專利名稱：能夠誘導細胞死亡的ror1生物抑制劑的制作方法
能夠誘導細胞死亡的R0R1生物抑制劑本發(fā)明涉及抑制RORl的生物分子。特別地，本發(fā)明提供了能夠通過特異性結(jié)合RORl、其結(jié)構(gòu)域或編碼RORl的核苷酸分子而誘導細胞死亡的諸如抗體和siRNA分子的抑制齊 。本發(fā)明的工作受到了第HEALTH-F5-2008-200755號補助協(xié)議下歐盟第七框架計劃 FP7/2007-2013/ 的資助。慢性淋巴細胞白血病(CLL)是以B淋巴細胞(B細胞)的異常瘤性増殖為特征的白細胞癌癥。CLL的B細胞的活化和成熟期不同于正常B細胞，并且其尤其為來源于具有不同免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgVH)基因突變的經(jīng)受過抗原的B細胞(Chiorazzi N et al.，NEngl J Med 2005; 352:804-15) 與基因未突變的患者相比，具有突變IgVH基因的CLL患者具有較好的預后(Damle RN et al. , Blood 1999; 94:1840-7; Hamblin TJ et al. , Blood 1999;94:1848-54)。全球基因表達譜型研究掲示了在突變和未突變的白血病B細胞中部分不同但整體重疊的表達譜，這提示具有共同的表型(Klein U et al.，J ExpMed2001;194:1625-38;Rosenwald A et al. , J Exp Med 2001;194:1639-47)?；虮磉_譜型研究顯示CLL細胞中的孤兒受體酪氨酸激酶(RTK)RORl増加43.8 倍(Klein U et al. , J Exp Med 2001;194:1625-38)。Rorl 是與肌肉特異性激酶(MUSK)和Trk神經(jīng)營養(yǎng)素受體相關(guān)的孤兒受體RTK家族的成員(Glass DJ, et al.,Cell1996;85:513-23;Masiakowski P et al. , J Biol Chem 1992;267:26181-90;ValenzuelaDM et al. , Neuron 1995;15:573-84)。Ror受體是參與信號轉(zhuǎn)導、細胞-細胞相互作用、細胞增殖調(diào)節(jié)、分化、細胞代謝以及存活的細胞表面受體(Masiakowski P et al. , Biol Cheml992; 267:26181-90; Yoda A etal. , J Recept Signal Transduct Res 2003;23:1-15)。它們在不同的物種(例如，人類、小鼠、果蠅以及秀麗隱桿線蟲)之間在進化上高度保守。人類RORl基因具有2814bp的編碼區(qū)，預計具有937個氨基酸，蛋白大小為105kDa，包括Ig樣結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域以及富含腦氨酸的結(jié)構(gòu)域(圖 I) (Yoda A et al. , J Recept Signal Transduct Res2003;23:1-15)。RORl位于染色體區(qū)lp31. 3 (http://www. ensembl. org),該區(qū)域在惡性血液病中不常見到染色體畸變(圖2)。人RORl在心臟、肺臟以及腎臟中都有表達，但在胎盤、胰腺以及骨骼肌中的表達較少(Reddy UR et al.，0ncogenel996; 13:1555-9)。RORl最初克隆自成神經(jīng)細胞瘤細胞系(Masiakowski P et al. , J Biol Chem 1992; 267:26181-90)，之后從胎兒腦庫分離出缺乏完整細胞外結(jié)構(gòu)域但含有跨膜結(jié)構(gòu)域的較短形式。已經(jīng)報道，在胎兒和成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中、人白血病、淋巴細胞系中以及源自神經(jīng)外胚層的多種人癌癥中均存在截短的 Rorl (t-Rorl)基因(Reddy URet al. , Oncogene 1996;13:1555-9)。還已描述了包含內(nèi)含子7的一短部分的來自外顯子1-7的較短轉(zhuǎn)錄物，預計長度為393個氨基酸，分子量為 44kDa (Ensembl ID; ENSG00000185483)。
在本發(fā)明的第一方面，提供了 RORl的生物抑制劑。生物抑制劑可為多種形式，且包括不同的作用方式。生物抑制是指RORl的量或作用降低，并且這種降低可通過暴露于(接觸)生物抑制劑而引起。例如，所述抑制劑可通過與RORl或編碼RORl的核苷酸序列結(jié)合而直接發(fā)揮作用?；蛘?，所述抑制劑可通過阻止RORl與正常情況下其與之相互作用的分子的相互作用(例如通過阻斷受體)、隔離與RORl結(jié)合或相連的分子、阻止RORl或其結(jié)合物插入諸如細胞膜的膜中而起作用。優(yōu)選地，所述生物抑制劑特異結(jié)合RORl的細胞外結(jié)構(gòu)域、RORl的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或編碼RORl的核苷酸序列。所述生物抑制劑合適地是抗體、干擾核酸分子或可溶性受體中的ー種。在一種實施方式中，所述生物抑制劑是抗體。抗體指完整的抗體及其抗原結(jié)合片 段。此類片段在下文有定義。抗體包含通過ニ硫鍵連接在一起的Mr為50，000-70, 000的兩個相同的多肽(稱為“重鏈”)，其中各自與凡為25，000的相同多肽(稱為“輕鏈”)對之ー連接。不同抗體分子重鏈各N末端之間和不同抗體分子各輕鏈之間具有相當大的序列可變性，因此，這些區(qū)域被稱為“可變區(qū)”。相反，不同抗體分子重鏈各C末端之間和不同抗體分子各輕鏈之間具有相當大的序列相似性，因此，這些區(qū)域被稱為“恒定區(qū)”?？乖Y(jié)合部位由重鏈和輕鏈對的可變域中的高可變區(qū)形成。高可變區(qū)還被稱為互補決定區(qū)(CDR)，其決定抗體對于配體的特異性。重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(\)通常包含三個CDR，其中各CDR側(cè)鄰為具有較小可變性的序列(稱為框架區(qū)(FR))?？贵w的重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)參與抗原識別，這由早期的胰蛋白酶消化實驗首先發(fā)現(xiàn)。進ー步的確認通過對嚙齒類動物抗體“人源化”而實現(xiàn)。嚙齒類動物源性可變域可與人源性的恒定域融合，使得所產(chǎn)生的抗體保留嚙齒類動物親本抗體的抗原特異性(Morrison et al. , 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855)?？