專利名稱：用作神經(jīng)遞質(zhì)分泌抑制劑和肌肉松弛誘導物的合成肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了涉及阻斷神經(jīng)遞質(zhì)分泌并誘導肌肉松弛的合成肽的材料和方法，以及所述肽作為神經(jīng)遞質(zhì)分泌和肌肉收縮的抑制劑和作為肌肉松弛誘導物的用途。
背景技術(shù)：
皺紋和細條紋是衰老的征兆。在想盡可能保持皮膚年輕化的產(chǎn)品中，抗皺霜占了相當大的比例。多年以來，人們一直通過保濕皮膚、改善皮膚再生、防止彈性纖維變性或促進膠原合成來治療皺紋和細條紋。在使人體皮膚變得平滑的化妝品治療類別中，瑞斯蕾恩(Restylane)和玻麗朗 (Perlane) (Q-Med, Uppsala, Sweden)均為遺傳工程透明質(zhì)酸衍生物，可用作一種膠原補充劑。膠原是機體最豐富的蛋白，是一種使皮膚堅韌耐久的彈性聚合物。隨著人的衰老，真皮或較深的皮膚層失去膠原，皮膚變得更易起皺紋和僵硬。視黃酸(維生素A)是一種有效的皮膚用非注射治療劑，經(jīng)常用于藥物療法以及非處方乳膏劑和洗劑。在化妝品市場上有許許多多抗衰老和抗皺乳膏劑用于短期改善皮膚，但經(jīng)常僅治療了皮膚的最外層，即表皮。膠原腺體位于真皮內(nèi)，所以不受這些乳膏劑的影響。為避免此問題，可采用替代療法。DHEA(脫氫表雄留酮)是一種由人腎上腺分泌的產(chǎn)物，其血清濃度隨著年齡的增長而下降。DHEA由于轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に睾痛萍に囟哂虚g接的內(nèi)分泌和胞內(nèi)分泌作用。透皮給予類固醇激素前體孕烯醇酮、DHEA以及天然激素孕酮具有某些重要優(yōu)勢。近些年，已售賣出大量含有這些活性成分的產(chǎn)品。用于轉(zhuǎn)運DHEA和孕酮通過皮膚的極佳組合物為水包油乳劑，其中含有皮膚脂肪組織的某些組分以及合適的滲透增強劑，并采用了脂質(zhì)體和納米球。某些神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿的分泌是面部肌肉收縮所必需的，抑制這些神經(jīng)遞質(zhì)是目前大部分針對表情紋的化妝品配方的基礎(chǔ)。真核細胞中區(qū)室之間的蛋白質(zhì)分泌和運輸由運載囊泡介導，運載囊泡由一個細胞器萌發(fā)，再與另一個細胞器融合。該轉(zhuǎn)運部分地由 SNARE蛋白介導，SNARE蛋白包括保守的膜結(jié)合蛋白如VAMP家族、突觸融合蛋白(syntaxin) 和SNAP-25家族，它們能介導膜的融合。例如，在響應(yīng)Ca2+流入的突觸傳遞中，含有神經(jīng)遞質(zhì)的突觸囊泡與突觸前膜融合， 并將其內(nèi)容物釋放到突觸間隙中。類似地，在神經(jīng)肌肉接頭處，Ca2+刺激含有乙酰膽堿的突觸前囊泡的胞吐作用，乙酰膽堿被釋放到突觸間隙中。SNARE蛋白，例如VAMP、突觸融合蛋白和SNAP25，參與這些囊泡的胞吐作用，這些囊泡含有不同的神經(jīng)遞質(zhì)，例如兒茶酚胺(去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺)、乙酰膽堿、5-羥色胺和/或肽神經(jīng)遞質(zhì)，例如腦啡肽。
乙酰膽堿是一種非常重要的神經(jīng)遞質(zhì)。乙酰膽堿的釋放對肌肉收縮很重要。乙酰膽堿還可能涉及傷害性感受和化學敏感性。抑制乙酰膽堿釋放可以是一種用于防止那些導致面部表情紋增加的肌肉收縮的方法。目前，大部分針對面部表情紋的化妝品配方都是基于對面部肌肉收縮必需的乙酰膽堿分泌的抑制，其中，肉毒桿菌毒素是抵御表情紋的最常用分子，主要用于眉毛之間、眼睛周圍和額頭上的皺紋。盡管已發(fā)現(xiàn)大部分肉毒桿菌毒素對人用是安全的，但通過肌內(nèi)注射給予這些物質(zhì)仍是一種不方便的給藥方法，有免疫原性，還可能會有某些副作用。在臨床試驗中關(guān)于肉毒桿菌毒素A (BOTOX )最常報告的不利事件是吞咽困難 (19% )、上呼吸道感染(12% )、脖子疼(11% )和頭痛(11% )。