專利名稱：生產(chǎn)重鏈抗體的小鼠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域?yàn)樯a(chǎn)重鏈抗體的遺傳修飾的非人動(dòng)物，尤其是在其編碼免疫球蛋白Y (IgG)基因的CHl結(jié)構(gòu)域(或CHl結(jié)構(gòu)域及鉸鏈區(qū))的序列內(nèi)包含核苷酸序列刪除卻能夠表達(dá)不缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域的IgM的遺傳修飾的非人動(dòng)物，具體而言為能夠產(chǎn)生野生型IgM分子(S卩，具有CHl結(jié)構(gòu)域)但產(chǎn)生不含功能性CHl結(jié)構(gòu)域(或CHl結(jié)構(gòu)域以及鉸鏈區(qū))的重鏈IgG抗體的小鼠。
背景技術(shù)：
在大多數(shù)動(dòng)物中，正常的免疫球蛋白重鏈只在與其同源輕鏈相偶聯(lián)時(shí)會(huì)有很好的 表達(dá)。在人類中，單獨(dú)的重鏈發(fā)現(xiàn)于重鏈疾病中，這些疾病的表征為重鏈功能失調(diào)，其缺少可變重鏈、CHl或可變重鏈及CHl結(jié)構(gòu)域的序列。不含輕鏈的重鏈可見于魚的特定物種以 及駱駝中。這些重鏈缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域并且在其重鏈可變結(jié)構(gòu)域中具有非人的特征。已有人嘗試通過修飾小鼠以表達(dá)模擬駱駝或魚的特定物種中發(fā)現(xiàn)的VHH結(jié)構(gòu)域的駱駝化基因而產(chǎn)生駱駝化抗體，部分地通過移除IgM和IgG的CHl結(jié)構(gòu)域并使重鏈可變區(qū)的構(gòu)象變?yōu)榕c駱駝和/或特定魚物種類似。然而，預(yù)期駱駝化抗體可誘導(dǎo)非駱駝動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域有對(duì)遺傳修飾的非人動(dòng)物的需要，其可用于產(chǎn)生具有非駱駝VH結(jié)構(gòu)域的重鏈抗體。附圖簡(jiǎn)述圖I不例說明了小鼠中的野生型IgGl基因座(locus) (IgGl，上圖)，顯不了 JH區(qū)域基因片段，其融合至CHl基因片段，其后為鉸鏈區(qū)域、CH2基因片段及CH3基因片段；由刪除CHl結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體靶向的IgGl位點(diǎn)(IgGl ACH1，中圖);由刪除CHl結(jié)構(gòu)域及鉸鏈區(qū)域的構(gòu)建體革巴向的IgGl位點(diǎn)(IgGl ACHl-A hinge,下圖)。圖2示例說明了靶向小鼠IgGl基因以產(chǎn)生表達(dá)缺少CHl結(jié)構(gòu)域的IgGl的經(jīng)遺傳修飾的基因座。圖3示例說明了靶向小鼠IgGl基因以產(chǎn)生表達(dá)缺少CHl結(jié)構(gòu)域并缺少鉸鏈區(qū)域的IgGl的經(jīng)遺傳修飾的基因座。圖4示例說明了靶向小鼠重鏈恒定區(qū)基因座以產(chǎn)生表達(dá)缺少CHl結(jié)構(gòu)域的IgGl而不表達(dá)IgG2b或IgG2a的經(jīng)遺傳修飾的基因座。圖5示例說明了由刪除CHl結(jié)構(gòu)域并刪除鉸鏈區(qū)且刪除IgG2b基因及IgG2a基因的構(gòu)建體靶向的小鼠重鏈恒定區(qū)。圖6示例說明了經(jīng)遺傳修飾的小鼠的重鏈恒定區(qū)，其具有缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的IgGl (上圖)，以及經(jīng)遺傳修飾的小鼠的重鏈恒定區(qū)，其具有缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的IgGl，且其缺少IgG2a基因并缺少IgG2b基因(下圖)。圖7顯示了對(duì)不同CHO細(xì)胞上清進(jìn)行的Western印跡，其中CHO細(xì)胞分別經(jīng)工程改造為獨(dú)立地表達(dá)對(duì)照(與小鼠Fe融合的細(xì)胞因子胞外域)、缺少CHl結(jié)構(gòu)域的嵌合(人VR) / (小鼠Fe)重鏈抗體(hVR-mFc A CHl )、缺少CHl結(jié)構(gòu)域的駱駝化嵌合(人VR) / (小鼠Fe)重鏈抗體(hVR*-mFc A CHl),嵌合(人VR) / (小鼠Fe)重鏈抗體(hVR-mFc)、駱駝化嵌合(人VR)/ (小鼠Fe)重鏈抗體(hVR*-mFc)、具有或不具有CHl結(jié)構(gòu)域的mFc (分別為mFc和mFc ACH1)。圖8顯示了用抗小鼠IgG對(duì)來自野生型小鼠(左)及來自IgGl缺少CHl結(jié)構(gòu)域且缺少鉸鏈區(qū)的經(jīng)遺傳修飾的小鼠(雜合，右)的小鼠血清進(jìn)行的還原性SDS-PAGE的Western印跡圖像；提供了重鏈以及分子量標(biāo)志物位置的示意圖。圖9顯示了來自野生型小鼠(WT)及來自四只IgGl缺少CHl結(jié)構(gòu)域且缺少鉸鏈區(qū)的經(jīng)遺傳修飾的小鼠(純合；分別標(biāo)記為HO UHO 2、H0 3、H0 4)的小鼠血清進(jìn)行的非還原性SDS-PAGE的Western印跡圖像，用抗小鼠IgG進(jìn)行印跡；每只小鼠(WT或HO)都有兩條泳道，泳道以上方的括號(hào)表示對(duì)應(yīng)著每只動(dòng)物血清的1:5及1:10稀釋樣品(對(duì)每只動(dòng)物為從左到右的連續(xù)泳道)。

圖10提供了正常IgGl抗體(左)及缺少CHl結(jié)構(gòu)域并缺少鉸鏈區(qū)的重鏈抗體的示 意圖。圖11顯示了對(duì)野生型小鼠(WT)及包含缺少CHl結(jié)構(gòu)域并缺少鉸鏈區(qū)的IgGl的經(jīng)遺傳修飾的小鼠(HO ;表達(dá)缺少CHl結(jié)構(gòu)域并缺少鉸鏈區(qū)的重鏈抗體的純合小鼠)分別進(jìn)行IgGl和IgG2b血清免疫球蛋白測(cè)定。對(duì)照為混合的人血清。圖12顯示了擴(kuò)增自小鼠(其在經(jīng)修飾的內(nèi)源小鼠重鏈基因座具有不含IgGlCHl及鉸鏈區(qū)序列的小鼠重鏈基因序列)的脾RNA的11個(gè)獨(dú)立RT-PCR克隆的蛋白質(zhì)序列。Bl=SEQID NO:19 ；B2=SEQ IDN0:21 ；B3=SEQ ID NO:23 ；B5=SEQ ID NO:25 ；D2=SEQ IDNO:27 ；D5=SEQID NO:29 ；D6=SEQ ID NO:31 ；E2=SEQ IDNO:33 ；E8=SEQ ID NO:35 ；E10=SEQ ID NO:37 ；F6=SEQ IDNO: 390小寫字體的堿基表示由于重組過程中的突變和/或N添加產(chǎn)生的非種系堿基。點(diǎn)表示在序列中的人為缺口以使骨架區(qū)(FR)及互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)之間能進(jìn)行合適的比對(duì)，在序列上對(duì)骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)有所標(biāo)注。對(duì)每個(gè)克隆顯示了內(nèi)源IgGl (CH2)恒定區(qū)的CH2區(qū)域中的前九個(gè)氨基酸。圖13顯示了擴(kuò)增自小鼠(其在修飾的內(nèi)源小鼠重鏈基因座具有不含IgGl CHl區(qū)域序列的人重鏈基因序列)的脾RNA的7個(gè)獨(dú)立RT-PCR克隆的蛋白質(zhì)序列。A8=SEQ IDNO:51 ；C2=SEQ IDNO:53 ；D9=SEQ ID NO:55 ；C4=SEQ ID NO:57 ；H8=SEQ IDNO:59 ；A5=SEQ IDNO:61 ；A2=SEQ ID N0:63。小寫字體的堿基表示由于重組過程中的突變和/或N添加產(chǎn)生的非種系堿基。點(diǎn)表示在序列中的人為缺口以使骨架區(qū)(FR)及互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)之間能進(jìn)行合適的比對(duì)，在序列上對(duì)骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)有所標(biāo)注。對(duì)每個(gè)克隆顯示了內(nèi)源IgGl(HINGE)恒定區(qū)的13個(gè)氨基酸鉸鏈區(qū)的前七個(gè)氨基酸。發(fā)明概述提供了經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎、非人動(dòng)物及產(chǎn)生和使用其的方法，其中所述動(dòng)物經(jīng)遺傳修飾為缺少免疫球蛋白G (IgG)的功能性CHl序列，任選的修飾為在經(jīng)修飾的IgG上缺少功能性IgG鉸鏈區(qū)，其中所述細(xì)胞、胚胎以及動(dòng)物包含有功能性IgM CHl序列。在一些方面，所述小鼠包含一種或多種人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因片段對(duì)一種或多種或全部?jī)?nèi)源小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因片段的取代。在一些方面，一種或多種人V、一種或多種人D以及一種或多種人J基因片段對(duì)所有內(nèi)源小鼠V、D和J基因片段進(jìn)行取代。在一方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其中遺傳修飾包括對(duì)編碼IgG恒定區(qū)的核苷酸序列的修飾，其中修飾引起IgG恒定區(qū)的CHl結(jié)構(gòu)域的功能丟失。在一個(gè)實(shí)施方式中，引起功能丟失的修飾為編碼CHl結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的刪除，或編碼CHl結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列之內(nèi)的刪除。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述IgG選自IgGl、IgG2a、IgG2b及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述IgG為IgGl。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述IgG為IgGl、IgG2a以及IgG2b。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾進(jìn)一步包含編碼含有所述CHl修飾的IgG的鉸鏈區(qū)的核苷酸序列的刪除。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠選自129種系、C57BL/6種系以及129xC57BL/6雜交系。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠為50%的129及50%C57BL/6。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠為129種系，選自129P1、129P2、129P3、129X1、129S1 (如、129Sl/SV、129Sl/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6 (129/SvEvTac)、129S7、129S8、129Tl、129T2 (見，例如 Festing 等人(1999) Revisednomenclaturefor strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836)。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠為C57BL種系，在一個(gè)特定實(shí)施方式中選自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C57BL/01a。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠為前述129種系及前述C57BL/6種系的雜交系。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠為前述129種系間的雜交系或前述BL/6種系之間的雜交系。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述雜交的129種系為129S6 (129/SvEvTac)種系。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含一個(gè)或多個(gè)未重排的內(nèi)源小鼠重鏈免疫球蛋白可變區(qū)(mVR)基因片段、其可操作地地連接于經(jīng)修飾的IgG恒定區(qū)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)mVR基因片段來自小鼠VH基因家族、選自VH1、VH3、VH5、VH7、VH14及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)mVR基因片段選自mVHl-26、1-42、1-50、1-58、1-72、3-6、5-6、7-1、14-2 及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含重排的基因，其編碼缺少功能性CHl區(qū)域的IgG重鏈中的FR1、FR2及FR3，其中FR1、FR2及FR3各自獨(dú)立地與衍生自選自VH1、VH3、VH5、VH7及VH14基因家族的mVH種系序列的FRl、FR2和FR3有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述mVH種系序列選自1-26、1-42、1-50、1-58、1_72、3_6、5-6、7-1 及 14-2 序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含衍生自選自DH 1-1、2-14、3-1、3-2、3-3、4_1及其組合的DH基因片段的CDR3。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠CDR3包含由JH (即JH1、JH2、JH3或JH4)編碼的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼⑶R3的重排的抗體序列，其衍生自DH 1_1、
