專(zhuān)利名稱(chēng)：生成哺乳動(dòng)物樣復(fù)合n-聚糖的酵母菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在真菌細(xì)胞中生成糖蛋白的方法和材料，且更具體而言，涉及生成含有哺乳動(dòng)物樣復(fù)合N-聚糖的蛋白質(zhì)或含有哺乳動(dòng)物糖基化途徑內(nèi)的中間體的蛋白質(zhì)的遺傳工程真菌細(xì)胞。
發(fā)明背景 需要高效表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)目前開(kāi)發(fā)下的大多數(shù)生物藥物(例如，重組蛋白)。許多這些生物藥物的生物學(xué)活性依賴(lài)于其翻譯后修飾(例如，磷酸化或糖基化)?；诮湍傅谋磉_(dá)系統(tǒng)組合易于遺傳操作與具有分泌并修飾蛋白質(zhì)的能力的微生物生物體的發(fā)酵。然而，酵母細(xì)胞中生成的重組糖蛋白主要展現(xiàn)出異源高甘露糖和高甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)，其對(duì)于蛋白質(zhì)功能、下游加工、及隨后的治療性用途，特別地在糖基化發(fā)揮生物學(xué)重要作用的情況中可以是不利的。發(fā)明概述可以使用本文中所描述的方法和遺傳工程真菌細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)靶分子(例如，靶蛋白)，其含有哺乳動(dòng)物樣N-聚糖或含有哺乳動(dòng)物(例如人)糖基化途徑內(nèi)的中間體。自此類(lèi)工程化改造細(xì)胞分離的靶分子可以用于生物藥物應(yīng)用，包括抗體生產(chǎn)、細(xì)胞因子生產(chǎn)，及用于治療代謝病癥諸如溶酶體貯積病。在一方面,本文件的特征在于一種生成能夠生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)或陸地酵母(Arxulaadeninivorans))的方法。該方法包括提供遺傳工程化改造為生成包含Man5GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞；并將編碼GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中,其中所述核酸包含編碼將編碼的GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I靶向至胞內(nèi)區(qū)室(例如，高爾基體)的靶向序列的核苷酸序列，其中GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。該方法可以進(jìn)一步包括將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成修飾為包含GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。革巴蛋白可以結(jié)合Fe受體。革巴蛋白可以是抗體或其片段。靶蛋白可以是治療性糖蛋白。靶蛋白可以是干擾素-iKGM-CSF、干擾素Y、或促紅細(xì)胞生成素。遺傳工程化改造為生成含有Man5GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞可以是OCHl活性缺陷的，并且包括編碼α-1，2_甘露糖苷酶的核酸，其中編碼α-1，2_甘露糖苷酶的核酸包括編碼將編碼的α-1，2_甘露糖苷酶靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的靶向序列的核苷酸序列。靶向序列可以是HDEL序列。所述方法可以進(jìn)一步包括將編碼甘露糖苷酶II的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中編碼甘露糖苷酶II的核酸包括編碼將編碼的甘露糖苷酶II靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中甘露糖苷酶II在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。所述方法可以進(jìn)一步包括將編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸包含編碼將編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2或GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可以是UDP-Gl c-4-差向異構(gòu)酶和β_1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的催化域的融合物。此方法可以進(jìn)一步包括將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成修飾為含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2或GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。該方法可以包括分離修飾為含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2 或 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。在另一方面，本文件的特征在于一種生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白的方法。該方法包括提供遺傳工程化改造為包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、α-1，2_甘露糖苷酶、和甘露糖苷酶II的核酸的真菌細(xì)胞(例如，解脂耶氏酵母或陸地酵母)，其中所述核 酸編碼靶向序列的核苷酸序列，或編碼多種靶向序列的多種核苷酸序列，所述靶向序列將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室，其中所述真菌細(xì)胞是OCHl活性缺陷的；并將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。編碼α -1，2-甘露糖苷酶的核酸可以包含將編碼的α -1，2-甘露糖苷酶靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列。例如，靶向序列可以是HDEL序列。編碼GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I和甘露糖苷酶II的核酸可以包含聞爾基祀向序列、或多種聞爾基祀向序列，其將編碼的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I和甘露糖苷酶II靶向至高爾基體。靶蛋白可以結(jié)合Fe受體。靶蛋白可以是抗體或其片段。靶蛋白可以是治療性糖蛋白。靶蛋白可以是干擾素-iKGM-CSF、干擾素Y、或促紅細(xì)胞生成素。在一些實(shí)施方案中，所述方法可以進(jìn)一步包括將編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸包含編碼將編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成修飾為含有GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白?？梢宰哉婢?xì)胞分離修飾為含有GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。本文件的特征還在于一種生成能夠生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞(例如，解脂耶氏酵母或陸地酵母)的方法。該方法包括提供遺傳工程化改造為生成含有Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞；并將編碼GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中所述核酸包含編碼將編碼的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I靶向至胞內(nèi)區(qū)室(例如，高爾基體)的靶向序列的核苷酸，其中GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。該方法可以進(jìn)一步包括將編碼革巴蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成修飾為含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。革巴蛋白可以結(jié)合Fe受體。靶蛋白可以是抗體或其片段。靶蛋白可以是治療性糖蛋白。靶蛋白可以是干擾素-0、GM-CSF、干擾素Y、或促紅細(xì)胞生成素。遺傳工程化改造為生成含有Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞可以是ALG3活性缺陷的，并且包含編碼α -1,2-甘露糖苷酶的核酸，其中所述核酸包含編碼將編碼的α-1，2_甘露糖苷酶靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的靶向序列的核苷酸序列。此類(lèi)真菌細(xì)胞可以進(jìn)一步是OCHl活性缺陷的和/或進(jìn)一步包括編碼α -1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，ALG6)的核酸。所述方法可以進(jìn)一步包括將編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中編碼GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸包含編碼將編碼的GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GlcNAc2Man3GIcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。所述方法可以進(jìn)一步包括將編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸包含編碼將編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GalGlcNAcMan3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可以是UDP-Glc-4-差向異構(gòu)酶和￠-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的催化域的融合物。所述方法可以進(jìn)一步包括將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成修飾為含有GalGlcNAcMan3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白。
所述方法可以進(jìn)一步包括將編碼葡萄糖苷酶II的a和0亞基的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中葡萄糖苷酶II的a和P亞基在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GalGlcNAcMan3GlcNAc2 或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。本文件的特征還在于一種生成含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的革巴蛋白的方法。該方法包括提供遺傳工程化改造為ALG3活性缺陷并包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸的真菌細(xì)胞，其中編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸包含編碼靶向序列的核苷酸序列，或編碼多種靶向序列的多種核苷酸序列，所述靶向序列將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室(例如，高爾基體)；并將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的靶蛋白。真菌細(xì)胞可以進(jìn)一步是OCHl活性缺陷的和/或進(jìn)一步包含編碼a-I，3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶諸如ALG6的核酸。真菌細(xì)胞可以進(jìn)一步包含編碼葡萄糖苷酶II的a和P亞基的核酸，其中葡萄糖苷酶II的a和0亞基在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。在另一方面，本文件的特征在于遺傳工程化改造為生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的分離的真菌細(xì)胞。真菌細(xì)胞可以是OCHl活性缺陷的，并且包含編碼a-1,2-甘露糖苷酶、GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、和甘露糖苷酶II的核酸，其中編碼a _1，2_甘露糖苷酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、和甘露糖苷酶II的核酸包含編碼祀向序列的核苷酸序列，或編碼多種靶向序列的多種核苷酸序列，所述靶向序列將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室，其中a -1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、和甘露糖苷酶II在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。真菌細(xì)胞可以進(jìn)一步包含編碼革巴蛋白的核酸,其中所述細(xì)胞生成修飾為含有GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。在一些實(shí)施方案中，此類(lèi)真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸，其中編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸包含編碼將編碼的GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，此類(lèi)真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，其中編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸包含編碼將編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。在又一方面，本文件的特征在遺傳工程化改造為生成含有GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的分離的真菌細(xì)胞。將真菌細(xì)胞遺傳工程化改造為ALG3活性缺陷的，并且包含編碼GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I和GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸，其中編碼GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I和GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸包含編碼靶向序列的核苷酸序列，或編碼多種靶向序列的多種核苷酸序列，所述靶向序列將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室，其中GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I和GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。遺傳工程真菌細(xì)胞進(jìn)一步可以是OCHl活性缺陷的和/或進(jìn)一步包含編碼a -1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。遺傳工程真菌細(xì)胞還可以包含編碼靶蛋白的核酸，其中所述細(xì)胞生成修飾為含有GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。真菌細(xì)胞進(jìn)一步可以包含編碼葡萄糖苷酶II的a和P亞基的核酸，其中葡萄糖苷酶II的a和P亞基在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。真菌細(xì)胞進(jìn)一步可以包含編碼半乳糖 基轉(zhuǎn)移酶的核酸，其中編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸包含編碼將編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。本文件的特征在于解脂耶氏酵母細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物，大量的所述解脂耶氏酵母細(xì)胞被遺傳工程化改造為生成含有Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白。將細(xì)胞工程化改造為ALG3活性缺陷的，并且包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，其中編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸包含編碼靶向序列的核苷酸序列，或編碼多種靶向序列的多種核苷酸序列，所述靶向序列將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室，其中GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞中的表達(dá)生成含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。遺傳工程真菌細(xì)胞進(jìn)一步可以是OCHl活性缺陷的和/或進(jìn)一步包含編碼a -1，3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，ALG6)的核酸。細(xì)胞進(jìn)一步可以包含編碼葡萄糖苷酶II的a和P亞基的核酸，其中葡萄糖苷酶II的a和0亞基在細(xì)胞中的表達(dá)生成含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的靶蛋白。在另一方面，本文件的特征在于解脂耶氏酵母細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物，大量所述解脂耶氏酵母細(xì)胞被工程化改造為生成含有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白，其中將細(xì)胞工程化改造為OCHl活性缺陷的，并且包含a-l，2_甘露糖苷酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、甘露糖苷酶II、GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，其中編碼a-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、甘露糖苷酶II、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸包括編碼靶向序列的核苷酸序列，或編碼多種靶向序列的多種核苷酸序列，所述靶向序列將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室，其中a -1，2_甘露糖苷酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、甘露糖苷酶II、GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞中的核苷酸序列生成包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的蛋白質(zhì)。本文件的特征還在于包含糖蛋白的組合物，其中糖蛋白上的至少50% (例如，至少70%或至少85%的N-聚糖是GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。雖然與本文中所描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中使用，但是下文描述了例示性的方法和材料。通過(guò)提及而完整收錄本文中提及的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利、Genbank 登錄號(hào)、和其它參考文獻(xiàn)。在矛盾的情況中，應(yīng)當(dāng)以本申，包括定義為準(zhǔn)。所述材料、方法和例子僅是例示性的，而并不意圖為限制性的。