乖禺愋杂煽勺冇蛸x予且不依賴于恒定域這一事實是通過包括均含有ー個或多個可變域的抗體片段的細菌表達的試驗而得知的。這些分子包括Fab樣分子(Betteret al. , 1988, Science, 240:1041)，F(xiàn)v 分子(Skerra et al. , 1988, Science, 240, 1038)，其中的Vh和Vlj配對結(jié)構(gòu)域通過柔性寡肽連接的單鏈Fv (ScFv)分子(Bird etal.,1988,Science 242:423;Huston et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879),以及包含分離的V結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (Ward et al. , 1989Nature 341,544)。涉及保留抗體片段的特異性結(jié)合位點的所述抗體片段合成的技術(shù)的綜述見Winter etal.,1991, Nature, 349, 293-299。為了生產(chǎn)多克隆抗體，可通過一次或多次注射天然蛋白、其合成變體或衍生物而對合適的宿主動物(例如，免、山羊、小鼠或其他哺乳動物)進行免疫接種。合適的免疫原性制劑可含有，例如，天然存在的免疫原性蛋白，表現(xiàn)為免疫原性蛋白的化學合成多肽，或重組表達的免疫原性蛋白。另外，所述蛋白可與已知在被免疫接種的哺乳動物中具有免疫原性的第二蛋白結(jié)合。此類免疫原性蛋白的實例包括但不限于鑰孔血藍蛋白(keyholelimpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白以及大豆胰蛋白酶抑制劑。該制劑可進ー步包含佐劑。用于提高免疫應答的多種佐劑包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)，礦物凝膠(例如，氫氧化鋁)，表面活性物質(zhì)(例如，溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽、油乳劑、ニ硝基酹等)，可用于人的佐劑,例如卡介苗和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)或相似的免疫刺激劑?？蓱玫钠渌魟嵗∕PL-TDM佐劑(單磷酰脂質(zhì)A\合成的海藻糖dicorynomycolate (trehalosedicorynomycolateノ)。針對所述免疫原性蛋白的多克隆抗體分子可分離自哺乳動物(例如，來自血液)和通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進ー步純化，例如使用蛋白A或蛋白G的親和層析(其初步產(chǎn)生了免疫血清的IgG級分)。接著，或者可選擇地，可將作為所尋找的免疫球蛋白的靶標的特異性抗原或其表位固定于柱子上以通過免疫親和層析純化免疫特異性抗體。免疫球蛋白的純化的討論見例如D. Wilkinson (The Scientist, published by TheScientist, Inc. , Philadelphia Pa. , Vol. 14, No. 8(Apr. 17, 2000), pp. 25-28)。本文所使用的術(shù)語“單克隆抗體或單抗”(mAb)或“單克隆抗體組合物”是指僅含有由獨特的輕鏈基因產(chǎn)物和獨特的重鏈基因產(chǎn)物組成的ー種分子類別的抗體分子的抗體分子群。特別地，單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)在該抗體分子群的所有分子中均相同。由此，MAb含有能夠與抗原的特定表位(通過對其的獨特結(jié)合親和力而表征)發(fā)生免疫相互作用的抗原結(jié)合部位。所述抗體可為人或人源化抗體或其片段。所述抗體可為包含scFv分子或Fab分子的片段?！癝cFv分子”指其中的Vh和\配對結(jié)構(gòu)域經(jīng)柔性寡肽而連接的分子。使用具有抗原結(jié)合活性的抗體片段的優(yōu)點是非完整抗體的數(shù)倍。片段的較小尺寸可導致藥理特性改進，例如較好的固體組織穿透性。完整抗體的效應子功能，例如互補結(jié)合，被去除。Fab、Fv、ScFv以及dAb抗體片段均可在大腸桿菌(E. coli)中表達并分泌,從而易于產(chǎn)生大量所述片段。完整抗體和F (ab’)2片段為“ニ價體”?！哎藘r體”是指所述抗體和F (ab’)2片段具有兩個抗原結(jié)合部位。相比之下，F(xiàn)ab、Fv、ScFv以及dAb片段為單價,僅具有ー個抗原結(jié)合部位。用于生成、分離和使用針對目的抗原或其表位的抗體的方法為相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如，可使用本領(lǐng)域已知的標準方法在合適的宿主動物(例如，小鼠、兔或山羊)中產(chǎn)生抗體，并將其用作粗的抗血清或?qū)ζ溥M行純化，例如通過親和純化而純化。具有目的特異性的抗體也可使用熟知的分子生物學方法產(chǎn)生，所述方法包括從重組抗體分子庫篩選，或?qū)⒒パa決定區(qū)(O)R)接枝(grafting)或改組(shuffling)至合適的框架區(qū)上。人抗體可選自重組庫和/或通過使用熟知的分子生物學技術(shù)將來自非人抗體的CDR接枝至人框架區(qū)上而產(chǎn)生。本發(fā)明ー種實施方式的抗體可具有

圖17、18以及19中顯示的序列。細胞外結(jié)構(gòu)域是指延伸超過細胞膜表面的生物分子部分，其中所述生物分子整合/包埋在細胞膜中。所述生物分子的實例是具有結(jié)合配體的細胞外部分的受體。如果受體的多肽鏈跨過雙層數(shù)次，則外部結(jié)構(gòu)域可包含數(shù)個伸出細胞膜的“環(huán)”。任何ー個環(huán)或它們的組合都可形成配體的結(jié)合部位。 優(yōu)選地，抗體結(jié)合的細胞外結(jié)構(gòu)域具有選自下述的氨基酸序列WNISSELNKDSYLTL,
RSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFO,YMESLHMQGEIENQI,CQPWNSQYPHTHTFTALRFP?？蛇x地，抗體結(jié)合的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列NKSQKPYKIDSKQAS。合適地，當抗體特異性結(jié)合RORl分子或其結(jié)構(gòu)域時，其在表達RORl的細胞中誘導細胞死亡。優(yōu)選地，生物抑制劑導致表達RORl的細胞死亡。細胞死亡包括所有形式的細胞死亡，包括細胞凋亡、壞死以及自體吞噬性細胞死亡。