2-14、3-1、3-2、3-3、4-1 及 JH1、JH2、JH3、或 JH4 的重排。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼缺少功能性CHl區(qū)域的IgG重鏈的FR4的重排基因、其中FR4與通過DHl-l、2-14、3-l、3-2、3-3或4-1和JH1、JH2、JH3或JH4重排而編碼的 FR4 有至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性。 在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠在內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因座包含非重排的人重鏈免疫球蛋白可變區(qū)(hVR)基因片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠在內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因座包含可操作地連接于經(jīng)修飾的IgG恒定區(qū)序列的非重排hVR基因片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，hVR基因片段來自人VH基因家族，選自VH1、VH3、VH4及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種或多種hVR基因片段選自1-2、1-8、1-18、1-46、1-69、3-21、3-72、及4-59。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述一種或多種hVR基因片段選自1-8、1-18和1-69。在一個(gè)實(shí)施方式中，所有或幾乎所有小鼠重鏈V基因片段由一種或多種人重鏈V基因片段所取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，所有小鼠重鏈V和D基因片段都由一種或多種人重鏈V和D基因片段所取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，所有小鼠重鏈V、D和J基因片段都由一種或多種人重鏈V、一種或多種人重鏈D及一種或多種重鏈J基因片段所取代。在這些實(shí)施方式中，人重鏈V和/或D和/或J基因片段處于小鼠內(nèi)源重鏈基因座并可操作地連接于小鼠恒定區(qū)基因或經(jīng)修飾的小鼠恒定區(qū)基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼缺少功能性CHl區(qū)域的IgG重鏈的FRl、FR2和FR3序列的核苷酸序列，其與來自1-8、1-18或1-69的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因片段的人種系核苷酸序列的FR1、FR2、和FR3有至少80%的同一性；其中不考慮小鼠和人序列的 CDR序列將經(jīng)修飾的小鼠的FR1+FR2+FR3序列與所引用的人種系序列進(jìn)行優(yōu)化對(duì)比(即，對(duì)FR進(jìn)行優(yōu)化對(duì)比，而不在比較中考慮任何CDR的氨基酸的同一性)。在特定的實(shí)施方式中，F(xiàn)R1、FR2和FR3與重鏈可變區(qū)基因片段為1_8、1_18或1_69基因片段的人種系核苷酸序列FR1+FR2+FR3 有大約 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠進(jìn)一步包含F(xiàn)R4，其與由人D6-19/J6重排、D6-7/J4重排、D4-4/J4重排、D6-6/J2重排、D3-16/J6重排、D6-6/J4重排及D1-7/J4重排形成的FR4有至少80%的同一性。在特定的實(shí)施方式中，所述FR4與由上述D/J重排形成的FR4有大約85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼FRl的核苷酸序列，所述FRl的氨基酸序列與由選自Vl-8、V1-18和V1-69的人重鏈可變區(qū)基因片段的種系序列編碼的FRl相差不超過I個(gè)、不超過2個(gè)、不超過3個(gè)、不超過4個(gè)或不超過5個(gè)氨基酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，編碼所述FRl的核苷酸序列為重排序列，其可操作地連接于編碼缺少功能性CHl序列的IgG恒定區(qū)的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼FR2的核苷酸序列，所述FRl的氨基酸序列與由選自Vl-8、V1-18和V1-69的人重鏈可變區(qū)基因片段的種系序列編碼的FR2相差不超過I個(gè)、不超過2個(gè)、不超過3個(gè)、不超過4個(gè)或不超過5個(gè)氨基酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，編碼所述FR2的核苷酸序列為重排序列，其可操作地連接于編碼缺少功能性CHl序列的IgG恒定區(qū)的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼FR3的核苷酸序列，所述FRl的氨基酸序列與由選自Vl-8、V1-18和V1-69的人重鏈可變區(qū)基因片段的種系序列編碼的FR3相差不超過I個(gè)、不超過2個(gè)、不超過3個(gè)、不超過4個(gè)、不超過5個(gè)、不超過6個(gè)、不超過7個(gè)、不超過8個(gè)、不超過9個(gè)、不超過10個(gè)或不超過11個(gè)氨基酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，編碼所述FR3的核苷酸序列為重排序列，其可操作地連接于編碼缺少功能性CHl序列的IgG恒定區(qū)的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼FR4的核苷酸序列，所述FR4的氨基酸序列與由選自人 D6-19/J6、D6-7/J4、D4-4/J4、D6-6/J2、D3-16/J6、D6-6/J4 和 D1-7/J4 的重排編碼的FR4氨基酸序列相差不超過I個(gè)、不超過2個(gè)、不超過3個(gè)氨基酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，編碼所述FR4的核苷酸序列為重排序列，其可操作地連接于編碼缺少功能性CHl序列的IgG恒定區(qū)的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼衍生自人重鏈D區(qū)域基因片段(hDH)的重鏈CDR3的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述hDH選自Dl-7、D3-16、D4-4、D6-6、D6-7和D6-19。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含編碼衍生自人重鏈連接基因片段(JH)的重鏈⑶R3的核苷酸序列。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述JH選自J2、J4及J6。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含由衍生自人DH和人JH重排的核苷酸序列編碼的重鏈CDR3。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述CDR3衍生自D1-7/J4、D3-16/J6、D4-4/J4、D6-6/J2、D6-6/J4、D6-7/J4 或 D6-19/J6 重排。
在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含hVR基因片段對(duì)內(nèi)源mVR基因片段的取代。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，hVR基因片段對(duì)內(nèi)源mVR基因片段的取代與經(jīng)修飾的重鏈恒定區(qū)在同一個(gè)等位基因上。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，hVR基因片段對(duì)mVR基因片段的取代與經(jīng)修飾的重鏈恒定區(qū)在不同的等位基因上。在一個(gè)實(shí)施方式中，90-100%的mVR基因片段由至少一種hVR基因片段所取代。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所有或幾乎所有內(nèi)源mVR基因片段被至少一種hVR基因片段所取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，取代為用至少18、至少39或至少80或81個(gè)hVR基因片段進(jìn)行取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，取代是用至少12個(gè)功能性hVR基因片段、至少25個(gè)功能性hVR基因片段或43個(gè)功能性hVR基因片段進(jìn)行取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠包含轉(zhuǎn)基因，其包含至少一個(gè)非重排hVR基因片段、至少一個(gè)非重排人D片段、至少一個(gè)非重排人J片段以及至少一種人重鏈恒定序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)和K輕鏈可變區(qū)基因座發(fā)生功能性沉默。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，小鼠能夠反式轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生嵌合人/小鼠抗體，其包含與小鼠IgG序列相鄰的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述小鼠IgG序列缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域并且任選的缺少所述缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域的IgG的鉸鏈區(qū)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步包含缺少CHl結(jié)構(gòu)域的IgG序列，且任選的包含具有功能性CHl結(jié)構(gòu)域的IgM。在一個(gè)進(jìn)一步的具體的實(shí)施方式中，IgG序列缺少鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含第一個(gè)重鏈可變區(qū)等位基因和第二個(gè)重鏈可變區(qū)等位基因，其中第一個(gè)等位基因和第二個(gè)等位基因都源自相同的小鼠種系。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一個(gè)等位基因來自第一種小鼠種系，第二個(gè)等位基因來自第二種小鼠種系。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一和第二個(gè)等位基因的其中一個(gè)等位基因包含至少一個(gè)hVR對(duì)mVR的取代。在另一個(gè)實(shí)施方式中，兩個(gè)等位基因都包含至少一個(gè)hVR對(duì)mVR的取代。在一方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其中小鼠表達(dá)包含CHl結(jié)構(gòu)域的IgM，且此小鼠表達(dá)缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域的IgG或表達(dá)缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域并缺少功能性鉸鏈區(qū)的 IgG0在一個(gè)實(shí)施方式中，所述IgG為IgGl.在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠表達(dá)四種IgG，為經(jīng)修飾的IgGl及野生型IgG3、IgG2a和IgG2b。在另一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠表達(dá)不超過兩種IgG，為經(jīng)修飾的IgGl和野生型IgG3。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，小鼠表達(dá)的重鏈同種型為野生型IgM、野生型IgD、野生型IgG3、修飾的IgGl、野生型IgG2a、野生型IgG2b、野生型IgA以及野生型IgE。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，小鼠表達(dá)的重鏈同種型為野生型IgM、野生型IgD、野生型IgG3、修飾的IgGl、野生型IgA及野生型IgE。在多個(gè)實(shí)施方式中，IgGl的修飾包含CHl結(jié)構(gòu)域的刪除，以及任選的，含有鉸鏈區(qū)的刪除。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠來自選自129、C56BL/6、129xC57BL/6雜交系的種系。