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從以下發(fā)明詳述及權(quán)利要求書(shū)看會(huì)是顯而易見(jiàn)的。附圖簡(jiǎn)述圖IA 是 Man5GLcNAc2 和 Man3GlcNAc2 結(jié)構(gòu)的示意圖。圖IB是質(zhì)粒pYlOCHl PUT TOPO的示意圖。圖2是一系列電泳圖(electroferogram),其描繪了對(duì)自pold Inuga解脂耶氏酵 母野生型細(xì)胞或Aochl pold Inuga解脂耶氏酵母細(xì)胞獲得的分泌性蛋白質(zhì)的N-聚糖分析。在OCHl滅活后的主要N-聚糖變?yōu)镸an8GlcNAc2。使用DNA測(cè)序儀輔助的、熒光團(tuán)輔助的碳水化合物電泳(DSA-FACE)來(lái)實(shí)施分析?！癕5，” “M6，” “M8，”和“M9，”指與基礎(chǔ)N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)綴合的甘露糖殘基的數(shù)目。Y軸代表作為每個(gè)N-聚糖結(jié)構(gòu)的量的指標(biāo)的相對(duì)熒光單位。X軸代表每個(gè)N-聚糖結(jié)構(gòu)通過(guò)毛細(xì)管的相對(duì)遷移率。頂部電泳圖是作為遷移率標(biāo)準(zhǔn)品使用的右旋糖苷的分析。圖 3 是質(zhì)粒 pYLHUXdL2preManHDEL 和 pYLTUXdL2preManHDEL 的示意圖。圖4是一系列電泳圖，其描繪了在將ManHDEL(=加有HDEL標(biāo)簽的a_l，2_甘露糖苷酶)表達(dá)盒(在TEFl或Hp4d啟動(dòng)子控制下)導(dǎo)入菌株G014中后的N-聚糖概況?！癛d”代表經(jīng)由圖3中顯示的載體上存在的zeta序列的“隨機(jī)整合”。甘露糖苷酶表達(dá)后的主要N-聚糖是Man5GlcNAc2。自這些菌株之一(G018，見(jiàn)表2)消除URA3標(biāo)志物不改變N-聚糖概況。圖 5 是質(zhì)粒 JME926 pPTLeu2-ADE2ex_Hp4dManHDEL (Yl)和 0XYP289pPTAxpl_LEU2ex-Hp4dManHDEL(Yl)的構(gòu)建策略的示意圖。見(jiàn)關(guān)于載體pYLTmAXrGnTII構(gòu)建的圖23。圖6是一系列電泳圖，其描繪了在通過(guò)LEU2或AXPl基因座中的靶向性整合(Tg)將ManHDEL(=加有HDEL標(biāo)簽的a -1,2-甘露糖苷酶)表達(dá)盒(在Hp4d啟動(dòng)子控制下)導(dǎo)入菌株G014中后的N-聚糖概況。Man5GlcNAc2變?yōu)橹饕狽-聚糖。圖7是在Kre2p的100個(gè)N端氨基酸與人GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的催化域間的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)和經(jīng)耶氏酵母密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(SEQ ID NO 4)的描繪。粗體融合蛋白的Kre2p部分；普通字體融合蛋白的GnT I部分；下劃線起始和終止密碼子。圖8是用于質(zhì)粒PYLTmAXhGnTI和pYLHp4mAXhGnTI的構(gòu)建策略的示意圖。圖9是一系列電泳圖，其描繪了在通過(guò)用表達(dá)GnT I的載體轉(zhuǎn)化將GnT I活性導(dǎo)入菌株G036中后的N-聚糖概況?！癛d”代表經(jīng)由圖8中顯示的載體上存在的zeta序列的“隨機(jī)整合”。表達(dá)GnT I活性后的主要N-聚糖是GlcNAcMan5GlCNAC2。用a-1，2-甘露糖苷酶的體外處理不顯著改變?cè)摳艣r，指示僅存在少量與Man5GlcNAc2不同的高甘露糖N-聚糖。體外己糖胺酶處理導(dǎo)致從GlcNAcMan5GlcNAc2向Man5GlcNAc2的轉(zhuǎn)變。

圖10是在Mnn2p的36個(gè)N端氨基酸與黑腹果蠅甘露糖苷酶II的催化域間的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID N07)和經(jīng)耶氏酵母密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(SEQ ID NO8)的描繪。粗體融合蛋白的Mnn2p部分；普通字體融合蛋白的Man II部分；加下劃線起始和終止密碼子。圖11 是質(zhì)粒 pYLTmAXDmManll 和 pYLTmAXDmManll (LEU2ex)的構(gòu)建策略的示意圖。圖12是一系列電泳圖，其描繪了在通過(guò)用Man II表達(dá)載體轉(zhuǎn)化將Man II活性導(dǎo)入菌株G040中后的N-聚糖概況?！癛d”代表經(jīng)由圖11中顯示的載體上存在的zeta序列的“隨機(jī)整合”。在表達(dá)Man II活性后，出現(xiàn)具有較高電泳遷移率的新峰，以及在與Man5GlcNAc2幾乎相同位置運(yùn)行的“肩部”峰。體外己糖胺酶處理導(dǎo)致這些峰向上轉(zhuǎn)變(緊靠觀察到的從GlcNAcMan5GlcNAc2向Man5GlcNAc2的轉(zhuǎn)變),指不末端GlcNAc的存在，并且如此鑒定該峰為GlcNAcMan3GlcNAc2和GlcNAcMan4GlcNAc2。用a -1，2-甘露糖苷酶的體外處理沒(méi)有顯著改變概況，指示僅存在少量與Man5GlcNAc2不同的高甘露糖N-聚糖。圖13是在Mnn2p的46個(gè)N端氨基酸、粟酒裂殖酵母UDP_Glc_4-差向異構(gòu)酶樣蛋白與人3-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的催化域間的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID N09) 和經(jīng)耶氏酵母密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(SEQ ID NO :10)。融合蛋白的Mnn2p部分是SEQID NO 9的1-46，接頭序列是47-49和405-408，融合蛋白的差向異構(gòu)酶序列是50-404，而融合蛋白的Man II部分是409-763。Mnn2p部分是SEQ ID NO : 10的核苷酸1-138，接頭序列是核苷酸139-147和1213-1224，差向異構(gòu)酶序列是核苷酸148-1212，而Man II部分是1225-2289。起始和終止密碼子是加下劃線的。圖 14 是質(zhì)粒 pYLTmAXSpGalIOhGalTI 和 pYLTmAXSpGaIIOhGalTI (ADE2ex)的構(gòu)建策略的示意性描繪。圖15是一系列電泳圖，其描繪了在將GallO-GalTI活性導(dǎo)入菌株G040中后的N-聚糖概況。將所得的轉(zhuǎn)化體G044在2種不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)?！癛d”代表經(jīng)由圖14中顯示的載體上存在的zeta序列的“隨機(jī)整合”。在表達(dá)GallO-GalTI活性后，出現(xiàn)新峰，其在Man7GlcNAc2和Man8GlcNAc2間的某個(gè)位置處運(yùn)行。體外半乳糖苷酶處理導(dǎo)致此峰向上轉(zhuǎn)變和GlcNAcMan5GlcNAc2的相等增加(通過(guò)半乳糖苷酶和己糖胺酶的雙重處理，后一種確認(rèn)為代表此N-聚糖)。這指示末端半乳糖的存在，并且如此鑒定G044概況的新峰為GalGlcNAcMan5GlcNAc2。用a-1，2_甘露糖苷酶的體外處理指示大量尚未修剪為Man5GlcNAc2的高甘露糖N-聚糖(特別是Man8GlcNAc2)的存在。圖16是質(zhì)粒pYLalg3PUT_ALG6的示意性描繪。圖17是一系列電泳圖，其描繪了在將pYLalg3PUT_ALG6導(dǎo)入菌株G036中后的N-聚糖概況。ALG6的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致大量葡萄糖基化的峰(GlcMarv GlcNAc2和Glc2Man5, GlcNAc2)，指示葡萄糖苷酶II將轉(zhuǎn)移至新生蛋白質(zhì)的Glc3Man5, GlcNAc2結(jié)構(gòu)不完全修剪為Man5, G1cNAc2。根據(jù)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，通過(guò)ER定位的加有HDEL標(biāo)簽的里氏木霉a-1，2-甘露糖苷酶的作用將生成的Man5, GlcNAc2部分(仍然是一些Man5, GlcNAc2和Man4, GlcNAc2)或幾乎完全修剪成 Man3GlcNAc2。因此，將 Man5, GlcNAc2 和 Man4, GlcNAc2 峰根據(jù)其對(duì)a-1，2-甘露糖苷酶的敏感性來(lái)鑒定。由于加帽葡萄糖，GlcMan5. GlcNAc2和Glc2Marv GlcNAc2對(duì)此處理不敏感。刀豆甘露糖苷酶部分能夠除去游離的a-l，6_連接的甘露糖，而且它還將Man3_5, GlcNAc2轉(zhuǎn)化成Man1GlcNAc^圖18是質(zhì)粒pYLTmAXhGnTI (Hygr ex)的構(gòu)建策略的示意性描繪。圖19是一系列電泳圖，其描繪了在通過(guò)用GnT I表達(dá)載體轉(zhuǎn)化將GnT I活性導(dǎo)入Aalg3-Hp4dALG6菌株的非消除(G039)或消除(G045)型式中后的N-聚糖概況。經(jīng)由己糖胺酶消化證明GlcNAcMan3GlcNAc2的生成。新峰完全向后轉(zhuǎn)變成Man3GlcNAc215在菌株G048中，向GlcNAcMan3GlcNAc2的轉(zhuǎn)化不是完全的，因?yàn)槿钥梢杂^察到一些Man3GlcNAc2t5此菌株還具有一些殘留的Man5, GlcNAc2,如通過(guò)a -1，2_甘露糖苷酶消化顯示的。圖20是質(zhì)粒JME925 pPTAde2-URA3ex_Hp4dhGnTI的構(gòu)建策略的示意性描繪。圖21是一系列電泳圖，其描繪了在將GnT I活性導(dǎo)入A alg3_Hp4dALG6菌株(=G045)的消除型式中；將肋4(1驅(qū)動(dòng)的表達(dá)構(gòu)建體整合入ADE2基因座(Tg-ade2)中后的N-聚糖概況。在此培養(yǎng)中，葡萄糖基化的N-聚糖的量較高，并且Marv _5，GlcNAc2至Man3GlcNAc2的轉(zhuǎn)化是不完全的。在轉(zhuǎn)化體G057中觀察到緊靠Man4, GlcNAc2運(yùn)行的新峰，并且可以基于己糖胺酶消化的結(jié)果稱(chēng)為GlcNAcMan3GlcNAc2 :新峰完全向后轉(zhuǎn)變成Man3GlcNAc2。圖22是在Mnn2p的36個(gè)N端氨基酸和大鼠GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的催化域間的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 17)和經(jīng)耶氏酵母密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(SEQ ID NO: 18)。粗體融合蛋白的Mnn2p部分；普通字體融合蛋白的Man II部分；加下劃線起始和終止密碼子。圖23是質(zhì)粒pYLTmAXrGnTII和pYLTmAXrGnTII (ADE2ex)的構(gòu)建策略的示意性描述。圖24是一系列電泳圖，其描繪了在將GnT II活性導(dǎo)入合成GlcNAcMan3GlcNAc2的菌株后的N-聚糖概況。經(jīng)由用GnTI和GnT II表達(dá)構(gòu)建體雙重轉(zhuǎn)化G045或經(jīng)由用GnTII表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化G047來(lái)獲得所得的菌株。在這兩種情況中，代表GlcNAcMan3GlcNAc2的峰幾乎完全消失，并且出現(xiàn)大大約I個(gè)葡萄糖單元的新峰。己糖胺酶處理指示新的N-聚糖上的兩個(gè)末端GlcNAc殘基的存在；峰向左轉(zhuǎn)變約兩個(gè)葡萄糖單元，并且如此代表GlCNAC2Man3GlcNAc2。a -1,2-甘露糖苷酶處理沒(méi)有導(dǎo)致主要差異，指示僅有存在的有限量的 Man4, _5, G1cNAc2。圖25是用于表達(dá)葡萄糖苷酶II活性的質(zhì)粒pYLTUXdL2preAnGlcII和pYLeu2ExTEFpreLip2AnGlucII ^ 的不意圖。圖 26 是質(zhì)粒 JME923 pPTura3-LEU2ex_TefL2preAnGlcIIa+b [altl]的構(gòu)建策略的示意圖。圖 27 是質(zhì)粒 JME923 pPTura3-LEU2ex_Hp4dL2preAnGlcIIa+b[altl]和 Zeta-LEU2ex_Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt]的構(gòu)建策略的不意圖。圖28是一系列電泳圖，其描繪了將葡萄糖苷酶II活性導(dǎo)入合成GlcNAcMan3GlcNAc2的菌株中后的N-聚糖概況。經(jīng)由用于gls2a和gls20亞基的雙重表達(dá)構(gòu)建體的隨機(jī)(G060)或靶向性(G061)整合獲得所得的菌株。在這兩種情況中，觀察到葡萄糖基化峰的降低。a-1，2-甘露糖苷酶處理指示不是所有生成的Man5，GlcNAc2被異源的加有HDEL標(biāo)簽的0-1，2-甘露糖苷酶轉(zhuǎn)化成1&111右1(3嫩(32。由于加帽葡萄糖，GlcMan5,GlcNAc2和GIC2Man5,GIcNAc2對(duì)此處理不敏感。刀豆甘露糖苷酶部分能夠除去剩余的葡萄糖基化N-聚糖和GlcNAcMan3GlcNAc2兩者上的游離的a -1，6-連接的甘露糖。此外，此處理將Man3_5, GlcNAc2轉(zhuǎn)化成Man1GlcNAc215 “Rd”代表經(jīng)由圖27中顯示的載體上存在的zeta序列的“隨機(jī)整合”。“Tg-ade2”和“Tg-ura3”分別代表ADE2和URA3基因座上的靶向性整合。圖29是一系列電泳圖，其描繪了經(jīng)由將GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II導(dǎo)入菌株G061中生成的菌株G070和G071的分泌物組的N-聚糖概況。用a -1，2-甘露糖苷酶(除去所有末端a-I，2-連接的甘露糖殘基)或己糖胺酶(其除去末端￠-1, 2-連接的GIcNAc殘基)處理N-聚糖以容許鑒定G070和G071天然概況中的峰。含有葡萄糖的N-聚糖不對(duì)兩種酶之任一種敏感。a -1,2-甘露糖苷酶處理導(dǎo)致Man5’ GlcNAc2和Man4GlcNAc2向Man3GlcNAc2的修剪。己糖胺酶處理除去P-I，2-連接的末端GlcNAc殘基,其已經(jīng)通過(guò)GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I和II添加以生成Man3GlcNAc2。圖30A是合成的pr印roLip2-輕鏈(LC)的核苷酸序列(SEQ ID NO 32)。圖30B是合成的pr印roLip2-LC的氨基酸序列(SEQ ID NO 33)。圖3IA是合成的pr印roLip2-重鏈(HC)的核苷酸序列(SEQ ID NO 34)?！D3IB是合成的pr印roLip2-HC的氨基酸序列(SEQ ID NO 35)。圖32是一系列電泳圖，其描繪了對(duì)用pYLHp4L2pr印roHerHC/LC (⑶T2ex)-ori2轉(zhuǎn)化的經(jīng)糖工程化改造的菌株G045，G057, G061和G071的SuperT/甘油搖瓶培養(yǎng)的N-聚糖概況分析。關(guān)于菌株G045，G057, G061和G071的描述，見(jiàn)表2。圖33是G096補(bǔ)料-分批發(fā)酵中在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)來(lái)自功能性ELISA的結(jié)果的圖。圖34A和B是一系列電泳圖，其描繪了 G096補(bǔ)料-分批發(fā)酵內(nèi)在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)對(duì)分泌物組的N-聚糖概況分析。發(fā)明詳述如本文中所描述的，酵母分泌性糖蛋白上的哺乳動(dòng)物樣復(fù)合N-聚糖的體內(nèi)合成可以基于Man5GlcNAc2或Man3GlcNAc2基本結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1A，“Man”指甘露糖，而“GlcNAc”指N-葡糖胺)。為了生成Man5GlcNAc2基本結(jié)構(gòu)，將酵母細(xì)胞工程化改造，使得a-I，2_甘露糖苷酶活性在胞內(nèi)區(qū)室中升高，并且外部鏈延伸(Outer CHain elongation, OCHI)活性降低。為了生成Man3GlcNAc2基本結(jié)構(gòu)，天冬酰胺連接的糖蛋白3 (ALG3)和在一些實(shí)施方案中，OCHl的活性降低，a-1，2-甘露糖苷酶的活性和在一些實(shí)施方案中，a-l，3_葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性升高。可以通過(guò)將酵母細(xì)胞進(jìn)一步工程化改造為含有下列一項(xiàng)或多項(xiàng)活性來(lái)改變此類(lèi)酵母細(xì)胞中生成的蛋白質(zhì)的N-聚糖概況(profile) :GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I (GnT I)活性、甘露糖苷酶II活性、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II (GnT II)活性、葡萄糖苷酶II活性、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Gal T)活性。例如，在生成Man5GlcNAc2或Man3GlcNAc2 N-聚糖的酵母細(xì)胞中表達(dá)GnT I導(dǎo)致將GlcNAc模塊轉(zhuǎn)移至Man5GlcNAc2或Man3GlcNAc2 N-聚糖，使得分別生成 GlcNAcMan5GlcNAc2 OrGlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖。在生成 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的細(xì)胞中，表達(dá)甘露糖苷酶II導(dǎo)致兩個(gè)甘露糖自GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖除去以生成GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖。在生成GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖的細(xì)胞中，表達(dá)GnT II導(dǎo)致另一個(gè) GlcNAc 模塊轉(zhuǎn)移至 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-聚糖以生成 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖。在生成GlcNAcMan3GlcNAc2或GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的細(xì)胞中表達(dá)Gal T導(dǎo)致將半乳糖轉(zhuǎn)移至 GlcNAcMan3GlcNAc2 或 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖以生成 GalGlcNAcMan3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖。在一些實(shí)施方案中，可以表達(dá)葡萄糖苷酶II (例如，通過(guò)表達(dá)a和0亞基)以提高M(jìn)an3GlcNAc2基本結(jié)構(gòu)的生成。靶分子