細胞凋亡(程序性細胞死亡，I型)是指細胞通過系統(tǒng)性去除內(nèi)容物而蓄意破壞自身的過程，而去除的內(nèi)容物則隨后被周圍細胞攝取。自體吞噬性細胞死亡(也稱為細胞質(zhì)性細胞死亡或程序性細胞死亡，II型)的特征為形成大的空泡，其在細胞核被破壞之前以特定的順序吞噬細胞器。壞死為過早的細胞死亡，其在沒有細胞及其組成部分的受控制的系統(tǒng)性去除的情況下發(fā)生。通常，壞死的特征是細胞器破裂及諸如溶菌酶的酶化合物外漏，其隨后破壞鄰近細胞并導致其壞死。抗體可用于治療中——例如，可將包含治療性抗體的藥物導入受治療者以調(diào)節(jié)所述受治療者的免疫應答。例如，對受治療者中的抗原具有特異性的治療性抗體將刺激針對所述抗原的免疫應答，由此誘導和/或促進免疫應答并有助于痊愈。用于向有需要的患者施用治療性抗體的方法為本領(lǐng)域熟知。在一種可選的實施方式中，生物抑制劑可為干擾核酸分子，包括SiRNA、反義RNA以及dsRNA。優(yōu)選地，干擾核酸分子是能夠與編碼RORl或其片段或變體的核苷酸序列雜交的反義多核苷酸。雜交可在合適的嚴謹條件下進行，例如65°C、2xSSC。“多核苷酸”包括DNA (脫氧核糖核酸)和/或RNA (核糖核酸)的單鏈和/或雙鏈分子及其衍生物。“編碼多核苷酸”包括其序列可經(jīng)翻譯以形成所需多肽的多核苷酸。目前還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可使用siRNA(小干擾RNA分子)誘導血管發(fā)生抑制。RNA干擾(RNAi)是用于沉默特定基因的天然機制?；驗榧毎峁┝酥圃斓鞍椎闹噶睿⑶耶敾虮怀聊瑫r，細胞停止制造由所述基因指定的蛋白。RNA干擾最初在植物中發(fā)現(xiàn)，但RNAi機制理解中的首個關(guān)鍵突破來自對線蟲的研究。這發(fā)生于1998年，當時認識到雙鏈RNA(dsRNA)在RNAi中具有關(guān)鍵作用。使用siRNA體內(nèi)沉默基因的第一個證據(jù)公布于 2002 年(McCaffrey, A. P. , Meuse, L. , Pham, T. T. , Conklin, D. S. , Hannon, G. J. and Kay,M. A. (2002) RNA interference in adult mice. Nature (London) 418，38 - 39),之后是 Songet al.的出版物，其表明siRNA可用于治療性干預。該研究掲示了靶向Fas的RNA干擾保護小鼠免于暴發(fā)性肝炎(Song, E.，Lee, S. K.，Wang, J. et al. (2003) Nat. Med. 9，347 - 351)。siRNA分子可為單鏈(ss)或雙鏈(ds)。siRNA分子可使用構(gòu)建體來遞送,該構(gòu)建體當被遞送至靶細胞時能夠表達siRNA分子?！靶「蓴_RNA”或“短干擾RNA”或“siRNA”或“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”是與靶核酸序列互補的雙鏈RNA分子。雙鏈RNA分子是通過第一 RNA部分和第二 RNA部分之間的互補配對而形成的。各部分的長度通常小于30個核苷酸(例如，29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個核苷酸)。在一些實施方式中，各部分的長度為19至25個核苷酸。在ー些siRNA分子中，RNA分子的第一和第二互補部分為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的“莖”。這兩部分可通過連接序列連接，而連接序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的“環(huán)”。所述連接序列的長度可不同。在一些實施方式中，所述連接序列的長度可為5、6、7、8、9、10、11、12或13個核苷酸。代表性的連接序列是5’-TTC AGA AGG-3’，但也可以使用多個序列中的任一者用于連接所述第一和第二部分。第一和第二部分互補，但可以不完全對稱，這是由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)可含有3’或5’懸突核苷酸(例如，1、2、3、4、或5個核苷酸的懸突)。許多研究者都證明了 RNA分子可有效抑制mRNA聚積。siRNA介導的核酸表達抑制是特異性的，這是因為siRNA和所靶向的核酸之間的甚至單個堿基錯配也可破壞RNA干擾的作用。siRNA通常并不引發(fā)抗病毒應答。合適地，siRNA與編碼RORl細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或編碼RORl細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列互補。 優(yōu)選地，siRNA分子具有下表顯示的siRNA序列
靶序列(cDNA, 5、3 )SiRNA 序列(5、3,)
AT GAA CCA ATG AAT AAC ATC AAU GAA CCA AUG AAU AAC AUC ROR IAAA AA J' CI A I AA AGG CCA ! C l AAA AAU CUA UAA AGG CCA UCU _ ROK 2AC ATG TCA ATT CCA AAT CAT J AAC AUG UCA AUU CCA AAU CAU J ROR 3在本發(fā)明的第二方面，提供了編碼第一方面的生物抑制劑的核苷酸序列。術(shù)語“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互換使用，并且是指核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列。這些術(shù)語也指基因組來源或合成來源的DNA或RNA,其可以是單鏈的或雙鏈的并且可以為正義鏈或反義鏈，或者指肽核酸(PNA)或任何DNA樣或RNA樣物質(zhì)。在本發(fā)明的序列中，A是腺嘌呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，G是鳥嘌呤，N是A、C、G或T(U)?？深A期是，當所述多核苷酸是RNA時，在本發(fā)明提供的序列中的T (胸腺嘧啶)用U(尿嘧啶)取代。通常，本發(fā)明提供的核酸片段可由基因組片段和短的寡核苷酸連接子組裝而成，或由一系列寡核苷酸組裝而成，或由単獨的核苷酸組裝而成，從而產(chǎn)生能在重組轉(zhuǎn)錄單元中表達的合成核酸，所述重組轉(zhuǎn)錄單元包含來源于微生物或病毒操縱子或真核基因的調(diào)控元件。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列的表達載體。