本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸酶突變體及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase,HAase)主要專一性水解透明質(zhì)酸，廣泛存在于真核和原核生物中，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)參與許多重要的生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞分裂、細(xì)胞間的連接、生殖細(xì)胞的活動(dòng)、DNA的轉(zhuǎn)染、胚胎發(fā)育、受傷組織的修復(fù)，以及正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增生，是一種重要的生理活性物質(zhì)。且于1928年被Duran Reynals首次發(fā)現(xiàn)并稱為“擴(kuò)散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質(zhì)酸酶。

根據(jù)透明質(zhì)酸酶作用的底物特異性和催化機(jī)制，水蛭透明質(zhì)酸酶屬于透明質(zhì)酸3-糖基水解酶家族(EC 3.2.1.36)，通過(guò)水解HA的β-1、3-糖苷鍵，生產(chǎn)以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產(chǎn)物。

水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶對(duì)底物的專一性強(qiáng)，與其它來(lái)源的透明質(zhì)酸酶相比，它對(duì)硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，并且不具有轉(zhuǎn)糖苷活性，活性不受肝素影響。因此，水蛭透明質(zhì)酸酶用于臨床藥用更具醫(yī)療價(jià)值意義。1941年Hirst首次證實(shí)水蛭透明質(zhì)酸酶強(qiáng)有力的抗菌性。相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)透明質(zhì)酸酶對(duì)治療心肌梗塞效果顯著。透明質(zhì)酸酶在抗腫瘤方面也具有重要的作用，惡性組織經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理后粘多糖含量增加，有利于腫瘤細(xì)胞結(jié)合更多的抗癌藥物。此外，透明質(zhì)酸酶在臨床上作為“藥物擴(kuò)散因子”、治療血栓、青光眼和其它藥用方面具有更大的應(yīng)用價(jià)值。

目前，水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶的最適pH為5～7，最適反應(yīng)溫度為36℃～38℃。該特性并不適合工業(yè)化應(yīng)用。工業(yè)應(yīng)用過(guò)程中，每將反應(yīng)體系的溫度從室溫提高一度，都需要消耗更多的能量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種透明質(zhì)酸酶突變體，該突變體具有更寬泛的最適反應(yīng)溫度，催化活力也有提高。

所述透明質(zhì)酸酶突變的氨基酸序列，是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列基礎(chǔ)上，將第121位甘氨酸G突變?yōu)榱涟彼酟，同時(shí)將299位的蘇氨酸T突變?yōu)楫惲涟彼酙，同時(shí)將321位的丙氨酸突變?yōu)楦彼酨。

本發(fā)明還提供一種表達(dá)所述透明質(zhì)酸酶突變體的重組菌，是以枯草芽孢桿菌168為宿主， 以pMA5載體為表達(dá)載體，以wapA信號(hào)肽引導(dǎo)酶的分泌表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將信號(hào)肽wapA通過(guò)NdeI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)重組至pMA5，再通過(guò)PCR獲得編碼N端有6個(gè)組氨酸的透明質(zhì)酸酶突變體基因H，將基因H片段和攜帶信號(hào)肽wapA的pMA5載體均采用EcoRI、BamHI限制性酶切位點(diǎn)雙切，然后連接，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，得到重組菌。

本發(fā)明還提供應(yīng)用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶突變體的方法，是按10％的接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為酵母粉18g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氫鈉15g/L，硫酸鉀4g/L，30℃220rpm培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)60h。

本發(fā)明將所述透明質(zhì)酸酶突變體采用食品級(jí)安全的工業(yè)菌株枯草芽孢桿菌進(jìn)行表達(dá)，獲得了透明質(zhì)酸酶生產(chǎn)菌株。以該重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵，可在發(fā)酵上清液中收集得到透明質(zhì)酸酶的突變體粗酶液，該酶在pH4～9的范圍內(nèi)保持很好的活性，相比突變前，在耐酸性能上有了提高；在溫度25～40℃的條件下能保持很好的活性，相比突變前，在耐受低溫的性能上有了顯著提高。