如本文中所使用的，靶分子指在遺傳工程細(xì)胞(例如，真菌細(xì)胞諸如解脂耶氏酵母、陸地酵母、或其它相關(guān)物種二形(dimorphic)酵母細(xì)胞；植物細(xì)胞，或動(dòng)物細(xì)胞)中經(jīng)歷N-糖基化的任何分子。在一些實(shí)施方案中，靶分子能夠經(jīng)由解脂耶氏酵母或陸地酵母(或其它相關(guān)物種二形酵母)分泌途徑的一個(gè)或多個(gè)步驟運(yùn)輸，導(dǎo)致其通過(guò)宿主細(xì)胞機(jī)器的N-糖基化。靶分子可以是內(nèi)源的或外源的。合適的靶蛋白包括病原體蛋白質(zhì)(例如，破傷風(fēng)類(lèi)毒素；白喉類(lèi)毒素；病毒表面蛋白(例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)糖蛋白B、H和gCIII ;人免疫缺陷病毒I(HIV-I)包膜糖蛋白；勞斯肉瘤病毒(RSV)包膜糖蛋白；單純皰疹病毒(HSV)包膜糖蛋白；埃巴病毒(EBV)包膜糖蛋白；水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)包膜糖蛋白；人乳頭瘤病毒(HPV)包膜糖蛋白((e.g. , tetanus toxoid ；diptheria toxoid ；viral surface proteins(e. g.,cytomegalovirus (CMV) glycoproteins B, H and gCIII ；human immunodeficiency virusI(HIV-1)envelope glycoproteins ；Rous sarcoma virus (RSV) envelope glycoproteins ；herpes simplex virus (HSV) envelope glycoproteins ；Epstein Barr virus (EBV)envelope glycoproteins ；varicella-zoster virus (VZV) envelope glycoproteins ； human papilloma virus (HPV) envelope glycoproteins);流感病毒糖蛋白；和肝炎家族表面抗原)、溶酶體蛋白質(zhì)(例如，葡糖腦苷脂酶、腦苷酯酶、或半乳糖腦苷脂酶)(e. g.，glucocerebrosidase, cerebrosidase, or galactocerebrosidase),、膜島素、膜高血糖素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子、結(jié)合Fe受體的蛋白質(zhì)、抗體或其片段、或任何蛋白質(zhì)域抗體或抗體片段的融合物(例如，蛋白質(zhì)-Fe)。生長(zhǎng)因子包括例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF);神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(TOGF)、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、筒箭毒堿(Myostatin)(⑶F_8)、生長(zhǎng)分化因子_9 (⑶F9)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF或FGF2)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。細(xì)胞因子包括例如，白介素(例如，IL-I至IL-33 諸如 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4，IL-5，IL-6，IL~1, IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13 或IL-15)和干擾素(例如，干擾素P或干擾素Y)。趨化因子包括例如1-309，TCA-3，MCP-I，MIP-I a，MIP-I ^，RANTES, CIO, MRP-2，MARC, MCP-3，MCP-2，MRP-2，CCF18, MIP-I y，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)，MCP-5，MCP-4，NCC-I, Ck^ 10，HCC-I,白細(xì)胞誘素-I, LEC,NCC-4，TARC，PARC或嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-2。還包括腫瘤糖蛋白(例如，腫瘤相關(guān)抗原)，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘蛋白、HER-2/neu、和前列腺特異性抗原(PSA) [Henderson和 Finn, Advances in Immunology,62, pp. 217-56 (1996)]。在一個(gè)實(shí)施方案中，革巴蛋白是抗HER2/neu抗體。在一些實(shí)施方案中，靶蛋白可以是與溶酶體貯積病癥有關(guān)的靶蛋白，該革El蛋白包括例如，alpha-L-艾杜糖苷酸酶、beta_D_半乳糖苷酶、beta-葡萄糖苷酶、beta-己糖胺酶、beta-D-甘露糖苷酶、alpha-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、alpha-N-乙?；肴樘擒彰浮⑻於滨０被咸擒彰?、艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶、alpha-氨基葡萄糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、beta_D_葡糖醒酸糖苷酶(glucoronidase)、透明質(zhì)酸酶、alpha-L-甘露糖苷酶、alpha-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K、和脂蛋白脂肪酶。靶蛋白還可以是融合蛋白。融合蛋白包括例如，(i)本文中所描述的任何蛋白質(zhì)或其片段與(ii)抗體或其片段的融合物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指(a)抗原結(jié)合片段或(b)可以與Fe受體相互作用的抗體Fe部分?？乖Y(jié)合片段可以是例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2、Fv、和單鏈Fv(scFv)片段。scFv片段是包含scFv來(lái)源的抗體的重和輕鏈可變區(qū)的單一多肽鏈。另外，可以在本發(fā)明的方法中使用雙抗體[Pol jak(1994) Structure2(12) :1121-1123 ;Hudson 等(1999) J. Immunol. Methods 23(1-2) :177-189]和胞內(nèi)抗體[Huston 等(2001)Hum. Antibodies 10(3-4) :127-142 ;Wheeler 等(2003)Mol. Ther. 8(3)355-366 ；Stocks (2004)Drug Discov. Today 9(22) :960-966]。也可以將靶蛋白與一種或多種聚合物、載體、賦形劑、免疫毒素、或可檢測(cè)(例如，熒光、發(fā)光、或放射性)模塊連接。例如，可以將靶蛋白與聚乙二醇連接，所述聚乙二醇可以用于提高小蛋白質(zhì)的分子量和/或延長(zhǎng)循環(huán)殘留時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，靶分子可以是或者含有多萜醇。遺傳工程細(xì)胞 可以使用本文中所描述的遺傳工程細(xì)胞來(lái)生成含有哺乳動(dòng)物樣N-聚糖的靶分子或含有哺乳動(dòng)物糖基化途徑內(nèi)的中間體的靶分子。例如，如本文中所描述的，可以將編碼一種或多種酶的核酸導(dǎo)入真菌細(xì)胞中，使得細(xì)胞生成期望的N-聚糖(例如，GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2 或Gal2GlCNAC2Man3GlcNAc2N-聚糖)。如此，在本文中所描述的任何實(shí)施方案中，真菌細(xì)胞可以含有編碼一種酶的核酸，或者核酸可以編碼多種酶。每種此類(lèi)核酸還可以含有如下文所描述的靶向序列。另外，也可以將編碼靶分子的核酸導(dǎo)入真菌細(xì)胞中，使得將靶分子生成并修飾為含有期望的N-聚糖(例如，GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAcMan3GIcNAc2,GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2 或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖)。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換使用，指RNA和DNA兩者，包括cDNA、基因組DNA、合成的DNA、和含有核酸類(lèi)似物的DNA (或RNA)。核酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)。核酸可以是雙鏈或單鏈(即，有義鏈或反義鏈)。核酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針、和引物，以及核酸類(lèi)似物?！岸嚯摹焙汀暗鞍踪|(zhì)”在本文中可互換使用，意指氨基酸的任何肽連接的鏈，而不管長(zhǎng)度或翻譯后修飾?！胺蛛x的核酸”指與存在于天然存在的基因組的其它核酸分子分開(kāi)的核酸，包括通常在天然存在的基因組(例如，酵母基因組)中的核酸的一側(cè)或兩側(cè)側(cè)翼的核酸。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”就核酸而言還包括任何非天然存在的核酸序列，因?yàn)榇祟?lèi)非天然存在的序列不存在于自然界，并且在天然存在的基因組中沒(méi)有剛好連續(xù)的序列。分離的核酸可以是例如，DNA分子，只要通常剛剛在天然存在的基因組中的DNA分子側(cè)翼找到的核酸序列之一被除去或缺乏。如此，分離的核酸包括但不限于作為不依賴(lài)于其它序列的不同分子(例如，化學(xué)合成的核酸、或通過(guò)PCR或限制性?xún)?nèi)切核酸酶處理生成的cDNA或基因組DNA片段)存在的DNA分子以及摻入載體、自主復(fù)制型質(zhì)粒、病毒(例如，任何副粘液病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、或皰疹病毒)中，或摻入原核生物或真核生物的基因組DNA中的DNA。另外，分離的核酸可以包括經(jīng)工程化改造的核酸諸如作為雜合或融合核酸的一部分的DNA分子。認(rèn)為存在于例如cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)，或含有基因組DNA限制性消化物的凝膠切片內(nèi)的數(shù)百至數(shù)百萬(wàn)個(gè)其它核酸間的核酸不是分離的核酸。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“外源的”就核酸和特定宿主細(xì)胞而言意指不存在于(并且不能獲自)如自然界中找到的所述特定細(xì)胞的任何核酸。如此，認(rèn)為一旦導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，非天然存在的核酸對(duì)于宿主細(xì)胞而言是外源的。重要的是，注意到非天然存在的核酸可以含有自然界中找到的核酸亞序列或核酸序列片段，只要整個(gè)核酸不存在于自然界中。例如，在表達(dá)載體內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且如此一旦導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，對(duì)于宿主細(xì)胞而言是外源的，因?yàn)檎麄€(gè)核酸分子(基因組DNA加載體DNA)不存在于自然界中。如此，認(rèn)為作為整體不存在于自然界中的任何載體、自主復(fù)制型質(zhì)粒、或病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、或皰疹病毒)是非天然存在的核酸。由此可見(jiàn)，認(rèn)為通過(guò)PCR或限制性?xún)?nèi)切核酸酶處理及eDNA的基因組DNA片段是非天然存在的核酸，因?yàn)樗鼈円宰匀唤缰姓也坏降姆珠_(kāi)的分子存在。由此還可見(jiàn)，以自然界中找不到的排列含有啟動(dòng)子序列和多肽編碼序列(例如，cDNA或基因組DNA)的任何核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是特定細(xì)胞外源的。例如，一旦自酵母X細(xì)胞分離的整個(gè)染色體被導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，所述染色體對(duì)于酵母I細(xì)胞而言是外源核酸。適合于遺傳工程的細(xì)胞包括例如真菌細(xì)胞(例如，解脂耶氏酵母或本文中所描述 的任何其它相關(guān)二形酵母細(xì)胞)、植物細(xì)胞、或動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以是原代細(xì)胞、永生化細(xì)胞、或經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。細(xì)胞可以是那些在動(dòng)物，例如，非人哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞。在如本文中規(guī)定的遺傳工程前，此類(lèi)細(xì)胞可以獲自多種商業(yè)來(lái)源和研究資源機(jī)構(gòu)，諸如例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)。細(xì)胞的遺傳工程可以包括遺傳修飾，諸如(i)刪除編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因；(ii)導(dǎo)入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)(例如，內(nèi)源或外源蛋白質(zhì))的突變體形式的重組核酸(即，表達(dá)具有N-糖基化活性的突變體蛋白質(zhì))導(dǎo)入或表達(dá)干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)的RNA分子；(iv)導(dǎo)入編碼具有N-糖基化活性的野生型(例如，內(nèi)源的或外源的)蛋白質(zhì)的重組核酸(即，表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì))；或者(V)改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的一種或多種內(nèi)源基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件，如此以改變其編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)。RNA分子包括例如小干擾RNA (SiRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、反義RNA、或微小RNA(miRNA)。應(yīng)當(dāng)理解，項(xiàng)(ii)包括例如，用相對(duì)于如此替換的內(nèi)源基因編碼具有更大N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因替換內(nèi)源基因。遺傳工程還包括改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因以生成具有添加(例如，異源序列)、刪除、或取代(例如，突變諸如點(diǎn)突變；保守或非保守突變)的蛋白質(zhì)?？梢詫⑼蛔兲禺愋砸?例如，定點(diǎn)誘變或同源重組)或者可以隨機(jī)引入(例如，可以將細(xì)胞化學(xué)誘變，如記載于例如 Newman 和 Ferro-Novick(1987) J. Cell Biol. 105(4) :1587 的。本文中所描述的遺傳修飾可以導(dǎo)致下列一項(xiàng)或多項(xiàng)(i)經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中的一種或多種N-糖基化活性的升高，(ii)經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中的一種或多種N-糖基化活性的降低，(iii)經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中的一種或多種N-糖基化活性的定位或胞內(nèi)分布的變化，或(iv)經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中的一種或多種N-糖基化活性的比率變化。應(yīng)當(dāng)理解，N-糖基化活性量增加可以由具有N-糖基化活性的一種或多種蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)、內(nèi)源基因的拷貝數(shù)目增加(例如，基因復(fù)制)、或刺激由基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)升高的內(nèi)源基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的變化所致。一種或多種N-糖基化活性的降低可以是由于具有N-糖基化改變活性的一種或多種蛋白質(zhì)的突變體形式(例如，顯性負(fù)性形式)的過(guò)表達(dá)、導(dǎo)入或表達(dá)降低具有N-糖基化活性的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)的一種或多種干擾RNA分子，或刪除編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的一種或多種內(nèi)源基因。刪除或破壞一種或多種內(nèi)源基因的方法記載于伴隨的實(shí)施例中。例如，為了通過(guò)同源重組破壞基因，可以以如下的方式構(gòu)建“基因替換”載體，使得包括選擇標(biāo)志基因。選擇標(biāo)志基因可以與5’和3’兩端與足以介導(dǎo)同源重組的長(zhǎng)度的基因的一部分可操作連接。選擇標(biāo)志可以是許多基因之一，所述基因互補(bǔ)宿主細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺陷型或者提供抗生素抗性，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合適的選擇標(biāo)志包括CAT基因，其對(duì)酵母細(xì)胞賦予氯霉素抗性，或IacZ基因，其導(dǎo)致由于表達(dá)￠-半乳糖苷酶所致的藍(lán)色菌落。然后，使用本領(lǐng)域中公知的方法(見(jiàn)下文)來(lái)將基因替換載體的線性化DNA片段導(dǎo)入細(xì)胞中?？梢曰谶x擇標(biāo)志來(lái)確定線性片段對(duì)基因組的整合和對(duì)基因的破壞，并且可以通過(guò)例如，Southern印跡分析來(lái)確認(rèn)。如伴隨的實(shí)施例中詳述的，在其選擇中使用后，可以通過(guò)例如Cre-IoxP系統(tǒng)(見(jiàn)·下文)自宿主細(xì)胞的基因組除去選擇標(biāo)志。此標(biāo)志物除去方法遍及整個(gè)實(shí)施例中稱(chēng)為“消除”?；蛘撸梢砸匀缦碌姆绞綐?gòu)建基因替換載體，使得包括要破壞的基因的一部分，其中該部分缺乏任何內(nèi)源基因啟動(dòng)子序列，并且編碼無(wú)一基因編碼序列或編碼基因編碼序列的無(wú)活性片段?！盁o(wú)活性片段”指編碼具有例如自基因的全長(zhǎng)編碼序列生成的蛋白質(zhì)的活性的小于約10% (例如，小于約9%、小于約8%、小于約7%、小于約6%、小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%、小于約1%、或0% )的蛋白質(zhì)的基因的片段。以如下的方式將基因的所述一部分插入載體中，使得無(wú)已知的啟動(dòng)子序列與基因序列可操作連接，但是終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止序列與基因序列的一部分可操作連接。隨后，可以將此載體在基因序列的一部分中線性化，并轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中。作為單一同源重組，然后將此線性化載體在基因的內(nèi)源對(duì)應(yīng)物中整合。表達(dá)載體可以是自主的或整合的?？梢詫⒅亟M核酸以表達(dá)載體形式諸如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘?；虿《绢w粒導(dǎo)入細(xì)胞中?？梢詫⒅亟M核酸在染色體外維持或者可以將其整合入酵母細(xì)胞染色體DNA中。表達(dá)載體可以含有編碼在選定的條件下對(duì)于細(xì)胞存活力需要的蛋白質(zhì)的選擇標(biāo)志基因(例如，URA3，其編碼尿嘧啶生物合成必需的酶，或TRP1，其編碼色氨酸生物合成需要的酶)以容許檢測(cè)和/或選擇用期望的核酸轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，704，362)。表達(dá)載體還可以包含自主復(fù)制序列(ARS)。例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 4，837，148描述了提供適合于維持畢赤酵母中的質(zhì)粒的手段的自主復(fù)制序列。整合性載體記載于例如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，882，279。整合性載體一般包含至少第一可插入DNA片段、選擇標(biāo)志基因、和第二可插入DNA片段的連續(xù)排列序列。第一和第二可插A DNA片段各為約200 (例如，約250、約300、約350、約400、約450、約500、或約1000或更多)個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，并且具有與要轉(zhuǎn)化的物種的基因組DNA的一部分同源的核苷酸序列。含有表達(dá)的感興趣基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因)的核苷酸序列在此載體中在第一和第二可插入DNA片段間插入，無(wú)論在標(biāo)志物基因之前還是之后?？梢詫⒄闲暂d體線性化，之后進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化以便于感興趣的核苷酸序列對(duì)宿主細(xì)胞基因組的整人