典型的原核載體質(zhì)粒為pUC18、pUC19、pBR322以及pBR329，可獲自Biorad實驗室(Richmond, CA, USA) ;pTrc99A、pKK223_3、ρΚΚ233_3、pDR540 以及 pRIT5,可獲自Pharmacia (Piscataway, NJ, USA) ；pBS 載體、Phagescript 載體、Bluescript 載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A,可獲自 Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037，USA)。典型的哺乳動物細胞載體質(zhì)粒為pSVL,可獲自Pharmacia (Piscataway, NJ, USA)。該載體使用SV40晩期啟動子來驅(qū)動克隆基因的表達，最高表達水平見于產(chǎn)生T抗原的細胞，例如C0S-1細胞?？烧T導的哺乳動物表達載體的實例是pMSG，也可獲自Pharmacia (Piscataway, NJ, USA)。該載體使用小鼠乳腺瘤病毒長末端重復序列的糖皮質(zhì)激素誘導型啟動子來驅(qū)動克隆基因的表達?？捎玫慕湍纲|(zhì)粒載體是pRS403_406和pRS413_416,并且通?？色@自StratageneCloning Systems (La Jolla, CA 92037，USA)。質(zhì)粒 Plasmids pRS403、pRS404、pRS405 以及PRS406是酵母整合質(zhì)粒(YIp)，并且引入了酵母選擇性標記HIS3、TRP1、LEU2以及URA3。質(zhì)粒pRS413-416是酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建含有編碼序列和例如合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制的表達載體。所述方法中的ー個包括通過均聚物尾連接。均聚物polydA (或polydC)尾通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶而被添加至待克隆的DNA片段上暴露的3’0H基團上。然后，該片段能夠退火至添加在線性化質(zhì)粒載體末端的PolydT (或polydG)尾。退火后留有的空隙可通過DNA聚合酶填充，游離末端可通過DNA連接酶連接。 另ー種方法包括通過粘性末端連接。相配的粘性末端可通過合適的限制性酶的作 用而在DNA片段和載體上生成。這些末端將通過互補堿基配對而迅速退火，并且遺留的缺ロ可通過DNA連接酶的作用而閉合。另ー種方法使用稱為連接子和適體的合成分子。帶鈍端的DNA片段通過細菌噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合物I而生成，其中，所述酶去除突出的3’末端并填充凹陷的3’末端?？赏ㄟ^T4 DNA連接酶將合成的連接子、含有所限定的限制性酶的識別序列的鈍端雙鏈DNA的片段與鈍端DNA片段連接。然后使用合適的限制性酶對其進行消化以產(chǎn)生粘性末端，并將其與具有相配末端的表達載體連接。適體也是含有用于連接的ー個鈍端且還具有一個預先形成的粘性末端的化學合成的DNA片段。含有多個限制性內(nèi)切核酸酶位點的合成連接子可自許多來源商購獲得，包括國際生物技術(shù)公司(New Haven, CN, USA)。對本發(fā)明編碼多肽的DNA進行修飾的期望方式是使用Saiki et al (1988) Science239，487-491所公開的聚合酶鏈式反應。在該方法中，待酶促擴增的DNA側(cè)鄰兩個特異性寡核苷酸引物，所述引物自身會引入至所擴增的DNA中。所述特異性引物可含有可用于利用本領(lǐng)域已知的方法向表達載體中克隆的限制性內(nèi)切酶識別位點。在本發(fā)明的第四方面，提供了包含本發(fā)明第二和第三方面所述的核苷酸序列或表達載體的宿主細胞。然后在合適的宿主中表達DNA以產(chǎn)生包含本發(fā)明化合物的多肽。因此，可根據(jù)基于本文包含的教導進行適當修飾的已知技木，使用編碼構(gòu)成本發(fā)明化合物的多肽的DNA構(gòu)建表達載體，然后使用該表達載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞，用以表達和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。此類技術(shù)包括公開于下述文獻中的技術(shù)1984年4月3日授予Rutter等人的美國專利第4, 440, 859號;1985年7月23日授予Weissman的美國專利第4，530,901號；1986年4月15日授予Crowl的美國專利第4，582，800號；1987年6月30日授予Mark等人的美國專利第4，677，063號；1987年7月7日授予Goeddel的美國專利第4，678，751號；1987年11月3日授予Itakura等人的美國專利第4，704, 362號；1987年12月I日授予Murray的美國專利第4，710，463號；1988年7月12日授予Toole, Jr.等人的美國專利第4，757，006號；1988年8月23日授予Goeddel等人的美國專利第4，766，075號；以及1989年3月7日授予Stalker的美國專利第4，810, 648號,這些文獻均通過引用并入本文。
編碼構(gòu)成本發(fā)明化合物的多肽的DNA可與許多種其他DNA序列連接，用于向合適的宿主中引入。伴侶DNA將取決于宿主的性質(zhì)，向宿主引入DNA的方式，以及是否需要游離基因的維持或整合。通常，以合適的方向和正確的表達閱讀框?qū)⑺鯠NA插入到表達載體，例如質(zhì)粒中。如有必要，所述DNA可連接有由期望宿主識別的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核苷酸序列，雖然表達載體通常具有這種調(diào)控。因此，所述DNA插入物可以可操作地與合適的啟動子連接。細菌啟動子包括大腸桿菌IacI和IacZ啟動子、T3和T7啟動子、gpt啟動子，噬菌體λ PR和PL啟動子、phoA啟動子和trp啟動子。真核啟動子包括CMV即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動子。其他合適的啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。表達載體還期望含有用于起始和終止轉(zhuǎn)錄的位點，和在轉(zhuǎn)錄區(qū)中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(W0 98/16643)。然后，通過標準技術(shù)將載體導入宿主。