具體實(shí)施方式

酶活測(cè)定方法：反應(yīng)體系為1ml，用pH 5.5、50mM的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配置2mg/ml的HA，反應(yīng)體系加入400μl的HA溶液、100μl的發(fā)酵上清液酶液，緩沖液補(bǔ)足至1ml；在38℃反應(yīng)20min，立即沸水終止反應(yīng)，采用DNS法測(cè)定產(chǎn)生的還原糖當(dāng)量，1U為一小時(shí)內(nèi)水解產(chǎn)生1μg還原糖所需酶量。

實(shí)施例1透明質(zhì)酸酶突變體的獲得

(1)將SEQ ID NO.2所示出發(fā)核苷酸序列中編碼第121位甘氨酸G、299位的蘇氨酸T、321位的丙氨酸A的序列通過(guò)分布PCR分別突變?yōu)榫幋a亮氨酸L、異亮氨酸I、脯氨酸P的核苷酸序列。

(2)向透明質(zhì)酸酶突變體N端引入6個(gè)組氨酸，設(shè)計(jì)引物PCR獲得編碼N端有6個(gè)組氨酸的透明質(zhì)酸酶突變體基因H。引物序列為：

F：CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGAC

R：CGCGGATCCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACGTTAG

以枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體pMA5為表達(dá)載體，將信號(hào)肽wapA(MKKRKRRNFKRFIAAFLVLALMISLVPA)通過(guò)NdeI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)重組至pMA5。

將基因H片段和攜帶信號(hào)肽wapA的pMA5載體分別采用EcoRI、BamHI限制性酶切位點(diǎn)雙切，載體和目的片段分別采用瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，體系10μl：1μl雙切的載體，4μl雙切的目的片段，5μl Solution連接酶，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確。挑選測(cè)序正確的重組克隆菌pMA5-wapA-H。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主Bacillus subtilis 168中，重組克隆子經(jīng)PCR驗(yàn)證正確。以相同策略表達(dá)突變前的透明質(zhì)酸酶，作為對(duì)照1，以空載為陰性對(duì)照。

(3)驗(yàn)證正確的重組枯草芽孢桿菌菌株pMA5-wapA-H進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)。單克隆接種于5ml的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)16h。按10％的接種量轉(zhuǎn)接于25ml的表達(dá)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(酵母粉18g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氫鈉15g/L，硫酸鉀4g/L)，30℃220rpm培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)60h，離心收集發(fā)酵上清液，作為粗酶液，SDS-PAGE電泳分析發(fā)酵上清液的結(jié)果表明在58kDa左右出現(xiàn)目標(biāo)條帶，發(fā)酵液上清中酶活為1945.5U/ml，未突變的透明質(zhì)酸酶的活力為15894U/ml，陰性對(duì)照未檢出透明質(zhì)酸酶活力。

實(shí)施例2透明質(zhì)酸酶突變體的活性測(cè)定

(1)pH對(duì)酶活的影響

在加酶之前，以0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液調(diào)整酶活測(cè)定體系的pH為別為2、3、4、5、6、7、8、9，分別測(cè)定透明質(zhì)酸酶突變體、未突變的透明質(zhì)酸酶的活力。以兩酶各自在pH 5.5的酶活反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，計(jì)算各自的殘余酶活。

表1

(2)溫度對(duì)酶活的影響

將透明質(zhì)酸酶突變體、未突變的透明質(zhì)酸酶的粗酶液分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃條件下，保溫30min，然后用于測(cè)定酶活。以兩酶各自在38℃的酶活為基礎(chǔ)，計(jì)算各自的殘余酶活。

表2

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 吳銀娣

<120> 一種透明質(zhì)酸酶突變體及其應(yīng)用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 489

<212> PRT

<213> 水蛭

<400> 1

Met Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp Lys Asn Val Ile Ala Ser

1 5 10 15

Val Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser

20 25 30

Pro Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile Thr Ser Pro Lys Leu Phe

35 40 45

Lys Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr

50 55 60

Phe Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys

65 70 75 80

Asp Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr

85 90 95

Arg Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe

100 105 110

Asp Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe

115 120 125

Asp Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu Ile Gly Lys Lys Met

130 135 140

Thr Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys

145 150 155 160

Val Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn Ile Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu

165 170 175

Pro Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu

180 185 190

Asp Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn

195 200 205

Lys Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr

210 215 220

Val Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp His Val Thr Ala Phe Thr

225 230 235 240

Leu His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr

245 250 255

Leu Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val

260 265 270

Lys Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu

275 280 285

Gly Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp

290 295 300

Arg Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala

305 310 315 320

Ala Asn Asn Val Lys Val Val Ile Arg Gln Thr Ile Tyr Asn Gly Tyr

325 330 335

Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp

340 345 350

Leu Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val

355 360 365

Asp Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr

370 375 380

Lys Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu

385 390 395 400

Thr Ile Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Ser Gly Lys Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Leu Thr Pro Glu

420 425 430

Gly Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu

435 440 445

Lys Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys

450 455 460

Thr Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser

465 470 475 480

Asp Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys

485

<210> 2

<211> 1470

<212> DNA

<213> 水蛭

<400> 2

atgaaagaga tcgcggtgac aattgacgat aagaacgtta ttgcctctgt cagcgagtca 60

ttccatggtg ttgcctttga tgcgtcgtta ttttcaccga aggggttgtg gagctttgtt 120

gacattacct caccgaaatt gtttaaactc ttggagggtc tctctcctgg ttacttcagg 180

gttggaggaa cgtttgctaa ctggctgttc tttgacttag atgaaaataa taagtggaaa 240

gactattggg cttttaaaga taaaacaccc gagactgcaa caatcacaag gaggtggctg 300

tttcgaaaac aaaacaacct gaaaaaagag acttttgacg acttagtcaa actaaccaaa 360

ggaagcaaaa tgagactgtt atttgattta aacgctgaag tgagaactgg ttatgaaatt 420

ggaaagaaaa tgacatccac ttgggatagc tcggaagctg aaaaattatt caaatactgt 480

gtgtcaaaag gttatggaga taatattgat tgggaacttg gtaatgaacc ggaccatacc 540

tccgcacaca atcttactga aaagcaagtt ggagaggact ttaaagccct gcataaagtg 600

ctagagaaat atccgacgtt gaataaagga tcgcttgttg gacctgacgt tggatggatg 660

ggagtctctt atgtgaaagg attagcagac ggggctggtg atcacgtaac cgcttttact 720

cttcatcagt attattttga cggcaatacc tcagatgtgt caacatacct tgacgctact 780

tattttaaaa aacttcaaca gctgtttgac aaagttaagg atgtcttgaa aaattctcca 840

cataaagata aaccgctctg gcttggagaa acaagttctg gatacaacag cggcacaaaa 900

gatgtatccg atcgatatgt tagcggattt ctaacattgg acaagttggg actcagtgca 960

gcgaacaatg tgaaagttgt gataagacaa acgatctata atggatacta cggacttctt 1020

gataaaaata ctctagagcc aaatccggat tattggctaa tgcatgttca caattctctg 1080

gttggaaata cggtttttaa agttgacgtt agtgacccta caaataaagc tagagtttat 1140

gcacagtgca ccaaaacaaa tagcaaacat actcagagta gatactacaa gggctcattg 1200

acgatctttg ctcttaatgt tggagatgaa gatgtgacgt tgaagattga tcaatacagt 1260

ggaaaaaaga tttattcata tattctgacc ccagaaggcg gccaacttac atcacaaaaa 1320

gttcttttga atggaaaaga attaaaatta gtgtcggatc aattgccaga actgaatgca 1380

gacgagtcga aaacctcttt cactctgtct ccaaagacat ttggattttt tgttgttagc 1440

gatgctaacg ttgaagcctg caaaaaataa 1470

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattcc accaccacca ccaccacatg aaagagatcg cggtgac 47

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcggatcct tattttttgc aggcttcaac gttag 35

<210> 5

<211> 28

<212> PRT

<213> wapA

<400> 5

Met Lys Lys Arg Lys Arg Arg Asn Phe Lys Arg Phe Ile Ala Ala Phe

1 5 10 15

Leu Val Leu Ala Leu Met Ile Ser Leu Val Pro Ala

20 25