口 O表達(dá)載體的特征可以是在酵母(例如，解脂耶氏酵母、陸地酵母、或其它相關(guān)二形酵母物種)啟動(dòng)子(其使它們能夠在酵母中表達(dá))的控制下的重組核酸。合適的酵母啟動(dòng)子包括 TEF1，HP4D，GAP, P0X2, ADCl，TPIl，ADH2，POX 和 GallO 啟動(dòng)子。見(jiàn)例如，Madzak 等，(2000)J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2:207-216 ；Guarente 等(1982)Proc. Natl. Acad.Sci. USA 79(23) :7410。其它合適的啟動(dòng)子記載于例如 Zhu 和 Zhang (1999) Bioinformatics15(7-8) :608-611及美國(guó)專(zhuān)利No. 6，265，185。在要將表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的情況中，表達(dá)載體的特征可以是在適合于在感興趣的宿主細(xì)胞中表達(dá)的動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子控制下的重組核酸。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的例子包括SV40和巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成性或誘導(dǎo)型(條件性的)。組成性啟動(dòng)子理解為其表達(dá)在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下恒定的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是響應(yīng)一種或多種誘導(dǎo)信號(hào)的啟動(dòng)子。例如，可 以將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子化學(xué)調(diào)節(jié)(例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到化學(xué)誘導(dǎo)劑諸如醇、四環(huán)素、類(lèi)固醇、金屬、或其它小分子的存在或缺乏調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子)或物理調(diào)節(jié)(例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到物理誘導(dǎo)物諸如光或高或低溫的存在或缺乏調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子)。也可以通過(guò)自身受到化學(xué)或物理信號(hào)直接調(diào)節(jié)的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子間接調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。細(xì)胞的遺傳工程還包括激活如下的內(nèi)源基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因)，其存在于宿主細(xì)胞中，但是在細(xì)胞中通常不表達(dá)或者在細(xì)胞中不以顯著的水平表達(dá)。例如，可以將內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)序列(例如，基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)修飾為使得可操作連接的編碼序列展現(xiàn)出升高的表達(dá)?？梢允褂猛粗亟M或靶向來(lái)用調(diào)節(jié)序列將通常與基因聯(lián)合的調(diào)節(jié)區(qū)替換或使其喪失能力，所述調(diào)節(jié)序列引起基因以比相應(yīng)的非遺傳工程細(xì)胞中明顯的水平高的水平表達(dá)，或者引起基因展現(xiàn)出與相應(yīng)的非遺傳工程細(xì)胞中明顯的調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)樣式不同的調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)樣式。適合于引入基因的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)的變化的方法記載于例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文本No. 20030147868。應(yīng)當(dāng)理解，其它遺傳工程修飾也可以是條件性的。例如，可以使用例如，位點(diǎn)特異性 DNA 重組酶諸如 Cre-IoxP 系統(tǒng)(見(jiàn)例如，Gossen 等(2002)Ann. Rev. Genetics 36 153-173及美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)文本No. 20060014264)來(lái)?xiàng)l件性刪除基因。可以使用多種方法諸如原生質(zhì)球技術(shù)或全細(xì)胞氯化鋰酵母轉(zhuǎn)化方法來(lái)將重組核酸導(dǎo)入本文中所描述的細(xì)胞中。其它可用于將質(zhì)粒或線性核酸載體轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中的方法記載于例如，美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，929，555 ;Hinnen 等(1978)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75 :1929 ；Ito 等(1983) J. Bacteriol. 153 :163 ;美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，879，231 ;及 Sreekrishna 等(1987)Gene 59:115。也可以使用電穿孔和PEG1000全細(xì)胞轉(zhuǎn)化規(guī)程，如由Cregg和Russel，Methods in Molecular Biology Pichia Protocols,第 3章，Humana Press,Totowa,N. J.,第27-39頁(yè)(1998)所描述的。動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染的特征可以在于例如，使用磷酸鈣、電穿孔、熱休克、脂質(zhì)體、或轉(zhuǎn)染劑諸如FUGENE 或UPOFtCTAMINEiS,或者通過(guò)接觸裸核酸載體與溶液中的細(xì)胞(見(jiàn)例如，Sambrook 等,Molecular Cloning A Laboratory Manual第二版第 1、2 和 3 卷 Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor,NewYork, USA, Nov. 1989)來(lái)將載體導(dǎo)入細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)使用合適的技術(shù)，包括但不限于在轉(zhuǎn)化后在缺乏需要的生物化學(xué)產(chǎn)物(由于細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷型所致)的情況中培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，選擇并檢測(cè)新表型，或在存在抗生素的情況中培養(yǎng)來(lái)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，所述抗生素在缺乏轉(zhuǎn)化體中含有的抗性基因的情況中對(duì)于酵母是毒性。也可以通過(guò)將表達(dá)盒整合入基因組中來(lái)選擇和/或確認(rèn)轉(zhuǎn)化體，其可以通過(guò)例如Southern印跡或PCR分析來(lái)評(píng)估。在將載體導(dǎo)入感興趣的靶細(xì)胞中后，可以將載體在細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌(Escherichia coli，E. coli)中生長(zhǎng)(例如，擴(kuò)增)?？梢酝ㄟ^(guò)導(dǎo)致載體DNA自細(xì)菌環(huán)境(milieu)純化的本領(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)自細(xì)菌細(xì)胞分離載體DNA?？梢杂每?、氯仿、和乙醚來(lái)廣泛提取純化的載體DNA，以確保質(zhì)粒DNA制備物中不存在大腸桿菌蛋白質(zhì)，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是毒性的?？梢允褂萌绫疚闹兴枋龅倪z傳工程來(lái)表達(dá)(例如，過(guò)表達(dá))、將修飾引入、或刪除許多編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因。此類(lèi)蛋白質(zhì)包括例如，0CH1、ALG3、a-1，3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、GnT I、甘露糖苷酶II、GnT II、葡萄糖苷酶II、或Gal T0編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以來(lái)自任何含有此類(lèi)基因的物種。可以獲得編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因的例示性真菌物種包括但不限于異常畢赤酵母 (Pichia anomala)、牛畢赤酵母(Pichia bovis)、加拿大畢赤酵母(Pichia canadensis)、卡氏畢赤酵母(Pichia carsonii)、粉狀畢赤酵母(Pichia farinose)、發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans)、Pichia f luxuum、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、膜購(gòu)畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、粗狀假絲酵母(Candida valida)、白念珠菌(Candida albicans)、Candida ascalaphidarum、Candida amphixiae、南極假絲酵母(Candida Antarctica)、大西洋假絲酵母(Candida atlantica)'Candida atmosphaerica、蟑蟲(chóng)郎假絲酵母(Candida blattae)、果生假絲酵母(Candida carpophila)、Candidacerambycidarum、Candida chauliodes、延古月索假絲酵母(Candida corydalis)、Candidadosseyi、杜氏假絲酵母(Candida dubliniensis)、Candida ergatensis、Candidafructus、光滑假絲酵母(Candida glabrata)、發(fā)酵假絲酵母(Candida fermentati)、吉利蒙假絲酵母(Candida guilliermondii)、黑馬朗假絲酵母(Candida haemulonii)、Candida insectamens、Candida insectorum、中型假絲酵母(Candida intermedia)、Candida jeffresii、乳酒假絲酵母(Candida kefyr)、克魯斯氏念珠菌(Candida krusei)、葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae) ^Candida lyxosophila、麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)、膜醭假絲酵母(Candida membranifaciens)、梅林假絲酵母(Candida milleri)、撤攬假絲酵母(Candida oleophila)、俄勒同假絲酵母(Candida oregonensis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、桔假絲酵母(Candida quercitrusa)、休哈塔假絲酵母(Candida shehatea)、Candida temnochilae、纖維假絲酵母(Candida tenuis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、Candida tsuchiyae、Candida sinolaborantiu、大顯假絲酵母(Candida sojae)、維斯假絲酵母(Candida viswanathii)、產(chǎn)I元假絲酵母(Candida utilis)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia silvestris、膜醭畢赤酵母、Pichia chodati、膜醭畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、Pichia minuscule、畢赤酵母、Pichia pseudopolymorpha^ Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pichia saitoi、Pichia silvestrisi^Pichia strasburgensis、陸生畢赤酵母(Pichia terricola)、Pichiavanriji、Pseudozyma Antarctica、圓紅冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、貝酵母(Saccharomycesbayanus)、Saccharomyces momdshuricus、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、貝酵母、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、二抱酵母(Saccharomyces bisporus)、謝瓦利埃酵母(Saccharomyces chevalieri)、德?tīng)柌冀湍?Saccharomyces delbrueckii)、少抱酵母(Saccharomyces exiguous)、發(fā)酵性酵母(Saccharomyces fermentati)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、Saccharomyces marxianus、蜂蜜酵母(Saccharomycesmellis)、羅斯酵母(Saccharomyces roseii)、魯酵母(Saccharomyces rouxii)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、魏氏酵母(Saccharomyces willianus)、路氏類(lèi)酵母(Saccharomycodes Iudwigii)、莢復(fù)膜抱酵母(Saccharomycopsis capsularis)、扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、扣囊復(fù)膜酵母、Endomyces hordei、Endomycopsisfobuligera. Saturnispora saitoi、八抱裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidental is)、德?tīng)柌加斜A酵母(Torulaspora delbrueckii)、德?tīng)柌加斜A酵母、Saccharomyces dairensis、德?tīng)柌加斜A酵母、Torulaspora fermentati、發(fā)酵性酵母(Saccharomyces fermentati)、德?tīng)柌加斜A酵母、羅斯有抱圓酵母(Torulasporarosei)、羅斯有孢圓酵母、德?tīng)柌加墟邎A酵母、羅斯酵母、德?tīng)柌加墟邎A酵母、德?tīng)柌冀?母、德?tīng)柌加斜A酵母、德?tīng)柌冀湍?、Zygosaccharomyces mongolicus、Dorulasporaglobosa、球形德巴利酵母(Debatyomyces globosus)、球擬圓酵母(Torulopsis globosa)、皮狀絲抱酵母(Trichosporon cutaneum)、三角酵母(Trigonopsisvariabilis)、Williopsis californica、土星擬威爾酵母(Williopsis saturnus)、二抱接合酵母(Zygosaccharomyces bisporus)、二抱接合酵母、Debaryomyces disporua、二抱酵母(Saccharomyces bisporas)、二抱接合酵母、二抱酵母、Zygosaccharomycesmellis、Zygosaccharomyces priorianus、Zygosaccharomyces rouxiim、魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、巴格式結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces barkeri)、魯酵母、魯氏接合酵母、醫(yī)醒接合酵母(Zygosaccharomyces majori)、Saccharomyces rousii、異常畢赤酵母(Pichia anomala)、Pichia bovis、加拿大畢赤酵母(Pichia Canadensis)、卡氏畢赤酵母(Pichia carsonii)、粉末畢赤酵母(Pichia farinose)、發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans)、Pichia fluxuum、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia pseudopolymorpha^ Pichia quercuum、Pichia robertsii、PseudozymaAntarctica、圓紅冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、圓紅冬抱酵母菌、膠紅類(lèi)酵母菌(Rhodotorula glutinis)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、貝酵母、二抱酵母、釀酒酵母、謝瓦利埃酵母、德?tīng)柌冀湍?、發(fā)酵性酵母、脆壁酵母、路氏類(lèi)酵母、粟酒裂殖酵母、西方許旺酵母、德?tīng)柌加墟邎A酵母、球有孢圓酵母(Torulaspora globosa)、變異三角酵母(Trigonopsis variabilis)、Williopsis californica、土星擬威爾酵母、二抱接合酵母、Zygosaccharomyces mellis、魯氏接合酵母、或本領(lǐng)域中已知的或本文中所描述的任何其它真菌(例如，酵母)。例示性的低等真核生物還包括曲霉屬(Aspergillus)的多種物種，包括但不限于淺藍(lán)灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergilluscandidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、彎頭曲霉(Aspergillus deflectus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(黑曲霉素)、赫曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、帚狀曲霉(Aspergillus penicilloides)、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、聚多曲霉(Aspergillussydowi)> 溜曲霉(Aspergillus tamari)、 土曲霉(Aspergillus terreus)> 焦曲霉(Aspergillus ustus)、或花斑曲霉(Aspergillus versicolor)?？梢垣@得編碼具有 N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因的例示性原生動(dòng)物屬包括但不限于動(dòng)體目(Blastocrithidia)、短膜蟲(chóng)屬(Crithidia)、腸錐蟲(chóng)屬(Endotrypanum)、匍滴蟲(chóng)屬(Herpetomonas)、利什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania)、細(xì)滴蟲(chóng)屬(Leptomonas)、植物單胞菌屬(Phytomonas)、錐體蟲(chóng)屬(Trypanosoma)(例如，布氏錐蟲(chóng)(T. bruceii)、網(wǎng)比亞錐蟲(chóng)(T. gambiense)、羅德西亞錐蟲(chóng)(T. rhodesiense)、和克氏維蟲(chóng)(T. cruzi))、和 Wallaceina。