在將BOTOX 給予患有外周運動神經(jīng)疾病(例如肌萎縮性側(cè)索硬化、運動神經(jīng)病)或神經(jīng)肌肉接頭障礙(例如重癥肌無力)的個體時要特別小心。此外，不能排除這些毒素可長期儲存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在所有情況下，肉毒桿菌毒素都是高度免疫原性的。最近，為避免肌內(nèi)注射毒素，已披露了透皮肉毒桿菌毒素組合物和給藥方法(美國專利公布號20050074461、美國專利公布號20050175636)。然而，在皮膚上存在毒素可能是危險的，原因是有可能接觸到口、鼻咽部位和消化道。盡管眾多研究闡明了肉毒桿菌毒素的作用方式，但仍有許多方面尚未被揭示。例如，BOTOX 含有3個截然不同的生物區(qū)，其中1個介導細胞特異性結(jié)合，第二個介導細胞進入，第三個具有針對多種底物(例如SNARE復合蛋白VAMP、突觸融合蛋白和SNAP-25)的蛋白酶活性(Montecucco等，Trends Biochem. 18 :324-327,1993) 肉毒桿菌毒素特異性切割SNARE復合物中存在的蛋白。這些SNARE蛋白參與含乙酰膽堿的囊泡的胞吐作用。在 BOTOX 存在下，SNAP25的最后9個氨基酸被去除掉。此截短形式的SNAP25極為穩(wěn)定，與野生型SNAP25競爭。類似地，VAMP或突觸融合蛋白可被其它類別的肉毒桿菌毒素所切割。一種對Botox有吸引力的替代包括生產(chǎn)截短形式的SNAP25、VAMP和突觸融合蛋白，它們表現(xiàn)出來的活性類似于肉毒桿菌毒素的活性，或者類似于設(shè)計用于通過作用于參與胞吐作用的囊泡而特異性阻斷乙酰膽堿釋放的肽(SNARE復合物)。業(yè)已表明，模擬 SNAP-25 的 C 端序列的肽(乙酰六肽-3) (Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2) (SEQ IDNO 24)在嗜鉻細胞中抑制分泌性囊泡?？?Gutierrez等，J. Biol. Chem. 272 2634-2639,1997) 0該肽還通過阻斷胞吐作用來影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。此乙酰六肽(也稱為ARGIRELINE (阿基瑞林)，LipotecSA, Barcelona, Spain)是一種抗皺肽，通過松弛面部張力和導致表面條紋和皺紋減少的獨特機制起作用。在國際化妝品科學雜志 (International Journal of Cosmetic Science)上發(fā)表的一項研究中采用了在水包油乳劑中該肽的濃度為10%。結(jié)果表明，在30天治療后皺紋深度減少達30% (V. Kanga, Skin care delivery systems, Happi,47(2004 年 1 月)；International Journal of CosmeticScience 24:303,2002)。迄今為止，SNAP25 分子是BOTOX 或ARGIRELINE 阻斷神經(jīng)遞質(zhì)釋放的靶，前一種藥物注射使用，后一種藥物局部使用。基于肽序列，棕櫚?；咫?Pal-KKTTS) (SEQ ID NO :25)可對皮膚具有有益作用。棕櫚酰寡肽是由kderma SA公司開發(fā)的親脂修飾肽，其所有權(quán)屬于Croda公司，以 MATRIXYL 銷售。五肽由氨基酸賴氨酸、蘇氨酸和絲氨酸組成，通過連接棕櫚酸而變成親脂性的。這產(chǎn)生序列 I^al-Lys-Ilir-Ilir-Lysler 即 Pal-KTTKS (SEQ ID NO』6)，該組合通過向真皮細胞發(fā)出合成蛋白(膠原蛋白I、III、IV)和多糖(葡胺聚糖、透明質(zhì)酸)的信號來模擬天然組織再生的過程，所述蛋白和多糖構(gòu)成了填充皮膚必需的結(jié)締組織(美國專利 6，620，419)。有兩組研究人員認為，在改善光老化作用方面棕櫚酰五肽與視黃醇等效，但沒有常常與視黃醇相關(guān)的副作用。有兩個fikderma SA支持的獨立試驗。第一個研究檢驗了棕櫚酰五肽(3ppm)與視黃醇(700ppm)對光老化皮膚上的魚尾紋部位的作用。