通常，并非所有宿主都被載體轉(zhuǎn)化，因此需 要選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞。ー種選擇技術(shù)包括向表達載體中引入具有任何必要控制元件的DNA序列標記,該標記在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞中編碼選擇性特征。這些標記包括用于真核細胞培養(yǎng)的ニ氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，以及用于在大腸桿菌及其他細菌中培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐霉素抗性基因?；蛘撸糜诖祟愡x擇性特征的基因可存在于用于共轉(zhuǎn)化目的宿主細胞的其他載體上。然后，根據(jù)本文公開的教導，在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適條件下將已經(jīng)轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的重組DNA的宿主細胞培養(yǎng)足夠的時間，以允許多肽的表達，然后可回收所表達的多肽?？赏ㄟ^熟知的方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括硫酸銨或こ醇沉淀法、酸提取法、陽離子或陰離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親和層祈、羥基磷灰石色譜法以及凝集素色譜法。更優(yōu)選地，采用高效液相色譜法(“HPLC”)進行純化。已知多種表達系統(tǒng)，包括(但不限干)采用以下的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化有例如重組細菌噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達載體的細菌(例如，大腸桿菌和芽孢桿菌(Bacillus subtilis))；轉(zhuǎn)化有例如酵母載體的酵母(例如，釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae));轉(zhuǎn)化有例如病毒表達載體(桿狀病毒)的昆蟲細胞系統(tǒng)；轉(zhuǎn)化有例如病毒或細菌表達載體的植物細胞系統(tǒng)；轉(zhuǎn)化有例如腺病毒表達載體的動物細胞系統(tǒng)。所述載體可包括原核復制子，例如Col El ori，用于在原核細胞中増殖，即便所述載體用于在其他非原核細胞類型中表達也是如此。所述載體還可包含合適的啟動子，例如能夠在轉(zhuǎn)化有所述載體的細菌宿主細胞(例如大腸桿菌)中指導基因表達(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的原核啟動子。啟動子是由允許RNA聚合酶結(jié)合和發(fā)生轉(zhuǎn)錄的DNA序列形成的表達調(diào)控元件。與示例細菌宿主相容的啟動子序列通常在含有用于插入本發(fā)明的DNA片段的合適限制性位點的質(zhì)粒載體中提供。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的生物抑制劑在誘導細胞死亡中的用途。在本發(fā)明的第六方面，提供了在ー種或多種細胞中誘導細胞死亡的方法，該方法包括將表達RORl的細胞與本發(fā)明第一方面所述的生物抑制劑相接觸。在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明的第一方面所述的生物抑制劑，其用在醫(yī)藥中。在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的生物抑制劑，其用于治療下述疾病慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、卵巣癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌?！爸委煛卑ㄒ韵潞x表現(xiàn)待治療的疾病特征的多種癌細胞的數(shù)量被減少和/或進ー步地癌細胞的生長被延遲和/或阻止和/或癌細胞被殺死。
可使用基于世界衛(wèi)生組織(WHO)對造血和淋巴組織的腫瘤的分類而在實施例I中列出的標準，鑒定慢性淋巴細胞白血病。在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的生物抑制劑在制備治療下述疾病的藥物中的用途慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、卵巣癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌。本發(fā)明的生物抑制劑可用于制備可用于治療下述疾病的藥物組合物(藥物)慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、卵巣癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌。在本發(fā)明的第十方面，提供了治療疾病的方法，該方法包括將本發(fā)明第一方面所述的生物抑制劑施用于受治療者，其中所述疾病選自慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、卵巣癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌?！笆苤委熣摺笔侵赴ㄈ嗽趦?nèi)的所有動物。受治療者的實例包括人、牛、犬、貓、山羊、綿羊以及豬。術(shù)語“患者”是指患有需要治療的病癥的受治療者。待治療的疾病可為進行性的，即，所述疾病隨時間惡化(即，不穩(wěn)定或不改善)。在CLL的情況下，如果符合下述標準則認為患者患有進行性疾病前3個月發(fā)生疾病相關(guān)性貧血(血紅蛋白〈100g/l)，血小板減少(<100χ109/1)和/或脾/肝/淋巴結(jié)大小増加和/或血淋巴細胞計數(shù)増加超過2倍，否則，則認為患者為非進行性的。在本發(fā)明的第十一方面，提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明第一方面所述的生物抑制劑和藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。實施例描述了制備藥物制劑的ー些方法，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，最合適的制劑取決于許多因素，包括給藥途徑、患者類型(例如，患者年齡、體重/大小)。優(yōu)選地，所述藥物組合物在表達RORl的細胞中誘導細胞死亡。在第十二方面，提供了試劑盒，其包含(i)本發(fā)明第一方面所述的生物抑制劑或本發(fā)明第十一方面所述的藥物組合物；(ii)用于施用所述抗體、siRNA或藥物組合物的裝置；以及(iii)使用說明書；