例如，編碼 GnT I 的基因可以獲自人(Swiss蛋白質(zhì)登錄號(hào)P26572)、大鼠、擬南芥屬(Arabidopsis)、小鼠、或果蜆屬(Drosophila);編碼GntII的基因可以獲自人、大鼠(Swiss蛋白質(zhì)登錄號(hào)Q09326)、擬南芥屬、或小鼠；編碼Man II的基因可以獲自人、大鼠、擬南芥屬、小鼠、果蠅屬(Swiss蛋白質(zhì)登 錄號(hào)Q24451);而編碼GalT的基因可以獲自人(Swiss蛋白質(zhì)登錄號(hào)P15291)、大鼠、小鼠、或牛。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞缺乏OCHl (GenBank登錄號(hào)AJ563920)基因或其基因產(chǎn)物(mRNA或蛋白質(zhì))。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞缺乏ALG3(Genbank 登錄號(hào)XM 503488，Genolevures參照YALI0E03190g)基因或其基因產(chǎn)物(mRNA或蛋白質(zhì))。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞表達(dá)(例如，過(guò)表達(dá))a-1，3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，ALG6，Genbank 登錄號(hào)XM 502922，Genolevures 參照YALI0D17028g)蛋白。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞表達(dá)a_l，2-甘露糖苷酶(例如，Genbank登錄號(hào)AF212153)蛋白。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞表達(dá)GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I (例如，Swiss Prot.登錄號(hào)P26572)蛋白。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞表達(dá)甘露糖苷酶II蛋白或其催化域(例如，SwissProt.登錄號(hào)Q24451)。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞表達(dá)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I蛋白或其催化域(例如，Swiss Prot.登錄號(hào)P15291)。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞表達(dá)GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II蛋白或其催化域(例如，Swiss Prot.登錄號(hào)Q09326)。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞表達(dá)葡萄糖苷酶II諸如解脂耶氏酵母、布氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma brucei)或黑曲霉素(Aspergillus niger)的葡萄糖苷酶II的alpha或beta亞基(或alpha和beta亞基兩者)。遺傳工程細(xì)胞可以具有這些修飾的任何組合。例如，在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞可以缺乏OCHl基因，并且表達(dá)a-l，2_甘露糖苷酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、甘露糖苷酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程細(xì)胞可以缺乏ALG3基因，并且表達(dá)a-I，2-甘露糖苷酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I。此類(lèi)遺傳工程細(xì)胞進(jìn)一步可以表達(dá)a-I，3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和/或表達(dá)葡萄糖苷酶II的alpha和beta亞基和/或缺乏OCHl基因。多種此類(lèi)蛋白質(zhì)之一可以是含有異源靶向序列的融合蛋白。例如，a-l，2-甘露糖苷酶可以具有HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)-保留氨基酸序列(見(jiàn)實(shí)施例)。應(yīng)當(dāng)理解，可以將具有N-糖基化活性的任何蛋白質(zhì)工程化改造成包含HDEL序列的融合蛋白。其它蛋白質(zhì)可以具有將蛋白質(zhì)靶向至高爾基體的異源序列。例如，可以使用由酵母Kre2p基因編碼的前100個(gè)N端氨基酸、由釀酒酵母Mnn2基因編碼的前36個(gè)N端氨基酸(Swiss Prot.登錄號(hào)P38069)、或由釀酒酵母Mnn2p基因編碼的前46個(gè)N端氨基酸來(lái)將蛋白質(zhì)靶向至高爾基。因此，編碼要在真菌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸可以包含編碼將編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列。例如，可以將a-1，2-甘露糖苷酶靶向至ER，而可以將GnTI、GnTII、甘露糖苷酶、和Gal T靶向至高爾基。在具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)源自與要表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞不同類(lèi)型(例如，不同物種)的細(xì)胞的實(shí)施方案中，可以將編碼蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在感興趣的特定細(xì)胞中表達(dá)。例如，可以將編碼來(lái)自布氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma brucei)的具有N-糖基化的蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在酵母細(xì)胞諸如解脂耶氏酵母中表達(dá)。此類(lèi)密碼子優(yōu)化可以用于提高蛋白質(zhì)在感興趣細(xì)胞中的表達(dá)。用于將編碼蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且記載于例如Gao等(Biotechnol. Prog. (2004) 20 (2)443-448),Kotula等(Nat. Biotechn. (1991)9,1386-1389)及Bennetzen等(J. Biol. Chem.(1982)257(6) :2036-3031)。表I顯示了解脂耶氏酵母的密碼子選擇。數(shù)據(jù)源自存在于5，967種編碼序列的2，945，919個(gè)密碼子。表I的內(nèi)容獲自密碼子選擇數(shù)據(jù)庫(kù)，其可以見(jiàn)萬(wàn)維網(wǎng)于 kazusa. or. jp/codon/cgi-bin/showcodon. cgi species = 284591。 表I解脂耶氏酵母密碼子選擇表UUU CUAUGU
15.9(46804) 21.8(64161)6.8( 20043)6.1( 17849)
UUC CCACGC
23.0( 67672) 20.6( 60695)23.1( 681 16)6.1( 17903)
UUA CAAAGA
1.8( 5280) 7.8( 22845)0.8( 2494)0.4( 1148)
UUG CGAGGG
10.4( 30576) 15.4( 45255)0.8( 2325)12.1(35555)
CUU CUAUGU
13.2( 38890) 17.4( 51329)9.6( 28191)6.0( 17622)
CUC CCACGC
22.6( 66461) 23.3( 68633)14.4( 42490)4.4( 12915)
CUA CAAAGA
5.3( 15548) 6.9( 20234)9.8( 28769)21.7( 63881)
CUG CGAGGG
33.5( 98823) 6.8( 20()42)32.1(94609)7.7( 22606)
AUU CUAUGU
22.4( 66134) 16.2( 47842)8.9(26184)6.7( 19861)
AUC CCACGC
24.4( 71810) 25.6( 75551)31.3( 92161)9.8( 28855)
AUA CAAAGA
2.2( 6342) 10.5( 30844)12.4( 36672)8.4( 24674)
AUG CGAGGG
22.6( 66620) 8.5( 25021)46.5(136914)2.4( 7208)
GUU CUAUGU
15.8( 46530) 25.5( 75193)21.5( 63259)16.6( 48902)
GUC CCACGC
21.5(63401) 32.7( 96219)38.3(112759)21.8( 64272)
GUA CAAAGA
4.0( 11840) i 1.2( 32999)18.8(55382)20.9( 61597)
GUG CGAGGG
25.7( 75765) 8.9( 26190)46.2(136241)4.4( 12883)表欄(Tablefield)以[三聯(lián)體][頻率每千]([數(shù)目])顯示。在一些實(shí)施方案中，可以將人蛋白質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中，并且可以抑制(例如，刪除或
突變)具有N-糖基化活性的一種或多種內(nèi)源酵母蛋白質(zhì)。用于“人源化”真菌糖基化
途徑的技術(shù)記載于例如 Choi 等(2003)Proc. Natl. Acad. Sci.USA100(9) :5022-5027;
Vervecken 等(2004) Appl. Environ. Microb. 70(5) :2639-2646 ;及 Gerngross (2004) Nature
Biotech. 22(11) :1410_1414。在遺傳工程牽涉例如蛋白質(zhì)表達(dá)或外源蛋白質(zhì)(包括內(nèi)源蛋白質(zhì)的突變體形式)表達(dá)變化的情況中，可以使用多種技術(shù)來(lái)測(cè)定遺傳工程細(xì)胞是否表達(dá)蛋白質(zhì)。例如，可以分別使用例如Northern印跡或RT-PCR分析或Western印跡分析來(lái)檢測(cè)編碼蛋白質(zhì)的mRNA或蛋白質(zhì)自身的存在?？梢酝ㄟ^(guò)使用多種技術(shù)，包括亞細(xì)胞分級(jí)和免疫熒光來(lái)分析具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位。用于檢測(cè)靶分子的糖基化的方法包括DNA測(cè)序儀輔助(DSA)、熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳(FACE)或表面增強(qiáng)的激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜術(shù)(SELDI-TOF MS)。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中例如，將糖蛋白變性，接著在例如膜上固定化。然后，可以用合適的還原劑諸如二硫蘇糖醇(DTT)或￠-巰基乙醇來(lái)還原糖蛋白?？梢允褂盟嶂T如碘乙酸來(lái)將蛋白質(zhì)的硫氫基基團(tuán)羧化。接著，可以使用酶諸如N-糖苷酶F來(lái)自蛋白質(zhì)釋放N-聚糖。任選地，可以將N-聚糖重建，并通過(guò)還原性胺化來(lái)衍生化。然后，可以將衍生化的N-聚糖濃縮。適合于N-聚糖分析的設(shè)備包括例如，ABI PRISM 377DNA測(cè)序儀(AppliedBiosystems)?？梢允褂美?GENESCAN 3. I 軟件(Applied Biosystems)來(lái)實(shí)施數(shù)據(jù)分析。任選地，可以用一種或多種酶進(jìn)一步處理分離的甘露糖蛋白(mannoprotein)以確認(rèn)其N(xiāo)-聚糖狀態(tài)。N-聚糖分析的其它方法包括例如質(zhì)譜術(shù)(例如MALDI-T0F-MS)、正常相的高壓液相層析(HPLC)、反相和離子交換層析(例如，在未標(biāo)記聚糖時(shí)通過(guò)脈沖安培 計(jì)檢測(cè)，且若將聚糖適當(dāng)標(biāo)記，則通過(guò)UV吸光度或突光)。還可見(jiàn)Callewaert等(2001)Glycobiology 11(4) :275-281 及 Freire 等(2006)Bioconjug. Chem. 17(2) :559_564。在遺傳工程細(xì)胞的任何遺傳修飾在誘導(dǎo)信號(hào)(例如，化學(xué)或物理信號(hào))存在上是誘導(dǎo)的或條件性的情況中，任選地，可以將遺傳工程細(xì)胞在將核酸導(dǎo)入之前、期間、或之后在存在誘導(dǎo)劑的情況中培養(yǎng)。例如，在導(dǎo)入編碼靶蛋白的核酸后，可以將細(xì)胞暴露于能夠促進(jìn)具有N-糖基化活性的一種或多種蛋白質(zhì)表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)劑。在多種誘導(dǎo)信號(hào)誘導(dǎo)具有N-糖基化活性的一種或多種蛋白質(zhì)的條件性表達(dá)的情況中，可以使細(xì)胞與多種誘導(dǎo)劑接觸?？梢宰赃z傳工程細(xì)胞分離修飾為包含期望的N-聚糖的靶分子?？梢詫⒔?jīng)修飾的靶分子在酵母細(xì)胞內(nèi)維持，并且在細(xì)胞裂解后釋放，或者可以經(jīng)由由指導(dǎo)分子自細(xì)胞分泌的編碼序列(對(duì)于外源核酸而言天然的或者工程化改造入表達(dá)載體中)提供的機(jī)制將經(jīng)修飾的靶分子分泌入培養(yǎng)液中?？梢酝ㄟ^(guò)多種用于檢測(cè)分子存在的標(biāo)準(zhǔn)方案來(lái)確認(rèn)細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)液中的經(jīng)修飾的靶分子的存在。例如，在改變的靶分子是蛋白質(zhì)的情況中，此類(lèi)方案可以包括但不限于用對(duì)改變的靶蛋白(或靶蛋白自身)特異性的抗體的免疫印跡或放射性免疫沉淀、對(duì)改變的靶蛋白(或靶蛋白自身)特異性的配體的結(jié)合、或測(cè)試經(jīng)修飾的靶蛋白(或靶蛋白自身)的酶比活。在一些實(shí)施方案中，自遺傳工程細(xì)胞分離的至少約25%的靶分子含有期望的N-聚糖。例如，自遺傳工程細(xì)胞分離的至少約27 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或至少約95%、或至少約99%的靶分子可以含有期望的N-聚糖。在一些實(shí)施方案中，在使用本文中所描述的方法生成的靶分子中，糖蛋白上的至少 50% (例如，至少 55，60，65，70，75，80 或 85 % )的 N-聚糖可以是 GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖。自DSA-FACE電泳圖中的峰面積評(píng)估GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖的百分比。見(jiàn)實(shí)施例13。在一些實(shí)施方案中，可以將分離的經(jīng)修飾的靶分子冷凍、凍干、或固定化并在合適的條件(例如，其容許改變的靶分子保留生物學(xué)活性)下貯存。經(jīng)工程化改造的細(xì)胞的培養(yǎng)物本文件還提供了本文中所描述的任何遺傳工程細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物。如本文中所使用的，遺傳工程細(xì)胞的“基本上純的培養(yǎng)物”是所述細(xì)胞的如下培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中活細(xì)胞總數(shù)的小于約40% (S卩，小于約35% ；30% ；25% ；20% ；15% ；10% ；5% ；2% ；1% ；0. 5% ；0. 25% ；0. 1% ；0. 01% ；0. 001% ；0. 0001% ;或甚至更少)是與遺傳工程細(xì)胞不同的活細(xì)胞，例如，細(xì)菌、真菌(包括酵母)、支原體、或原生動(dòng)物細(xì)胞。在本上下文中的術(shù)語(yǔ)“約”意味著相關(guān)百分比可以是在規(guī)定的百分比之上或之下的規(guī)定百分比的15%百分比。如此，例如，約20%可以是17%至23%。遺傳工程細(xì)胞的此類(lèi)培養(yǎng)物包括細(xì)胞和生長(zhǎng)、貯存、或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基。培養(yǎng)子可以是液體、半固體(例如，凝膠狀培養(yǎng)基)、或冷凍的。培養(yǎng)基 包括在液體中或在半固體培養(yǎng)基中/上生長(zhǎng)或在貯存或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，包括冷凍貯存或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中貯存或轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞。培養(yǎng)物在培養(yǎng)容器或貯存容器或基片(例如，培養(yǎng)皿、燒瓶、或管或忙存小瓶或管)中?？梢詫⒈疚闹兴枋龅倪z傳工程細(xì)胞例如，以冷凍的細(xì)胞懸浮液在例如含有凍干保護(hù)劑諸如甘油或蔗糖的緩沖液中以?xún)龈杉?xì)胞貯存。或者，可以將它們例如以例如通過(guò)流化床干燥或噴霧干燥，或任何其它合適的干燥方法獲得的干燥細(xì)胞群貯存。通過(guò)改變的N-糖基化分子可治療的病癥可以使用修飾為含有期望的N-聚糖的分離的靶分子來(lái)治療多種病癥，包括代謝病癥、癌癥和炎性病癥。⑴代謝病癥代謝病癥是一種影響個(gè)體人(或動(dòng)物)細(xì)胞內(nèi)的能量生成的病癥。大多數(shù)代謝病癥是遺傳的，盡管一些可以由于飲食、毒性、感染等而為“獲得性的”。遺傳性代謝病癥又稱(chēng)為先天性代謝錯(cuò)誤。一般地，遺傳性代謝病癥是由導(dǎo)致細(xì)胞的代謝過(guò)程中的一些步驟必需的缺少或不適當(dāng)構(gòu)建的酶的遺傳缺陷引起的。最大類(lèi)別的代謝病癥是碳水化合物代謝的病癥、氨基酸代謝的病癥、有機(jī)酸代謝的病癥(有機(jī)酸尿癥)、脂肪酸氧化的病癥和線粒體代謝、葉啉代謝的病癥、嘌呤或嘧啶代謝的病癥、類(lèi)固醇代謝的病癥、線粒體功能的病癥、過(guò)氧化物酶體功能的病癥、和溶酶體貯積病(LSD)?？