在一個(gè)方面，提供了表達(dá)重鏈抗體的小鼠，其中重鏈抗體主要由二聚重鏈構(gòu)成，其中重鏈缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域或缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域和功能性鉸鏈區(qū)，所述重鏈包含哺 乳動(dòng)物重鏈可變結(jié)構(gòu)域(其包含與種系可變區(qū)基因編碼的哺乳動(dòng)物重鏈可變結(jié)構(gòu)域不相同的序列)，且所述重鏈包含人或小鼠的CH2結(jié)構(gòu)域及人或小鼠的CH3結(jié)構(gòu)域，其中小鼠表達(dá)野生型人或小鼠IgM。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含功能性免疫球蛋白輕鏈基因基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，其中哺乳動(dòng)物重鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿嘶蛐∈笾劓溈勺兘Y(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈抗體主要由缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域并缺少功能性鉸鏈區(qū)的二聚體重鏈構(gòu)成，其中重鏈包含人可變結(jié)構(gòu)域(其包含至少一個(gè)體細(xì)胞突變并包含CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自小鼠和人結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域都來自人；在另一個(gè)實(shí)施方式中，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域都是小鼠。在一個(gè)方面，提供了重鏈抗體，其中重鏈抗體包含的重鏈含有非駱駝可變結(jié)構(gòu)域和缺少CHl結(jié)構(gòu)域的重鏈恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈抗體還缺少鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈抗體包含主要由鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域以及CH3結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈抗體包含主要由CH2結(jié)構(gòu)域以及CH3結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，非駱駝的可變結(jié)構(gòu)域?yàn)轶w細(xì)胞突變的人或小鼠重鏈可變結(jié)構(gòu)域，獲自來自小鼠或包含人重鏈可變區(qū)基因片段的經(jīng)遺傳修飾的小鼠的B細(xì)胞的編碼IgM或IgG的核苷酸序列。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，小鼠包含人源化的重鏈可變區(qū)基因片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含至少一種人可變區(qū)基因片段對(duì)內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因片段基因座的取代。在另一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含至少一種人可變區(qū)基因片段、至少一種人D基因片段及至少一種人J基因片段對(duì)內(nèi)源小鼠重鏈片段基因座的取代。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，內(nèi)源小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因座全部地或幾乎全部由包含多個(gè)人V、D和J基因片段的人重鏈可變區(qū)基因座取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，非駱駝的可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿嘶蛐∈罂勺兘Y(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，非駱駝的可變結(jié)構(gòu)域?yàn)榘环N或多種駱駝化修飾的人或小鼠可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，駱駝化修飾選自L11S、V37F、G44E、L45C、L45R和W47G (Kabat編號(hào))。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，駱駝化修飾選自V37F、G44E和L45C。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)3 (⑶R3)，其包含兩個(gè)半胱氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈抗體包含第一種重鏈(包含第一種重鏈可變結(jié)構(gòu)域)和第二種重鏈(包含第二種重鏈可變結(jié)構(gòu)域)的二聚體，其中第一種和第二種重鏈每種都缺少CHl結(jié)構(gòu)域(或缺少CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū))。在一個(gè)實(shí)施方式中，二聚體的第一種重鏈的人可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合第一個(gè)表位，而二聚體的第二種重鏈的人可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合第二種表位，其中第一個(gè)和第二個(gè)表位不相同。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，第一種和第二種重鏈的重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含如本文所描述的人重鏈可變結(jié)構(gòu)域及/或人重鏈FR區(qū)。在一方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的非人細(xì)胞，其中遺傳修飾包括刪除IgG CHl結(jié)構(gòu)域，且細(xì)胞表達(dá)功能性IgM。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞包含的IgM基因包含編碼CHl結(jié)構(gòu)域的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞選自非人ES細(xì)胞、多能細(xì)胞及全能細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，非人ES細(xì)胞選自小鼠ES細(xì)胞及大鼠ES細(xì)胞。在一方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的非人胚胎，其中遺傳修飾包括如本文所描述的修飾。在一個(gè)實(shí)施方式中，遺傳修飾包括刪除IgG CHl結(jié)構(gòu)域，且非人胚胎表達(dá)功能性IgM。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，非人胚胎包含的IgM基因包含CHl結(jié)構(gòu)域。·在一個(gè)實(shí)施方式中，非人胚胎為小鼠胚胎或大鼠胚胎。在一方面，提供了包含供體細(xì)胞的非人胚胎，其中供體細(xì)胞是經(jīng)遺傳修飾的，且其中遺傳修飾為本文描述的修飾。在一個(gè)實(shí)施方式中，遺傳修飾包括刪除IgG CHl結(jié)構(gòu)域，且細(xì)胞包含的IgM基因包含CHl結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，非人胚胎為小鼠胚胎或大鼠胚胎，供體細(xì)胞分別為小鼠ES細(xì)胞或大鼠ES細(xì)胞。在一方面，提供了 DNA構(gòu)建體。其中DNA構(gòu)建體包含(a)同源于第一條序列5’并緊緊鄰近于IgG CHl區(qū)域起始處的小鼠同源臂；(b)標(biāo)記物或藥物選擇盒；以及(c)同源于第二條序列3’并緊緊鄰近于IgGCHl區(qū)末端的小鼠同源臂或備選地，同源于第二條序列3’并緊緊鄰近于IgG鉸鏈區(qū)域末端的同源臂。在一方面，提供了用于產(chǎn)生缺少CHl結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，包括(a)對(duì)如本文所描述的非人動(dòng)物進(jìn)行免疫，所述動(dòng)物在IgG中缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域或在IgG中缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域且缺少功能性鉸鏈區(qū)，其中小鼠表達(dá)包含功能性CHl結(jié)構(gòu)域的IgM ； (b)將所述非人動(dòng)物維持在足以使非人動(dòng)物產(chǎn)生抗體的條件下；(c)鑒定由缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域或缺少功能性鉸鏈區(qū)的小鼠產(chǎn)生的抗體；以及(d)從小鼠中分離抗體、產(chǎn)生抗體的細(xì)胞或編碼抗體序列的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，非人動(dòng)物包含功能性的免疫球蛋白輕鏈基因基因座。在一個(gè)方面，提供了用于對(duì)小鼠重鏈抗體進(jìn)行人源化的方法，包括用目的抗原免疫產(chǎn)生重鏈抗體的經(jīng)遺傳修飾的小鼠，使得小鼠不斷產(chǎn)生(mount)免疫應(yīng)答，鑒定小鼠B細(xì)胞中編碼的小鼠VH區(qū)域(其中B細(xì)胞特異性結(jié)合目的抗原)以及對(duì)VH區(qū)域進(jìn)行人源化。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)生重鏈抗體的經(jīng)遺傳修飾的小鼠為如本文描述的小鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含可操作地連接于重鏈恒定基因座的至少一種mVR基因片段，該重鏈恒定區(qū)基因座包含完整的IgM基因并包含缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域并缺少鉸鏈結(jié)構(gòu)域的IgG基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG基因?yàn)镮gGl基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG基因選自IgGl、IgG2A、IgG2B、IgG3及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括將編碼人源化VH區(qū)域的核苷酸序列克隆至人免疫球蛋白恒定區(qū)的核苷酸序列上。
在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠mVR基因片段來自小鼠VH基因家族，其選自VHl和VH14，并且人源化過程包括用來自人VHl基因的骨架取代小鼠骨架VHl或VH14。在一個(gè)實(shí)施方式中，人 VHl 基因選自 1-2、1-3、1-8、1-17、1-18、1-24、1-45、1-46、1-58 和 1-69 在特定的實(shí)施方式中，所述mVR基因?yàn)?-58基因且所述人基因?yàn)?-18基因；mVR基因?yàn)?_26基因且人基因?yàn)?-2基因；mVR基因?yàn)?-50基因且人基因?yàn)?-46基因；mVR基因?yàn)?_17基因且人基因?yàn)?-2基因；mVR基因?yàn)?-42基因且人基因?yàn)?_2基因；mVR基因?yàn)?4_1基因且人基因?yàn)?-2基因；*mVR基因?yàn)?4-2基因且人基因?yàn)?_2基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，mVR基因片段來自小鼠VH基因，其選自VH4、VH5、VH6、VH7、VH10、VHl I以及VH13基因，并且人源化過程包括用來自人VH3基因的骨架取代小鼠骨架。在一個(gè)實(shí)施方式中，人 VH3 基因選自 3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-16、3-20、3-21、3-23、3-30、
