專利名稱：誘導(dǎo)t細(xì)胞死亡的表位的制作方法
相關(guān)的申請本申請要求2004年5月11日提交的美國臨時申請系列號60/570,161的優(yōu)先權(quán)，作為參考將其內(nèi)容完整地在此引入。
背景在治療自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病和T細(xì)胞來源的癌癥中控制不需要的免疫應(yīng)答是關(guān)鍵的。通過免疫抑制或通過免疫耐受性的誘導(dǎo)可以限制過度侵襲性的T細(xì)胞的活性。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為涉及維持免疫系統(tǒng)的適當(dāng)功能和除去不需要的細(xì)胞，例如過度侵襲性的T細(xì)胞(Kabelitz等(1993)Immunol Today 14，338-340；和Raff(1992)Nature 356，397-399)。
概述本發(fā)明涉及誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡的表位。這些表位可用于，尤其是，選擇結(jié)合這些表位的化合物。這樣的化合物在治療涉及過度侵襲性T細(xì)胞的疾病中是有用的。這種疾病的實例包括自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病和T細(xì)胞來源的癌癥。
在一個方面，本發(fā)明的特征是分離的表位的三維構(gòu)象。在活化的T細(xì)胞上的所述表位與配體的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。這種表位被表示為(1)X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO1)，其中X1是Tyr、Trp、His或Met；X2是Asp；X3是Ser、Phe、Pro、Glu或His；X4是在動物中天然產(chǎn)生的任何氨基酸；以及X5是Pro、Tyr、His或Trp；(2)X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO2)，其中X6是Asp；X7是Tyr、Met、Asn、Trp或Phe；
X8是Phe或Leu；X9是Pro；以及X10是Glu；或者(3)X11-X12-X13-X14(SEQ ID NO3)，其中X11是Pro；X12是Met；X13是Glu或Ser；以及X14是Ile。
任何如上所述的表位可以是，例如，多肽、兩個多肽的相互作用區(qū)域、糖(carbohydrate)部分、糖蛋白，或它們的任何構(gòu)象的、功能的等同物。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是含有X1-X2-X3-X4-X5、X6-X7-X8-X9-X10，或X11-X12-X13-X14的分離的多肽。在活化的T細(xì)胞上的所述多肽與配體的結(jié)合誘導(dǎo)該細(xì)胞的死亡。在一個實施方案中，所述多肽含有4到400個氨基酸(例如，4和400之間的任何整數(shù)，包括4和400)。例如，所述多肽可以是X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO1)、X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO2)、X11-X12-X13-X14(SEQ ID NO3)、或SEQ ID NO4、6-18和20-22的任何一個。
“分離的表位”或“分離的多肽”是指基本上不含天然相關(guān)的分子的表位或多肽，即，它是至少75％(例如，75％和100％之間的任何數(shù)，包括75％和100％)的干重純度的?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法，例如，通過柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析來測定純度。本發(fā)明的分離的表位或多肽可以從天然來源純化、通過重組DNA技術(shù)或通過化學(xué)方法來制備。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是與上述表位之一結(jié)合的新的化合物。所述化合物可以是任何類型的分子，包括抗體，例如單克隆抗體。本發(fā)明的化合物可以用于檢測本發(fā)明的表位和用于誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡。
制備抗體的方法也處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述方法包括向受試者施用有效量的上述表位(例如，多肽)之一。所述抗體可以用于檢測本發(fā)明的表位或用于誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡。
本發(fā)明特征還在于鑒定誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的候選化合物(例如，單克隆抗體)的方法。所述方法涉及用測試化合物接觸本發(fā)明的表位并測定所述測試化合物是否與表位結(jié)合。如果測試化合物與表位結(jié)合，它就是誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的候選物。
本發(fā)明進(jìn)一步的特征在于通過用本發(fā)明的化合物接觸活化的T細(xì)胞來誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的方法。
在另一個方面，本發(fā)明特征在于藥物組合物，其含有藥學(xué)上可接受的載體和(1)本發(fā)明的表位，例如多肽，或(2)與所述表位結(jié)合的化合物。
本發(fā)明提供了用于治療涉及過度侵襲性T細(xì)胞的疾病的組合物和方法，所述疾病例如自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病和T細(xì)胞來源的癌癥。在以下附隨的說明中將闡述本發(fā)明的一個或多個實施方案的細(xì)節(jié)。根據(jù)詳細(xì)的說明，本發(fā)明的其他特征、目的和益處將更為明顯。