具體實施例方式本發(fā)明的實施方式在下述編號段落中描述。1.R0R1的生物抑制劑。2.段落I中所述的生物抑制劑，其中，所述抑制劑特異性結(jié)合RORl的細胞外結(jié)構(gòu)域、RORl的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或編碼RORl的核苷酸序列。3.段落I或2中所述的生物抑制劑，其中，所述抑制劑選自抗體、干擾核酸分子或可溶性受體。4.段落3中所述的生物抑制劑，其中，所述抗體是完整抗體或其片段。 5.前述任何段落中所述的生物抑制劑，其中，當所述生物抑制劑與RORl或編碼RORl的核苷酸序列特異性結(jié)合時，其在表達RORl的細胞中誘導細胞死亡。6.段落I至4中任何一段落中所述的生物抑制劑，其中，所述生物抑制劑所結(jié)合的細胞外結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列WNISSELNKDSYLTL。7.段落I至4中任何一段落中所述的生物抑制劑，其中，所述生物抑制劑所結(jié)合的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列NKSQKPYKIDSKQAS。8.段落I至5任何一段落中所述的生物抑制劑，其中，所述干擾核酸分子是干擾RNA分子，例如siRNA、反義RNA或dsRNA。9.段落I至5和8任何一段落中所述的生物抑制劑，其中所述干擾核酸分子與編碼RORl的核苷酸序列或其片段或變體互補。10.段落9中所述的生物抑制劑，其中，所述干擾核酸是能夠與編碼RORl的核苷酸序列或其片段或變體雜交的反義多核苷酸。11.段落9或10中所述的生物抑制劑，其中，所述干擾核酸與編碼RORl的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或編碼RORl的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列互補。12.段落5至7中任何一段落中所述的生物抑制劑，其中，所述干擾核酸是具有選自 AAUGAACCAAAGAAUAACAUC、AAAAAUCUAUAAAGGCCAUCU 或 AACAUGUCAAUUCCAAAUCAU 的序列的SiRNA013.編碼前述段落中任一段落所述的生物抑制劑的核苷酸序列。14.包含段落13中所述的核苷酸序列的表達載體。15.包含段落13或14中所述的核苷酸序列或表達載體的宿主細胞。16.段落I至12中所述的生物抑制劑在誘導細胞的細胞死亡中的用途。17.在ー種或多種細胞中誘導細胞死亡的方法，其包括將表達RORl的細胞與段落I至12中所述的生物抑制劑相接觸。18.段落I至12中所述的生物抑制劑，其用于醫(yī)藥中。19.段落I至12中所述的生物抑制劑，其用于治療選自下述的疾病慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、卵巣癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌。20.段落I至12中所述的生物抑制劑在制備治療下述疾病的藥物中的用途慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、卵巣癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌。21.治療疾病的方法，其包括將段落I至12所要求保護的生物抑制劑施用藥于受治療者，其中，所述疾病選自慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、卵巣癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌。22.段落19至21所要求保護的生物抑制劑、用途或方法，其中，所述疾病是進行性疾病。23.段落19至22所要求保護的生物抑制劑、用途或方法，其中，所述疾病是慢性淋巴細胞白血病。
24.藥物組合物，其包含段落I至12所述的生物抑制劑和藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。25.權(quán)利要求18中所要求保護的藥物組合物，其在表達RORl的細胞中誘導細胞死亡。26.試劑盒，其包含⑴段落I至12中所要求保護的生物抑制劑或段落24或25中所要求保護的藥物組合物；(ii)用于施用所述生物抑制劑或藥物組合物的裝置；以及(iii)使用說明書。27.基本如本文實施例和附圖所述的生物抑制劑。28.基本如本文實施例和附圖所述的生物抑制劑的用途。29.基本如本文實施例和附圖所述的使用生物抑制劑的方法。30.基本如本文實施例和附圖所述的藥物組合物。31.基本如本文實施例和附圖所述的試劑盒。實施例下述實施例體現(xiàn)了本發(fā)明的多個方面。應理解，實施例中所使用的特定抗體和/或抗原用于描述本發(fā)明的原理，并非g在限制其范圍。以下參考附圖對實施例進行描述圖1-R0R1基因和Rorl蛋白的示意圖。人R0R-1基因具有2814bp的編碼區(qū)，預計序列為937個氨基酸，蛋白質(zhì)大小為105kDa，包含Ig樣結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域以及富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域。圖中標記了 N-Rorl-Ig (RSTIYGSRLRI RN LDTTDTGYFQ),N-Rorl-CRD (YMESLHMQGEIENQI)、N-Ror I-KNG (CQPffNSQYPHTHTFTALRFP)、C-Rorl-17、C-Rorl-904(NKSQKPYKIDSKQAS) (Y)的抗體識別位點的位置以及下述蛋白結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig)、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)、三環(huán)結(jié)構(gòu)域(Kr)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(TK)、富含絲氨酸和蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域(S/T)以及富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(P)。圖2-標記B-CLL中過表達的基因的部分的人染色體I圖譜。圖3-CLL細胞與對照供體中的RORl基因表達(RT-PCR)。陽性對照=克隆至pGEM-T easy載體中的PCR產(chǎn)物。