3-33、3-35、3-38、3-43、3-48、3-49、3-53、3-64、3-66、3-72、3-73 和 3-74。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，mVR基因?yàn)?-1基因且人基因?yàn)?-72基因；mVR基因?yàn)?_6基因且人 基因?yàn)?_59基因；mVR基因?yàn)?-6基因且人基因?yàn)?-21基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，mVR基因片段來自小鼠VH基因家族，其選自VH3和VH12，并且人源化過程包括用來自人VH4基因的骨架取代小鼠骨架。在一個(gè)實(shí)施方式中，人VH4基因選自 4-4、4-28、4-31、4-34、4-39、4-59 和 4-61。在一個(gè)實(shí)施方式中，mVR基因片段來自小鼠VH4基因家族，并且人源化過程包括用來自人VH6基因的骨架取代小鼠VH4骨架。在一個(gè)實(shí)施方式中，人VH基因?yàn)?-1。在一個(gè)實(shí)施方式中，mVR基因片段來自小鼠VH9基因家族，并且人源化過程包括用來自人VH7家族的人VH基因的骨架取代小鼠VH9骨架。在一個(gè)實(shí)施方式中，人VH6基因選自 7-4-1 和 7-81。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化過程進(jìn)一步包括產(chǎn)生小鼠⑶R中的一個(gè)或多個(gè)保守性或非保守性置換、一個(gè)或多個(gè)刪除、和/或一個(gè)或多個(gè)插入，以使小鼠CDR能更密切地對(duì)應(yīng)于人的⑶R。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化過程進(jìn)一步包括產(chǎn)生人骨架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)保守性或非保守性置換、一個(gè)或多個(gè)刪除、和/或一個(gè)或多個(gè)插入，以使人骨架區(qū)能更密切地對(duì)應(yīng)于小鼠骨架區(qū)。在一個(gè)方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其包含功能性免疫球蛋白輕鏈基因，其中小鼠表達(dá)缺少輕鏈并缺少CHl區(qū)域或缺少CHl區(qū)域和鉸鏈區(qū)的重鏈抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含缺少編碼CHl區(qū)域的序列或缺少編碼鉸鏈和CHl區(qū)域的序列的免疫球蛋白基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，缺少序列的免疫球蛋白是一種或多種重鏈恒定區(qū)基因。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，缺少序列的免疫球蛋白基因選自IgGl、IgG2a、IgG2b及IgG3基因。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，小鼠包含具有CHl區(qū)域，和/或鉸鏈區(qū)，和/或CHl區(qū)域和鉸鏈區(qū)的IgM。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體在對(duì)抗原進(jìn)行應(yīng)答時(shí)得到表達(dá)，且抗體特異性結(jié)合所述抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包含小鼠VH結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，小鼠VH結(jié)構(gòu)域包含小鼠VH基因片段，其選自1-26、1-42、1-50、1-58、1-72、3-6、5-6、7-1、14-1和14-2。
在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包含人VH結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，人VH結(jié)構(gòu)域包含衍生于選自1-2、1-18、1-46、3-21、3-72和4-59的人VH基因的序列。在一個(gè)方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其表達(dá)主要由各自缺少CHl結(jié)構(gòu)域的兩條IgGl重鏈構(gòu)成的結(jié)合性蛋白質(zhì)，其中小鼠表達(dá)的IgM包含由CHl區(qū)域，且其中小鼠不能夠由其自身的基因組表達(dá)包含編碼IgGl的CHl結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的mRNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，各自缺少CHl結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白重鏈從N端到C端主要由人或小鼠重鏈免疫球蛋白可變區(qū)、任選的鉸鏈區(qū)、小鼠CH2區(qū)域及小鼠CH3區(qū)域構(gòu)成。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，重鏈免疫球蛋白可變區(qū)為人可變區(qū)，存在有鉸鏈區(qū)，并且小鼠包含功能性輕鏈基因基因座。在一方面，提供了小鼠，其表達(dá)完全或部分缺少輕鏈及缺少CHl區(qū)域的重鏈抗體，其中小鼠在B細(xì)胞上表達(dá)B細(xì)胞受體,其表面上的B細(xì)胞受體展示了包含直接融合至免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或直接融合至CH2區(qū)域的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合分子，其中結(jié)合分子缺少CHl區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合分子包含IgGlCH2和CH3區(qū)域。在一個(gè)方面，提供了用于產(chǎn)生重鏈抗體的方法，包括用目的抗原免疫小鼠，其中小鼠包含缺少編碼CHl區(qū)域的序列的IgG基因，其中小鼠包含完好的IgM恒定區(qū)基因，使得小鼠不斷產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答，還包括從小鼠中分離特異性識(shí)別目的抗原的細(xì)胞或蛋白質(zhì)，其中的細(xì)胞或蛋白質(zhì)包含缺少CHl結(jié)構(gòu)域并缺少同源輕鏈及特異性結(jié)合目的抗原的重鏈抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含功能性輕鏈基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含的功能性輕鏈基因，選自、、K及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含一種或多種人V、D、J基因片段對(duì)所有或幾乎所有小鼠重鏈V、D、J基因片段的取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，缺少編碼CHl的序列的IgG基因選自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3
及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，缺少CHl序列的IgG基因?yàn)镮gGl，且小鼠缺少編碼IgG2a、IgG2b、IgG3或其組合的基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，缺少CHl序列的IgG基因?yàn)镮gG2a，且小鼠缺少編碼IgGl、IgG2b、IgG3或其組合的基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，缺少CHl序列的IgG基因?yàn)镮gG2b，且小鼠缺少編碼IgGl、IgG2a、IgG3或其組合的基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，缺少CHl序列的IgG基因?yàn)镮gG3，且小鼠缺少編碼IgGl、IgG2a、IgG3或其組合的基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠包含了在其表面有B細(xì)胞受體的B細(xì)胞，其中B細(xì)胞受體包含結(jié)合目的抗原的重排重鏈VDJ，其中B細(xì)胞受體包含的IgM包含CHl區(qū)域，且其中IgM包含輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，輕鏈?zhǔn)荲J重排的。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，輕鏈為與結(jié)合目的抗原的重排重鏈VDJ同源的K或V輕鏈。在一個(gè)方面，提供了在根據(jù)本發(fā)明的小鼠中產(chǎn)生的小鼠重鏈抗體、人重鏈抗體或嵌合的人/小鼠重鏈抗體。在一個(gè)方面，提供了使用根據(jù)本發(fā)明的小鼠中產(chǎn)生的重鏈可變區(qū)核苷酸序列或其片段產(chǎn)生的小鼠重鏈抗體、人重鏈抗體、嵌合的人/小鼠重鏈抗體或人源化重鏈抗體。 其他實(shí)施方式有所描述，并在本領(lǐng)域技術(shù)人員總覽了接下來的詳細(xì)描述后對(duì)其變
得清楚。
發(fā)明詳述本發(fā)明不限于所描述的具體的方法和實(shí)驗(yàn)條件，這些方法和條件可以變化。本文所使用的術(shù)語只是用于描述特定的實(shí)施方式 的目的，不意欲為限制性的，本發(fā)明的范圍只會(huì)受到權(quán)利要求的限制。除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)的和科學(xué)的術(shù)語與使用本發(fā)明的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員一般理解的意義相同。盡管可在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用任何類似于或等價(jià)于本文所描述的那些的方法和材料，然而現(xiàn)在描述的是具體的方法和材料。本文提到的所有出版物都以其全部并入本文作為參考。CHl結(jié)構(gòu)域及杭體產(chǎn)牛提供了經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，其生產(chǎn)缺少一個(gè)CHl結(jié)構(gòu)域的抗體，包括重鏈抗體，即，缺少輕鏈的抗體。經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物包含的遺傳修飾包括缺少功能性免疫球蛋白重鏈結(jié)構(gòu)域(CHl結(jié)構(gòu)域)，例如，IgGl CHl結(jié)構(gòu)域，并且在一些實(shí)施方式中，有進(jìn)一步的修飾，其包括缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白重鏈中鉸鏈區(qū)的刪除，其中所述非人動(dòng)物表達(dá)功能性IgM。其他修飾包括使得除IgGl和IgM之外的同種型變得無功能，例如，在IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgA和IgE的基因中制造刪除或刪除這些基因。還提供了經(jīng)遺傳修飾的非人胚胎、細(xì)胞及靶向構(gòu)建體，用于產(chǎn)生所述非人動(dòng)物、非人胚胎及細(xì)胞。在產(chǎn)生能生產(chǎn)重鏈抗體(即缺少輕鏈的抗體)的經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞上的工作集中在模擬其他物種中的重鏈抗體上，例如，駱駝和特定的魚類。此方法已經(jīng)用于將小鼠ES細(xì)胞遺傳修飾為刪除IgM和IgG基因中免疫球蛋白恒定區(qū)的CHl結(jié)構(gòu)域，并向此ES細(xì)胞中引入駱駝或駱駝化的(即，VHH或VHH樣的)重鏈可變區(qū)。進(jìn)行IgM和IgG CHl結(jié)構(gòu)域的刪除可能阻止內(nèi)源、天然抗體的形成，其與形成于經(jīng)遺傳修飾的基因座的駱駝化抗體產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。進(jìn)行VHH基因片段的加入可能模擬與CHl刪除相組合時(shí)重鏈抗體的形成。來自這些動(dòng)物的重鏈抗體會(huì)包含VHH基因片段。VHH基因片段被認(rèn)為可能對(duì)重鏈抗體合適的表達(dá)是必須的，因?yàn)轶w外研究顯示非駱駝VH結(jié)構(gòu)域存在于缺少CHl結(jié)構(gòu)域的重鏈中時(shí)，不能理想地形成可表達(dá)的重鏈抗體。然而，在駱駝中(以及在一些軟骨魚類中)，存在包括CHl結(jié)構(gòu)域或CHl樣結(jié)構(gòu)域的基因。認(rèn)為包含VHH而缺少CHl結(jié)構(gòu)域的抗體產(chǎn)生自RNA剪接或能夠編碼CHl區(qū)域的DNA序列的重排。因此，甚至駱駝都保留了編碼CHl區(qū)域的DNA序列。因?yàn)?在一些情況下)人能夠產(chǎn)生完全或部分缺少CHl區(qū)域的重鏈抗體(例如，在人的重鏈疾病中)，可能可以驅(qū)使非駱駝動(dòng)物如小鼠在特定的一組條件下形成缺少CHl區(qū)域的重鏈。此方法取決于不打亂CH的種系結(jié)構(gòu)，但相反地使得此動(dòng)物的輕鏈基因座無活性。這種方法的先決條件是帶有無功能的輕鏈基因座時(shí)，那些需要同源輕鏈而表達(dá)的重鏈(例如，具有CHl區(qū)域的全長(zhǎng)重鏈)由于缺少K或入輕鏈而不產(chǎn)生，這樣只有那些能夠在沒有輕鏈時(shí)進(jìn)行表達(dá)和分泌的重鏈(S卩，缺少CHl區(qū)域的重鏈)得到表達(dá)和分泌。該方法依賴于功能性K或\基因片段的缺失(其能重排形成功能性輕鏈基因)，并取決于任何功能性重排的輕鏈基因的缺失，因此其需要進(jìn)行遺傳操作(例如，敲除)以破壞兩個(gè)種系輕鏈基因座的功能性。該方法取決于導(dǎo)致內(nèi)源CHl核苷酸序列不可用的“天然”過程，且所述CHl沉默的“天然”過程發(fā)生于類別轉(zhuǎn)換中。似乎沒有任何可能能在包含功能性輕鏈基因的動(dòng)物中使用這樣的過程。進(jìn)一步地，似乎“天然”過程包括合成大量的正常RNA，即，包括編碼CHl區(qū)域的區(qū)域的RNA。