詳細(xì)說明本發(fā)明基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，通過新的誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡的表位的接合，T細(xì)胞可以被誘導(dǎo)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡和被耗盡。對于治療與過度的或不需要的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或T細(xì)胞增殖相關(guān)的病癥，耗盡活化的T細(xì)胞是特別有用的。例如，耗盡活化的T細(xì)胞可以引起降低或消除與自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病或T細(xì)胞來源的癌癥相關(guān)的不需要的T細(xì)胞活性或增殖。
因此，本發(fā)明的特征是分離的表位的三維構(gòu)象。在活化的T細(xì)胞上配體與表位的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。所述表位由X1-X2-X3-X4-X5、X6-X7-X8-X9-X10或X11-X12-X13-X14表示。例如，使用如Duggan等，(1995)J Med Chem.383332-41和Toogood(2002)J Med Chem.451543-57中描述的計算機(jī)模擬程序，可以確定X1-X2-X3-X4-X5、X6-X7-X8-X9-X10或X11-X12-X13-X14的三維構(gòu)象。構(gòu)象、功能等效物的表位可以根據(jù)X1-X2-X3-X4-X5、X6-X7-X8-X9-X10或X11-X12-X13-X14的三維構(gòu)象來設(shè)計，使用本領(lǐng)域已知的方法來制備，并通過例如以下實施例中描述的方法來測試它們涉及誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的能力。參見，例如，Barbas等(2001)Phage display.A laboratory manual.CSHLPress；Parmley等(1998)Gene 73，305-318；Scott等(1990)Science 249，386-390；美國專利申請No.20030049252 A1；WO 03/013603 A1；Osborne(1996)Curr Opin Immunol 8245-248；Lin等(1997)J.Immunol.158，598-603；Zhang等(1995)Nature 377，348-350；Lai等(1995)EurJ Immunol 25，3243-3248；Mollereau等(1996)J Immunol 156，3184-3190；和Gribben等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92，811-815。
如在此使用的，“活化的T細(xì)胞”是比未活化的T細(xì)胞具有更高的擴(kuò)增頻率、速率或幅度的T細(xì)胞。細(xì)胞的“死亡”包括程序化的細(xì)胞死亡，即，細(xì)胞凋亡。當(dāng)用藥物處理的細(xì)胞群體展現(xiàn)出比未處理的細(xì)胞群體更高的死亡率時，該藥物“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”。例如，根據(jù)annexin V染色和FACS分析測定的，當(dāng)用單克隆抗體m128-9F9、m152-15A7或m166-43B6處理時，與未處理的細(xì)胞相比，經(jīng)歷了細(xì)胞凋亡的體外活化的T細(xì)胞的百分比是約兩倍(參見以下實施例)。
本發(fā)明特征還在于含有X1-X2-X3-X4-X5、X6-X7-X8-X9-X10或X11-X12-X13-X14的分離的多肽。所述多肽可用于鑒定誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的化合物。這種化合物與活化的T細(xì)胞表面上表達(dá)的多肽的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的，通過與細(xì)胞表面多肽競爭內(nèi)源性的誘導(dǎo)死亡的配體，游離多肽(即，不在細(xì)胞表面上表達(dá)的那些)可以抑制不需要的細(xì)胞的死亡。所述多肽的長度或序列可以根據(jù)這些用途來變化。本發(fā)明的多肽可以作為，例如，分離的T細(xì)胞表面蛋白、合成多肽或重組多肽來獲得。為了制備重組多肽，可以將編碼它的核酸與編碼融合伙伴(partner)的另一個核酸連接，所述融合伙伴例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6x-His表位標(biāo)記或M13基因3蛋白。產(chǎn)生的融合核酸在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離的融合蛋白。可以進(jìn)一步處理分離的融合蛋白，例如通過酶消化，來除去融合伙伴并獲得本發(fā)明的重組多肽。
