性。
結(jié)果,進(jìn)行了上述各種酸加熱處理的瓊脂對(duì)于HL-60細(xì)胞可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。其結(jié)果如表5所示。另外,表5中的數(shù)字表示590nm處的吸光度與添加水的對(duì)照組相比達(dá)到2分之1以下的稀釋液的稀釋倍率。另外,括號(hào)中的數(shù)字表示不加瓊脂本實(shí)施例中使用的最大濃度的酸用NaOH中和后,用蒸餾水稀釋之后添加時(shí),590nm處的吸光度與添加水的對(duì)照組相比達(dá)到2分之1以下的稀釋液的稀釋倍率。表50.1M0.5M 1M 2M枸櫞酸 4 8 16(8)硝酸8 1616(2)硫酸8 16(2)磷酸4 8 16(1)鹽酸16(2)采用以下正相HPLC對(duì)實(shí)施例8-(1)得到的瓊脂酸加熱處理產(chǎn)物進(jìn)行分析。
柱PALPAK type S(4.6×250mm,寶酒造公司生產(chǎn),CA8300)溶劑A90%乙腈水溶液溶劑B50%乙腈水溶液流速1ml/分洗脫溶劑A(10分鐘)→由溶劑A至溶劑B的直線濃度梯度(40分鐘)→溶劑B(10分鐘)檢測(cè)195nm處的吸光度柱溫度40℃結(jié)果在0.5M、1M、2M枸櫞酸;0.1M、0.5M、1M、2M硝酸;0.1M、0.5M硫酸;0.1M、0.5M、1M磷酸;0.1M鹽酸中進(jìn)行加熱處理的試樣中含有以瓊脂二糖為主的瓊脂低聚糖。
其代表性的結(jié)果如圖16所示。也就是說(shuō),圖16是在0.5M磷酸中進(jìn)行加熱處理后的瓊脂的正相HPLC洗脫圖,橫軸表示保留時(shí)間(分鐘),縱軸表示195nm處的吸光度。實(shí)施例9將市售的瓊脂(伊那瓊脂型S-7,伊那食品工業(yè)公司生產(chǎn))5g懸濁于20、50或100mM枸櫞酸45ml中,在95℃下加熱,在加熱下述時(shí)間后取一部分樣。
20mM枸櫞酸處理產(chǎn)物310分鐘、350分鐘、380分鐘、440分鐘和530分鐘;50mM枸櫞酸處理產(chǎn)物100分鐘、120分鐘、140分鐘、160分鐘、180分鐘、200分鐘、220分鐘、240分鐘、260分鐘、290分鐘和320分鐘;100mM枸櫞酸處理產(chǎn)物60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、120分鐘、140分鐘、160分鐘、180分鐘、200分鐘、220分鐘和240分鐘。
將各試樣的10倍稀釋液1μl在硅膠60板F254(Merck公司生產(chǎn))上點(diǎn)樣,用1-丁醇∶乙醇∶水=5∶5∶1展開(kāi),用苔黑酚-硫酸法檢測(cè)。
其結(jié)果,各試樣中均含有瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖等的瓊脂低聚糖。
20mM枸櫞酸處理產(chǎn)物中瓊脂低聚糖的含量增加到加熱350分鐘,之后幾乎達(dá)到恒量。
50mM枸櫞酸處理產(chǎn)物中瓊脂低聚糖的含量增加到加熱200分鐘,之后幾乎達(dá)到恒量。
100mM枸櫞酸處理產(chǎn)物中瓊脂低聚糖的含量增加到加熱160分鐘,之后幾乎達(dá)到恒量。
用越高濃度的枸櫞酸處理的試樣其最終的瓊脂低聚糖含量越高。
采用與實(shí)施例8-(2)同樣的正相HPLC對(duì)各試樣進(jìn)行分析時(shí),得到與薄層色譜同樣的結(jié)果。但是,100mM枸櫞酸處理產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)比50mM枸櫞酸處理產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)多,隨加熱時(shí)間的增加雜質(zhì)也增加。實(shí)施例10(1)將實(shí)施例3-(1)制得的瓊脂二糖溶解至0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM。將各試樣1μl在硅膠60板F254上點(diǎn)樣,用氯仿∶甲醇∶乙酸=7∶2∶2的溶劑展開(kāi)3次,用苔黑酚-硫酸法顯色。顯色后的板通過(guò)FOTODYNE FOTO/Analyst ArchiverEcripse(中心科學(xué)貿(mào)易公司出售)取得圖像數(shù)據(jù),采用圖像解析軟件1-D Basic(Advanced American Biotechnology公司生產(chǎn))對(duì)該圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像處理,使各種濃度瓊脂二糖的斑點(diǎn)強(qiáng)度數(shù)值化,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖17所示。也就是說(shuō),圖17是瓊脂二糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,將斑點(diǎn)強(qiáng)度相對(duì)于各種濃度的瓊脂二糖作圖,橫軸表示瓊脂二糖的濃度(mM),縱軸表示斑點(diǎn)強(qiáng)度。另外,圖17中的計(jì)算公式表示斑點(diǎn)強(qiáng)度(y)與瓊脂二糖的濃度(x)之間的關(guān)系,對(duì)于瓊脂二糖濃度未知的試樣,可以通過(guò)得到的斑點(diǎn)強(qiáng)度由計(jì)算公式計(jì)算出瓊脂二糖的濃度。
另外,同樣的制作實(shí)施例5得到的瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)將市售的瓊脂(Agar Noble)0.2g懸濁于水90ml中,采用微波爐加熱溶解,冷卻到室溫附近。向其中加入1M HCl或1M枸櫞酸10ml,分別配制0.2%瓊脂0.1M HCl溶液和0.2%瓊脂0.1M枸櫞酸溶液。將該溶液在90℃加熱,在5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、21小時(shí)各時(shí)刻取樣。將各試樣按照實(shí)施例10-(1)記載的方法進(jìn)行薄層色譜分析,求出斑點(diǎn)強(qiáng)度,計(jì)算出瓊脂二糖的濃度。另外,在瓊脂二糖濃度為0.05mM至1mM的范圍將各試樣適當(dāng)稀釋。
圖18、圖19表示對(duì)于0.2%瓊脂0.1M HCl溶液和0.2瓊脂0.1M枸櫞酸溶液其加熱時(shí)間和瓊脂二糖產(chǎn)量之間的關(guān)系。也就是說(shuō),圖18表示對(duì)于0.2%瓊脂0.1M HCl溶液其加熱時(shí)間和瓊脂二糖產(chǎn)量之間的關(guān)系,圖19表示對(duì)于0.2%瓊脂0.1M枸櫞酸溶液其加熱時(shí)間和瓊脂二糖產(chǎn)量之間的關(guān)系。圖18、圖19中,橫軸表示加熱時(shí)間(小時(shí)),縱軸表示瓊脂二糖的濃度(mM)。
如圖18所示,確認(rèn)在0.2%瓊脂0.1M HCl溶液中,1小時(shí)后瓊脂二糖的濃度達(dá)到最高,之后減少。另外,如圖19所示,確認(rèn)在0.2%瓊脂0.1M枸櫞酸溶液中,瓊脂二糖的濃度緩慢增加到8小時(shí),第21小時(shí)減少。另外,0.2%瓊脂0.1M HCl溶液的5分鐘加熱試樣以及0.2%瓊脂0.1M枸櫞酸溶液的5、10、20分鐘加熱試樣中瓊脂二糖的濃度為檢測(cè)限以下。
(3)將Agar Noble懸濁于5、50、500mM枸櫞酸中使之達(dá)到10%,在65、80、95℃加熱,在加熱后30分鐘、1、2、4、8、24小時(shí)取樣,按照實(shí)施例10-(1)記載的方法測(cè)定瓊脂低聚糖的產(chǎn)量。
結(jié)果,將瓊脂溶解于5 mM枸櫞酸的場(chǎng)合,80℃下生成一些瓊脂低聚糖,65℃下幾乎不生成瓊脂低聚糖。95℃下,瓊脂二糖在8~24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖也在8~24小時(shí)顯示高值。將瓊脂溶解于50mM枸櫞酸的場(chǎng)合,65℃下幾乎不生成瓊脂低聚糖。80℃下瓊脂二糖在24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖在4~8小時(shí)顯示高值。95℃下,瓊脂二糖在24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖在4~8小時(shí)顯示高值。將瓊脂溶解于500mM枸櫞酸的場(chǎng)合,65℃下在4~24小時(shí)生成了一些瓊脂低聚糖。80℃下瓊脂二糖在2~24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖、瓊脂六糖在1~6小時(shí)顯示高值。瓊脂八糖在1~2小時(shí)顯示高值。95℃下瓊脂二糖在1~24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖在1~2小時(shí)顯示高值。瓊脂六糖、瓊脂八糖在30分鐘~1小時(shí)顯示高值。
采用500mM枸櫞酸水解的例子如圖20和圖21所示。也就是說(shuō),圖20是表示500mM枸櫞酸、80℃下瓊脂低聚糖生成的圖,圖中縱軸表示瓊脂低聚糖的產(chǎn)量(圓圈瓊脂二糖;三角形瓊脂四糖;正方形瓊脂六糖;×形瓊脂八糖),橫軸表示時(shí)間。另外,圖21是表示500 mM枸櫞酸、95℃下瓊脂低聚糖生成的圖,圖中縱軸表示瓊脂低聚糖的產(chǎn)量(圓圈瓊脂二糖;三角形瓊脂四糖;正方形瓊脂六糖;×形瓊脂八糖),橫軸表示時(shí)間。
(4)使用50、500、1000mM的醋酸,采用與實(shí)施例10-(3)相同的方法,測(cè)定瓊脂低聚糖的生成。