陰性對照=無模板的反應混合物。圖4-R0R1基因表達需要PMA/離子霉素(ionomycin)誘導在正常淋巴細胞中表達。在培養(yǎng)48小時后，在活化(PMA/離子霉素)的正常B淋巴細胞和T淋巴細胞、扁桃體B細胞和白血病CLL細胞中的Rorl表達的代表實例。通過定量實時PCR測定所述表達。倍數(shù)增加為相對于零時觀察到的水平。組成型表達Rorl mRNA的CLL細胞和扁桃體B細胞不能進ー步活化，而強活化信號誘導正常B細胞和T細胞中的Rorl基因表達。*=組成型表達RORl且不能被進ー步活化的CLL細胞和扁桃體B細胞。圖5-CLL細胞和健康對照中的Rorl蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡)。所有三種抗體均顯示了 105kD的條帶。C-Ror-1-904還檢測到了估計的Ror-I的130kDA變體。剝離印跡，并使用β_肌動蛋白抗體染色，以顯示所上樣的樣品。圖6-在兩名CLL患者和健康供體中與⑶19相比Rorl的細胞表面染色強度。該圖顯示了進行性和非進行性CLL患者的白血病細胞和以及健康供體的PBMC的Rorl (M-Ror-Icom)和CD 19的細胞表面染色。圖7-多克隆抗體的特異性對照。上圖使用可商購獲得的抗Ror-I多克隆抗體(N-Ror-Iram)的蛋白質(zhì)印跡分析。兩種抗體均與相同的37kDA條帶反應。在大腸桿菌中表達Ror-I蛋白的重組細胞外部分,并將上清濃縮30倍。下圖使用系列稀釋的代表胞質(zhì)區(qū)的可商購獲得的重組Ror-I蛋白并使用本發(fā)明人的兔多克隆抗體c-Ror-1-904檢測的蛋白質(zhì)印跡。[Ror-c-1-904抗體不與Ror-I蛋白的重組細胞外部分反應(數(shù)據(jù)未顯示)]。圖8-活化的正常B細胞中的Rorl蛋白未被磷酸化。正常B細胞的PMA/離子霉素活化誘導未被磷酸化的Ror-I蛋白的表達。圖A=使用PMA/離子霉素活化并使用抗Rorl單克隆抗體檢測的經(jīng)純化的正常外周B細胞的細胞裂解物的免疫印跡。圖B=經(jīng)純化的正常血液B細胞的免疫沉淀(使用抗Rorl單克隆抗體)，其中所述B細胞使用PMA/離子霉素活化，不使用㈠或使用⑴過釩酸鹽(陽性對照，用以誘導 磷酸化)處理，使用PY99單克隆抗體染色，并使用N-ROrl再檢測。PMA/離子霉素活化的B細胞未顯示任何自磷酸化。圖9-Rorl蛋白在CLL細胞中被組成型地磷酸化。CLL患者的代表性試驗。使用磷酸酪氨酸單克隆抗體(PY99)對蛋白磷酸化進行的免疫印跡。使用抗Rorl單克隆抗體使細胞裂解物進行免疫沉淀。使用PY99抗體檢測磷酸化，隨后剝離并使用N-Rorl多克隆抗體再檢測。圖10-抗Rorl單克隆抗體誘導CLL細胞凋亡(膜聯(lián)蛋白(Annexin)-V/PI) (I號CLL患者)。針對Ror-I受體的外部結(jié)構(gòu)域的抗Ror-I單克隆抗體誘導CLL細胞凋亡?；颊咧g的細胞凋亡模式不同。CRD=富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，KNG=三環(huán)結(jié)構(gòu)域，Ig=免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。圖11-抗Ror-I單克隆抗體誘導CLL細胞凋亡(膜聯(lián)蛋白-V/PI) (2號CLL患者)。
針對Ror-I受體的外部結(jié)構(gòu)域的抗Ror-I單克隆抗體誘導CLL細胞凋亡?；颊咧g的細胞凋亡模式不同。CRD=富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，KNG=三環(huán)結(jié)構(gòu)域，Ig=免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。圖12-抗Rorl IgG抗體在CLL細胞的ADCC中誘導細胞毒性。使用抗Rorl單克隆抗體和EHEB CLL細胞系作為靶標，正常健康供體PBMC作為效應細胞的ADCC (18小時)。使用抗Rorl單克隆抗體和CLL細胞作為靶標，同基因NK細胞作為效應細胞的ADCC(18小吋)。使用來自三名不同患者的結(jié)果。圖13-抗Rorl IgG抗體誘導源自肺癌的腫瘤細胞系(A549)和前列腺癌的腫瘤細胞系(DU145)的細胞死亡。 與對照抗體相比，使用KNG抗體和交聯(lián)抗體處理A549肺癌細胞系和DU145前列腺癌細胞系誘導顯著的細胞死亡。圖14-使用抗Ror-IIgG抗體的體內(nèi)處理耗盡了移植至SCID小鼠中的原代CLL細胞。將來自嚴重受影響的CLL患者的PBMC移植至SCID小鼠中。使用抗ROR單克隆抗體的處理完全耗盡了來自小鼠腹腔(peritoneum)的人細胞。圖15-通過 RT-PCR 測定的 CLL 中 Ror-1 mRNA 的 siRNA 下調(diào)。根據(jù)實時定量PCR測定，siRNA介導CLL細胞中Ror_l mRNA的下調(diào)。圖16-Ror-l的siRNA沉默誘導CLL細胞凋亡。siRNA介導的Ror-I沉默導致CLL細胞的特異性凋亡。三種不同患者的結(jié)果(使用三種不同的siRNA構(gòu)建體)。圖17-抗Ror I I g24 (克隆2A4)抗體的\和Vh序列。圖18-抗Rorl CRD16 (克隆1C11)抗體的Vl和Vh序列。圖19-抗Rorl KNG20 (克隆4C10)抗體的Vl和Vh序列。圖20-健康供體的PBMC細胞表面染色。使用六種抗1 ( 1抗體244、1(11、447、388、108以及 4C10 進行。圖21-CLL淋巴細胞的細胞表面染色。使用六種抗1 ( 1抗體244、1(11、447、388、108以及 4C10 進行。圖22-對CLL患者和健康供體的用抗RORl抗體的細胞染色頻率進行比較。圖23-對進行性和非進行性CLL疾病的用抗RORl抗體的細胞染色頻率進行比較。圖24-抗Rorl單克隆抗體誘導CLL細胞凋亡(膜聯(lián)蛋白-V/PI)。六種抗1 ( 1抗體244、1(11、447、388、108以及 4C10 的比較。圖25-CLL細胞中的PARP裂解。凝膠顯示了與利妥昔單抗(rituximab)、鼠抗體和無抗體對照相比響應抗RORl抗體的裂解的PARP。實施例I-Rorl特異性抗體的產(chǎn)生抗Rorl抗體的產(chǎn)生針對表I所描述的四種合成肽生成小鼠單克隆抗體。免疫級肽購自ThermoElectron Corporation (GmbH, Ulm, Germany)。根據(jù)經(jīng)較小修飾的標準方案，使用結(jié)合有鑰孔血藍蛋白(KLH)的肽產(chǎn)生小鼠單克隆抗體(mAb) (Kohler and Milstein C，(1975)Nature256pp495-7)。使用無關(guān)肽和蛋白以及轉(zhuǎn)染有Rorl基因的C0S-7細胞系通過ELISA測定法測定所產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性。表I.用于產(chǎn)生單克隆抗體的Rorl肽