本發(fā)明的表位或本發(fā)明的多肽可用于在動物(用于制備抗體)或人(用于治療疾病)中產(chǎn)生抗體。在動物中制備單克隆和多克隆抗體及其片段的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Harlow和Lane，(1988)AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。術(shù)語“抗體”包括完整的分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv(單鏈抗體)和dAb(結(jié)構(gòu)域抗體；Ward，等(1989)Nature，341，544)。這些抗體可用于檢測表位，例如，鑒定與表位結(jié)合的化合物(見下文)。能誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的抗體對于治療諸如自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病或T細(xì)胞來源的癌癥的疾病也是有用的。一般地，本發(fā)明的表位，例如，多肽，可以與載體蛋白，例如KLH偶聯(lián)，與佐劑混合，并注入到宿主動物中。然后可以通過肽親和層析來純化該動物中產(chǎn)生的抗體。通常采用的宿主動物包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠?？捎糜谔岣呙庖邞?yīng)答的各種佐劑取決于宿主物種，包括弗氏佐劑(完全的和不完全的)，礦物凝膠例如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂，普盧蘭尼克多元醇類(pluronic polyol)，聚陰離子，肽，油乳劑，鑰孔血藍(lán)素，和二硝基酚。有用的人佐劑包括BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))和Corynebacterium parvum。
抗體分子的異質(zhì)性群體(heterogeneous populations)多克隆抗體存在于被免疫受試者的血清中。針對特定抗原的抗體勻質(zhì)群體單克隆抗體可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)來制備(參見，例如，Kohler等(1975)Nature 256，495；Kohler等(1976)Eur J Immunol 6，511；Kohler等(1976)Eur J Immunol 6，292；和Hammerling等(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.)。特別地，可以通過為了在培養(yǎng)物中通過連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)來獲得單克隆抗體，例如在Kohler等(1975)Nature 256，495和美國專利No.4,376,110中描述的；人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等(1983)ImmunolToday 4，72；Cole等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026，和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等(1983)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。這樣的抗體可以是任何免疫球蛋白類型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，和它們的任何亞類。可以體外或體內(nèi)地培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。在體內(nèi)生產(chǎn)高滴度單克隆抗體的能力使之成為特別有用的制備方法。
此外，可以使用為了產(chǎn)生“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)。參見，例如，Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81，6851；Neuberger等(1984)Nature 312，604；和Takeda等(1984)Nature 314452。嵌合抗體是一種分子，其中不同的部分來自不同的動物物種，例如，具有來自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些抗體?；蛘撸梢孕薷臑榱酥苽鋯捂溈贵w而描述的技術(shù)(美國專利No.4,946,778和4,704,692)來制備單鏈Fv抗體的噬菌體庫。通過經(jīng)由氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段來形成單鏈抗體。此外，可以通過已知的技術(shù)來產(chǎn)生抗體片段。例如，這種片段包括但不限于，可通過抗體分子的胃蛋白酶消化而產(chǎn)生的F(ab′)2片段，以及可通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。
抗體也可以通過本領(lǐng)域已知的方法來人源化。例如，具有期望的結(jié)合特異性的單克隆抗體可以被商業(yè)地人源化(Scotgene，Scotland；and OxfordMolecular，Palo Alto，Calif.)。完全人的抗體，例如在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)的那些，處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)(參見，例如，Green等(1994)Nature Genetics 7，13；和美國專利No.5,545,806和5,569,825)。
本發(fā)明進(jìn)一步特征在于與本發(fā)明的表位結(jié)合并誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的新化合物。例如，可以根據(jù)表位的三維構(gòu)象，使用計算機(jī)模擬程序來設(shè)計這種化合物，并使用本領(lǐng)域已知方法來合成。也可以通過如下所述的庫篩選來鑒定該化合物。
測試化合物可以使用本領(lǐng)域已知的組合庫方法中的許多方法的任何一種來獲得，這些庫包括肽文庫、類肽文庫(具有肽的功能性、但帶有對酶降解有抗性的新的非肽骨架的分子的庫)、空間可定址的(spatially addressable)平行固相或液相庫、通過去褶合或親和層析選擇獲得的合成庫、“一珠一化合物”的庫、和抗體庫。參見，例如，Zuckermann等(1994)J Med Chem 37，2678-85；Lam(1997)Anticancer Drug Des 12，145；Lam等(1991)Nature 354，82；Houghten等(1991)Nature 354，84；和Songyang等(1993)Cell 72，767。