其結(jié)果,將瓊脂溶解于50mM醋酸時(shí),80℃下生成一些瓊脂低聚糖,65℃下幾乎不生成瓊脂低聚糖。將瓊脂溶解于500mM醋酸時(shí),65℃下幾乎不生成瓊脂低聚糖。80℃和95℃下生成一些瓊脂低聚糖。將瓊脂溶解于1000mM醋酸時(shí),65℃下幾乎不生成瓊脂低聚糖。80℃下在24小時(shí)瓊脂二糖顯示高值,在8小時(shí)生成一些瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖。95℃下瓊脂二糖在8小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖也在8小時(shí)顯示高值。
(5)使用60、600、1200mM的乳酸,按照與實(shí)施例10-(3)相同的方法測(cè)定瓊脂低聚糖的生成。
該結(jié)果,將瓊脂溶解于60mM乳酸中時(shí),95℃下生成一些瓊脂低聚糖,65、80℃下幾乎不生成瓊脂低聚糖。將瓊脂溶解于600mM乳酸中時(shí),80℃下瓊脂二糖在8~24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖、瓊脂六糖在4~8小時(shí)顯示高值。瓊脂八糖在4小時(shí)顯示高值。95℃下瓊脂二糖在4~8小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖、瓊脂六糖在2~6小時(shí)顯示高值。將瓊脂溶解于1200mM乳酸中時(shí),80℃下瓊脂二糖在4~24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖、瓊脂六糖在2~6小時(shí)顯示高值。瓊脂八糖在2小時(shí)顯示高值。95℃下瓊脂二糖在2~8小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖、瓊脂六糖在1~2小時(shí)顯示高值。
采用1200mM乳酸水解的例子如圖22和圖23所示。也就是說(shuō),圖22是表示1200mM乳酸、80℃下瓊脂低聚糖生成的圖,圖中縱軸表示瓊脂低聚糖產(chǎn)量(圓圈瓊脂二糖;三角形瓊脂四糖;正方形瓊脂六糖;×形瓊脂八糖),橫軸表示時(shí)間。另外,圖23是表示1200mM乳酸、95℃下瓊脂低聚糖生成的圖,圖中縱軸表示瓊脂低聚糖產(chǎn)量(圓圈瓊脂二糖;三角形瓊脂四糖;正方形瓊脂六糖;×形瓊脂八糖),橫軸表示時(shí)間。
(6)使用20、200、1000mM的蘋(píng)果酸,按照與實(shí)施例10-(3)相同的方法測(cè)定瓊脂低聚糖的生成。
其結(jié)果,將瓊脂溶解于20mM蘋(píng)果酸中時(shí),95℃下生成一些瓊脂低聚糖,65、80℃下幾乎不生成瓊脂低聚糖。將瓊脂溶解于200mM蘋(píng)果酸中時(shí),65℃下在24小時(shí)生成一些瓊脂低聚糖。80℃下瓊脂二糖在8~24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖在4~8小時(shí)顯示高值。瓊脂六糖在4小時(shí)顯示高值。瓊脂八糖在4小時(shí)顯示高值。95℃下瓊脂二糖在4~8小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖在4小時(shí)顯示高值。將瓊脂溶解于1000mM蘋(píng)果酸中時(shí),65℃下在24小時(shí)生成一些瓊脂低聚糖。80℃下瓊脂二糖在2~24小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖在2~6小時(shí)顯示高值。瓊脂六糖、瓊脂八糖在2小時(shí)顯示高值。95℃下瓊脂二糖在1~8小時(shí)顯示高值,瓊脂四糖在1~2小時(shí)顯示高值。瓊脂六糖、瓊脂八糖在1小時(shí)顯示高值。
采用1000mM蘋(píng)果酸水解瓊脂的例子如圖24和圖25所示。也就是說(shuō),圖24是表示1000mM蘋(píng)果酸、80℃下瓊脂低聚糖生成的圖,圖中縱軸表示瓊脂低聚糖產(chǎn)量(圓圈瓊脂二糖;三角形瓊脂四糖;正方形瓊脂六糖;×形瓊脂八糖),橫軸表示時(shí)間。另外,圖25是表示1000mM蘋(píng)果酸、95℃下瓊脂低聚糖生成的圖,圖中縱軸表示瓊脂低聚糖產(chǎn)量(圓圈瓊脂二糖;三角形瓊脂四糖;正方形瓊脂六糖;×形瓊脂八糖),橫軸表示時(shí)間。
(7)將Agar Noble懸濁于100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mM的蘋(píng)果酸中使之達(dá)到10%,在70、80、90℃加熱。加熱后在30分鐘、1、2、3、4、8、24小時(shí)取樣,按照與實(shí)施例10-(3)相同的方法測(cè)定瓊脂低聚糖的生成。
在300mM以上的蘋(píng)果酸濃度下,即使在70℃,8小時(shí)以上也可生成較多的瓊脂低聚糖。1000mM、70℃下水解的例子如圖26所示。也就是說(shuō),圖26是表示1000mM蘋(píng)果酸、70℃下瓊脂低聚糖生成的圖,圖中縱軸表示瓊脂低聚糖產(chǎn)量(圓圈瓊脂二糖;三角形瓊脂四糖;正方形瓊脂六糖;×形瓊脂八糖),橫軸表示時(shí)間。
根據(jù)上述實(shí)施例10-(3)~(7)的結(jié)果,用于制備瓊脂低聚糖的酸優(yōu)選枸櫞酸、乳酸、蘋(píng)果酸,酸的濃度優(yōu)選數(shù)十mM至數(shù)M,加熱溫度優(yōu)選70~95℃,加熱時(shí)間優(yōu)選數(shù)十分鐘至24小時(shí)。
(8)采用下述方法對(duì)瓊脂二糖進(jìn)行定量,使用F-試劑盒乳糖/半乳糖(Boehringer Mannheim公司生產(chǎn),編號(hào)176303),使β-半乳糖甙酶作用于瓊脂二糖,測(cè)定生產(chǎn)的半乳糖濃度。
按照試劑盒的使用方法進(jìn)行定量,但β-半乳糖甙酶的反應(yīng)改變?yōu)?7℃、1小時(shí)。使用乳糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出按乳糖換算的摩爾濃度(mM)后,轉(zhuǎn)換成瓊脂二糖的濃度(mg/ml)。
使用上述實(shí)施例制得的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖,采用上述方法嘗試進(jìn)行定量。其結(jié)果,瓊脂二糖的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值一致。另一方面,采用上述方法實(shí)質(zhì)上沒(méi)有檢測(cè)出瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖。即說(shuō)明采用上述檢測(cè)方法實(shí)質(zhì)上檢測(cè)不出瓊脂二糖以外的瓊脂低聚糖,也說(shuō)明采用上述方法可以測(cè)定瓊脂低聚糖中的瓊脂二糖濃度。
(9)將市售的瓊脂(伊那瓊脂型S-7伊那食品工業(yè)公司生產(chǎn))100 g和H型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Diaion SK104H三菱化成生產(chǎn))10g在95℃的去離子水900g中混合,在95℃下攪拌的同時(shí)進(jìn)行瓊脂酸分解180分鐘。然后,冷卻到室溫,用活性炭1%W/W以及硅藻土545(Celite公司生產(chǎn))0.5%W/W Body feed過(guò)濾,得到濾液。
采用與實(shí)施例8-(2)相同的正相HPLC對(duì)制得的濾液進(jìn)行分析,確認(rèn)生成了以瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖為主要成分的瓊脂低聚糖。
該濾液pH為2.4,酸度為1.7,白利糖度為9.4%,使用上述實(shí)施例10-(8)記載的F-試劑盒乳糖/半乳糖測(cè)得的瓊脂二糖量為7.4%。
(10)在100g去離子水中加入H型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(DiaionSK104H)18.5g,在95℃下攪拌。以后每隔10分鐘添加1次瓊脂(伊那瓊脂型S-7),每次10g添加5次,之后每次15g添加2次,再每次20g添加3次,最后添加30g。添加的瓊脂總量達(dá)到185g后,在95℃下攪拌150分鐘,然后冷卻到室溫。采用傾瀉法分離樹(shù)脂和液體后,用活性炭3%W/W以及硅藻土545(Celite公司生產(chǎn))0.5%W/W Bodyfeed過(guò)濾分離液,得到濾液。
采用與實(shí)施例8-(2)相同的正相HPLC對(duì)制得的濾液進(jìn)行分析,確認(rèn)生成了以瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖為主要成分的瓊脂低聚糖。
該濾液pH為1.2,酸度為11.9,白利糖度為64%,使用上述實(shí)施例10-(8)記載的F-試劑盒乳糖/半乳糖測(cè)得的瓊脂二糖量為24.4%。
(11)使用市售的瓊脂(伊那瓊脂型S-7)100g,加入各種磷酸濃度的去離子水使之達(dá)到1升,在95℃下攪拌的同時(shí)使瓊脂液化。
另外,使用加入枸櫞酸濃度為1%W/V的去離子水1升的物質(zhì),與磷酸同樣進(jìn)行瓊脂液化。液化是指即使在其冰點(diǎn)也不變成凝膠的狀態(tài),測(cè)定達(dá)到該狀態(tài)的時(shí)間(液化時(shí)間)。另外,使用上述實(shí)施例10-(8)記載的F-試劑盒乳糖/半乳糖測(cè)定液化時(shí)以及之后的瓊脂二糖產(chǎn)量。