第二個研究檢驗了棕櫚酰五肽(5ppm)對光老化皮膚婦女中的彈性蛋白和膠原蛋白IV的結(jié)構(gòu)的作用。棕櫚酰五肽觸發(fā)彈性蛋白和膠原蛋白IV的生長，并增強彈性蛋白和膠原蛋白IV的結(jié)構(gòu)。該肽與任何副作用都無關(guān)，在皺紋修復中是視黃酸類物質(zhì)的安全有效的替代品。通過生物轉(zhuǎn)化黃秋葵(Hibiscus esculents L. (okra))種子的天然蛋白而獲得的寡肽是一種為Myoxinol LS 9736(Cognis，Cincinnati, OH)的有專利的復合物，其主要由低分子量的寡肽組成，使得生物利用度良好。這些植物肽通過抑制導致在面部出現(xiàn)表情紋的機械因素以和肉毒桿菌毒素類似的方式對抗皺紋。此新型活性成分具有雙重作用，在生物學上起延遲細胞衰老的作用(抗自由基活性)，并在機械上起抑制面部肌肉收縮的作用。 肉毒桿菌毒素防止形成動態(tài)性皺紋，例如穿過前額的水平和垂直眉心皺紋、眼睛周圍的魚尾紋和嘴周圍的鼻唇皺紋。使用針對受神經(jīng)支配的肌肉細胞收縮的體外試驗檢測該成分作為抗皺劑的潛力。通過使用卡立普多(一種已知的肌肉松弛藥)作為陽性對照，記錄對小時內(nèi)的收縮頻率，評價該成分抑制肌肉細胞自發(fā)收縮的能力。Cognis報道，在3周時間段內(nèi)將含l^Myoxinol LS 9736的乳膏劑應(yīng)用于魚尾紋部位，表明有相當大的抗衰老特性。該乳膏劑使皮膚更平滑，皺紋由于肌肉細胞收縮這一導致出現(xiàn)動態(tài)面部皺紋的主要機械因素的顯著下降而有的明顯減少。收縮抑制作用在用藥后M小時停止。模擬SNARE蛋白區(qū)段的氨基酸序列的其它合成肽已用于研究牽涉分泌途徑的蛋白(例如 ESUP-A)的功能性作用(Gutierrez 等，J.Biol· Chem. 272』6；34-2639，1997)。合成肽的使用經(jīng)常受限于難以進入靶細胞，需要通過皂苷透化細胞的人工系統(tǒng)是介導合成肽的作用所必需的。該問題可通過將合成肽與已知將肽或蛋白轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域(例如已知的蛋白轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(PTD))融合而避免。PTD，例如HIV的TAT蛋白的區(qū)段，已得到廣泛深入研究，已知為將蛋白轉(zhuǎn)導到不同細胞類型中的有效途徑(關(guān)于綜述參見Dietz等，Mol. Cell. Neurosci. 27 :85-131, 2004)。還已經(jīng)表明HIV的基本轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域介導向小鼠多個器官的轉(zhuǎn)運。腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射PTD融合蛋白，使蛋白在包括腦在內(nèi)的多個器官中傳遞。相反，在與TAT PTD或9-精氨酸(9R)融合時只有1個過氧化氫酶蛋白局部滲透的實例(Jin 等，F(xiàn)ree RadicalBiology and Medicine，31 1509-1519，2001)。然而，當單獨使用 TAT PTD 或9-精氨酸(9R)時，沒有顯示出對神經(jīng)遞質(zhì)釋放的作用。同樣，9-聚賴氨酸增強過氧化物歧化酶向哺乳動物皮膚中的滲透(Park等，Molecules and Cells 13:202-208,2002)。除SNAP 25序列以外，還沒有報告阻斷神經(jīng)遞質(zhì)釋放的其它肽。美國專利 6，794，362描述了來源于用于化妝品組合物的彈性蛋白的肽的應(yīng)用。美國專利6，358，929 描述了賴氨酸-脯氨酸-纈氨酸(KPV)肽和衍生物在用于抑制或減少接觸性超敏反應(yīng)的化妝品組合物中作為添加劑的應(yīng)用。美國專利6，183，759描述了與用于化妝品組合物的羊毛脂衍生的非羥基脂肪酸綴合的肽的合成。另外，乙酰膽堿與其在肌肉細胞上的受體的結(jié)合后觸發(fā)肌肉收縮。肌肉收縮涉及肌球蛋白和肌動蛋白的瞬時相互作用。肌球蛋白在粗肌絲中組構(gòu)，而肌動蛋白在細肌絲中聚合(F-肌動蛋白)。