用于分子庫合成的方法的實例可在本領(lǐng)域中找到，例如DeWitt等(1993)PNAS USA 90，909；Erb等(1994)PNAS USA 91，11422；Zuckermann等(1994)J Med Chem 37，2678；Cho等(1993)Science 261，1303；Carrell等(1994)Angew Chem Int Ed Engl 33，2059；Carell等(1994)Angew Chem Int EdEngl 33，2061；和Gallop等(1994)J Med Chem 37，1233。
化合物的庫可以存在于溶液中(例如，Houghten(1992)Biotechniques 13，412-421)、或珠子(Lam(1991)Nature 354，82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364，555-556)、細(xì)菌(美國專利No.5,223,409)、芽孢(美國專利No.5,223,409)、質(zhì)粒(Cull等(1992)PNAS USA，89，1865-1869)或噬菌體(Scott和Smith(1990)Science 249，386-390；Devlin(1990)Science 249，404-406；Cwirla等(1990)PNAS USA 87,6378-6382；Felici(1991)J Mol Biol 222,301-310；和美國專利No.5,223,409)上。
為了鑒別誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的候選化合物，用本發(fā)明的表位接觸測試化合物，評估所述化合物與表位的結(jié)合。如果測試化合物與表位結(jié)合，它就是誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的候選物。
按各種方法進(jìn)行篩選分析。例如，一種方法包括將表位(或含有表位的分子，例如，多肽或融合蛋白)或測試化合物錨定在固相上，并在反應(yīng)結(jié)束時檢測固相上形成的表位-測試化合物復(fù)合物。實際上，微量滴定板可以方便地用作固相?？梢酝ㄟ^非共價的或共價的連接來固定錨定元件。非共價連接可以僅通過用錨定元件(anchor component)的溶液包被固體表面并使平板干燥來實現(xiàn)?；蛘?，特異于錨定元件的固定化抗體(例如，單克隆抗體)可用來將錨定元件固定到固體表面。將非錨定元件添加到包被有錨定元件的固體表面。在反應(yīng)完成后，在一定條件下除去非錨定元件的未結(jié)合部分(例如，通過洗滌)，從而任何形成的復(fù)合物仍保持固定在固體表面上?？梢园炊喾N方式完成這些復(fù)合物的檢測。當(dāng)非錨定元件被預(yù)先標(biāo)記時，檢測到固定到固體表面上的標(biāo)記指示了復(fù)合物形成。當(dāng)非錨定元件沒有預(yù)先標(biāo)記時，可使用間接標(biāo)記來檢測表面上形成的復(fù)合物，例如，使用特異于非錨定元件的抗體(該抗體隨后可以用例如標(biāo)記的抗Ig抗體直接標(biāo)記或間接標(biāo)記)。
或者，可以在液相中進(jìn)行反應(yīng)。例如，使用特異于表位(或含有表位的分子)或測試化合物的固定化抗體，來從未結(jié)合的元件(component)中分離復(fù)合物。然后，例如使用特異于其他元件的標(biāo)記的抗體來檢測復(fù)合物。
通過使用以下實施例中描述的方法或本領(lǐng)域已知的任何其他方法來確定化合物誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的能力，可以驗證侯選化合物。驗證的化合物可用于誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡，和用于治療諸如自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病或T細(xì)胞來源的癌癥的疾病。
本發(fā)明提供了誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的方法，例如，通過在體外使活化的T細(xì)胞與本發(fā)明的化合物接觸，或通過向有需要的受試者施用有效量的本發(fā)明的化合物。需要治療的受試者可被鑒定為患有以過度或不需要的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為特征的病癥或存在該風(fēng)險，例如，患有自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病或T細(xì)胞來源的癌癥的患者。這種方法可以單獨地或者與其他藥物或治療共同地進(jìn)行。
術(shù)語“治療”被定義為向受試者施用組合物，目的是治愈、減輕、解除、矯正、防止或改善失調(diào)、失調(diào)的癥狀、繼發(fā)于失調(diào)的疾病狀態(tài)或趨于失調(diào)的傾向。“有效量”是能夠在治療的受試者中產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上期望的結(jié)果，例如上述結(jié)果的組合物的量。