其結(jié)果如表6、表7所示。表6磷酸濃度 液化時(shí)間95℃瓊脂二糖(%W/V) (分)保留時(shí)間 (g/升)(分)0.2150150 2.57180 3.80300 7.970.3120120 4.88180 7.04300 13.900.5110110 6.09180 8.48300 21.401.090 907.58120 18.80表7枸櫞酸濃度液化時(shí)間95℃ 瓊脂二糖(%W/V) (分)保留時(shí)間 (g/升)(分)1.0 9090 0.951203.401504.093005.7036014.80實(shí)施例11(1)在市售的瓊脂(伊那瓊脂型S-7,伊那食品工業(yè)公司生產(chǎn))150g、食品添加劑枸櫞酸(酐)(三榮源F·F·I公司生產(chǎn))15g中加入去離子水使之達(dá)到1.5升,溫度上升到92℃后,攪拌條件下在92~95℃保持130分鐘。然后冷卻到室溫,用硅藻土545(Celite公司生產(chǎn))0.5%Body feed過(guò)濾,得到濾液(瓊脂分解低聚糖溶液)。采用與實(shí)施例8-(2)相同的正相HPLC對(duì)制得的濾液進(jìn)行分析,確認(rèn)生成了以瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖為主要成分的瓊脂低聚糖。
該濾液pH為2.6,酸度為0.92,白利糖度為9.2%,采用上述實(shí)施例10-(8)記載的方法測(cè)得的瓊脂二糖產(chǎn)量為43.1mM。
(2)將實(shí)施例11-(1)制得的濾液(瓊脂分解低聚糖溶液)稀釋20倍,添加酸味劑、甜味劑、調(diào)味香料,制備瓊脂二糖2.25mM的清涼飲料。
其配方如表8和表9所示。也就是說(shuō),表8是菩提子味清涼飲料的配方,表9是紫蘇味清涼飲料的配方。
將各表所示的原料加入到水中溶解,配制清涼飲料,分裝到200ml的罐中。將表5所示配方的清涼飲料用二氧化碳飽和,制得氣壓達(dá)到0.8kg/cm2(20℃)的碳酸飲料。
各飲料的分析值如表8、表9的下欄所示。
表8瓊脂分解低聚糖溶液50ml1/7菩提子 20g維生素C 0.2g枸櫞酸0.2g甘露醇1.25g菩提子調(diào)味香料1g去離子水 余量合計(jì) 1000mlpH3.2酸度*0.23白利糖度 2.2酸度*0.1N NaOH ml/10ml(以下相同)表9瓊脂分解低聚糖溶液50ml紫蘇提取物20g維生素C 0.2g枸櫞酸0.2g紫蘇調(diào)味香料 0.5g去離子水 余量合計(jì)1000mlpH2.9酸度*0.10白利糖度 0.6由10名評(píng)審員對(duì)各種本發(fā)明的碳酸飲料進(jìn)行口感評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)分為5段(5良好,1差)。用酸度相同的枸櫞酸液代替瓊脂分解低聚糖溶液作為對(duì)照。
菩提子味的口感評(píng)價(jià)平均值如表10所示,紫蘇味的口感評(píng)價(jià)平均值如表11所示。
表10本發(fā)明產(chǎn)品 對(duì)照味覺(jué)溫和度 4.6 3.1爽滑度 4.8 3.0滋味的平衡 4.5 2.9綜合評(píng)定 4.6 3.1表11本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)照味覺(jué)溫和度4.52.5爽滑度4.32.4滋味的平衡 4.22.5綜合評(píng)定4.32.4將本發(fā)明產(chǎn)品分別與對(duì)照組相比,調(diào)節(jié)了飲料滋味的平衡,味覺(jué)更溫和、爽滑,是具有新味覺(jué)的飲料。另外,用二氧化碳飽和前的清涼飲料也分別與上述相同,是具有新味覺(jué)的本發(fā)明產(chǎn)品的飲料。
(3)在上述表8、表9記載的清涼飲料中加入乙醇進(jìn)行配制,使乙醇達(dá)到6%V/V或8%V/V,分裝到200ml的罐中。然后,將該醇飲料用二氧化碳飽和,制備氣壓達(dá)到0.8kg/cm2(20℃)的本發(fā)明的清涼碳酸醇飲料。
本發(fā)明的清涼碳酸醇飲料與不含有瓊脂分解低聚糖溶液的對(duì)照組相比,調(diào)節(jié)了飲料滋味的平衡,味覺(jué)更溫和、爽滑,是具有新味覺(jué)的清涼碳酸醇飲料。實(shí)施例12(1)如下所述配制含有瓊脂枸櫞酸分解產(chǎn)物的飲料。其配方如表12所示。也就是說(shuō),表12的本發(fā)明產(chǎn)品1使用實(shí)施例11-(1)制得的濾液(瓊脂低聚糖溶液)0.1%W/V、瓊脂(超瓊脂AX-30伊那食品工業(yè)公司生產(chǎn))0.25%W/V和枸櫞酸0.07W/V。本發(fā)明產(chǎn)品2不添加瓊脂低聚糖溶液,使用瓊脂0.25%W/V、枸櫞酸0.08%W/V。本發(fā)明產(chǎn)品1和2是分別將瓊脂溶解于溫水后,與其它材料混合,在酸性條件下93℃加熱10秒,在低于93℃~80℃加熱20分鐘,再在低于80℃~75℃加熱15分鐘,制得含有瓊脂枸櫞酸分解產(chǎn)物的飲料。另一方面,對(duì)照組的配方與本發(fā)明產(chǎn)品2相同,但在93℃下加熱10秒。
對(duì)于含有枸櫞酸分解產(chǎn)物的各種粘稠飲料(本發(fā)明產(chǎn)品1和2),由10名評(píng)審員進(jìn)行口感評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)分為5段(5良好,1差)??诟性u(píng)價(jià)的平均值如表13所示。表12本發(fā)明產(chǎn)品1 本發(fā)明產(chǎn)品2瓊脂(g) 2.5 2.5瓊脂低聚糖溶液(ml) 1.0 01/7菩提子果汁(g)1.5 1.5砂糖(g) 66.0 66.0枸櫞酸(g) 0.7 0.8枸櫞酸鈉(g) 0.5 0.5香料2.0 2.0去離子水余量 余量合計(jì) 1000ml 1000mlpH 3.68 3.67酸度*1.53 1.57白利糖度 7.5 7.4瓊脂二糖(mM)**0.06 0.02瓊脂二糖(mM)**按照實(shí)施例10-(8)記載的方法測(cè)定表13本發(fā)明產(chǎn)品1 本發(fā)明產(chǎn)品2對(duì)照味覺(jué)溫和度4.4 4.13.6爽滑度4.5 4.33.8滋味的平衡 4.4 4.23.6綜合評(píng)定4.5 4.33.7本發(fā)明產(chǎn)品1和本發(fā)明產(chǎn)品2與對(duì)照相比,調(diào)節(jié)了飲料滋味的平衡,粘度適當(dāng),味覺(jué)更溫和、爽滑,是具有新味覺(jué)的飲料。另外,確認(rèn)通過(guò)在枸櫞酸存在下進(jìn)行熱處理,在本發(fā)明產(chǎn)品1和2中產(chǎn)生了抗氧化用的低聚糖、瓊脂二糖,提供了一種含有抗氧化用低聚糖的新型飲料。
另外,分別用在75℃下加熱1日、85℃下加熱5分鐘、103℃下加熱5分鐘、122℃下加熱45秒代替在低于80℃~75℃下加熱15分鐘的加熱條件,按照實(shí)施例10-(8)記載的方法測(cè)定瓊脂二糖的產(chǎn)量,分別為0.03mM、0.02mM、0.04mM和0.05mM,確認(rèn)通過(guò)加熱處理生成了瓊脂二糖,另外加熱條件越強(qiáng),瓊脂二糖產(chǎn)量越高。
(2)在實(shí)施例12-(1)記載的本發(fā)明產(chǎn)品1、本發(fā)明產(chǎn)品2和對(duì)照的飲料中加入乙醇,使乙醇達(dá)到2%V/V或4%V/V,減少相當(dāng)于該量的多余的去離子水,配制醇飲料。
本發(fā)明產(chǎn)品1和本發(fā)明產(chǎn)品2與對(duì)照相比,調(diào)節(jié)了飲料滋味的平衡,粘度適當(dāng),味覺(jué)更溫和、爽滑,是具有新味覺(jué)的飲料。
另外,上述本發(fā)明的醇飲料的凍結(jié)產(chǎn)物具有果汁冰糕樣的良好口感。實(shí)施例13(1)將市售瓊脂(Agar Noble)懸濁于0.1N鹽酸中,使?jié)舛冗_(dá)到1%,在37℃處理5小時(shí)、16小時(shí)或48小時(shí)。用蒸餾水將該處理液稀釋10倍,采用實(shí)施例9記載的薄層色譜法進(jìn)行分析,確認(rèn)處理5小時(shí)僅生成了一點(diǎn)瓊脂低聚糖,處理16小時(shí)的產(chǎn)量比處理5小時(shí)多,處理48小時(shí)產(chǎn)量進(jìn)一步增加。
(2)將市售的瓊脂(Agar Noble)懸濁于磷酸緩沖食鹽水或蒸餾水中,使?jié)舛冗_(dá)到1%,在121℃加熱4小時(shí)。用蒸餾水將該加熱處理物稀釋10倍,采用實(shí)施例9記載的薄層色譜法進(jìn)行分析,確認(rèn)在磷酸緩沖食鹽水中進(jìn)行加熱處理的試樣產(chǎn)生了痕量的瓊脂低聚糖,而在蒸餾水中進(jìn)行加熱處理的試樣則產(chǎn)生了明顯多的瓊脂低聚糖。另外,前者加熱處理后的pH約為7,后者的pH約為5,如果冷卻到室溫,前者變成凝膠,而后者卻不會(huì)變成凝膠。實(shí)施例14(1)將瓊脂(Agar Noble)懸濁于0.1N HCl使?jié)舛冗_(dá)到10%,在100℃加熱19分鐘。采用經(jīng)水平衡后的TOYOPEARL HW40C(TOSO公司生產(chǎn))柱(4.4cm×85cm)處理10ml上述試樣,以水作為移動(dòng)相,以每分鐘1.4ml的流速進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜分析。用示差折射計(jì)檢測(cè)洗脫出的物質(zhì),收集每7ml作為1流份。
確認(rèn)在洗脫時(shí)間406分鐘、435分鐘、471分鐘和524分鐘出現(xiàn)峰,采用實(shí)施例9記載的薄層色譜法對(duì)各峰所對(duì)應(yīng)的流份進(jìn)行分析,它們依次是瓊脂八糖、瓊脂六糖、瓊脂四糖和瓊脂二糖。將這些流份冷凍干燥,得到30mg瓊脂八糖、100mg瓊脂六糖、150mg瓊脂四糖和140mg瓊脂二糖。
(2)分別在實(shí)施例14-(1)所得瓊脂二糖、瓊脂四糖的100mM水溶液25μl中加入100ml L-半胱氨酸水溶液50μl,加入磷酸緩沖食鹽水925μl,在37℃下使之反應(yīng)1小時(shí)或16小時(shí)。用同濃度的L-賴(lài)氨酸水溶液代替L-半胱氨酸水溶液進(jìn)行同樣的反應(yīng)。
用各反應(yīng)試樣1μl在硅膠板60F254上點(diǎn)樣,用1-丁醇∶乙醇∶水=5∶5∶1展開(kāi),用苔黑酚硫酸法檢測(cè)。