梢越?jīng)由施用本文中所描述的一種或多種糖基化分子(或其藥物組合物)治療的代謝紊亂的例子可以包括遺傳性血色病(hereditary hemochromatosis)、眼皮膚白化病(oculocutaneous albinism)、蛋白 C 缺乏(protein C deficiency)、I 型遺傳性血管性水腫(type I hereditary angioedema)、先天性鹿糖酶異麥芽糖酶缺乏(congenitalsucrase-isomaltase deficiency)、克里格勒-納賈爾 II 型(Crigler-Najjar type II)、Laron綜合征、遺傳性髓過(guò)氧化酶(hereditary Myeloperoxidase)、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥(primary hypothyroidism)、先天性長(zhǎng) QT綜合征(congenital long QT syndrome)、甲狀腺素-結(jié)合球蛋白缺乏(tyroxine binding globulin def iciency)、家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia)、家方矣性乳糜微粒血癥(familial chylomicronemia)、無(wú) 3 脂蛋白血癥(abeta-lipoproteinema)、低血楽J旨蛋白 A水平(low plasmalipoproteinA levels)、伴有肝損傷的遺傳性肺氣腫(hereditary emphysema with liver injury)、先天性甲狀腺功能減退癥(congenital hypothyroidism)、成骨不全(osteogenesisimperfecta)、遺傳性低纖維蛋白原血癥(hereditary hypofibrinogenemia)、alpha-1 抗胰凝乳蛋白酶缺乏(antichymotrypsin def iciency)、腎性尿崩癥(nephrogenic diabetesinsipidus)、垂體神經(jīng)部尿崩癥(neurohypophyseal diabetes insipidus)、腺苷脫胺酶缺陷(adenosine deaminase def iciency)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PelizaeusMerzbacher disease)、血管性血友病(von Willebrand disease) IIA 型、組合的因子 V 和VIII缺乏、脊椎骨飯遲緩性發(fā)育不良(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda)、無(wú)脈絡(luò)膜(choroideremia)、I 細(xì)胞病(cell disease)、巴藤病(Batten disease)、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telangiectasias)、ADPKD_ 常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominantpolycystic kidney disease)、微域毛包含病(icrovillus inclusion disease)、結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis)、Lowe 眼腦腎綜合征(oculocerebro-renal syndromeof Lowe)、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome)、少淋巴細(xì)胞綜合征(Bare lymphocyte syndrome)、丹吉爾 病(Tangier disease)、家族性肝內(nèi)膽汁郁積(familial intrahepatic cholestasis)、X連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(X-linked adreno-leukodystrophy)、Scott綜合征、Hermansky-Pudlak綜合征I和2型、Zellweger綜合征、肢根性點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不良(rhizomelic chondrodysplasia puncta)、常染色體隱性原發(fā)性高草酸尿(autosomalrecessive primary hyperoxaluria)、Mohr Tranebjaerg 綜合征、脊髓延髓肌肉萎縮癥(spinal and bullar muscular atrophy)、原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障石辱(primary ciliarydiskenesia) (Kartagener 氏綜合征)、巨大癥(giantism)和肢端肥大癥(acromegaly)、乳溢(galactorrhea)、阿狄森氏綜合征(Addison’ s disease)、腎上腺性男性化(adrenalvirilism)、Cushing氏綜合征、酮酸中毒(ketoacidosis)、原發(fā)性或繼發(fā)性醒甾酮增多癥(aldosteronism)、Miller Dieker 綜合征、無(wú)腦回(Iissencephaly)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)兀病(motor neuron disease)、Usher 氏綜合征、Wiskott-Aldrich 綜合征、Optiz 綜合征、享廷頓氏病(Huntington’ s disease)、遺傳性膜腺炎(hereditary pancreatitis)、抗憐脂綜合征(anti-phospholipid syndrome)、重疊結(jié)締組織病(overlap connectivetissue disease)、舍格倫氏綜合征(Sjdgren’S syndrome)、僵體綜合征(stiff-mansyndrome)、Brugada 綜合征、芬蘭型先天性腎炎綜合征(congenital nephritic syndromeof the Finnish type)、杜賓-約翰遜綜合征(Dubin-Johnson syndrome)、X-連鎖低憐血癥(X_l inked hypophosphosphatemia)、彭德萊綜合征(Pendred syndrome)、持續(xù)性幼兒型胰島素過(guò)度分泌低血糖癥(persistent hyperinsulinemic hypoglycemia ofinfancy)、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(hereditary spherocytosis)、無(wú)血衆(zhòng)銅藍(lán)蛋白(acerulopIasminemia)、嬰兒神經(jīng)兀錯(cuò)樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積癥(infantile neuronal ceroidlipofuscinosis)、假性軟骨發(fā)育不全(pseudoachondroplasia)和多發(fā)性骨飯、Stargardt樣黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(multiple epiphyseal, Stargardt-Iike macular dystrophy)、X-連鎖夏科-馬里-圖思病(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease)、常染色體顯性色素性視網(wǎng)膜炎(autosomal dominant retinitis pigmentosa)、Wolcott-Rallison 綜合征、庫(kù)興氏病(Cushing，s disease)、角膜緣帶肌營(yíng)養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy)、粘多糖病(mucoploy-saccharidosis) IV型、芬蘭型遺傳性家族型淀粉樣變(hereditaryfamilial amyloidosis of Finish)、安徒生病(Anderson disease)、肉瘤(sarcoma)、慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病(chronic myelomonocytic leukemia)、心肌病(cardiomyopathy)、面生殖發(fā)育異常(faciogenital dysplasia)、Torsion 病、亨廷頓(Huntington)和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxias)、遺傳性高同種半胱氨酸血癥(hereditaryhyperhomosyteinemia)、多神經(jīng)病(polyneuropathy)、下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)兀病(lowermotor neuron disease)、色素性視網(wǎng)膜炎(pigmented retinitis)、血清陰性多關(guān)節(jié)炎(seronegative polyarthritis)、間質(zhì)性月市纖維化(interstitial pulmonary fibrosis)、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’ s phenomenon)、韋格納氏肉芽腫病(Wegner’ s granulomatosis)、蛋白尿(preoteinuria)、CDG-Ia. CDG-Ib. CDG-Ic. CDG-Id. CDG-Ie. CDG-If. CDG-IIa.CDG-IIb. CDG-IIc. CDG-IIcU Ehlers-Danlos 綜合征、多發(fā)性外生骨疣(multipleexostoses)、格里塞利綜合征(Griscelli syndrome) (I型或2型)、或X-連鎖非特異性智力低下(X-linked non-specific mental retardation) □另外，代謝紊亂還可以包括 溶酶體積病癥，諸如但不限于法布里病(Fabry disease)、法韋爾病(Farber disease)、戈謝病(Gaucher disease)、GMl-神經(jīng)節(jié)苷脂積病(gangliosidosis)、泰-薩克斯(Tay-Sachs)病、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、GM2 激活物病(activator disease)、克拉伯病(Krabbe disease)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(metachromatic leukodystrophy)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease) (A、B、和 C 型)、胡爾勒病(Hurler disease)、謝伊病(Scheie disease)、亨特病(Hunter disease)、桑菲列普病(Sanfilippodisease) ^莫爾丘病(Morquio disease)、馬-拉病(Maroteaux-Lamy disease)、透明質(zhì)酸酶缺乏(hyaluronidase deficiency)、天冬氨酉先基葡萄糖胺尿(aspartyIglucosaminuria)、巖藻糖苷積癥(fucosidosis)、甘露糖苷積癥(mannosidosis)、欣德勒病(Schindlerdisease)、涎酸積癥(sialidosis) I型、蓬佩病(Pompe disease)、致密性成骨不全癥(Pycnodysostosis)、錯(cuò)樣脂褐質(zhì)沉積癥(ceroid lipofuscinosis)、膽固醇脂C積病(cholesterol ester storage disease)、沃爾曼病(Wolman disease)、多種硫酸酯酶缺乏癥(Multiple sulfatase def iciency)、半乳糖唾液酸沉積癥(galactosialidosis)、粘脂糖癥(mucolipidosis) (II、III、和IV型)、胱氨酸C積癥(cystinosis)、唾液酸C積病(sialic acid storage disorder)、乳糜微粒駐留病(chylomicron retention disease)伴 Marinesco-Sjogren綜合征、Hermansky-Pudlak 綜合征、Chediak-Higashi 綜合征、Danon病、或Geleophysic發(fā)育異常。 代謝紊亂的癥狀是許多的且多種多樣的，并且可以包括下列一項(xiàng)或多項(xiàng)例如，貧血(anemia)、疲勞(fatigue)、容易瘀傷(bruising easily)、低血小板(lowblood platelet)、月干增大(liver enlargement)、脾增大(spleen enlargement)、骨骼衰減(skeletal weakening)、肺損傷(lung impairment)、感染(例如，胸感染(chest infections)或月市炎(pneumonias))、腎損傷(kidney impairment)、進(jìn)行性腦損傷(progressive brain damage)、癲癇發(fā)作(seizures)、額外厚的胎糞(extrathick meconium)、咳嗽(coughing)、哮鳴(wheezing)、過(guò)多唾液或粘液生成、呼吸急促(shortness of breath)、腹痛(abdominal pain)、腸閉塞(occluded bowel or gut)、生育力問(wèn)題(fertility problems)、鼻中的息肉(polyps in the nose)、指/恥甲和皮膚的件狀肥大(clubbing)、手或腳疼痛(pain in the hands or feet)、毛細(xì)管擴(kuò)張性撫(angiokeratoma)、出汗減少(decreased perspiration)、角膜和晶狀體混池(opacities)、白內(nèi)障(cataracts)、二尖瓣脫垂(mitral valve prolapse)和 / 或反胃(regurgitation)、心月巴大(cardiomegaly)、溫度不耐性胃(temperature intolerance) >步行困難(difficulty walking)、吞咽困難(difficulty swallowing)、進(jìn)行性視覺(jué)喪失(progressive vision loss)、進(jìn)行性聽(tīng)覺(jué)喪失(progressive hearing loss)、張力過(guò)低(hypotonia)、巨舌(macroglossia)、反身寸消失(areflexia)、下腰痛(lower back pain)、睡眠性呼吸暫停(sleep apnea)、端坐呼吸(orthopnea)、目盍睡(somnolence)、脊柱前凸(lordosis)、或脊柱側(cè)彎(scoliosis)。應(yīng)當(dāng)理解，由于缺陷的或缺乏的蛋白質(zhì)的多種多樣的性質(zhì)和所得疾病表型(例如，代謝紊亂的癥狀表現(xiàn))，給定病癥一般會(huì)僅呈現(xiàn)所述特定病癥特征性的癥狀。例如，法布里病患者可以呈現(xiàn)上文提及的癥狀的特定亞組，諸如但不限于溫度不耐性、角膜潤(rùn)轉(zhuǎn)(corneal whirling)、疼痛、皮疫(skin rashes)、惡心(nausea)、或腹灣(dirarrhea)。具有Gaucher綜合征的患者可以呈現(xiàn)為伴有脾大(splenomegaly)、硬化(cirrhosis)、抽搐(convulsions)、張力過(guò)高(hypertonia)、呼吸暫停(apnea)、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)、或皮膚變色(skin discoloration)。·在施用本文中所描述的一種或多種分子外，也可以通過(guò)合適的營(yíng)養(yǎng)和維生素(例如，輔因子療法)、物理療法、和疼痛藥物治療代謝病癥。根據(jù)給定的代謝病癥的特定性質(zhì)，患者可以在任何年齡時(shí)呈現(xiàn)這些癥狀。在許多病例中，癥狀可以存在于兒童或成人早期中。例如，法勃雷病(Fabry disease)的病癥可以存在于早期年齡，例如年齡為10或11歲。如本文中所使用的，“有風(fēng)險(xiǎn)形成代謝病癥”的受試者是具有形成病癥的素因，即形成由于酶中的突變所致的代謝病癥的遺傳素因的受試者，所述酶諸如alpha-L-艾杜糖苷酸酶、beta-D-半乳糖苷酶、beta-葡萄糖苷酶、beta-己糖胺酶(己糖胺酶)、beta-D-甘露糖苷酶、alpha-L-巖藻糖苷酶(fucosidase)、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、alpha-N-乙?；肴樘擒彰?、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶、alpha-氨基葡萄糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、beta_D_葡糖醒酸糖苷酶(glucoronidase)、透明質(zhì)酸酶、alpha-L-甘露糖苷酶、alpha-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K、或脂蛋白脂肪酶。明顯地，“有風(fēng)險(xiǎn)形成代謝病癥”的受試者不是感興趣物種內(nèi)的所有受試者?！皯岩苫加胁“Y”的受試者是具有病癥諸如本文中所描述的那些病癥之任一的一種或多種癥狀的受試者。(ii)癌癥癌癥是一類(lèi)以不受控制的細(xì)胞分裂和這些通過(guò)經(jīng)由侵入直接生長(zhǎng)入相鄰組織中，或者通過(guò)轉(zhuǎn)移植入遠(yuǎn)距離部位(其中癌細(xì)胞經(jīng)由血流或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn))擴(kuò)散的能力為特征的疾病或病癥。癌癥可以影響所有年齡的人，但是風(fēng)險(xiǎn)隨年齡而趨于升高。癌癥的類(lèi)型可以包括例如，肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液學(xué)癌癥、神經(jīng)組織癌、黑素瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、宮頸癌、陰道癌、或膀胱癌。如本文中所使用的，“有風(fēng)險(xiǎn)形成癌癥”的受試者是具有形成癌癥的素因，即有形成癌癥的遺傳素因，諸如腫瘤抑制物基因中的突變(例如，BRCAl、p53、RB、或APC中的突變)或者已經(jīng)暴露于可導(dǎo)致癌癥的環(huán)境的受試者。如此，受試者也可以是在受試者已經(jīng)暴露于致突變或致癌水平的某些化合物(例如，香煙煙中的致癌性化合物諸如丙烯醛、砷、苯、苯并蒽、苯并芘、釙-210(氡)、烏拉坦(Urethane)、或氯化乙烯)時(shí)“有風(fēng)險(xiǎn)形成癌癥”的受試者。此外，受試者可以是在受試者已經(jīng)暴露于例如大劑量的紫外光或X-照射，或者暴露于(感染)引起腫瘤/腫瘤相關(guān)病毒諸如乳頭瘤病毒、埃巴病毒、乙肝病毒、或人T細(xì)胞白血病-淋巴瘤病毒時(shí)“有風(fēng)險(xiǎn)形成癌癥”。從上文看，會(huì)清楚的是，“有風(fēng)險(xiǎn)形成癌癥”的受試者不是感興趣物種內(nèi)的所有受試者?！皯岩删哂邪┌Y”的受試者是具有癌癥的一種或多種癥狀的受試者。癌癥的癥狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且包括但不限于乳房腫塊(breast lumps)、乳頭變化(nipplechange)、乳房囊腫(breast cyst)、乳房疼痛(breast pain)、體重減輕(weight loss)、虛弱(weakness)、過(guò)度疲勞(excessive fatigue)、進(jìn)食困難(difficulty eating)、食欲不振(loss of appetite)、久嗽(chronic cough)、氣喘惡化(worsening breathlessness)、咳血(coughing up blood)、尿血(blood in the urine)、血便(blood in stool)、惡心(nausea)、嘔吐(vomiting)、月干轉(zhuǎn)移(liver metastases)、月市轉(zhuǎn)移(lung metastases)、骨轉(zhuǎn)移(bone metastases)、肚脹(abdominal fullness)、胃氣脹(bloating)、腹膜腔中的流 體(fluid in peritoneal cavity)、陰道出血(vaginal bleeding)、便秘(constipation)、腹脹(abdominal distension)、結(jié)腸穿孔(perforation of colon)、急性腹膜炎(acuteperitonitis)(感染、發(fā)熱、疼痛)、疼痛、嘔血(vomiting blood)、重度出汗(heavysweating)、發(fā)熱、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、頭暈、寒戰(zhàn)、肌肉痙攣、結(jié)腸轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、膀胱轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腎轉(zhuǎn)移、和胰腺轉(zhuǎn)移、吞咽困難等。從上文上，會(huì)清楚的是，“懷疑具有癌癥”的受試者不是感興趣物種內(nèi)的所有受試者。在施用本文中所描述的一種或多種改變的N-糖基化分子外，也可以通過(guò)化學(xué)治療劑、電離福射、免疫治療劑、或超高溫治療(hyperthermotherapy)劑來(lái)治療癌癥?；瘜W(xué)治療劑包括例如，順鉬、卡鉬(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、環(huán)憐酉先胺(cyclophosphamide)、喜樹(shù)喊(camptothecin)、阿霉素(adriamycin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(bisulfan)、硝基服(nitrosurea)、更生霉素(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博來(lái)霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、Verampil、鬼曰毒素(podophyllotoxin)、他莫昔芬(tamoxifen)、泰素(taxol)、反鉬(transplatinum)、5_氟尿P密唳、長(zhǎng)春花新堿(vincristin)、長(zhǎng)春堿(vinblastin)、和甲氨蝶呤。