要治療的示例性疾病包括但不限于糖尿病、關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和牛皮癬關(guān)節(jié)炎)、多發(fā)性硬化、腦脊髓炎、重癥肌無力、全身性紅斑狼瘡、自體免疫甲狀腺炎、皮炎(包括特異反應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎)、牛皮癬、Sjogren氏綜合癥、Crohn氏病、口瘡性潰瘍、虹膜炎、結(jié)膜炎、角膜結(jié)膜炎、I型糖尿病、炎癥性腸疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘、過敏性哮喘、皮膚紅斑狼瘡(cutaneous lupuserythematosus)、硬皮癥、陰道炎、直腸炎、藥疹、麻風(fēng)病翻轉(zhuǎn)反應(yīng)、麻風(fēng)的結(jié)節(jié)性紅斑、自體免疫葡萄膜炎、變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎、急性壞死出血性腦病、自發(fā)性的雙側(cè)漸進(jìn)性感覺神經(jīng)性的聽力喪失、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞貧血、自發(fā)性血小板減少、多軟骨炎、Wegener氏肉芽腫病、慢性活動性肝炎、Stevens-Johnson綜合癥、自發(fā)性口炎性腹瀉、扁平苔癬、Graves氏病、結(jié)節(jié)病、原發(fā)性膽汁肝硬變、后葡萄膜炎(uveitis posterior)、間隙肺部纖維化、移植物抗宿主病、移植的情況(包括使用異源或異種組織的移植)例如骨髓移植、肝臟移植、或任何器官或組織的移植、變態(tài)反應(yīng)例如特異反應(yīng)性過敏、AIDS和T細(xì)胞瘤例如白血病或淋巴瘤。
在體內(nèi)途徑中，治療組合物(例如，含有本發(fā)明的表位、本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的化合物的組合物)被施用給受試者。一般地，表位、多肽或化合物被懸浮在藥學(xué)上可接受的載體(例如，生理鹽水)中，并口服地、或通過靜脈內(nèi)輸注、或皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、胃內(nèi)、氣管內(nèi)或肺內(nèi)地注射或植入來施用。
所需的劑量取決于給藥途徑的選擇；配方的性質(zhì)；受試者的疾病的性質(zhì)；受試者的大小、體重、表面積、年齡和性別；施用的其他藥物；以及主治醫(yī)師的判斷。適合的劑量在0.01-100.0mg/kg的范圍內(nèi)?？紤]到可用組合物的變化和各種給藥途徑的不同效率，所需劑量的廣泛變化是預(yù)期的。例如，預(yù)計口服施用比靜脈內(nèi)注射需要更高的劑量。這些劑量水平的變化可以使用本領(lǐng)域充分了解的、用于優(yōu)化的經(jīng)驗性規(guī)則來調(diào)整。將組合物封裝在適合的遞送載體中(例如，聚合的微?；蚩芍踩胙b置)可以提高給藥的效率，特別是對于口服給藥。
含有藥學(xué)上可接受的載體和有效量的本發(fā)明的化合物的藥物組合物也處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該藥物組合物可用于治療如上所述的疾病。藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑，以及等滲劑和吸收延遲劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以使用常規(guī)方法被配制為用于不同給藥途徑的劑型。例如，它可以被配置為用于口服施用的膠囊、軟明膠膠囊劑(gel seal)或片劑。膠囊可以含有任何標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)上可接受的材料，例如明膠或纖維素。片劑可以根據(jù)常規(guī)程序通過壓縮組合物與固體載體和潤滑劑的混合物來配制。固體載體的實例包括淀粉和糖膨潤土(sugar bentonite)。組合物也可以以含有粘合劑，例如乳糖或甘露醇、常規(guī)填料和制片劑的硬殼片劑或膠囊劑的形式來施用?？梢酝ㄟ^胃腸外途徑施用藥物組合物。胃腸外劑型的實例包括活性劑的水溶液、等滲鹽水或5％葡萄糖，或其他公知的藥學(xué)上可接受的賦形劑。環(huán)糊精或其他增溶劑是熟悉本領(lǐng)域的人員公知的，可以用作用于治療劑給藥的藥物賦形劑。
可以在體外和體內(nèi)評估本發(fā)明的組合物的效力。參見，例如，以下的實施例。簡要地，可以在體外測試該組合物誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的能力。對于體內(nèi)研究，可以將組合物注射到動物(例如，小鼠模型)中，然后獲取它的治療效果。根據(jù)該結(jié)果，可以確定合適的劑量范圍和給藥途徑。
以下的具體實施例被認(rèn)為僅僅是說明性的，無論如何不是對所公開的其余部分的限定。不需進(jìn)一步的詳細(xì)描述，相信本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)在此的說明將本發(fā)明利用到最大程度。此處引用的全部出版物作為參考將它們完全地引入。
制備小鼠脾細(xì)胞懸液將小鼠脾臟浸泡在8ml的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)中，用無菌蓋玻片輕輕地切碎，轉(zhuǎn)移到15ml離心管(Costar)，在200xg下離心5分鐘。棄去上清液，通過輕敲管壁將細(xì)胞團(tuán)粒重懸浮在殘余的緩沖液中。通過添加1ml的RBC裂解緩沖液(0.6 M NH4Cl，0.17 M Tris-base，pH7.65)裂解污染紅細(xì)胞(RBC)，隨后在室溫下孵育2min，用9ml的HBSS快速中止。將細(xì)胞在200xg沉淀5分鐘，洗滌兩次，重懸浮在RPMI培養(yǎng)基中。用血細(xì)胞計(CambridgeScientific Inc.)和臺盼藍(lán)排斥測定混合物中細(xì)胞的濃度和存活力。
制備抗T細(xì)胞、誘導(dǎo)凋亡的單克隆抗體通過用Concanovalin A活化的人T細(xì)胞免疫小鼠來產(chǎn)生誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的單克隆抗體，并篩選它們結(jié)合活化人T細(xì)胞以及隨后誘導(dǎo)T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的能力。根據(jù)Kohler和Milstein((1976)Euro J Immunol 6，511-519)的公知的細(xì)胞融合方法產(chǎn)生分泌期望抗體的雜交瘤來制備單克隆抗體。根據(jù)這些方法產(chǎn)生的三個雜交瘤分泌單克隆抗體，分別稱為m128-9F9、m152-15A7和m166-43B6，其能在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