其結(jié)果,在L-半胱氨酸的1小時(shí)反應(yīng)試樣中,瓊脂二糖、瓊脂四糖的斑點(diǎn)消失。另外,L-半胱氨酸、L-賴(lài)氨酸的16小時(shí)反應(yīng)試樣中,瓊脂二糖、瓊脂四糖的斑點(diǎn)均消失。
采用與實(shí)施例8-(2)同樣的正相HPLC對(duì)各試樣進(jìn)行分析,得到與薄層色譜分析相同的結(jié)果。
(3)將實(shí)施例14-(2)制得的各反應(yīng)試樣10μl加入到96孔微孔板的孔中,按照實(shí)施例2-(1)記載的方法測(cè)定對(duì)HL-60的癌細(xì)胞增殖抑制活性。
其結(jié)果,瓊脂二糖、瓊脂四糖斑點(diǎn)消失的試樣其活性也消失。也就是說(shuō),瓊脂二糖、瓊脂四糖和L-半胱氨酸的1小時(shí)反應(yīng)試樣以及瓊脂二糖、瓊脂四糖與L-半胱氨酸、L-賴(lài)氨酸的16小時(shí)反應(yīng)試樣,與同濃度的瓊脂二糖、瓊脂四糖相比,細(xì)胞增殖抑制活性達(dá)到約1/10。實(shí)施例15(1)將κ-角叉菜膠(Sigma公司生產(chǎn),C-1263)2.5g懸浮于0.1NHCl 50ml中,在100℃下加熱16分鐘使之溶解。冷卻至室溫,用NaOH中和到pH中性附近后,用Cosmonice濾器過(guò)濾,用以下正相HPLC進(jìn)行分離。
柱PALPAK type S(4.6mm×250mm,寶酒造公司生產(chǎn),CA8300)溶劑A90%乙腈水溶液溶劑B50%乙腈水溶液流速1 ml/分洗脫溶劑A(10分鐘)→由溶劑A到溶劑B的直線濃度梯度(40分鐘)→溶劑B(10分鐘)檢測(cè)215nm處的吸光度柱溫度40℃試樣處理量50μl正相HPLC得到的分離圖如圖27所示。也就是說(shuō),圖27是κ-角叉菜膠酸分解產(chǎn)物的正相HPLC色譜圖,橫軸表示保留時(shí)間(分鐘),縱軸表示215nm處的吸光度。
分別收集各洗脫峰,在加壓下干固后,溶解于100μl水。將各流份過(guò)濾滅菌,按照實(shí)施例2-(1)記載的方法測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制活性。其結(jié)果,在添加了27.797分鐘、33.905~34.784分鐘、36.226~36.654分鐘的各峰處收集的流份的組中,可以觀察到細(xì)胞凋亡小體,與添加水的對(duì)照組相比,在590nm處的吸光度低,抑制了細(xì)胞增殖。
將洗脫時(shí)間27.797分鐘的峰處收集的流份在上述HPLC條件下分離12次,合并,加壓下干固,得到具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性和抗癌活性的物質(zhì)。
(2)采用DK302質(zhì)量分析計(jì)(日本電子公司生產(chǎn))對(duì)實(shí)施例15-(1)記載的具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌活性的物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量分析。使用甘油作為基質(zhì),用陰離子方式進(jìn)行測(cè)定。FAB-MSm/z 403[M-H]-495[M+甘油-H]-其結(jié)果如圖28所示。也就是說(shuō),圖28是具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌活性的物質(zhì)的質(zhì)譜圖,橫軸表示m/z值,縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
測(cè)定由實(shí)施例15-(1)得到的細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌活性物質(zhì)的核磁共振光譜。核磁共振裝置采用JNM-A500(日本電子公司生產(chǎn))。
圖29表示細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌活性物質(zhì)的1H-NMR光譜圖。在圖29中,橫軸表示化學(xué)位移值(ppm),縱軸表示信號(hào)強(qiáng)度。
根據(jù)這些質(zhì)量分析、1H-NMR的解析結(jié)果,鑒定實(shí)施例15-(1)記載的細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌活性物質(zhì)為κ-角叉菜二糖〔β-D-吡喃半乳糖-4-硫酸酯-(1→4)-3,6-脫水-D-半乳糖〕。
以上結(jié)果表明實(shí)施例15-(1)得到的細(xì)胞凋亡誘發(fā)性和抗癌活性物質(zhì)為κ-角叉菜二糖。
(3)將實(shí)施例15-(1)得到的κ-角叉菜二糖溶解于水使之達(dá)到1.56mM,在96孔微孔板的孔中加入10μl,按照實(shí)施例2-(1)記載的方法測(cè)定細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性和癌細(xì)胞增殖抑制活性。結(jié)果,用光學(xué)顯微鏡觀察到細(xì)胞凋亡小體,與添加水的對(duì)照組相比,添加κ-角叉菜二糖的組抑制細(xì)胞增殖約70%。因此,κ-角叉菜二糖在156μM下對(duì)HL-60細(xì)胞可誘發(fā)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。實(shí)施例16(1)將市售瓊脂粉末(和光純藥公司生產(chǎn))4.5g懸濁于0.1N鹽酸150ml中,用微波爐加熱溶解,將溶液在沸水浴上保持10分鐘。進(jìn)行加熱處理后,將該加熱處理瓊脂溶液放冷至室溫,離心分離除去不溶物。然后,回收離心上層清液,用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)為pH6.8。在該離心上層清液150ml中加入等量的乙酸乙酯后,劇烈攪拌,分成乙酸乙酯相和水相。將分離得到的水相用蒸發(fā)器干固后,再度溶解于150ml水,通過(guò)離心分離除去溶解時(shí)的不溶物,得到上層清液。另外,乙酸乙酯相用蒸發(fā)器干固,溶解于100ml離子交換水,用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)為pH6.5。
將乙酸乙酯相、水相用孔徑0.2μm的濾器(Corning公司生產(chǎn))過(guò)濾滅菌后,用水稀釋10、20、30倍,按照與實(shí)施例2-(1)相同的方法測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制活性。其結(jié)果,確認(rèn)水相具有增殖抑制活性,乙酸乙酯相沒(méi)有增殖抑制活性。
將制得的水相溶液50ml用Cellulofine GCL-25柱(41×905mm)凝膠過(guò)濾。洗脫液使用含有10%乙醇的0.2M NaCl。洗脫圖如圖30所示。也就是說(shuō),圖30是表示采用Cellulofine GCL-25進(jìn)行凝膠過(guò)濾結(jié)果的圖,圖中縱軸表示采用苯酚硫酸法測(cè)得的洗脫液中的糖含量(吸光度490nm黑圓圈),橫軸表示流份號(hào)(1流份10ml)。
用各洗脫流份1μl分別在硅膠板60F254(Merck公司生產(chǎn))上點(diǎn)樣,用1-丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶2展開(kāi)后,用苔黑酚試劑〔將400mg的苔黑素一水合物(和光純藥公司生產(chǎn))溶解于22.8ml硫酸,加水至200ml得到的物質(zhì)〕噴霧,用150℃下加熱后的電熱板加熱,觀察斑點(diǎn)。
將采用上述TLC分析對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)的40號(hào)至120號(hào)流份中的每5流份合并,過(guò)濾滅菌,測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制活性。其結(jié)果,86號(hào)至90號(hào)流份具有最強(qiáng)的增殖抑制活性。
(2)回收86至88號(hào)流份,用蒸發(fā)器干固,得到0.94g粉末。將得到的粉末溶解于90%乙醇30ml,用5C濾器(ADVANTEC公司生產(chǎn))除去白色沉淀,采用交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)LH-20柱(35×650mm)進(jìn)行凝膠過(guò)濾。洗脫液使用90%乙醇。洗脫圖如圖31所示。也就是說(shuō),圖31是表示用交聯(lián)葡聚糖LH-20柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾結(jié)果的圖,圖中縱軸表示采用苯酚硫酸法測(cè)得的洗脫液中的糖含量(吸光度490nm黑圓圈),橫軸表示流份號(hào)(每1流份10ml)。
采用與上述相同的硅膠板對(duì)各洗脫流份進(jìn)行分析。
TLC分析結(jié)果檢測(cè)出的各成分大致分為5組流份號(hào)30~35、36~40、41~44、45~48、49~53。每一流份號(hào)125μl合并成上述組,用蒸發(fā)器干固,溶解于500μl離子交換水,測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制活性。
將對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制活性最強(qiáng)的36至40號(hào)流份用蒸發(fā)器干固,溶解于5ml的1-丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶2,用填充有經(jīng)1-丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶2洗滌的硅膠60F254柱(20×710mm)處理。用1-丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶2作為洗脫液(1流份=3ml)。