提供了組合物和方法，用于產(chǎn)生小鼠，以生產(chǎn)缺少免疫球蛋白CHl結(jié)構(gòu)域(及任選的鉸鏈區(qū))，其包括重鏈抗體并包括含有VH結(jié)構(gòu)域的抗體(例如，小鼠或人VH結(jié)構(gòu)域)。這些方法包括選擇性地使內(nèi)源的非IgM CHl區(qū)域變得無功能(例如，通過刪除CHl結(jié)構(gòu)域的序列)以及在內(nèi)源小鼠可變區(qū)基因座采用非重排的內(nèi)源小鼠可變區(qū)(mVR)基因片段或非重排的人可變區(qū)(hVR)基因片段以在小鼠中產(chǎn)生嵌合的人/小鼠抗體。對(duì)CHl結(jié)構(gòu)域的刪除是在一種或多種IgG基因中而不是在IgM基因中進(jìn)行的。此方法選擇性地使得一個(gè)或多個(gè)IgGCHl結(jié)構(gòu)域變得無功能，而同時(shí)保留功能性IgM。除了刪除所述一個(gè)或多個(gè)IgGCHl結(jié)構(gòu)域之夕卜，提供了進(jìn)一步的實(shí)施方式，用于刪除其中的CHl結(jié)構(gòu)域已經(jīng)是刪除或變得無功能的IgG的鉸鏈區(qū)或使其無功能。IgG CHl刪除方法采用了對(duì)動(dòng)物中天然B細(xì)胞發(fā)育的相對(duì)保守性的破壞，因?yàn)椴皇墙?jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的所有Ig同種型會(huì)顯示出無功能的CHl (以及任選的鉸鏈區(qū))或CHl (以及任選的鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域的刪除。因此，CHl修飾不發(fā)生于IgM分子中，并因此不會(huì) 影響B(tài)細(xì)胞早期發(fā)育中依賴于具有功能性CHl的IgM的那些步驟。因?yàn)镮gM沒有經(jīng)過修飾，因此具有IgG的CHl結(jié)構(gòu)域(以及任選的IgG的鉸鏈區(qū))的一種或多種刪除但不具有IgM的CHl結(jié)構(gòu)域的刪除的動(dòng)物應(yīng)當(dāng)能夠在就IgG而言可變結(jié)構(gòu)域展示之前的克隆選擇步驟中加工令人滿意的大量可變區(qū)的庫。因此，在多種實(shí)施方式中，對(duì)用于重鏈抗體的可變區(qū)的多樣性上的遺傳修飾的任何有害影響不會(huì)對(duì)用于就IgG進(jìn)行選擇的可變區(qū)的庫有負(fù)面影響。進(jìn)一步地，當(dāng)種系中變得無功能(例如，刪除)的CHl序列為IgGl時(shí)，小鼠會(huì)缺少產(chǎn)生任何編碼CHl結(jié)構(gòu)域的RNA的能力。對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行遺傳修飾以使一種或多種IgG同種型的CHl結(jié)構(gòu)域或CHl結(jié)構(gòu)域及鉸鏈區(qū)變得無功能，可以產(chǎn)生小鼠，其能夠從VH結(jié)構(gòu)域的完全或幾乎完全的庫中選擇合適的VH區(qū)以在重鏈抗體中表達(dá)。對(duì)IgG同種型(而非IgM)進(jìn)行選擇性修飾避免了由于缺少CHl結(jié)構(gòu)域或IgM中缺少CHl結(jié)構(gòu)域，在選擇中存活的VH區(qū)的數(shù)量的潛在的減少。因此，有可用于在(缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域及缺少鉸鏈區(qū)的)IgG情況下進(jìn)行選擇的更VH區(qū)的完全的庫。因此，根據(jù)本發(fā)明，在經(jīng)遺傳修飾的小鼠中選擇VH結(jié)構(gòu)域不是根據(jù)例如哪種VH結(jié)構(gòu)域可以幫助克服由于IgM結(jié)構(gòu)修飾造成的早期IgM依賴的B細(xì)胞發(fā)育的障礙。相反地，早期IgM依賴的步驟應(yīng)當(dāng)如正常般發(fā)生，產(chǎn)生大的重鏈庫，可用于根據(jù)其在缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域及缺少鉸鏈區(qū)的IgG的情況下表達(dá)的合適度進(jìn)行選擇。因此，在多種實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)遺傳修飾的小鼠應(yīng)當(dāng)維持功能性IgM表達(dá)，其應(yīng)當(dāng)提供進(jìn)行更天然的克隆選擇過程的機(jī)會(huì)。例如，替代的輕鏈以及同源輕鏈二者在有功能性IgM (例如，不缺少CHl結(jié)構(gòu)域的IgM)的情況下能夠通過IgM的CHl結(jié)構(gòu)域相聯(lián)系并參與早期B細(xì)胞發(fā)育的選擇過程。在根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的小鼠中，認(rèn)為發(fā)生向IgG同種型的類別轉(zhuǎn)換是第一個(gè)選擇步驟，其中發(fā)生了對(duì)能夠在缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域及缺少鉸鏈區(qū)的恒定結(jié)構(gòu)域的情況下表達(dá)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的任何選擇。B細(xì)胞發(fā)育中的IgM盡管在駱駝、特定魚類以及病理?xiàng)l件下的觀察顯示了在一定環(huán)境下，缺少其重鏈恒定的CHl結(jié)構(gòu)域的抗體可在缺少同源輕鏈的情況下表達(dá)，然而生產(chǎn)抗體的B細(xì)胞的正常發(fā)育一般需要CHl結(jié)構(gòu)域的存在。所有重鏈同種型，包括IgM，都包含CHl結(jié)構(gòu)域。人們認(rèn)為在IgM的情況下，替代的輕鏈和同源輕鏈都通過重鏈的CHl結(jié)構(gòu)域與給定的重鏈相互作用。由于重鏈抗體的發(fā)育取決于IgM同種型重鏈的結(jié)構(gòu)完整性或功能性，因此破壞IgM的結(jié)構(gòu)完整性或功能是不可取的?？贵w的正常發(fā)育要求抗體在多重復(fù)雜的選擇方案中存活，這些選擇方案導(dǎo)致功能性的有用的抗體的存活及最終表達(dá)?？贵w結(jié)構(gòu)的破壞對(duì)抗體的存活或最終表達(dá)不利，破壞的程度達(dá)到抗體不能有效地競(jìng)爭(zhēng)和進(jìn)化以滿足一種或多種天然抗體選擇方案。在抗體發(fā)育早期，抗體重鏈經(jīng)歷了一個(gè)選擇過程，其中通過多種選擇方案天然選擇了合適的重鏈以進(jìn)行進(jìn)一步選擇而最終形成功能性及親和力成熟的抗體。始祖B細(xì)胞(或原B細(xì)胞)中表達(dá)自重組的抗體重鏈基因片段的重鏈正常地與替代輕鏈配對(duì)以在原B細(xì)胞表面上展示IgM同種型而形成稱為前B細(xì)胞受體或前BCR的結(jié)構(gòu)(其包括其他共受體)。一旦前BCR呈遞在細(xì)胞表面上，認(rèn)為前-BCR將其復(fù)合體合適的形成的信號(hào)傳遞至細(xì)胞，有效地向細(xì)胞說明重鏈已經(jīng)通過此早期選擇步驟。因此，細(xì)胞了解到重鏈可進(jìn)行進(jìn)一步的選擇。如果在IgM及替代輕鏈的情況下呈遞時(shí)重鏈包含對(duì)前BCR形成有害的缺陷，細(xì)胞將經(jīng)歷凋亡。如果細(xì)胞經(jīng)歷凋亡，則重鏈的重鏈可變區(qū)的用途及對(duì)多樣性的幫助會(huì)失去。因此， 抗體選擇的一個(gè)非常早期步驟要求在IgM同種型的情況下呈遞重鏈和替代的輕鏈。替代輕鏈被認(rèn)為至少部分地通過IgM的CHl結(jié)構(gòu)域與IgM相互作用。在此早期時(shí)機(jī)的抗體結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤或破壞(例如，無功能的CHl結(jié)構(gòu)域)可導(dǎo)致克隆選擇失敗、表達(dá)重鏈的原B細(xì)胞喪失以及喪失在可用抗體中采用特定重鏈可變結(jié)構(gòu)域的可能。一旦具有前BCR的細(xì)胞通過了此選擇步驟，下一步的選擇步驟要求重鏈與同源輕鏈(例如，小鼠和人的K或X)配對(duì)。配對(duì)的重鏈/同源輕鏈結(jié)構(gòu)在IgM同種型的情況下
通過IgM的chi結(jié)構(gòu)域再次呈遞在細(xì)胞(現(xiàn)在為初始(naive)前B細(xì)胞)表面上。細(xì)胞
表面的此復(fù)合體產(chǎn)生功能性的膜結(jié)合的B細(xì)胞受體(BCR)。認(rèn)為此BCR將通知細(xì)胞重鏈適合于進(jìn)行進(jìn)一步選擇以及細(xì)胞現(xiàn)在可以確定表達(dá)此具體的輕鏈并進(jìn)行進(jìn)一步的B細(xì)胞成熟步驟，包括親和成熟及類別轉(zhuǎn)換。如果在IgM及其同源輕鏈的情況下呈遞時(shí)，重鏈包含對(duì)BCR形成有害的缺陷，細(xì)胞將經(jīng)歷凋亡。如果細(xì)胞經(jīng)歷凋亡，則重鏈的重鏈可變區(qū)的用途及對(duì)多樣性的幫助會(huì)失去。因此，抗體選擇一個(gè)的非常早期步驟要求在IgM同種型的情況下呈遞重鏈和替代的輕鏈。再次地，在此早期的時(shí)機(jī)抗體結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤或破壞(例如，無功能的CHl結(jié)構(gòu)域)可導(dǎo)致克隆選擇失敗、同時(shí)喪失表達(dá)重鏈的前B細(xì)胞。迄今已經(jīng)在篩選中存活的前B細(xì)胞在IgM的情況下呈遞與同源輕鏈配對(duì)的重鏈，然后經(jīng)歷成熟過程，最終導(dǎo)致類別轉(zhuǎn)換以及進(jìn)一步的選擇機(jī)制，其中重鏈和同源輕鏈在IgG同種型的情況下呈遞在B細(xì)胞表面上。在此步驟中可發(fā)生對(duì)缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域及缺少鉸鏈區(qū)的IgG重鏈的任何選擇。在根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物中，認(rèn)為重鏈可變區(qū)的正常庫可用于基于可變結(jié)構(gòu)域是否存活而被表達(dá)于缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域及缺少鉸鏈區(qū)的IgG重鏈中而進(jìn)行選擇。相反地，具有受損的IgM的小鼠可能不能呈遞重鏈可變區(qū)的完全庫，因?yàn)橹挥心軌蛟谑軗pIgM的情況下在篩選中存活的可變區(qū)可用于類別轉(zhuǎn)換。因此，缺少功能性IgM的動(dòng)物在其他合適的重鏈可變基因片段發(fā)生重排之后其產(chǎn)生B細(xì)胞群體的能力可能有極大的減弱。在這樣的情況下，甚至有豐富的重鏈可變區(qū)供應(yīng)可用時(shí)(例如，動(dòng)物具有合適數(shù)量的能夠重排的重鏈可變區(qū)基因片段)，展示有可取的多樣化程度的令人滿意的B細(xì)胞群體可能不能形成，因?yàn)镮gM受到損害減少了選擇過程中重鏈的存活。
用功能性I成基因生產(chǎn)重鏈抗體可取的是要維持在IgM環(huán)境下的B細(xì)胞發(fā)育中呈遞時(shí)能夠有效地在篩選中存活的重排重鏈可變區(qū)的合適數(shù)量以產(chǎn)生足夠的多樣性而通過用目的免疫原免疫非人動(dòng)物產(chǎn)生抗體。因此，在免疫球蛋白重鏈中包含非功能性CHl結(jié)構(gòu)域或非功能性CHl結(jié)構(gòu)域及非功能性鉸鏈區(qū)的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物應(yīng)當(dāng)不在IgM兩個(gè)等位基因上都包含CHl刪除。在一些實(shí)施方式中，不可取的是刪除所有Ig同種型的CHl結(jié)構(gòu)域以在經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物中產(chǎn)生重鏈抗體。因此，提供了方法和組合物，用于通過失活、刪除或使得編碼IgG的CHl結(jié)構(gòu)域或其片段的核苷酸序列無功能(在一些實(shí)施方式中還有失活、刪除或使得所述IgG的鉸鏈區(qū)無功能)同時(shí)使得其他同種型(例如，IgM)保留功能性CHl結(jié)構(gòu)域，而在經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物中產(chǎn)生重鏈抗體。人們相信其他同種型的CHl結(jié)構(gòu)域(除了一種或多種所選的IgG CHl結(jié)構(gòu)域)的功能性引起B(yǎng)細(xì)胞發(fā)育的過程，其不會(huì)破壞或基本上不破壞重鏈可變區(qū)在非IgG同種型如IgM同種型的情況下呈遞的發(fā)育步驟。因此例如B細(xì)胞發(fā)育中IgM依賴的步驟的破壞相對(duì)得到最小化。不受本發(fā)明的限制(其由權(quán)利要求描述)，本發(fā)明者 提出與重鏈可變結(jié)構(gòu)域在IgM情況下呈遞相關(guān)的早期選擇步驟的最小破壞會(huì)產(chǎn)生更多具有重鏈可變區(qū)細(xì)胞，其存活下來進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換成為IgG同種型，并在缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域及缺少鉸鏈區(qū)的IgG的情況下進(jìn)行選擇。因此，提供了經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，以及用于所述產(chǎn)生所述動(dòng)物的方法和組合物，其中遺傳修飾致使Ig結(jié)構(gòu)域而不是IgM中功能性CHl結(jié)構(gòu)域的缺失(在進(jìn)一步的實(shí)施方式中缺失了功能性鉸鏈區(qū))。在多種實(shí)施方式中，在經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物的基因組中刪除了編碼CHl或CHl及鉸鏈區(qū)的序列(或其基本上的功能部分)。經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物可用于產(chǎn)生重鏈抗體(即，缺少輕鏈的抗體)，包括完全人抗體(經(jīng)遺傳修飾而包含人免疫球蛋白基因的小鼠中)以及嵌合的人/小鼠抗體(例如，在經(jīng)遺傳修飾而包含人可變區(qū)基因片段、D區(qū)域和J區(qū)域的小鼠中，或在具有能夠反式轉(zhuǎn)換為缺少CHl結(jié)構(gòu)域或缺少CHl結(jié)構(gòu)域及缺少鉸鏈區(qū)的經(jīng)遺傳修飾的IgG同種型的人轉(zhuǎn)基因的小鼠中)。重鏈抗體抗體可用作人治療劑。重鏈抗體即缺少輕鏈的抗體也可用作人治療劑。因?yàn)橹劓溈贵w缺少輕鏈，所以其更小并因此預(yù)期會(huì)比包含輕鏈的抗體顯示更好的組織穿透性，然而其含有類似或更有利的藥物動(dòng)力學(xué)譜，并仍然保留與常規(guī)抗體相比的類似效應(yīng)子功能。