將每個雜交瘤的濃縮的培養(yǎng)物上清液在20000xg旋轉(zhuǎn)10分鐘，用結(jié)合緩沖液(0.1M醋酸鈉，pH5.0)以1∶1的比例稀釋上清液。用3-5ml的結(jié)合緩沖液洗滌蛋白G柱(約1ml床體積(bed volum))三次。將澄清的培養(yǎng)物上清液加載到蛋白G柱上，收集流通物并再加載到柱上。然后用6-10ml結(jié)合緩沖液洗滌柱，用5ml洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸-HCl，pH2.8)從柱上洗脫結(jié)合的抗體。每個級分含有1ml洗脫的抗體，通過將每1ml級分與50微升1M的Tris-HCl、pH7.5混合來將洗脫的級分調(diào)節(jié)到中性pH值。集中含有抗體的級分，相對2升PBS、pH7.4透析三次，每次透析三小時。根據(jù)Bradford描述的方法使用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析(BIO-RAD，Hercules，CA)來測定抗體樣品中的蛋白濃度。
通過單克隆抗體誘導(dǎo)活化人T細(xì)胞的死亡將活化的T細(xì)胞(參見上面)重懸浮在含有5ng/ml的IL-2的RPMI培養(yǎng)基中至5×105細(xì)胞/ml的終濃度，并用對照Ig、m128-9F9、m152-15A7或m166-43B6處理。
公知的是誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡的抗體能夠用做治療劑來治療T細(xì)胞相關(guān)的疾病，例如移植排斥、自體免疫疾病和過敏癥。針對人T細(xì)胞產(chǎn)生了三種單克隆抗體，檢查了這些單克隆抗體誘導(dǎo)活化人T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的能力。將含有由雜交瘤細(xì)胞系m128-9F9、m152-15A7或m166-43B6分泌的單克隆抗體的培養(yǎng)物上清液分別與未活化的人T細(xì)胞(第0天)或體外活化的人T細(xì)胞(第7天)孵育6小時。孵育后細(xì)胞用annexin V染色，進(jìn)行FACS分析。設(shè)門于(gated)CD3陽性細(xì)胞以確定體外活化的人T細(xì)胞或靜息人T細(xì)胞的計數(shù)。凋亡的細(xì)胞是annexin V染色陽性的。表1概述了在所有掃描的T細(xì)胞中凋亡的T細(xì)胞的百分比。出人意料地，由雜交瘤細(xì)胞系m128-9179、m152-15A7和m166-43B6分泌的單克隆抗體誘導(dǎo)了體外活化的人T細(xì)胞的死亡但不影響未活化的人T細(xì)胞。這種誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡而不影響靜息T細(xì)胞的能力是細(xì)胞凋亡途徑的獨特特征，并且是靶向T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的治療試劑的支配性特征。
表1凋亡的T細(xì)胞的百分比
誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡的表位的鑒定為了鑒定由單克隆抗體m128-9F9、m152-15A7和m166-43B6識別的誘導(dǎo)死亡的表位，將這些單克隆抗體用于在多肽文庫(Ph.D.-12TM噬菌體展示肽文庫試劑盒(Phage Display Peptide Library Kit)，New England Biolabs，Inc.)中篩選共有結(jié)合序列。所述庫含有與406-aa M13基因3蛋白連接的各種12-mer肽。96孔微量滴定板用0.1M NaHCO3(pH8.6)包被緩沖液中10μg/ml濃度的50μl/孔的抗體在4℃包被過夜。洗滌之后，通過與含有0.1MNaHCO3(pH 8.6)、5mg/ml BSA、0.02％NaN3的封閉緩沖液(150μl/孔)在4℃孵育至少一小時來封閉平板。然后將平板與各種濃度的來自如上所述多肽文庫的融合蛋白在室溫下孵育一小時。在用含TBS的0.5％Tween洗滌之后，用含0.2M Glycine-HCl(pH2.2)的1mg/ml BSA緩沖液洗脫結(jié)合的融合蛋白，用1M Tris-HCl(pH9.1)中和。然后測定洗脫的融合蛋白的氨基酸序列。
由單克隆抗體m128-9F9結(jié)合的多肽序列顯示如下WPEDSSYDSWPRGSEQ ID NO4LDYDFLPETEP SEQ ID NO5TATWDPDYFS SEQ ID NO6AETDYDPDHFTPGSEQ ID NO7DARYSHDPAWPYGSEQ ID NO8AGQKWDPEWPHSGSEQ ID NO9EPNMDPNWASPSGSEQ ID NO10KSITYDESWWYNGG SEQ ID NO11YDHHWTNPPTQK SEQ ID NO12YDHHWPRDDIAP SEQ ID NO13
獲得了X1-X2-X3-X4-X5的共有多肽序列，其中X1＝Y(jié)/W/H/M、X2＝D、X3＝S/F/P/E/H、X4＝任何氨基酸，和X5＝P/Y/H/W。
由單克隆抗體m166-43B6結(jié)合的多肽序列顯示如下QDTWYPDYFPESSEQ ID NO14SHTLLNDMFPESSEQ ID NO15SPLRDNFPETLWSEQ ID NO16ASPYMDNFPEENSEQ ID NO17QLVQDWLPEESHSEQ ID NO18YLDYDFLPETEPP SEQ ID NO19獲得了X6-X7-X8-X9-X10的共有多肽序列，其中X6＝D、X7＝Y(jié)/M/N/W/F、X8＝F或L、X9＝P、和X10＝E。