(iii)炎性病癥如本文中所使用的，“炎性病癥”指一種或多種物質(zhì)(例如，不天然存在于受試者中的物質(zhì))經(jīng)由白血病(例如，B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、或樹(shù)突細(xì)胞)的作用不適當(dāng)?shù)赜|發(fā)病理學(xué)應(yīng)答，例如，病理學(xué)免疫應(yīng)答的過(guò)程。因而，炎性應(yīng)答中牽涉的此類(lèi)細(xì)胞稱(chēng)為“炎性細(xì)胞”。不適當(dāng)觸發(fā)的炎性應(yīng)答可以是如下的炎性應(yīng)答，其中受試者之中或之上不存在外來(lái)物質(zhì)(例如，抗原、病毒、細(xì)菌、真菌)。不適當(dāng)觸發(fā)的應(yīng)答可以是如下的應(yīng)答，其中炎性細(xì)胞靶向自身組分(例如，自身抗原)(例如，自身免疫性病癥諸如多發(fā)性硬化)。不適當(dāng)觸發(fā)的應(yīng)答還可以是如下的應(yīng)答，其在幅度(magnitude)或持續(xù)時(shí)間上是不適當(dāng)?shù)?，例如過(guò)敏反應(yīng)。如此，不適當(dāng)靶向的應(yīng)答可以是由于微生物感染(例如，病毒性、細(xì)菌性、或真菌性)的存在所致。炎性病癥(例如，自身免疫性疾病)的類(lèi)型可以包括但不限于骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、脊椎關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathies)、POEMS 綜合征、克羅恩氏病(Crohn，s disease)、多中心性卡斯?fàn)柭喜?multicentric Castleman，s disease)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupuserythematosus, SLE)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)、肌營(yíng)養(yǎng)不良(musculardystrophy, MD)、膜島素依賴(lài)性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM)、皮肌炎(dermatomyositis)、多肌炎(polymyositis)、炎性神經(jīng)病(inflammatoryneuropathies)諸如Guillain Barre綜合征、血管炎(vasculitis)諸如韋格納氏肉芽腫病(Wegener，s granulomatosus)、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(polyarteritis nodosa)、風(fēng)濕性多肌痛(polymyalgia rheumatica)、顳動(dòng)脈炎(temporal arteritis)、斯耶格倫氏綜合征(Sjogren’s syndrome)、Bechet 氏綜合征、丘-施二氏綜合征(Churg-Strauss syndrome) >或高安氏動(dòng)脈炎(Takayasu’ s arteritis)。炎性病癥中還包括某些類(lèi)型的變態(tài)反應(yīng)諸如鼻炎(rhinitis)、鼻竇炎(sinusitis)、蕁麻疫(urticaria)、蕁麻疫(hives)、血管性水腫 (angioedema)、特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis)、食物變態(tài)反應(yīng)(food allergies)(例如，堅(jiān)果變態(tài)反應(yīng))、藥物變態(tài)反應(yīng)(例如，青霉素)、昆蟲(chóng)變態(tài)反應(yīng)(例如，對(duì)蜂螯傷的變態(tài)反應(yīng))、或肥大細(xì)胞增多癥(mastocytosis)。炎性病癥還可以包括潰瘍性結(jié)腸炎和哮喘。“有風(fēng)險(xiǎn)形成炎性病癥”的受試者指具有一種或多種炎性病癥的家族史(例如，一種或多種炎性病癥的遺傳素因)的受試者或暴露于一種或多種炎癥誘導(dǎo)條件的受試者。例如，受試者可以已經(jīng)暴露于病毒或細(xì)菌超抗原諸如但不限于葡萄球菌腸毒素(SE)、鏈球菌生膿外毒素(SPE)、金黃色葡萄球菌毒性休克綜合征毒素(TSST-I)、鏈球菌有絲分裂外毒素(SME)和鏈球菌超抗原(SSA)。從上文看，會(huì)清楚的是，“有風(fēng)險(xiǎn)形成炎性病癥”的受試者不是感興趣物種內(nèi)的所有受試者?！皯岩删哂醒仔圆“Y”的受試者是呈現(xiàn)為炎性病癥的一種或多種癥狀的受試者。炎性病癥的癥狀是本領(lǐng)域中公知的，并且包括但不限于發(fā)紅、腫脹(例如，腫脹的關(guān)節(jié))、觸感溫暖的關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、關(guān)節(jié)功能喪失、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞、能量損失、頭痛、食欲不振、肌肉僵硬、失眠、發(fā)癢(itchiness)、不通氣的鼻(stuffy nose)、噴嚷(sneezing)、咳嗽(coughing)、一種或多種神經(jīng)學(xué)癥狀諸如頭暈(dizziness)、癲癇發(fā)作、或疼痛。從上文看，會(huì)清楚的是，“懷疑具有炎性病癥”的受試者不是感興趣物種內(nèi)的所有受試者。在施用本文中所描述的一種或多種分子外，也可以通過(guò)非類(lèi)固醇消炎藥(NSAID)、疾病緩解抗風(fēng)濕藥(disease-modifying anti-rheumatic drug,DMARD)、生物反應(yīng)修飾劑、或皮質(zhì)類(lèi)固醇來(lái)治療炎性病癥。生物反應(yīng)修飾劑包括例如，抗TNF劑?？筎NF劑的非限制性例子包括可溶性TNF受體或?qū)NF特異性的抗體,諸如阿達(dá)木單抗(adulimumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、或依那西普(etanercept)。以下部分中列出了適合于使用任何經(jīng)改變的N-糖基化分子(或其藥物組合物)來(lái)治療本文中所描述的任何病癥(例如，預(yù)防或改善其一種或多種癥狀)的方法。藥物組合物和治療方法可以將修飾為具有期望的N-聚糖的靶分子摻入藥物組合物中，所述藥物組合物含有治療有效量的分子和一種或多種佐劑、賦形劑、載體、和/或稀釋劑?？山邮艿南♂寗⑤d體和賦形劑通常沒(méi)有不利地影響接受體的穩(wěn)態(tài)(例如，電解質(zhì)平衡)?？山邮茌d體包括生物相容性、惰性或生物可吸收鹽、緩沖劑、寡或多糖、聚合物、粘性改善劑、防腐劑等。一種例示性的載體是生理鹽水(0. 15M NaCl, pH 7. 0至7. 4)。另一種例示性的載體是50mM磷酸鈉、IOOmM氯化鈉。關(guān)于配制和施用藥物組合物的技術(shù)的更多詳情可參見(jiàn)例如Remington’sPharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co. , Easton, Pa.)。補(bǔ)充性活性化合物也可以摻入組合物中。含有具有N-聚糖的分子的藥物組合物的施用可以是系統(tǒng)的或局部的?？梢匀缦屡渲扑幬锝M合物，使得它們適合于胃腸外和/或非胃腸外施用。具體的施用模式包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、口服、直腸、含服、表面、鼻、眼、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、支氣管、淋巴系統(tǒng)、陰道、和子宮內(nèi)施用。施用可以是通過(guò)周期性注射藥物組合物的推注或者可以通過(guò)自外部(例如，IV袋)或內(nèi)部(例如，生物可蝕性植入物、生物人工器官、或植入的經(jīng)改變的N-糖基化分子生成細(xì)胞的集落)的儲(chǔ)庫(kù)的靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用而是不中斷的或連續(xù)的。見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，407，957，5，798，113和5，800，828?？梢允褂煤线m的投遞手段來(lái)實(shí)現(xiàn)藥物組合物的施用，諸如泵(見(jiàn)例如Annals of Pharmacotherapy, 27 :912(1993)；·Cancer,41 :1270(1993) ；Cancer Research,44 :1698(1984);微囊化(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，352，883 ;4，353，888 ;和5，084，350);連續(xù)釋放聚合物植入物(見(jiàn)例如Sabel，美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，883，666) ;macroencapsulation (見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，284，761，5，158，881，4，976，859 和 4，968，733 及公布的 PCT 專(zhuān)利申請(qǐng) W092/19195, WO 95/05452);注射(皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、或?qū)ζ渌线m的部位)；或口服施用(在膠囊、液體、片劑、丸劑、或延長(zhǎng)釋放的配制劑中)。胃腸外投遞系統(tǒng)的例子包括乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入輸注系統(tǒng)、泵投遞、包囊細(xì)胞投遞、脂質(zhì)體投遞、針投遞注射、無(wú)針注射、噴霧器、氣霧器、電穿孔、和經(jīng)皮貼片。適合于胃腸外施用的配制劑通常含有經(jīng)改變的N-糖基化分子的無(wú)菌水性制備物，其優(yōu)選地是與接受體的血液等張的(例如，生理鹽水溶液)。配制劑可以以單位劑量或多劑形式呈現(xiàn)。適合于口服施用的配制劑可以以離散單元呈現(xiàn)，諸如膠囊、扁囊劑、片劑、或錠劑，它們各自含有預(yù)定量的經(jīng)改變的N-糖基化分子；或水性液體或非水性液體中的懸浮液，諸如糖衆(zhòng)劑、酏劑、乳劑、或頓服水劑(draught)?？梢詫?duì)哺乳動(dòng)物(例如，人患者)以例如膏齊IJ、噴霧齊IJ、泡沫、凝膠、油膏、軟膏、或干擦施用適合于表面施用的具有N-聚糖的分子。干擦在施用部位可以是再水合的。此類(lèi)分子也可以直接輸注入(例如，浸入并干燥)繃帶、紗布、或貼片，其然后可以直接表面應(yīng)用。此類(lèi)分子也可以以半液體、膠化、或完全液體狀態(tài)在供表面施用的繃帶、紗布或貼片中維持(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，307，717)?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)人員可確定的劑量方案對(duì)有此需要的受試者施用治療有效量的藥物組合物。例如，可以對(duì)受試者以每劑0. 01 Ii g/kg至10，000 u g/kg受試者體重的劑量系統(tǒng)性施用組合物。在另一個(gè)例子中，劑量是每劑Iu g/kg至IOOii g/kg受試者體重。在另一個(gè)例子中，劑量是每劑I U g/kg至30 u g/kg受試者體重,例如,每劑3 u g/kg至10 u g/kg受試者體重。為了有效治療效力，首先可以以不同給藥方案施用含有N-聚糖的分子。單位劑量和方案取決于如下因素，其包括例如，哺乳動(dòng)物物種、其免疫狀態(tài)、哺乳動(dòng)物的體重。通常，可以使用合適的篩選測(cè)定法作為臨床測(cè)試規(guī)程的一部分來(lái)監(jiān)測(cè)此類(lèi)分子在組織中的水平，例如以測(cè)定給定治療方案的功效。分子的給藥頻率在醫(yī)學(xué)從業(yè)人員(例如醫(yī)生或護(hù)士)的技術(shù)和臨床判斷內(nèi)。通常，通過(guò)可以建立最佳施用參數(shù)的臨床試驗(yàn)來(lái)建立施用方案。然而，從業(yè)人員可以依照受試者的年齡、健康、重量、性別和醫(yī)學(xué)狀態(tài)來(lái)改變此類(lèi)施用方案?？梢愿鶕?jù)治療是預(yù)防性還是治療性來(lái)改變給藥頻率。可以通過(guò)例如細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的已知藥學(xué)規(guī)程來(lái)確定此類(lèi)分子或其藥物組合物的毒性和治療效力。例如，可以使用這些規(guī)程來(lái)測(cè)定LD50 (對(duì)50%的群體致死的劑量)和ED50(在50%的群體中治療有效的劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比率是治療系數(shù)，并且其可以表示為比率LD50/ED50。優(yōu)選展現(xiàn)出大的治療系數(shù)的藥物組合物。雖然 可以使用展現(xiàn)出毒性副作用的藥物組合物，但是要注意設(shè)計(jì)如下的投遞系統(tǒng)，其將此類(lèi)化合物靶向受累組織位置以使對(duì)正常細(xì)胞(例如，非靶定細(xì)胞)的潛在損害最小化，由此降低副作用?？梢栽谂渲坪线m受試者(例如，人患者)用劑量范圍中使用自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)。此類(lèi)藥物組合物的劑量一般位于包括具有少許毒性或沒(méi)有毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可以在此范圍內(nèi)變化，這取決于所采用的劑量形式和所利用的施用路徑。對(duì)于如本文中所描述的那樣使用的藥物組合物(例如，用于治療受試者中的代謝紊亂)，最初可以自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法評(píng)估治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量以達(dá)到包括IC50 (即，實(shí)現(xiàn)對(duì)癥狀的半最大抑制的藥物組合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍，如在細(xì)胞培養(yǎng)中所測(cè)定的?？梢允褂么祟?lèi)信息來(lái)更精確地確定人中有用的劑量?？梢岳缤ㄟ^(guò)高效液相層析來(lái)測(cè)量血漿中的水平。如本文中所定義的，含有N-聚糖的分子的“治療有效量”是能夠在經(jīng)治療的受試者中產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上期望的結(jié)果(例如，改善代謝紊亂的一種或多種癥狀)的分子的量。治療有效量(即，有效劑量)可以包括每千克受試者或樣品重量毫克或微克量的化合物(例如，每千克約I微克至每千克約500毫克、每千克約100微克至每千克約5毫克、或每千克約I微克至每千克約50微克)。受試者可以是任何哺乳動(dòng)物，例如，人(例如，人患者)或非人靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，黑猩猩、狒狒、或猴)、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、倉(cāng)鼠、馬、一類(lèi)牲畜(例如，母牛、豬、綿羊、或山羊)、犬、貓、或鯨?？梢詫?duì)受試者以與另一種治療，例如用于代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病癥)的治療的聯(lián)合療法施用本文中所描述的分子或其藥物組合物。例如，聯(lián)合療法可以包括對(duì)受試者(例如，人患者)施用一種或多種別的藥劑，其對(duì)具有，或有風(fēng)險(xiǎn)形成，(或懷疑具有)代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病癥)的受試者提供治療益處。如此，可以同時(shí)施用化合物或藥物組合物和一種或多種別的藥劑。或者，可以第一次施用所述分子，而第二次施用一種或多種別的藥劑，或者反之亦然。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，在先前的療法是特別有毒性(例如，具有顯著副作用概況的用于代謝紊亂的治療)的情況中，可以使用本文中所描述的分子的施用來(lái)以如下的水平抵消和/或減少先前療法的量，從而足以給出相同或改善的治療益處，而沒(méi)有毒性。本文中所描述的任何藥物組合物可以與施用用法說(shuō)明書(shū)一起包含在容器、包裝、或分配器中。以下是本發(fā)明實(shí)施的實(shí)施例。它們不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例表2含有用于下文所描述的實(shí)驗(yàn)的所有菌株的列表。在表2中，MH=加有HDEL標(biāo)簽的a -I, 2-甘露糖苷酶；;=經(jīng)由zeta序列的隨機(jī)整合；?？?docking) A =對(duì)特定基 因座的整合；且(H)=潮霉素抗性的。
權(quán)利要求
1.一種生成能夠生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞的方法，所述方法包括 a)提供遺傳工程化改造為生成包含Man5GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞； b)將編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述核酸包含編碼將所述編碼的GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成修飾為包含所述GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的所述祀蛋白。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述靶蛋白結(jié)合Fe受體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述靶蛋白是抗體或其片段。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述靶蛋白是治療性糖蛋白。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述靶蛋白是干擾素-i3、GM-CSF、干擾素Y、或促紅細(xì)胞生成素。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述胞內(nèi)區(qū)室是高爾基體。
8.權(quán)利要求I的方法，其中遺傳工程化改造為生成含有Man5GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的所述真菌細(xì)胞是OCHl活性缺陷的，并且包括編碼α-1，2-甘露糖苷酶的核酸，其中編碼所述α -I, 2-甘露糖苷酶的所述核酸包括編碼將所述編碼的α -I, 2_甘露糖苷酶靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的靶向序列的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述靶向序列是HDEL序列。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述真菌細(xì)胞是解脂耶氏酵母或陸地酵母。
11.權(quán)利要求I的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼甘露糖苷酶II的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中編碼所述甘露糖苷酶II的所述核酸包含編碼將所述編碼的甘露糖苷酶II靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中所述甘露糖苷酶II在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求I或權(quán)利要求11的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸包含編碼將所述編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GalGlcNAcMan5GlcNAc2或GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求12的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成修飾為包含所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2 *GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是UDP-Glc-4-差向異構(gòu)酶和β -I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的催化域的融合物。