采用硅膠板對(duì)各洗脫流份進(jìn)行與上述相同的分析。結(jié)果,檢測(cè)出的成分大致分為流份號(hào)46~52(第1組)、60~70(第2組)、72~84(第3組)、86~94(第4組)、96~120(第5組)。
用蒸發(fā)器將各組干固,分別溶解于5ml離子交換水中,用孔徑0.45μm的濾器(IWAKI公司生產(chǎn))過(guò)濾。測(cè)定所得各溶液對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制活性。結(jié)果,確認(rèn)第3、4、5組具有增殖抑制活性。
通過(guò)TLC分析和質(zhì)量分析,確認(rèn)第4、5組的結(jié)構(gòu)為瓊脂二糖。
通過(guò)質(zhì)量分析和NMR分析,確認(rèn)第3組的結(jié)構(gòu)為β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖。圖32是β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖的質(zhì)譜圖,橫軸表示m/z值,縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度(%)。另外,圖33是β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖的1H-NMR光譜圖,橫軸表示化學(xué)位移值(ppm),縱軸表示信號(hào)的強(qiáng)度。
判斷出β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖與瓊脂二糖同樣對(duì)HL-60細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制活性。實(shí)施例17(1)如下所述測(cè)定實(shí)施例3所得來(lái)自瓊脂的糖類(lèi)抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生的活性。
將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)3A(National CollectionOf Type Culture,NCTC 8319)接種在5ml腦心浸出(Brain heartinfusion)培養(yǎng)基(Difco公司生產(chǎn),0037-17-8)中,在37℃培養(yǎng)1夜。通過(guò)離心分離收集菌體,用磷酸緩沖食鹽水洗滌3次后,懸濁于磷酸緩沖食鹽水中,使之達(dá)到1×107菌落形成單位/ml。將100μl上述菌懸濁液、100μl試樣水溶液、100μl的1mg/ml高鐵血紅蛋白(Sigma公司生產(chǎn),M9250)水溶液以及600μl磷酸緩沖食鹽水和100μl的50mM叔丁基氫過(guò)氧化物(片山化學(xué)公司生產(chǎn),03-4990)水溶液混合,在37℃下反應(yīng)30分鐘。加入1ml的2×NMP培養(yǎng)基〔將8g營(yíng)養(yǎng)肉湯(Difco公司生產(chǎn),0003-01-6)、5g胰蛋白胨(Difco公司生產(chǎn),0123-17-3)、5g NaCl、10g甘露醇(Nacalai Tesque公司生產(chǎn),213-03)、0.035g酚紅(Nacalai Tesque公司生產(chǎn),268-07)溶解于蒸餾水,達(dá)到500ml,用NaOH調(diào)節(jié)為pH7.4后,過(guò)濾滅菌得到的物質(zhì)〕,停止反應(yīng),用NMP培養(yǎng)基(用無(wú)菌水將2×NMP培養(yǎng)基稀釋2倍得到的物質(zhì))稀釋3倍,共稀釋12次,在96孔微孔板的各孔中加入160μl,在37℃下培養(yǎng)1夜。用肉眼觀察培養(yǎng)基的顏色,可見(jiàn)菌生長(zhǎng)且培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色的孔中的試樣具有抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生的活性。
其結(jié)果如表14所示。在表14中,+表示可見(jiàn)菌生長(zhǎng)的孔中的試樣,-表示不可見(jiàn)菌生長(zhǎng)的孔中的試樣。另外,表的最上列所示的濃度為叔丁基氫過(guò)氧化物和菌體在37℃下反應(yīng)30分鐘的反應(yīng)液中的試樣濃度。表140.1mM1mM瓊脂二糖+ +瓊脂四糖- +半乳糖 - -以上結(jié)果表明瓊脂二糖和瓊脂四糖具有較強(qiáng)的抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生的活性。角叉菜二糖和3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖也具有同樣的活性。
(2)將市售瓊脂(伊奈瓊脂型S-7,伊奈食品工業(yè)公司生產(chǎn))5g懸濁于50mM枸櫞酸45ml中,在93℃下加熱155分鐘,用NaOH調(diào)節(jié)為pH6得到的試樣(枸櫞酸處理產(chǎn)物),以及懸浮于100mM鹽酸45ml中,在95℃加熱13分鐘,用NaOH調(diào)節(jié)為pH6的試樣(鹽酸處理產(chǎn)物)用水稀釋1、2、4、8、10、100倍,按照與實(shí)施例17-(1)相同的方法測(cè)定抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生的活性。其結(jié)果,確認(rèn)枸櫞酸處理產(chǎn)物、鹽酸處理產(chǎn)物兩者均在稀釋到10倍之前具有活性,兩者具有同等的抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生的活性。實(shí)施例18瓊脂二糖對(duì)刀豆球蛋白(Con A)引起的淋巴細(xì)胞胚細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變的抑制作用由ddY小鼠(日本SLC;雄性,7周齡)摘出脾臟,充分粉碎,懸濁在含有10%牛胎兒血清(HyClone)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中,得到單細(xì)胞液。將細(xì)胞浮游液接種在塑料陪替氏培養(yǎng)皿中,用二氧化碳培養(yǎng)器在37℃下培養(yǎng)2小時(shí),使粘連性細(xì)胞粘附在陪替氏培養(yǎng)皿上,將其除去,以非粘連性細(xì)胞作為脾臟淋巴細(xì)胞使用。將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106細(xì)胞/ml,以200μl/孔接種在96孔微孔板上,在對(duì)照組以外的各孔中添加各種濃度的瓊脂二糖。而且,在所有孔中添加5μg的ConA(刀豆球蛋白),用二氧化碳培養(yǎng)器在37℃下培養(yǎng)1天。培養(yǎng)后在各孔中加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷,再培養(yǎng)1天,用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定攝入細(xì)胞的量。
其結(jié)果如圖34所示。也就是說(shuō),圖34是表示ConA引起的淋巴細(xì)胞胚細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變中瓊脂二糖濃度和3H-胸腺嘧啶核苷攝入量之間關(guān)系的圖,橫軸表示瓊脂二糖濃度,縱軸表示3H-胸腺嘧啶核苷的攝入量(cpm)。白色棒形圖表示沒(méi)有刺激時(shí)3H-胸腺嘧啶核苷的攝入量,斜線棒形圖表示用ConA刺激時(shí)3H-胸腺嘧啶核苷的攝入量。圖34說(shuō)明對(duì)于促細(xì)胞分裂劑刺激引起的小鼠淋巴細(xì)胞增殖,瓊脂二糖具有用量依存的抑制作用,100μg/ml幾乎可以完全抑制,確認(rèn)對(duì)淋巴細(xì)胞的活化具有抑制作用。另外,確認(rèn)3,6-脫水吡喃半乳糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角叉菜二糖和3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖也具有同樣的活性。實(shí)施例19瓊脂二糖對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用由BALB/c小鼠(日本SLC,雄性,6周齡)以及C57BL/6小鼠(日本SLC,雄性,6周齡)摘出脾臟,按照上述方法得到脾臟淋巴細(xì)胞。將各細(xì)胞浮游液的濃度調(diào)整為2×106細(xì)胞/ml,將各100μl混合接種在96孔微孔板上。在對(duì)照組以外的各孔中添加各種濃度的瓊脂二糖,用二氧化碳培養(yǎng)器在37℃下培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后在各孔中加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷,再培養(yǎng)1天,用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定攝入細(xì)胞的量。