由單克隆抗體m152-15A7結(jié)合的多肽序列顯示如下YTPMPMEISHSASEQ ID NO20MNDKYIPMSISASEQ ID NO21KIPHKTLVPMEISEQ ID NO22TDSAAMEIQTTQSEQ ID NO23獲得了X11-X12-X13-X14的共有多肽序列，其中X11＝P/A、X12＝M、X13＝E/S、和X14＝I。
由單克隆抗體識別的誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡的表位的ELISA分析為了鑒定由如上所述單克隆抗體識別的誘導(dǎo)死亡的表位的特異性，進(jìn)行了夾心ELISA。將含表位多肽的連續(xù)稀釋物(從0.0017fmol到17fmol)與預(yù)先包被在ELISA平板上的單克隆抗體m128-9F9、m152-15A7或m166-43B6孵育，來測定它們的結(jié)合親和性。
96孔微量滴定板用濃度1μg/ml的50μl/孔的抗體在4℃包被過夜。通過與含0.25％BSA的PBS溶液(150μl/孔)在37℃孵育1小時來封閉平板。然后將平板在室溫下與含有各種多肽的融合蛋白孵育2小時。用含0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗滌4次之后，然后將平板與2μg/ml特異于融合伙伴(fusion partner)的抗體在室溫下孵育1.5小時。孵育之后，用PBST洗滌平板4次。然后將50μl的1比3000稀釋的、與堿性磷酸酶(AP)綴合的特異的山羊抗融合伙伴抗體添加到每個孔中，在37℃孵育平板1小時。通過添加50μl的AP底物溶液(1AP底物片溶于5ml底物緩沖液)來進(jìn)行酶反應(yīng)。結(jié)果證明了所有選擇的多肽特異性地結(jié)合用于進(jìn)行選擇的、它們的相應(yīng)的抗體。
其他實施方案在本說明書中公開的所有特征可以按任何組合來組合。在本說明中公開的每個特征可以由服務(wù)于相同、等同或類似目的的可選擇特征來替代。因而，除非是特意地聲明了，所公開的每個特征僅僅是普通系列的同等物或類似特征的一個實例。
根據(jù)以上的說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的基本特征而不背離本發(fā)明的精神和范圍，可以進(jìn)行本發(fā)明的各種變化和修改來使其適應(yīng)各種用途和狀況。因而，其他實施方案也處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.由X1-X2-X3-X4-X5表示的分離的表位的三維構(gòu)象，其中在活化的T細(xì)胞上的所述表位與配體的結(jié)合誘導(dǎo)所述細(xì)胞的死亡，和X1是Tyr、Trp、His或Met；X2是Asp；X3是Ser、Phe、Pro、Glu或His；X4是任何氨基酸；和X5是Pro、Tyr、His或Trp。
2.包含X1-X2-X3-X4-X5的分離的多肽，其中在活化的T細(xì)胞上的所述多肽與配體的結(jié)合誘導(dǎo)所述細(xì)胞的死亡，和X1是Tyr、Trp、His或Met；X2是Asp；X3是Ser、Phe、Pro、Glu或His；X4是任何氨基酸；和X5是Pro、Tyr、His或Trp。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述多肽長度是5到1500個氨基酸。
4.權(quán)利要求3的多肽，其中所述多肽長度是5到150個氨基酸。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中所述多肽長度是5到15個氨基酸。
6.權(quán)利要求2的多肽，其中所述多肽選自SEQ ID NO4和6-13。
7.權(quán)利要求2的多肽，其中所述多肽是X1-X2-X3-X4-X5。
8.抗體，其與具有權(quán)利要求1的三維構(gòu)象的表位結(jié)合并且誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡。
9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體是單克隆的。
10.制備抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的具有權(quán)利要求1的三維構(gòu)象的表位。
11.鑒定誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡的候選化合物的方法，所述方法包括使化合物與具有權(quán)利要求1的三維構(gòu)象的表位接觸，其中所述化合物與所述表位的結(jié)合表明所述化合物是誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的候選物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述化合物是抗體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述化合物是單克隆抗體。
14.誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡的方法，所述方法包括使活化的T細(xì)胞與權(quán)利要求8的抗體接觸。
15.藥物組合物，包括具有權(quán)利要求1的三維構(gòu)象的表位和藥學(xué)上可接受的載體。
16.藥物組合物，包含權(quán)利要求2的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
17.藥物組合物，包含權(quán)利要求8的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
18.由X6-X7-X8-X9-X10表示的分離的表位的三維構(gòu)象，其中在活化的T細(xì)胞上的所述表位與配體的結(jié)合誘導(dǎo)所述細(xì)胞的死亡，和X6是Asp；X7是Tyr、Met、Asn、Trp或Phe；X8是Phe或Leu；X9是Pro；和X10是Glu。