因?yàn)槠漭^小，所以重鏈抗體還能夠在給定體積中以更高的劑量進(jìn)行施用。常用的施用抗體的方法是通過皮下注射，對(duì)于給定抗體劑量，施用體積減小能夠?qū)颊咛峁┮嫣幉⒈苊饬似は伦⑸浯篌w積造成的并發(fā)癥及痛楚。重鏈抗體的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于通過將對(duì)兩個(gè)不同表位有特異性的重鏈異源二聚化于單一治療劑中產(chǎn)生雙特異性抗體。因?yàn)橹劓溈贵w缺少輕鏈，所以其尤其適合于產(chǎn)生雙特異性抗體，因?yàn)椴恍枰こ谈脑觳桓深A(yù)任何一條重鏈的結(jié)合親和力或特異性的普通輕鏈但還能夠使得雙特異性抗體得到合適的表達(dá)。本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物可用于產(chǎn)生廣泛多樣的重鏈抗體。本文所描述的遺傳修飾可在例如任何合適的小鼠種系中產(chǎn)生。小鼠種系可具有任何適合于產(chǎn)生所選的重鏈抗體的遺傳背景。下文提供了包括了特定實(shí)施方式的一些遺傳背景。所述經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物可以為小鼠，其包含根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾以及取代了內(nèi)源的小鼠重鏈可變區(qū)基因座的一種或多種非重排的人可變區(qū)基因片段、一種或多種非重排的D區(qū)基因片段以及一種或多種非重排的J區(qū)基因片段。在這樣的小鼠中，人源化的可變區(qū)基因座能夠重組以形成內(nèi)源小鼠恒定結(jié)構(gòu)域上游的重排可變區(qū)基因(其中一種或多種免疫球蛋白恒定區(qū)基因得到本文所描述的修飾)。因此小鼠能夠產(chǎn)生嵌合的人可變區(qū)/小鼠恒定區(qū)重鏈抗體。在接觸目的免疫原時(shí)，小鼠將能夠生成根據(jù)本發(fā)明的重鏈抗體，其為親和成熟的并能夠特異性結(jié)合目的免疫原的表位。所述經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物可以為小鼠，其包含的內(nèi)源小鼠可變區(qū)包含非重排的內(nèi)源小鼠可變區(qū)基因片段、非重排的內(nèi)源小鼠D區(qū)基因片段以及非重排的內(nèi)源小鼠J區(qū)基因片段，其中小鼠包含本文描述的小鼠重鏈恒定區(qū)的遺傳修飾。小鼠因此能夠產(chǎn)生小鼠重鏈抗體。在接觸目的免疫原時(shí)，小鼠將能夠生成根據(jù)本發(fā)明的重鏈抗體，其為親和成熟的并能夠特異性結(jié)合目的免疫原的表位。所述經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物可以為小鼠，其包含的人轉(zhuǎn)基因含有非重排的人可變區(qū)基因片段、非重排的人D區(qū)基因片段以及非重排的人J區(qū)基因片段，mu基因及允許進(jìn)行反式轉(zhuǎn)換的序列。小鼠會(huì)進(jìn)一步包含如本文所描述的小鼠重鏈恒定區(qū)的修飾。小鼠因此能夠產(chǎn) 生完全的人IgM抗體，并通過反式轉(zhuǎn)換產(chǎn)生嵌合的人可變區(qū)/小鼠恒定區(qū)抗體，其中恒定區(qū)包含如本文所描述的遺傳修飾。在接觸目的免疫原時(shí)，小鼠將能夠生成根據(jù)本發(fā)明的重鏈抗體，其為親和成熟的并能夠特異性結(jié)合目的免疫原的表位。體外表汰重鏈抗體本發(fā)明者已經(jīng)確認(rèn)正常的人或小鼠重鏈可變區(qū)(hVR或mVR)可在缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域的IgG的條件下在體外系統(tǒng)中表達(dá)。本發(fā)明者在具有野生型小鼠IgM的小鼠中從非重排的hVR微基因座表達(dá)hVR。將所表達(dá)的hVR克隆至缺少CHl結(jié)構(gòu)域的IgG2b上，用hVR-IgG2b A CHl瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，從而表達(dá)并分泌所產(chǎn)生的hVR_IgG2b A CHl，這有效地確認(rèn)了具有野生型IgM的小鼠中所選擇的hVR在轉(zhuǎn)換為缺少功能性CHl結(jié)構(gòu)域的IgG(即，為重鏈抗體)時(shí)可由細(xì)胞表達(dá)并分泌。本發(fā)明者構(gòu)建了體外系統(tǒng)以在CHO細(xì)胞中表達(dá)缺少CHl結(jié)構(gòu)域并具有hVR或人的駱駝化VR (hVR*)的重鏈。VR獲自RAG小鼠，其包含用人重鏈可變區(qū)微基因座(有三個(gè)人V區(qū)基因片段，6-1、1-2及1-3，所有人DH基因片段，所有人JH基因片段)對(duì)內(nèi)源小鼠重鏈基因座的取代。內(nèi)源小鼠免疫球蛋白K和X輕鏈基因座是完好的并有功能的。產(chǎn)生嵌合重鏈(hVR-mFc)及駱駝化重鏈(hVR*_mFc)構(gòu)建體用于在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，使用了獲自具有上文描述的微基因座的小鼠的VR序列。嵌合重鏈為小鼠中B細(xì)胞發(fā)育過程中正常的V-D-J重組的產(chǎn)物，以形成包含嵌合重鏈(hVR-mFc)和小鼠輕鏈的功能性抗體。所產(chǎn)生的hVR-mFc和hVR*-mFc構(gòu)建體都具有CHl結(jié)構(gòu)域并缺少CHl結(jié)構(gòu)域。hVR-mFc和hcVR-mFc構(gòu)建體在CHO細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染顯示沒有CHl結(jié)構(gòu)域時(shí)，具有hVR和hVR*的重鏈表達(dá)并保持溶于上清中。在存在有CHl結(jié)構(gòu)域時(shí)，含有hVR或hVR*的重鏈不在上清中表達(dá)。此發(fā)現(xiàn)表明這些重鏈抗體可不采用駱駝VHH結(jié)構(gòu)域而采用如人或小鼠VH結(jié)構(gòu)域，在缺少CHl結(jié)構(gòu)域的重鏈抗體中產(chǎn)生。人源化的重鏈抗體為產(chǎn)生本發(fā)明的重鏈抗體的人源化形式，用抗原免疫有純合修飾的動(dòng)物，一旦動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，則將來經(jīng)免疫的動(dòng)物脾臟的細(xì)胞與合適的永生化細(xì)胞相融合(例如，骨髓瘤細(xì)胞)以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。備選地，抗體可直接獲自經(jīng)免疫動(dòng)物的B細(xì)胞。通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)篩選來自雜交瘤細(xì)胞的上清(或例如來自分離的B細(xì)胞)確定抗體的存在并根據(jù)需要的特征選擇特異性針對(duì)所述免疫原的抗體。重鏈可變區(qū)(VH)核酸可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離自雜交瘤和/或B細(xì)胞而獲得(Sambrook,等人 1989. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, SecondEdition, Cold Spring Harbor,N.Y. ;Ausubel,et al. 1995. Short Protocols inMolecular Biology，3rded.，Wiley & Sons)。一旦確定了 VH 核酸序列，則可獲得推導(dǎo)的氨基酸序列并與其他人VH序列相比較以鑒定一組具有類似序列的相關(guān)VH 序列。相關(guān)VH序列可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的抗體數(shù)據(jù)庫獲得，例如，The InternationalImMunoGeneTics Information System (IMGT )。這種比較可通過用肉眼或備選地采用比對(duì)程序(如CLUSTAL)用電子方法比對(duì)所完成的序列而進(jìn)行比對(duì)。在此比較中，鑒定出互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)及骨架區(qū)(FR)。⑶R和FR的殘基根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)序列定義而確定(例如，Kabat等人 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutesof Health, Bethesda Md. ; Chothia and Lesk, 1987. J. Mol Biol. 196:901-917)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)清楚可能偶爾存在對(duì)免疫球蛋白重鏈序列的CDR和FR區(qū)域的編號(hào)或確定方法上的分歧。在這些情況下，優(yōu)選的是結(jié)構(gòu)限定，然而，由序列限定方法鑒定出的殘基被認(rèn)為是用于確定基于重鏈序列比較可以置換哪些骨架區(qū)殘基的重要FR殘基。一旦進(jìn)行了比對(duì)，就能鑒定出VH序列中可置換的位置。如果與其他人VH序列相t匕，分離的VH序列的某一位置的氨基酸的同一性發(fā)生變化，則評(píng)估所述位置在分離的VH序列的所述位置進(jìn)行置換的合適度。因此，分離的VH序列中與相比的其他相關(guān)人VH序列有不同的任何位置可潛在地作為能夠用其他一種或任何相關(guān)人VH序列中相應(yīng)位置的氨基酸所置換的位置。將與其他相關(guān)人VH序列有同一性的位置(即，未表現(xiàn)出變化性的位置)確定為不可置換位置。在多種實(shí)施方式中，采用上文的方法以提供保守的人重鏈抗體序列。用于本文所描述的目的的人源化的重鏈抗體為免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段，其能夠結(jié)合預(yù)先確定的抗原并包含具有與人FR氨基酸相比幾乎類似或相同的氨基酸序列的FR區(qū)域以及具有與非人的CDR氨基酸相比幾乎類似或相同的氨基酸序列的CDR。一般地，人源化的重鏈抗體具有一個(gè)或多個(gè)衍生自非人來源的氨基酸殘基。這些殘基通常衍生自重鏈可變結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步地，這些殘基可能有相關(guān)的特征例如親和力和/或特異性以及其他想要的與抗體功能相關(guān)的生物學(xué)活性。在多種實(shí)施方式中，人源化的重鏈抗體基本上包含至少一個(gè)，在其他實(shí)施方式中至少兩個(gè)這樣的VH結(jié)構(gòu)域，其中所有或幾乎所有的CDR區(qū)域?qū)?yīng)著非人VH結(jié)構(gòu)域的CDR區(qū)域且所有或幾乎所有的FR區(qū)域?yàn)槿薞H結(jié)構(gòu)域序列的FR區(qū)域。人源化的重鏈抗體會(huì)包含唯一的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，其在一個(gè)實(shí)施方式中缺少至少CHl結(jié)構(gòu)域，在一個(gè)實(shí)施方式中還缺少人Fe的鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈抗體不包含輕鏈并包含免疫球蛋白G(IgG)重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈抗體的恒定區(qū)包括IgG重鏈Fe的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，重鏈抗體的恒定區(qū)包括IgM的CHl區(qū)域。人源化的重鏈抗體可選自任何類型的IgG，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在多種實(shí)施方式中，恒定區(qū)可包含來自超過一種類型IgG的序列，選擇特定的恒定區(qū)以優(yōu)化想要的效應(yīng)子功能，這一點(diǎn)本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。