其結(jié)果如圖35所示。也就是說(shuō),圖35是表示混合淋巴反應(yīng)中瓊脂二糖濃度和3H-胸腺嘧啶核苷攝入量之間關(guān)系的圖,橫軸表示瓊脂二糖濃度,縱軸表示3H-胸腺嘧啶核苷的攝入量(cpm)。白色棒形圖表示單獨(dú)使用來(lái)自?xún)煞N系統(tǒng)的細(xì)胞時(shí)3H-胸腺嘧啶核苷的攝入量,斜線棒形圖表示將來(lái)自?xún)煞N系統(tǒng)的細(xì)胞混合時(shí)3H-胸腺嘧啶核苷的攝入量。圖35說(shuō)明對(duì)于異抗原刺激活化的淋巴細(xì)胞,瓊脂二糖具有用量依存的抑制作用,10μg/ml幾乎可以完全抑制,確認(rèn)對(duì)淋巴細(xì)胞的活化具有抑制作用。另外,確認(rèn)3,6-脫水吡喃半乳糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角叉菜二糖和3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖也具有同樣的活性。實(shí)施例20(1)將RAW264.7細(xì)胞(ATCC TIB 71)懸濁于含有10%牛胎兒血清(Gibco公司生產(chǎn))、不含酚紅、含有2mM L-谷氨酸(TechnologiesOriental公司生產(chǎn),25030-149)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Bio Whittaker公司生產(chǎn),12-917F)中,使之達(dá)到3×105細(xì)胞/ml,在48孔微孔板的各孔中加入500μl,在5%二氧化碳存在下,在37℃培養(yǎng)12小時(shí)。在各孔中加入10μl的25μg/ml脂多糖(LPS,Sigma公司生產(chǎn),L-2012)和10μl的5000、1500、500、150或50μM瓊脂二糖或新瓊脂二糖(Sigma公司生產(chǎn),G4410)水溶液,再培養(yǎng)12小時(shí)后,測(cè)定NO在培養(yǎng)基中氧化生成的NO2-濃度。另外,對(duì)照組設(shè)定為不加LPS的組和不加瓊脂二糖或新瓊脂二糖的組。
上述培養(yǎng)后,在100μl的培養(yǎng)基中加入100μl的4%Greece試劑(Sigma公司生產(chǎn),G4410),在室溫下放置15分鐘后,測(cè)定490nm處的吸光度。按照上述培養(yǎng)基中溶解的已知濃度的NaNO2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)基中的NO2-濃度。測(cè)定均進(jìn)行三次。
其結(jié)果,瓊脂二糖可以濃度依存的抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生NO,而新瓊脂二糖則不能抑制。其結(jié)果如圖36和圖37所示。也就是說(shuō),圖36是表示添加瓊脂二糖在各種培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。圖37是表示添加新瓊脂二糖在各種培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。在圖36、圖37中,橫軸表示培養(yǎng)條件,縱軸表示NO2-濃度(μM)。
用3,6-脫水吡喃半乳糖、角叉菜二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖和3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖代替瓊脂二糖,也可以得到同樣的結(jié)果。
(2)將市售的瓊脂(伊那瓊脂型S-7,伊那食品工業(yè)公司生產(chǎn))5g懸濁于45ml的0.1N HCl中,在95℃下處理13分鐘。冷卻到室溫后,用NaOH中和,用0.22μm的MILLEX-GP濾器(Milipore公司生產(chǎn),SLGPR25LS)過(guò)濾。對(duì)于該試樣(瓊脂鹽酸分解溶液)和實(shí)施例11-(1)得到的瓊脂分解低聚糖溶液(瓊脂枸櫞酸分解溶液),按照實(shí)施例20-(1)記載的方法測(cè)定NO抑制活性。也就是說(shuō),對(duì)預(yù)先在48孔微孔板培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞,在各孔中加入10μl的25μg/ml LPS和10μl的上述試樣的20倍稀釋液,進(jìn)行測(cè)定。另外,對(duì)照組設(shè)定為不加LPS的組、不加上述試樣的組以及加入2.5mM枸櫞酸的組。另外,測(cè)定均進(jìn)行2次。
其結(jié)果,瓊脂鹽酸分解溶液、瓊脂枸櫞酸分解溶液均可抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生NO。其結(jié)果如圖38所示。也就是說(shuō),圖38是表示添加瓊脂鹽酸分解溶液、瓊脂枸櫞酸分解溶液進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。圖38中,橫軸表示培養(yǎng)條件,縱軸表示NO2-濃度(μM)。
(3)按照與實(shí)施例20-(2)同樣的方法,使用100mM半乳糖(Nacalai公司生產(chǎn),編號(hào)165-11)、100mM 3,6-脫水-D-半乳糖(Funakoshi公司生產(chǎn),編號(hào)G0002)水溶液,評(píng)價(jià)抑制NO產(chǎn)生的活性。
其結(jié)果,3,6-脫水-D-半乳糖可以抑制NO產(chǎn)生,而半乳糖則不能抑制。其結(jié)果如圖39所示。也就是說(shuō),圖39是表示添加3,6-脫水-D-半乳糖、半乳糖進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。圖39中,橫軸表示培養(yǎng)條件,縱軸表示NO2-濃度(μM)。
(4)將RAW264.7細(xì)胞懸濁于實(shí)施例20-(1)記載的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基中,使之達(dá)到3×105細(xì)胞/ml,在48孔微孔板的各孔中加入500μl,在5%二氧化碳存在下,在37℃培養(yǎng)10小時(shí)。然后,添加10μl的5000 mM瓊脂二糖水溶液,分別培養(yǎng)1、2、4、6小時(shí)。之后,除去培養(yǎng)上清液,在各孔中分別加入新的上述Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基500μl,添加10μl的2.5μg/ml LPS、800 U/ml干擾素-γ(IFN-γ,Cosmobio公司出售,GZM-MG-IFN)水溶液,培養(yǎng)1小時(shí)。之后,除去培養(yǎng)上層清液,在各孔中分別加入新的上述Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基500μl,再培養(yǎng)16小時(shí)后,按照實(shí)施例20-(1)記載的方法測(cè)定NO在培養(yǎng)基中氧化生成的NO2-濃度。另外,對(duì)照組設(shè)定為不添加LPS、IFN-γ水溶液的組以及不添加瓊脂二糖的組。另外,測(cè)定均進(jìn)行2次。
結(jié)果,預(yù)先將瓊脂二糖添加到細(xì)胞中時(shí)間長(zhǎng)的可以抑制NO產(chǎn)生。也就是說(shuō),預(yù)先將瓊脂二糖添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中,可以抑制、預(yù)防LPS、IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生NO。其結(jié)果如圖40所示。圖40是表示在各種培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中NO2-濃度的圖。圖40中橫軸表示培養(yǎng)條件,縱軸表示NO2-濃度。另外,確認(rèn)3,6-脫水吡喃半乳糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角叉菜二糖和3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖也具有同樣的活性。實(shí)施例21(1)將瓊脂粉末(和光純藥公司生產(chǎn))加入50mM枸櫞酸溶液,使終濃度達(dá)到3%,95℃下,加熱處理160分鐘,制成用于抗癌試驗(yàn)的低聚糖溶液。
由日本Charles River公司購(gòu)入4周齡、雄性裸鼠(SPF/VAF Balb/cAnNCrj-nu),預(yù)喂養(yǎng)1周。向該小鼠皮下移植大腸癌細(xì)胞株HCT116(ATCC CCL-247)達(dá)到1.5×106細(xì)胞/小鼠。
從移植大腸癌細(xì)胞株第2周開(kāi)始,在使用上述用于抗癌試驗(yàn)的低聚糖溶液之前調(diào)節(jié)為pH6.5,每周5天作為飲水使之自由攝取。每只小鼠平均每天攝取3.5ml。另外,作為飼料,使之自由攝取Oriental酵母公司生產(chǎn)的MF。
在開(kāi)始給與低聚糖后第4周,摘除低聚糖給藥組各小鼠的實(shí)體瘤,將其重量與攝取普通飲水的對(duì)照組的實(shí)體瘤重量進(jìn)行比較。另外,本試驗(yàn)每組10只小鼠。
結(jié)果,確認(rèn)抗癌試驗(yàn)用試樣口服給藥組顯著抑制癌細(xì)胞增殖,來(lái)源于瓊脂的低聚糖經(jīng)口服給藥顯示很強(qiáng)的抗癌作用。
其結(jié)果如圖41所示。也就是說(shuō),圖41是表示本發(fā)明低聚糖抗癌活性的圖,縱軸表示實(shí)體瘤重量(g),橫軸表示對(duì)照組、低聚糖給藥組。
另外,在抗癌試驗(yàn)用試樣中和物的口服給藥組中,有1例癌癥完全消失。
(2)使用實(shí)施例11-(1)記載的瓊脂低聚糖溶液,進(jìn)行對(duì)歐利希氏腹水癌的抗癌試驗(yàn)。
采用5周齡的雌性ddY系小鼠(體重約25g),腹腔投給歐利希氏癌細(xì)胞(1.2×106細(xì)胞/小鼠),由存活數(shù)計(jì)算平均存活天數(shù)和壽命延長(zhǎng)率。