19.包含X6-X7-X8-X9-X10的分離的多肽，其中在活化的T細(xì)胞上的所述多肽與配體的結(jié)合誘導(dǎo)所述細(xì)胞的死亡，和X6是Asp；X7是Tyr、Met、Asn、Trp或Phe；X8是Phe或Leu；X9是Pro；和X10是Glu。
20.權(quán)利要求19的多肽，其中所述多肽長度是5到1500個氨基酸。
21.權(quán)利要求20的多肽，其中所述多肽長度是5到150個氨基酸。
22.權(quán)利要求21的多肽，其中所述多肽長度是5到15個氨基酸。
23.權(quán)利要求19的多肽，其中所述多肽選自SEQ ID NO14-18。
24.權(quán)利要求19的多肽，其中所述多肽是X6-X7-X8-X9-X10。
25.抗體，其與具有權(quán)利要求18的三維構(gòu)象的表位結(jié)合并且誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡。
26.權(quán)利要求25的抗體，其中所述抗體是單克隆的。
27.制備抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的具有權(quán)利要求18的三維構(gòu)象的表位。
28.鑒定誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡的候選化合物的方法，所述方法包括使化合物與具有權(quán)利要求18的三維構(gòu)象的表位接觸，其中所述化合物與所述表位的結(jié)合表明所述化合物是誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的候選物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述化合物是抗體。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物是單克隆抗體。
31.誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡的方法，所述方法包括使活化的T細(xì)胞與權(quán)利要求25的抗體接觸。
32.藥物組合物，包括具有權(quán)利要求18的三維構(gòu)象的表位和藥學(xué)上可接受的載體。
33.藥物組合物，包含權(quán)利要求19的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
34.藥物組合物，包含權(quán)利要求25的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
35.由X11-X12-X13-X14表示的分離的表位的三維構(gòu)象，其中在活化的T細(xì)胞上的所述表位與配體的結(jié)合誘導(dǎo)所述細(xì)胞的死亡，和X11是Pro；X12是Met；X13是Glu或Ser；和X14是Ile。
36.包含X11-X12-X13-X14的分離的多肽，其中在活化的T細(xì)胞上的所述多肽與配體的結(jié)合誘導(dǎo)所述細(xì)胞的死亡，和X11是Pro；X12是Met；X13是Glu或Ser；和X14是Ile。
37.權(quán)利要求36的多肽，其中所述多肽長度是4到1500個氨基酸。
38.權(quán)利要求37的多肽，其中所述多肽長度是4到150個氨基酸。
39.權(quán)利要求38的多肽，其中所述多肽長度是4到15個氨基酸。
40.權(quán)利要求36的多肽，其中所述多肽選自SEQ ID NO20-22。
41.權(quán)利要求36的多肽，其中所述多肽是X11-X12-X13-X14。
42.抗體，其與具有權(quán)利要求35的三維構(gòu)象的表位結(jié)合并且誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡。
43.權(quán)利要求44的抗體，其中所述抗體是單克隆的。
44.制備抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的具有權(quán)利要求35的三維構(gòu)象的表位。
45.鑒定誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡的候選化合物的方法，所述方法包括使化合物與具有權(quán)利要求35的三維構(gòu)象的表位接觸，其中所述化合物與所述表位的結(jié)合表明所述化合物是誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的候選物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述化合物是抗體。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述化合物是單克隆抗體。
48.誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括使活化的T細(xì)胞與權(quán)利要求42的抗體接觸。
49.藥物組合物，包括具有權(quán)利要求35的三維構(gòu)象的表位和藥學(xué)上可接受的載體。
50.藥物組合物，包含權(quán)利要求36的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
51.藥物組合物，包含權(quán)利要求42的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的表位和含有所述表位的多肽。還公開了誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的化合物、制備針對所述表位的抗體的方法、鑒定與所述表位結(jié)合的化合物的方法、誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞死亡的方法和含有所述化合物的藥物組合物。
文檔編號C07K7/06GK1985000SQ200580023402
公開日2007年6月20日 申請日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月11日
發(fā)明者林榮華, 張重男 申請人:臺醫(yī)生物科技股份有限公司