一般地，人源化重鏈抗體的重鏈FR和重鏈⑶R區(qū)域不需要精確對(duì)應(yīng)于親本序列，例如，非人的重鏈CDR或人重鏈FR可通過置換、插入或刪除至少一個(gè)殘基而改變以使重鏈⑶R或重鏈FR殘基在給定的位點(diǎn)不對(duì)應(yīng)于人重鏈FR序列或非人重鏈⑶R區(qū)域。然而這些突變不會(huì)很劇烈。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少75%的人源化的重鏈抗體殘基對(duì)應(yīng)親本重鏈FR和重鏈CDR序列中的殘基，在另一個(gè)實(shí)施方式中為90%，在另一個(gè)實(shí)施方式中超過95%。如本文所公開的人源化的重鏈抗體在一個(gè)實(shí)施方式中是通過計(jì)算機(jī)分析親本序列及多種概念化人源化合成物序列而制備的，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可得及已知的計(jì)算機(jī)程序。產(chǎn)生人源化形式及/或用于改變?nèi)缑庖咴浴⒂H和力等等的特征的序列修飾是采用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生的(例如US 5, 565, 332 Hoogenboom等人；US 5, 639, 641 Pedersen等人；US 5，766，886 Studnicka 等人；US 5，859，205 Adair 等人 US6, 054，297 Carter 等人；US 6，407, 213 Carter 等人；US 6，639，055 Carter 等人；US 6，849，425 Huse 等人；US6, 881, 557 Foote;US 7，098，006Gorman 等人；US 7, 175, 996 Watkins 等人；US 7, 235, 643Nicolaides 等人；US 7, 393, 648 Rother 等人；US 7, 462, 697 Couto 等人)。 在多種實(shí)施方式中，對(duì)親本重鏈抗體序列做出的產(chǎn)生親本重鏈抗體變體的所需置換為在一個(gè)實(shí)施方式中維持了或在另一個(gè)實(shí)施方式中增加了親本重鏈抗體的抗原結(jié)合活性的置換。一般地，親本重鏈抗體的重鏈抗體變體對(duì)具體抗原的抗原結(jié)合親和力為親本重鏈抗體的結(jié)合親和力的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%(例如，至少150%、至少200%、至少500%、至少1000%或多至至少10，000%)。在一些實(shí)施方式中，變體重鏈抗體與親本重鏈抗體相比包含單一置換。然而，在其他實(shí)施方式中，與親本重鏈抗體序列相比，數(shù)個(gè)衍生自在特定位置具有同一性的其他人重鏈抗體序列的氨基酸如多至大約5或10個(gè)或更多的氨基酸得到置換。在一個(gè)實(shí)施方式中，置換為保守性的(即，氨基酸與要取代的殘基具有類似的特性)，在另一個(gè)實(shí)施方式中為非保守性的(即，氨基酸與要取代的殘基具有不同的特性)。在多個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)試所得的變體重鏈抗體以確認(rèn)取代殘基沒有顯著降低所需的結(jié)合親和力及/或特異性。在一些實(shí)施方式中，通過用來自不同的人重鏈序列的氨基酸進(jìn)行置換產(chǎn)生了改善的變體重鏈抗體。已經(jīng)表明天然發(fā)生的重鏈抗體(如，駱駝中發(fā)現(xiàn)的)在對(duì)應(yīng)于傳統(tǒng)抗體分子(S卩，兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體)的重鏈輕鏈可變區(qū)交界處的位置上包含獨(dú)特的氨基酸殘基。已知傳統(tǒng)抗體中這些交界處的殘基影響這兩條鏈相互之間的位置和方向。盡管已知這些天然重鏈抗體包含與缺少輕鏈可變區(qū)相關(guān)的殘基的取代，然而與傳統(tǒng)抗體相比其在序列的其他位置上保留了這些殘基以保留特征性的免疫球蛋白折疊。發(fā)現(xiàn)于天然重鏈抗體中的置換為L(zhǎng)11S、V37F、G44E、L45R或L45C、W47G以及添加的半胱氨酸殘基，其有助于重鏈可變區(qū)的⑶Rl和⑶R3之間二硫鍵的形成。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的重鏈抗體可在這些位置保留親本抗體的殘基。在其他實(shí)施方式中，親本抗體在這些位置有與天然重鏈抗體中殘基相關(guān)聯(lián)的突變。在一些實(shí)施方式中，可取的是在至少這些位置之一保留親本重鏈抗體中發(fā)現(xiàn)的相同殘基或，在一個(gè)實(shí)施方式中要產(chǎn)生衍生自來自如本文描述的經(jīng)遺傳修飾的小鼠的分離的VH序列的人源化重鏈抗體時(shí)保留這些位置的全部殘基。在多種實(shí)施方式中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解的是，合理地，不預(yù)期這些交界處殘基參與由本文描述的經(jīng)遺傳修飾的小鼠產(chǎn)生的重鏈抗體中的鏈間相互作用。
產(chǎn)牛經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物用于產(chǎn)生表達(dá)重鏈抗體的動(dòng)物的遺傳修飾通過使用小鼠作為說明方便地得到描述。根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的小鼠可以多種方式產(chǎn)生，尤其是根據(jù)下文討論的實(shí)施方式產(chǎn)生。圖I中提供了 IgGl基因座的不意圖(非等比例,上圖)以顯不IgGl基因座處的CH結(jié)構(gòu)域排列。如圖示的，結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3及鉸鏈區(qū)存在于轉(zhuǎn)換區(qū)域下游，形成可容易鑒別的核苷酸范圍。缺少編碼IgGl的CHl結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列但包含鉸鏈區(qū)的經(jīng)遺傳修飾的小鼠可通過任何本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生。例如,可產(chǎn)生靶向載體,用缺少編碼CHl結(jié)構(gòu)域序列但包含鉸鏈區(qū)序列的截短的IgGl取代IgGl基因。圖2顯示了由具有5’(相對(duì)于基因組IgGl基因轉(zhuǎn)錄方向)同源臂的靶向構(gòu)建體所靶向的小鼠基因組(上圖)，所述5’同源臂包含內(nèi)源CHl結(jié)構(gòu)域上游的序列，接著為編碼IgGl鉸鏈、IgGl CH2結(jié)構(gòu)域、IgGl CH3結(jié)構(gòu)域、藥物選擇性盒(例如，Iox抗性基因)和IgGl跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列以及含有相對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域位于3’端的3’同源臂。在此基因座發(fā)生同源重組及移除藥物選擇性盒(例如通過Cre處理)時(shí)，內(nèi)源IgGl由缺少CHl結(jié)構(gòu)域的IgGl取代(圖2的下圖；lox位點(diǎn)未顯示)。圖UIgGl A CH1，中圖)顯示了所產(chǎn)生的基因座的結(jié)構(gòu)，其可表達(dá)具有融合至鉸鏈序列的J區(qū)序列的IgGl。缺少編碼IgGl的CHl結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列并缺少編碼鉸鏈區(qū)的核苷酸序列的經(jīng)遺傳修飾的小鼠可通過本領(lǐng)域已知的任何方法產(chǎn)生。例如，可產(chǎn)生靶向載體，用缺少編碼CHl結(jié)構(gòu)域的序列并缺少編碼鉸鏈區(qū)的序列的截短的IgGl取代IgGl基因。圖3顯示了具有5’(相對(duì)于基因組IgGl基因轉(zhuǎn)錄方向)同源臂的靶向構(gòu)建體所靶向的小鼠基因組(上圖)，所述5’同源臂包含內(nèi)源CHl結(jié)構(gòu)域上游的序列，接著為編碼IgGl CH2結(jié)構(gòu)域、IgGl CH3結(jié)構(gòu)域、藥物選擇性盒(例如，Iox抗性基因)和IgGl跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列以及含有相對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域位于3’端的3’同源臂。在此基因座發(fā)生同源重組及移除藥物選擇性盒(例如通過Cre處理)時(shí)，內(nèi)源IgGl由缺少CHl結(jié)構(gòu)域的IgGl取代(圖3的下圖；lox位點(diǎn)未顯示)。圖I (IgGl ACHl-Ahinge，下圖)顯示了所產(chǎn)生的基因座的結(jié)構(gòu)，其可表達(dá)具有融合至CH2結(jié)構(gòu)域的J區(qū)序列的IgGl?？赏ㄟ^刪除一種或多種其他IgG同種型如刪除或使編碼IgG2b和IgG2a的序列失活，而對(duì)缺少IgGl CHl序列(IgGl A CH1)，或缺少IgGl CHl序列并缺少鉸鏈(IgGlACHl-Ahinge)的經(jīng)遺傳修飾的小鼠進(jìn)行進(jìn)一步的修飾以增強(qiáng)經(jīng)修飾的IgGl同種型的用途。例如，產(chǎn)生具有的靶向構(gòu)建體，所述5’同源臂包含內(nèi)源鉸鏈區(qū)序列上游的序列(或內(nèi)源CHl結(jié)構(gòu)域序列上游的序列)，編碼IgGl CH2和CH3結(jié)構(gòu)域、藥物選擇性盒的序列，隨后為編碼IgGl跨膜結(jié)構(gòu)域的序列，如果需要，后面還有另一個(gè)藥物選擇性盒。在此基因座發(fā)生同源重組及移除藥物選擇性盒(例如通過Cre處理)時(shí)，內(nèi)源重鏈恒定區(qū)基因座只包含兩種IgG基因內(nèi)源1§63及1§61八011(見圖4，下圖；重組酶位點(diǎn)未顯示；見圖6，下圖)或IgGlACHl-Ahinge (見圖5，下圖；重組酶位點(diǎn)未顯示；見圖6，下圖)。具有IgGl A CHl- A hinge或IgGl A CHl A IgG2a A IgG2b等位基因的經(jīng)遺傳修飾的小鼠中表達(dá)的IgGl將具有如圖10右區(qū)所顯示的結(jié)構(gòu)，即VH結(jié)構(gòu)域會(huì)融合至CH2結(jié)構(gòu)域。作為比較，圖10的左區(qū)提供了野生型IgGl抗體，顯示其CHl結(jié)構(gòu)域通過鉸鏈區(qū)連接于CH2結(jié)構(gòu)域，并通過二硫鍵連接于輕鏈恒定結(jié)構(gòu)與CL。相反，所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠產(chǎn)生的抗體缺少鉸鏈和CHl結(jié)構(gòu)域并因此缺少CL結(jié)構(gòu)域。如上文描述的以及其他的經(jīng)遺傳修飾的小鼠是通過如下方法產(chǎn)生將合適的靶向構(gòu)建體引入合適的小鼠ES細(xì)胞(產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的靶向)，鑒別出包含靶向構(gòu)建體的標(biāo)記物或選擇性盒的陽性克隆并進(jìn)行培養(yǎng)。然后在適合產(chǎn)生嵌合小鼠或完全的ES細(xì)胞衍生小鼠的條件下采用這些克隆作為供體ES細(xì)胞進(jìn)入宿主胚胎。任選的，在ES細(xì)胞階段或者在嵌合或ES細(xì)胞衍生小鼠階段移除標(biāo)記物或選擇盒，例如通過使用Iox盒并與包含Cre的種系雜交，或通過對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行電穿孔引入Cre表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式產(chǎn)生具有IgGl A CHl-A hinge等位基因(雜合)的經(jīng)遺傳修飾的小鼠。從小鼠分離血清并在使用抗小鼠IgGl抗體的Western (還原條件)中進(jìn)行印跡以檢測(cè)重鏈。野生型小鼠顯示有對(duì)應(yīng)于野生型IgGl重鏈大小的條帶，與此相反，被修飾 為含有IgGl ACHl-Ahinge等位基因的經(jīng)遺傳修飾的小鼠還表達(dá)與抗小鼠IgGl抗體反應(yīng)的重鏈，其具有的大小為由一個(gè)VH、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的重鏈抗體大小(見圖8)。
實(shí)施例實(shí)施例I :重鏈抗體的體外表達(dá)嵌合重鏈構(gòu)建體通過分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生(例如，見Maniatis等人1982.Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory),將人可變區(qū)與小鼠IgG2b (mIgG2b)的恒定區(qū)相融合。每種構(gòu)建體的人可變基因片段都為全長(zhǎng)人可變基因片段，包含兩個(gè)外顯子(即，前導(dǎo)序列加成熟序列)，其鑒定來自分離自初始RAG小鼠的IgM的hVR，所述小鼠包含用三個(gè)hVR基因片段、所有的hDH基因片段以及所有hJH基因片段對(duì)源小鼠免疫球蛋白重鏈基因座的取代。IgM抗體的輕鏈為小鼠輕鏈。使用了 mIgG2b序列的兩種形式；一種具有另一種不具有CHl結(jié)構(gòu)域。還構(gòu)建了數(shù)種其他的構(gòu)建體以作為轉(zhuǎn)染及表達(dá)的對(duì)照。第一種對(duì)照構(gòu)建體是使用融合至小鼠IgG2a(mIgG2a)恒定區(qū)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞因子受體構(gòu)建的(I號(hào)對(duì)照)。兩種另外的對(duì)照是通過將小鼠ROR信號(hào)序列融合至具有及不具有CHl結(jié)構(gòu)域的小鼠IgG2a序列而構(gòu)建的(分別為II號(hào)和III號(hào)對(duì)照)。還使用了 PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建了每種人可變區(qū)的駱駝化形式(例如，見Hutchinson 等人 1978. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.J. Biol. Chem. 253 (18) :6551-60)。對(duì)每種可變區(qū)使用了兩個(gè)特異性引物組在人可變區(qū)序列內(nèi)產(chǎn)生特異性區(qū)域，產(chǎn)生包含駱駝樣特征的人可變區(qū)序列。引物L(fēng)I (SEQ ID N0:1)和HHl. 2 mut BOT (SEQ ID NO:2)用于擴(kuò)增包含可變區(qū)5’半?yún)^(qū)的一個(gè)產(chǎn)物而引物HHl. 2 mutTOP (SEQ ID N0:3)和ml8. 3. I (SEQ IDN0:4)用于擴(kuò)增包含可變區(qū)的3’半?yún)^(qū)。這些產(chǎn)物得到純化并相混合作為第三次PCR反應(yīng)的模板，其中使用引物L(fēng)I和ml8. 3. I。對(duì)產(chǎn)生的駱駝化人可變區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、純化并通過測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。通過用包含限制性酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增人可變區(qū)(駱駝化及非駱駝化)及恒定區(qū)，隨后可通過粘性末端而連接，產(chǎn)生全長(zhǎng)重鏈構(gòu)建體(可變區(qū)及恒定區(qū))。將全長(zhǎng)重鏈構(gòu)建體克隆入表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行純化并通過測(cè)序再次確認(rèn)。表I列出了各個(gè)重鏈構(gòu)建體,其SEQID NO及對(duì)各個(gè)構(gòu)建體的簡(jiǎn)短描述。__表 I__