每組8只小鼠,設(shè)定對(duì)照組、實(shí)施例11-(1)記載的瓊脂分解低聚糖溶液的3.3倍稀釋液攝取組及16.7倍稀釋液攝取組,共3組。也就是說(shuō),配制實(shí)施例11-(1)制備的瓊脂分解低聚糖溶液的各種水稀釋液,在投給癌細(xì)胞3天前作為飲水自由攝取。瓊脂分解低聚糖溶液的3.3倍稀釋液攝取組每天攝取該稀釋液的量是5ml/天/小鼠。瓊脂分解低聚糖溶液的16.7倍稀釋液攝取組每天攝取該稀釋液的量是6ml/天/小鼠。另外,對(duì)照組每天攝取水的量是7ml/小鼠。
結(jié)果,對(duì)照組平均存活天數(shù)是11.8天,瓊脂分解低聚糖溶液的3.3倍稀釋液攝取組,及瓊脂分解低聚糖溶液的16.7倍稀釋液攝取組的平均存活天數(shù)分別是19.8天及14.4天,壽命延長(zhǎng)率分別為168%及122%,確認(rèn)具有顯著延長(zhǎng)壽命的效果。實(shí)施例22在Wistar系大鼠(雄性,5周齡,體重約150g;日本SLC)的腹腔內(nèi)注射100μg的蛋清白蛋白(OA;Sigma公司)及1ml的明礬(商品名Imject Alum;Piace公司)致敏,14天后由腹腔大動(dòng)脈采集末梢血,其血清作為抗OA抗體。
在Wistar系大鼠(雄性,7周齡,體重約為200g;日本SLC)的剃毛背部皮下投給抗OA抗體100μl,被動(dòng)致敏。在致敏48小時(shí)后,在每組4只大鼠的腹腔投給實(shí)施例11-(1)記載的瓊脂分解低聚糖溶液或其10倍的水稀釋溶液2ml。對(duì)照組的大鼠腹腔給予水2ml。
在給藥30分鐘后,由尾靜脈注射含有0.1%OA、0.5%伊文思藍(lán)(Nacalai Tesque)的生理鹽水1ml,引起PCA。在抗原誘發(fā)30分鐘后,斷頭、放血處死大鼠,切除背部漏出色素的部位,回收。
將回收的皮膚浸泡在1ml的1N KCl(Nacalai Tesque)中,放置1夜后,加入含有0.6N H3PO4(Merck公司)的丙酮溶液(Nacalai Tesque)9ml,提取色素,用ELISA閱讀器測(cè)定620nm處的吸光度。由伊文思藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出皮膚的色素漏出量。
結(jié)果如圖42所示。也就是說(shuō),圖42是表示本發(fā)明低聚糖PCA抑制的圖,圖中縱軸表示色素漏出量(μg/部位),橫軸表示使用的瓊脂分解低聚糖溶液。
如圖所示,通過(guò)給與瓊脂分解低聚糖溶液,PCA引起的色素漏出被抑制到一半以下,與對(duì)照組相比具有顯著性差異(p<0.05)。
另外,確認(rèn)3,6-脫水吡喃半乳糖、瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角叉菜二糖及3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖具有相同的效果。實(shí)施例23向6孔板中分別注入懸濁在含有10%FBS的RPMI-1640中的小鼠黑素瘤細(xì)胞B16BL6,使之達(dá)到5×104細(xì)胞/孔/2ml培養(yǎng)基,37℃下培養(yǎng)。第2天,加入100μl的瓊脂二糖溶液(2mg/ml~0.2mg/ml),第7天更換培養(yǎng)基,同時(shí)加入100μl的瓊脂二糖溶液(2mg/ml~0.2mg/ml)。第8天,回收細(xì)胞,分解處理DNA、RNA、蛋白質(zhì)后,測(cè)定400nm處的吸光度,檢測(cè)抑制黑色素產(chǎn)生的作用。
也就是說(shuō),抽濾除去培養(yǎng)基后,每孔添加溶解在20mM EDTA溶液中的0.25%胰蛋白酶0.3ml,37℃下培養(yǎng)10分鐘。接著,添加2ml新的培養(yǎng)基,懸濁細(xì)胞,回收到試管中。接著,離心除去培養(yǎng)基后,用2ml的PBS懸濁細(xì)胞,再次離心分離。除去上層清液后,向細(xì)胞中加入30μl含有5mM氯化錳的50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.0)和1μl的70000U/ml DNaseI(寶酒造公司生產(chǎn)),充分混合后,37℃下培養(yǎng)2小時(shí),分解DNA。接著加入10mg/ml的核糖核酸酶A(Sigma公司生產(chǎn))1μl,50℃下培養(yǎng)1小時(shí),分解RNA。最后,加入含有100μg/ml蛋白酶K(Sigma公司生產(chǎn))、0.1%三硝基甲苯X和10mM EDTA的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.8),使之達(dá)到相對(duì)于細(xì)胞數(shù)2×106液體總量為200μl,37℃下培養(yǎng)16小時(shí)后,測(cè)定400nm處的吸光度。
結(jié)果如表15所示。如表15所示,確認(rèn)瓊脂二糖在50、100μg/ml的濃度下具有抑制黑色素產(chǎn)生的活性,瓊脂二糖具有美白效果。另外,確認(rèn)瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角叉菜二糖及3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖具有相同的效果。
表15瓊脂二糖 400nm吸光度μg/ml平均 ±SD100 0.383 ± 0.007500.392 ± 0.172100.521 ± 0.256對(duì)照 0.487 ± 0.038注)測(cè)定進(jìn)行3次,對(duì)照組添加培養(yǎng)基100μl。綜上所述,本發(fā)明可以提供作為細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑、抗癌劑、活性氧產(chǎn)生抑制劑、過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生抑制劑、NO產(chǎn)生抑制劑等抗氧化劑、免疫調(diào)節(jié)劑的有效成分有用的,選自3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體及它們的2-O-甲基化衍生物的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物,例如含有該化合物的物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下通過(guò)酸分解和/或酶分解生成的瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、角叉菜二糖、3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖等功能性物質(zhì)。
這些物質(zhì)作為細(xì)胞凋亡誘發(fā)用藥品、抗癌用藥品、抑制活性氧產(chǎn)生用藥品、抑制NO產(chǎn)生用藥品等抗氧化用藥品、免疫調(diào)節(jié)用藥品、抗過(guò)敏反應(yīng)用藥品的有效成分是有用的,另外,含有、添加和/或稀釋有選自這些的糖化合物的食品或飲料作為具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用、抗癌作用、抑制活性氧產(chǎn)生的作用、抑制NO產(chǎn)生的作用等抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抗過(guò)敏反應(yīng)作用的功能性食品或飲料是有用的,可以提供誘發(fā)癌癥患者及病毒性疾病患者的病變細(xì)胞凋亡,對(duì)這些疾病的預(yù)防、癥狀改善有效的食品或飲料。特別是大腸癌、胃癌等消化系統(tǒng)癌癥的場(chǎng)合,本發(fā)明的上述化合物作為食品、飲料經(jīng)口服攝取,能夠引起癌細(xì)胞凋亡,所以本發(fā)明的食品或飲料對(duì)消化系統(tǒng)癌癥的預(yù)防、癥狀改善具有優(yōu)良效果。另外,由于其具有抑制活性氧產(chǎn)生的作用等抗氧化作用,所以上述食品或飲料作為抗氧化應(yīng)激反應(yīng)用食品或飲料也具有優(yōu)良效果。
另外,本發(fā)明的功能性物質(zhì)作為用于抑制活性氧產(chǎn)生的抗氧化用糖是有用的,含有、稀釋和/或添加有本發(fā)明抗氧化用糖的食品或飲料作為用于改善由活性氧等生物體內(nèi)氧化物質(zhì)引起的疾病癥狀的食品或飲料是有用的。另外,本發(fā)明的食品或飲料通過(guò)其有效成分——選自3,6-脫水吡喃半乳糖或其醛異構(gòu)體或它們的2-O-甲基化衍生物的化合物和/或含有該化合物的可溶性糖化合物的作用,具有改善或預(yù)防便秘的效果。
本發(fā)明提供的抗氧化用糖作為賦予食品或飲料抑制活性氧產(chǎn)生作用等抗氧化性的新功能性糖化合物是有用的。
另外,本發(fā)明的功能性物質(zhì)具有保鮮效果,對(duì)食品、新鮮物品的味道及鮮度的保持極為有效。
此外,含有本發(fā)明糖化合物的化妝品作為用于美白、保濕的化妝品有效。
本發(fā)明還提供含有、稀釋和/或添加有該功能性物質(zhì)的酸性食品或酸性飲料,在該食品或飲料的制備方法中,實(shí)質(zhì)上除去對(duì)該功能性物質(zhì)的含量有影響的因素,就能夠得到有效性非常高、功能性物質(zhì)含量高的食品或飲料。另外,在有機(jī)酸存在下制備的酸味劑作為在味道、功能性方面優(yōu)良的新型酸味劑也很有用。
權(quán)利要求
1.用于治療或預(yù)防對(duì)下述化合物具有敏感性疾病的藥物組合物,它含有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物的化合物以及還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分。式1