15.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括分離修飾為包含所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2或GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
16.一種生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的靶蛋白的方法，所述方法包括 a)提供遺傳工程化改造為包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、α-I, 2_甘露糖苷酶、和甘露糖苷酶II的核酸的真菌細(xì)胞，其中所述核酸包含編碼將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述真菌細(xì)胞是OCHl活性缺陷的；并 b)將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成包含所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述真菌細(xì)胞是解脂耶氏酵母或陸地酵母。
18.權(quán)利要求16的方法，其中編碼所述α-1，2-甘露糖苷酶的所述核酸包含將所述編碼的α -I, 2-甘露糖苷酶靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述靶向序列是HDEL序列。
20.權(quán)利要求16的方法，其中編碼所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I和所述甘露糖苷酶II的所述核酸包含編碼將所述編碼的GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I和甘露糖苷酶II靶向至高爾基體的高爾基靶向序列的核苷酸序列。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述靶蛋白結(jié)合Fe受體。
22.權(quán)利要求16的方法，其中所述靶蛋白是抗體或其片段。
23.權(quán)利要求16的方法，其中所述靶蛋白是治療性糖蛋白。
24.權(quán)利要求16的方法，其中所述靶蛋白是干擾素-β、GM-CSF、干擾素、、或促紅細(xì)胞生成素。
25.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括將編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸包含編碼將所述編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成修飾為包含GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
26.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括分離修飾為包含所述GalGlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
27.一種制備能夠生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞的方法，所述方法包括 a)提供遺傳工程化改造為生成包含Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的真菌細(xì)胞； b)將編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述核酸包含編碼將所述編碼的GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
28.權(quán)利要求27的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成修飾為包含所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述祀蛋白。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述靶蛋白結(jié)合Fe受體。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述靶蛋白是抗體或其片段。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述靶蛋白是治療性糖蛋白。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述靶蛋白是干擾素-i3、GM-CSF、干擾素Y、或促紅細(xì)胞生成素。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述胞內(nèi)區(qū)室是高爾基體。
34.權(quán)利要求27的方法，其中遺傳工程化改造為生成包含Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的所述真菌細(xì)胞是ALG3活性缺陷的，并且包含編碼α -I, 2_甘露糖苷酶的核酸，所述核酸包含編碼將所述編碼的α -I, 2-甘露糖苷酶靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的靶向序列的核苷酸序列。
35.權(quán)利要求34的方法，其中遺傳工程化改造為生成包含Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步是OCHl活性缺陷的。
36.權(quán)利要求34或35的方法，其中遺傳工程化改造為生成包含Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼α -I, 3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述α-1，3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是ALG6。
38.權(quán)利要求27的方法，其中所述真菌細(xì)胞是解脂耶氏酵母或陸地酵母。
39.權(quán)利要求27的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中編碼所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的所述核酸包含編碼將所述編碼的GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II在真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GlCNAC2Man3GlCNAC2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
40.權(quán)利要求27或權(quán)利要求39的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸包含編碼所述將所述編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GalGlcNAcMan3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
41.權(quán)利要求40的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成修飾為包含所述GalGlcNAcMan3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是UDP-Glc-4-差向異構(gòu)酶和β -I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的催化域的融合物。
43.權(quán)利要求40的方法，所述方法進(jìn)一步包括將編碼葡萄糖苷酶II的α和β亞基的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述葡萄糖苷酶II的所述α和β亞基在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
44.一種生成包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的靶蛋白的方法，所述方法包括 a)提供遺傳工程化改造為ALG3活性缺陷并包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸的真菌細(xì)胞，其中編碼所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸包含編碼將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列； b)將編碼靶蛋白的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞生成包含所述Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的所述革巴蛋白。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步是OCHl活性缺陷的。
46.權(quán)利要求44或45的方法，其中所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼α-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。
47.權(quán)利要求46的方法，其中編碼所述α-1，3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸是ALG6。
48.權(quán)利要求44、權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的方法，其中所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼葡萄糖苷酶II的所述α和β亞基的核酸，其中所述葡萄糖苷酶II的所述α和β亞基在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含所述Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
49.一種遺傳工程化改造為生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)的分離的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞是OCHl活性缺陷的，并且包含編碼α -I, 2-甘露糖苷酶、GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、和甘露糖苷酶II的核酸，其中編碼所述α-1,2-甘露糖苷酶、所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、和所述甘露糖苷酶II的所述核酸包含編碼將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述α -I, 2-甘露糖苷酶、所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、和所述甘露糖苷酶II在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
50.權(quán)利要求49的真菌細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳工程化改造的真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼革巴蛋白的核酸，其中所述細(xì)胞生成修飾為包含所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的所述革巴蛋白。
51.權(quán)利要求49或權(quán)利要求50的真菌細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳工程化改造的真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸，其中編碼所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的所述核酸包含編碼將所述編碼的GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
52.權(quán)利要求51的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，其中編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸包含編碼將所述編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
53.一種遺傳工程化改造為生成包含GlCNAC2Man3GlCNAC2N-聚糖的蛋白質(zhì)的分離的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞被遺傳工程化改造為ALG3活性缺陷的，并且包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I和GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的核酸，其中編碼所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I和所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的所述核酸包含編碼將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I和所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
54.權(quán)利要求53的真菌細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳工程化改造的真菌細(xì)胞進(jìn)一步是OCHl活性缺陷的。
55.權(quán)利要求53或權(quán)利要求54的真菌細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳工程化改造的真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼α-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。
56.權(quán)利要求53、權(quán)利要求54或權(quán)利要求55的真菌細(xì)胞，其中所述經(jīng)遺傳工程化改造的真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼靶蛋白的核酸，其中所述細(xì)胞生成修飾為包含所述GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
57.權(quán)利要求53-56中任一項(xiàng)的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼葡萄糖苷酶II的所述α和β亞基的核酸，其中所述葡萄糖苷酶II的所述α和β亞基在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含所述GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的所述蛋白質(zhì)。
58.權(quán)利要求57的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，其中編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸包含編碼將所述編碼的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶靶向至高爾基體的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
59.解脂耶氏酵母細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物，大量的所述解脂耶氏酵母細(xì)胞被遺傳工程化改造為生成包含Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白，其中將所述細(xì)胞工程化改造為ALG3活性缺陷的，并且包含編碼GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，其中編碼所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶I、所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸包含編碼將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、所述GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在所述細(xì)胞中的表達(dá)生成包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
60.權(quán)利要求59的基本上純的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步是OCHl活性缺陷的。
61.權(quán)利要求59或權(quán)利要求60的基本上純的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼α -I, 3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。
62.權(quán)利要求59、權(quán)利要求60或權(quán)利要求61的基本上純的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼葡萄糖苷酶II的所述α和β亞基的核酸，其中所述葡萄糖苷酶II的所述α和β亞基在所述真菌細(xì)胞中的表達(dá)生成包含所述Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的所述靶蛋白。
63.解脂耶氏酵母細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物，大量所述解脂耶氏酵母細(xì)胞被工程化改造為生成包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白，其中將細(xì)胞工程化改造為OCHl活性缺陷的，并且包含編碼α -1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、甘露糖苷酶II、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，其中編碼所述α-1,2-甘露糖苷酶、所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、所述甘露糖苷酶II、所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的所述核酸包括編碼將每種編碼的蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)區(qū)室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述α -I, 2-甘露糖苷酶、所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I、所述甘露糖苷酶II、所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II、和所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在所述細(xì)胞中的表達(dá)生成包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的蛋白質(zhì)。
64.包含糖蛋白的組合物，其中所述糖蛋白上的所述N-聚糖的至少50%是GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖。
65.權(quán)利要求64的組合物，其中所述糖蛋白上的所述N-聚糖的至少70%是GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖。
66.權(quán)利要求64的組合物，其中所述糖蛋白上的所述N-聚糖的至少85%是GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖。
全文摘要
本文中描述了可用于生成含有哺乳動(dòng)物樣復(fù)合N-聚糖或含有哺乳動(dòng)物糖基化途徑中的中間體的靶分子的方法和經(jīng)工程化改造的真菌細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N9/10GK102834509SQ201080061857
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者S.C.J.蓋森斯, W.弗維肯 申請(qǐng)人:奧克西雷恩英國(guó)有限公司