二~SEQIDNO
_^___( D'-A/蛋白質(zhì))
hVR-mFc__融合至小鼠丨gG2b的非駱駝化的人可變區(qū)__5/6_
h\ R*-mFc__融合至小鼠丨gG2b的駱駝化的人可變區(qū)__7/8_
融合至缺少CHl結(jié)構(gòu)域的小鼠丨gG2b的非路駝hVR-mFcACHi ^ 9/10__化的人可變區(qū)__
融合至缺少CHl結(jié)構(gòu)域的小鼠IgG2b的路敢化 hVR*-mFc A CHl, , —11/12
__的人可變區(qū)__將嵌合重鏈構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-Kl)中，分析不存在免疫球蛋白輕鏈時(shí)的表達(dá)情況。通過Western印跡檢查上清及細(xì)胞裂解物，使用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗小鼠IgG抗體(Promega)通過化學(xué)發(fā)光以檢測(cè)重鏈的存在情況。對(duì)所有的嵌合重鏈構(gòu)建體進(jìn)行六(6)次獨(dú)立的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染產(chǎn)物代表性的Western印跡顯示于圖7。所有嵌合重鏈構(gòu)建體，具有和不具有CHl結(jié)構(gòu)域，以及對(duì)照構(gòu)建體都在細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到。只有缺少CHl結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體能在上清中觀察到(圖7，左)。I號(hào)和III號(hào)對(duì)照(缺少CHl結(jié)構(gòu)域的小鼠Fe蛋白質(zhì))也檢測(cè)到(圖7)，但是包含CHl結(jié)構(gòu)域的小鼠Fe蛋白質(zhì)沒有檢測(cè)到。包含CHl結(jié)構(gòu)域的非駱駝化及駱駝化的重鏈構(gòu)建體在任何轉(zhuǎn)染的上清中都沒有檢測(cè)到(圖7，右)。然而，缺少CHl結(jié)構(gòu)域的非駱駝化及駱駝化的人重鏈構(gòu)建體在所有轉(zhuǎn)染的上清中都檢測(cè)到。綜上，結(jié)果確認(rèn)了在沒有免疫球蛋白輕鏈時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞可表達(dá)和分泌缺少CHl結(jié)構(gòu)域的(正?；蝰橊劵?hVR，而在沒有輕鏈時(shí)，不分泌包含CHl結(jié)構(gòu)域的(正常或駱駝化的)hVR0實(shí)施例2 :小鼠重鏈IgGl恒定區(qū)的修飾A.小鼠IgGl-CHl-Hinge革巴向載體的制備(圖3)構(gòu)建了靶向構(gòu)建體，用于對(duì)來自VELOCIMMUNE 小鼠(描述于下文)的ES細(xì)胞的C57BL/6等位基因引入小鼠IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的CHl和鉸鏈區(qū)的刪除。靶向構(gòu)建體是使用VELOClGEN E 技術(shù)產(chǎn)生的(見，例如美國(guó)專利號(hào)6, 586, 251 及 Valenzuela 等人(2003) High-throughput engineering of the mousegenome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21
(6):652-659),以修飾細(xì)菌人工染色體(BAC)BMQ 70p08。修飾BMQ 70p08 BAC DNA以刪除IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的CHl及鉸鏈區(qū)同時(shí)使得剩余的IgGl基因保持完好(例如，CH2、CH3及轉(zhuǎn)膜外顯子)。簡(jiǎn)言之，分別使用引物ml02 (SEQ ID 勵(lì)13)和111104 (SEQ IDN0:14)和 mlOO (SEQID勵(lì)15)和11199 (SEQ ID NO: 16)產(chǎn)生上游和下游的同源臂。這些同源臂用于產(chǎn)生刪除了 IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的CHl及鉸鏈區(qū)而保留IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的CH2、CH3及跨膜區(qū)的盒(見，例如圖3)。靶向構(gòu)建體包括位于IgGl基因的CH3和跨膜結(jié)構(gòu)域外顯子之間的Iox潮霉素抗性基因。CHl及鉸鏈外顯子上游(例如，IgG3、IgD、IgM)的基因及IgGl轉(zhuǎn)膜外顯子下游的基因(例如，gG2b、IgG21、IgE、IgA等等)不受靶向構(gòu)建體的修飾。所有恒定結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)化區(qū)域不受靶向構(gòu)建體的修飾。穿過刪除部分的核苷酸序列如下所示，其表示存在于刪除點(diǎn)的剪接受體序列TGACAGTGTAATCACATATA CTTTTTCTTG T (AG)TCCCAGA AGTATCATC (SEQID NO: 17)。刪除序列包含剪接受體(上文括號(hào)中包含的AG)及剪接受體5’端的前-CHl序列以及剪接受體3’端的前-CH2外顯子序列。B.小鼠IgGl-CHl靶向載體的制備(圖2)用于對(duì)來自VELOCIMMUNE 小鼠(描述于下文)的ES細(xì)胞的129/SvEvTac等位基因引入小鼠IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的CHl的刪除的第二種靶向構(gòu)建體是通過與本實(shí)施例的A部分中描述類似方式構(gòu)建的。靶向構(gòu)建體是使用VE LOCI GEN E 技術(shù)產(chǎn)生的(見，例如美國(guó)專利號(hào)6, 586, 251 及 Valenzuela 等人(2003) High-throughput engineering of the mousegenome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6) :652-659)以修飾細(xì)菌人工染色體(BAC) BMQ 70p08。修飾BMQ 70p08 BAC DNA以刪除IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的CHl區(qū)域同時(shí)使得剩余的IgGl基因保持完好(例如，鉸鏈、CH2、CH3及轉(zhuǎn)膜外顯子，見圖2)。第二種靶構(gòu)建體的同源臂與CHl-Hinge靶向載體的相同(如上文實(shí)施例的A部分所描述)。這些同源臂用于產(chǎn)生刪除了 IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的CHl區(qū)域而保留IgGl恒定結(jié)構(gòu)域的鉸鏈、CH2、CH3及跨膜區(qū)的盒(見，例如圖2)。靶向構(gòu)建體包括位于IgGl基因的CH3和跨膜結(jié)構(gòu)域外顯子之間的Iox潮霉素抗性基因。CHl外顯子上游的基因(例如，IgG3、IgD、IgM)及IgGl轉(zhuǎn)膜外顯子下游的基因(例如，IgG2b、IgG21、IgE、IgA等等)不受靶向構(gòu)建體的修飾。所有恒定結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)化區(qū)域不受靶向構(gòu)建體的修飾。穿過刪除部分的核苷酸序列如下所示，其表示存在于刪除點(diǎn)的剪接受體序列TGACAGTGTAATCACATATA CTTTTTCTTG T(AG)TGCCCAG GGATTGTGGTTGTAAGCCTT GCATATGTAC AGGTAAGTCA GTAGGCCTTTCACCCTGACC C (SEQID N0:64)。刪除序列包含剪接受體(上文括號(hào)中包含的AG)及剪接受體5’端的前-CHl序列以及剪接受體3’端的鉸鏈外顯子序列。實(shí)施例3 ES細(xì)胞中小鼠重鏈恒定區(qū)的修飾A.用IgGl-CHl-Hinge靶向載體靶向小鼠ES細(xì)胞用上文描述的靶向構(gòu)建體靶向小鼠ES細(xì)胞(S卩，引入IgGl基因的CHl及鉸鏈區(qū)的刪除的靶向構(gòu)建體)。ES細(xì)胞來自VELOCIMMUNE 小鼠，其為129種系和C57BL/6種系的50/50雜交種系，具有遺傳修飾而包含用非重排的人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段對(duì)小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段的取代。用來與C57BL/6雜交的129種系為包含用非重排的人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段對(duì)小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段的取代的種系。雜合的VEIXJCIMMUNE 小鼠在一個(gè)等位基因上有來自129種系的一組內(nèi)源小鼠重鏈恒定區(qū)基因，在另一個(gè)等位基因上有來自C57BL/6種系的一組內(nèi)源小鼠重鏈恒定區(qū)基因。129重鏈等位基因鄰近重鏈可變區(qū)基因片段(為人重鏈可變區(qū)基因片段，取代了內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因片段(即，在內(nèi)源小鼠基因座))的基因座。BL/6重鏈等位基因鄰近野生型小鼠重鏈可變區(qū)基因片段。VELOCIMMUNE㊣小鼠還可具有野生型內(nèi)源小鼠輕鏈恒定區(qū)基因。因此，通過用包含IgG、D、E或A的CHl刪除的構(gòu)建體靶向129等位基因可產(chǎn)生嵌合的人/小鼠重鏈抗體，而以類似的構(gòu)建體靶向C57BL/6等位基因，可產(chǎn)生缺少CHl結(jié)構(gòu)域并缺少鉸鏈區(qū)的完全的小鼠重鏈抗體。
用實(shí)施例2的A部分的線性化靶向載體電穿孔來自上文描述的VEIOCIMMUNE 小鼠的ES細(xì)胞并根據(jù)潮霉素抗性基因的存在情況進(jìn)行選擇。B.用IgGl-CHl靶向載體靶向小鼠ES細(xì)胞以相似的方式，用描述于實(shí)施例2的B部分的CHl靶向構(gòu)建體靶向小鼠ES細(xì)胞(又見圖2)。ES細(xì)胞來自VELOCIMMUNE 小鼠，其為129/SvEvTac種系和C57BL/6種系的50/50雜交種系，具有遺傳修飾而包含非重排的人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段對(duì)小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段的取代。用來與C57BL/6雜交的129/SvEvTac種系為包含用人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段對(duì)小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段的取代的種系。雜合的VELOCIMMUNE 小鼠在一個(gè)等位基因上有來自129/SvEvTac種系的一組內(nèi)源小鼠重鏈恒定區(qū)基因，在另一個(gè)等位基因上有來自C57BL/6種系的一組內(nèi)源小鼠重鏈恒定區(qū)基因。129/SvEvTac重鏈等位基因鄰近重鏈可變區(qū)基因片段(為人的重鏈可變區(qū)基因片段，取代了內(nèi)源小鼠重鏈可變區(qū)基因片段(即，在內(nèi)源小鼠基因座))的基因座。·BL/6重鏈等位基因鄰近野生型小鼠重鏈可變區(qū)基因片段。VELOCIMMUNE 小鼠還可具有野生型內(nèi)源小鼠輕鏈恒定區(qū)基因。因此，通過用包含IgG、D、E或A CHl刪除的構(gòu)建體靶向129/SvEvTac等位基因可產(chǎn)生嵌合的人/小鼠重鏈抗體，而用類似的構(gòu)建體靶向C57BL/6等位基因，可產(chǎn)生缺少CHl結(jié)構(gòu)域并缺少鉸鏈區(qū)的完全的小鼠重鏈抗體。用實(shí)施例2的B部分的線性化靶向載體電穿孔來自上文描述的VELOCIMMUNE 小鼠的ES細(xì)胞并根據(jù)潮霉素抗性基因的存在情況進(jìn)行選擇。實(shí)施例4 :攜帶經(jīng)修飾的IgGl恒定區(qū)的小鼠的產(chǎn)生A.攜帶 IgGl-CHl-Hinge 刪除的小鼠將上文描述的所靶向的ES用作供體ES細(xì)胞并通過VEEOCIMOUSE 方法引入8-細(xì)胞期小鼠胚胎中(見例如美國(guó)專利號(hào)7，294，754及Poueymirou等人(2007) FOgeneration mice that are essentially fully derived from the donor gene-targetedES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25 (I):91-99.)。通過使用可檢測(cè)出位于刪除的鉸鏈及CHl區(qū)上游及下游的序列的修飾的等位基因測(cè)定法(Valenzuela等人，見上文)進(jìn)行基因分型鑒定出具有所靶向的C57BL/6 IgGl等位基因的VELOCIMICE (完全衍生自供體ES細(xì)胞的FO小鼠)。進(jìn)行了 IgGl CHl和鉸鏈區(qū)刪除(在C57BL/6等位基因，即小鼠等位基因上)的基因分型的小鼠與Cre刪除子的小鼠種系雜交(見例如，國(guó)際專利申請(qǐng)
發(fā)明者A·J·莫菲, L·麥克唐納, S·史蒂文斯 申請(qǐng)人:瑞澤恩制藥公司