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物,其中,糖化合物是含有選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物的物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下得到的酸分解產(chǎn)物和/或酶分解產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物,其中,含有選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物的物質(zhì),是選自瓊脂、瓊脂糖和角叉菜膠中的至少1種物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1~3中任意-項(xiàng)所述的藥物組合物,其中,糖化合物是選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物。
5.如權(quán)利要求1~6中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物,其中所說(shuō)的疾病,是需要誘發(fā)細(xì)胞凋亡的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧產(chǎn)生的疾病、需要抑制一氧化氮產(chǎn)生的疾病或需要進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的疾病。
6.用于改善對(duì)下述化合物敏感的疾病癥狀的食品或飲料,或用于預(yù)防該疾病的食品或飲料,其中所說(shuō)的食品或飲料含有、添加和/或稀釋有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物。
7.如權(quán)利要求6所述的食品或飲料,其中,糖化合物是含有選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物的物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下得到的酸分解產(chǎn)物和/或酶分解產(chǎn)物。
8.如權(quán)利要求7所述的食品或飲料,其中,含有選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物的物質(zhì),是選自瓊脂、瓊脂糖和角叉菜膠中的至少1種物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求6~8中任意一項(xiàng)所述的食品或飲料,其中,糖化合物是選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物。
10.如權(quán)利要求6~9中任意一項(xiàng)所述的食品或飲料,其中所說(shuō)的疾病是需要誘發(fā)細(xì)胞凋亡的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧產(chǎn)生的疾病、需要抑制一氧化氮產(chǎn)生的疾病或需要進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的疾病。
11.一種抗氧化劑,其特征在于,該抗氧化劑含有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分。
12.如權(quán)利要求11所述的抗氧化劑,其中,糖化合物是含有選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物的物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下得到的酸分解產(chǎn)物和/或酶分解產(chǎn)物。
13.如權(quán)利要求12所述的抗氧化劑,其中,含有選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物的物質(zhì),是選自瓊脂、瓊脂糖和角叉菜膠中的至少1種物質(zhì)。
14.如權(quán)利要求11~13中任意一項(xiàng)所述的抗氧化劑,其中,糖化合物是選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物。
15.如權(quán)利要求11~14中任意一項(xiàng)所述的抗氧化劑,其中所說(shuō)的抗氧化劑是活性氧產(chǎn)生抑制劑。
16.一種食品或飲料,其特征在于,該食品或飲料含有權(quán)利要求11~15任意一項(xiàng)所述的抗氧化劑。
17.一種抗氧化用糖,從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中選擇的化合物和含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的。
18.如權(quán)利要求17所述的抗氧化用糖,它是選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物。
19.如權(quán)利要求17或18所述的抗氧化用糖,是用于抑制活性氧產(chǎn)生的糖。
20.一種保鮮劑,其特征在于,該保鮮劑含有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物和含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分。
21.如權(quán)利要求20所述的保鮮劑,其中,糖化合物是含有選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物的物質(zhì)在pH低于7的酸性條件下得到的酸分解產(chǎn)物和/或酶分解產(chǎn)物。
22.如權(quán)利要求21所述的保鮮劑,其中,含有選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的至少1種化合物的物質(zhì),是選自瓊脂、瓊脂糖和角叉菜膠中的至少1種物質(zhì)。
23.如權(quán)利要求20~22中任意一項(xiàng)所述的保鮮劑,其中所說(shuō)的糖化合物是選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物。
24.一種化妝品,其特征在于,該化妝品是以選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物作為有效成分。
25.一種酸性食品或酸性飲料,其特征在于,該酸性食品或酸性飲料由含有、添加和/或稀釋有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物構(gòu)成的。
26.如權(quán)利要求25所述的酸性食品或酸性飲料,其中,糖化合物是選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖和β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物。
27.下列化合物在制備用于誘發(fā)細(xì)胞凋亡、抗癌、抑制活性氧產(chǎn)生、抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生、抑制NO產(chǎn)生或免疫調(diào)節(jié)的藥物組合物中的用途,該化合物是從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物。
28.下列化合物在制備用于誘發(fā)細(xì)胞凋亡、抗癌、抑制活性氧產(chǎn)生、抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生、NO產(chǎn)生抑制劑或免疫調(diào)節(jié)的飲食品中的用途,該化合物是從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物。
29.下列化合物在制備抗氧化劑或保鮮劑中的用途,該化合物是從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物中的化合物以及含有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種的化合物。
30.下列化合物在制備化妝品中的用途,該化合物是選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉菜二糖及β-D-吡喃半乳糖-3,6-脫水-2-O-甲基-L-半乳糖中的至少1種糖化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療、改善或預(yù)防對(duì)下述化合物具有敏感性疾病的藥物組合物、飲食品、化妝品等,它們含有從選自式1所示3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛異構(gòu)體、其水合物及它們的2-O-甲基化衍生物的化合物以及還原末端具有該化合物的可溶性糖化合物中選擇的至少1種化合物作為有效成分。該化合物具有誘發(fā)細(xì)胞凋亡、抗癌、抑制活性氧產(chǎn)生、抑制過(guò)氧化脂質(zhì)游離基產(chǎn)生、抑制NO產(chǎn)生等活性,作為抗氧化劑、保鮮劑的有效成分也是有用的。
文檔編號(hào)C07G99/00GK1285838SQ98813026
公開(kāi)日2001年2月28日 申請(qǐng)日期1998年11月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月11日
發(fā)明者榎龍嗣, 佐川裕章, 冨永隆生, 西山英治, 小山信人, 酒井武, 于福功, 豬飼勝重, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社
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