權(quán)利要求
1.RORl生物抑制劑，其能夠在表達RORl的細胞中誘導細胞死亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物抑制劑，其中，所述抑制劑特異性結(jié)合RORl的細胞外結(jié)構(gòu)域、RORl的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或編碼RORl的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生物抑制劑，其中，所述抑制劑選自抗體、干擾核酸分子或可溶性受體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物抑制劑，其中，所述抗體是完整抗體或其片段。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的生物抑制劑，其中，當所述抑制劑與RORl或所述編碼RORl的核苷酸序列特異性結(jié)合時，誘導細胞死亡。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的生物抑制劑，其中，所述生物抑制劑所結(jié)合的細胞外結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列WNISSELNKDSYLTL。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的生物抑制劑，其中，所述生物抑制劑所結(jié)合的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列NKSQKPYKIDSKQAS。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的生物抑制劑，其中，所述干擾核酸分子是干擾RNA分子，例如siRNA、反義RNA或dsRNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至5和8中任一項所述的生物抑制劑，其中所述干擾核酸分子與所述編碼RORl的核苷酸序列或其片段或變體互補。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物抑制劑，其中，所述干擾核酸是能夠與所述編碼RORl的核苷酸序列或其片段或變體雜交的反義多核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10中所述的生物抑制劑，其中，所述干擾核酸與編碼RORl的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或編碼RORl的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列互補。
12.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的生物抑制劑，其中，所述干擾核酸是具有選自AAUGAACCAAAGAAUAACAUC、AAAAAUCUAUAAAGGCCAUCU 或 AACAUGUCAAUUCCAAAUCAU 的序列的SiRNA0
13.編碼前述權(quán)利要求中任一項所述的生物抑制劑的核苷酸序列。
14.包含權(quán)利要求13所述的核苷酸序列的表達載體。
15.包含權(quán)利要求13或14所述的核苷酸序列或表達載體的宿主細胞
16.權(quán)利要求I至12所述的生物抑制劑在誘導細胞死亡中的用途。
17.在一種或多種細胞中誘導細胞死亡的方法，其包括將表達RORl的細胞與權(quán)利要求I至12所述的生物抑制劑相接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求I至12所述的生物抑制劑，其用于醫(yī)藥中。
19.根據(jù)權(quán)利要求I至12所述的生物抑制劑，其用于治療選自下述的疾病慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌。
20.根據(jù)權(quán)利要求I至12中所述的生物抑制劑在制備治療選自下述的疾病的藥物中的用途慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌。
21.治療疾病的方法，其包括將權(quán)利要求I至12所述的生物抑制劑施用于受治療者的步驟，其中，所述疾病選自慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及肝細胞癌。
22.根據(jù)權(quán)利要求19至21所述的生物抑制劑、用途或方法，其中，所述疾病是進行性疾病。
23.根據(jù)權(quán)利要求19至22所述的生物抑制劑、用途或方法，其中，所述疾病是慢性淋巴細胞白血病。
24.藥物組合物，其包含權(quán)利要求I至12所述的生物抑制劑和藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其在表達RORl的細胞中誘導細胞死亡。
26.試劑盒，其包含 (i)權(quán)利要求I至12所述的生物抑制劑或權(quán)利要求24或25所述的藥物組合物； ( )用于進行所述生物抑制劑或藥物組合物給藥的裝置；以及 (iii)使用說明書。
27.基本如本文參照實施例和附圖所述的生物抑制劑。
28.基本如本文參照實施例和附圖所述的生物抑制劑的用途。
29.基本如本文參照實施例和附圖所述的使用生物抑制劑的方法。
30.基本如本文參照實施例和附圖所述的藥物組合物。
31.基本如本文參照實施例和附圖所述的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過特異性結(jié)合ROR1、其結(jié)構(gòu)域或編碼ROR1的核苷酸分子而誘導細胞死亡的抗體和siRNA分子。本發(fā)明還提供了涉及本發(fā)明的抗體和siRNA分子的方法和本發(fā)明的抗體和siRNA分子的用途。
文檔編號C12N15/113GK102712695SQ201080061963
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者哈坎·梅爾斯泰特, 英格麗德·泰格, 霍賈托爾拉·拉巴尼 申請人:生物發(fā)明國際公司