肌肉收縮通過細肌絲和粗肌絲彼此滑過而發(fā)生。組裝還包括微小肌肉蛋白a_輔肌動蛋白、肌間線蛋白、波形蛋白和伴肌動蛋白。改變肌絲形成，例如改變肌動蛋白聚合，可作為一種避免肌肉收縮和引起肌肉松弛的方法。在受損的肌肉中，傷口愈合經(jīng)常因纖維化過程而延遲。特定的生長因子如TGF-β 參與該纖維化過程。TGF-β的過量表達導致發(fā)生使引起纖維化的基質(zhì)蛋白沉積增加的事件。特定酶如前轉(zhuǎn)化酶(例如尤其為弗林蛋白酶)活化/加工TGF-β是纖維化過程中的關(guān)鍵事件。經(jīng)由前轉(zhuǎn)化酶阻斷TGF-β活化可能對傷口愈合有益。因此，在本領(lǐng)域仍需要鑒定具有諸如以下多效功能的肽序列并將其用作治療皺紋和受損肌肉的治療劑抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和抑制肌肉收縮，同時引起肌肉松弛。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用作神經(jīng)遞質(zhì)釋放抑制劑的肽的鑒定以及這些肽在生物功能(例如肌肉收縮)中阻斷神經(jīng)遞質(zhì)釋放和誘導肌肉松弛的應(yīng)用。還公開了這些肽在適用于皮膚的組合物中用于抑制神經(jīng)遞質(zhì)分泌、防止肌肉收縮和治療皺紋和細紋的應(yīng)用。還公開了這些肽針對肌肉細胞誘導肌肉細胞松弛的應(yīng)用。在一個實施方案中。本發(fā)明提供含有選自SEQ ID NO :1_23中的一種或多種肽的組合物。一方面，所述組合物含有選自SEQ ID N0:l-23中的2種以上、3種以上、4種以上、 5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、19種以上、20種以上、21種以上直至22種以上的肽。另一方面，本發(fā)明提供含有一種或多種肽的組合物，所述肽與在SEQ ID NO 1-23中所示的肽具有至少80%的同一性。預期所述肽與SEQ ID NO :1_23中所示的任一種肽共享至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一個相關(guān)實施方案中，所述組合物含有SEQ ID NO 24-29中的一種或多種。又一方面，本發(fā)明提供如上所述的肽組合物，其中所述肽含有所需氨基酸的L-對映體或所需氨基酸的D-對映體，或所需氨基酸的L-對映體或D-對映體的混合物。在一個相關(guān)方面，本發(fā)明預期，肽組合物可為或還可以包含在SEQ ID NO :1-23中所示的一種或多種月太的一種或多種逆向逆型異構(gòu)體(retro-inverso isomer)。在另一個實施方案中，預期本發(fā)明的組合物含有一種或多種肽，其中一種或多種肽是融合蛋白。一方面，本發(fā)明的肽與第二種蛋白的全部或部分融合。在一個相關(guān)方面， 組合物中的一種或多種肽與易位結(jié)構(gòu)域融合。另一方面，蛋白易位結(jié)構(gòu)域來源于HIV TAT 蛋白。再一方面，蛋白易位結(jié)構(gòu)域是一段富含精氨酸的序列。又一方面，所述肽與脂解肽GKH融合。本發(fā)明涉及的其它蛋白易位結(jié)構(gòu)域包括但不限于pentratin-Ι、觸角足蛋白 (antennapedia)易位結(jié)構(gòu)域、L-精氨酸寡聚物、D-精氨酸寡聚物、L-賴氨酸寡聚物、D-賴氨酸寡聚物、L-組氨酸寡聚物、D-組氨酸寡聚物、L-烏氨酸寡聚物、D-烏氨酸寡聚物、HSV-I 蛋白VP22及其片段、具有至少6個連續(xù)氨基酸殘基(即L-精氨酸、D-精氨酸、L-賴氨酸、 D-賴氨酸、L-組氨酸、D-組氨酸、L-烏氨酸、D-烏氨酸或其組合)的肽；以及其肽類似物。在一個相關(guān)方面，本發(fā)明的肽與核酸融合，所述核酸包括但不限于DNA、RNA(單鏈的或雙鏈的)或RNAi。在一個變化中，為了與延長保存期、增加穩(wěn)定性、增加所述肽在哺乳動物中的循環(huán)體內(nèi)半衰期、降低系統(tǒng)毒性等相關(guān)的目的，進一步修飾本發(fā)明的肽。采用標準藥物和制劑化學實現(xiàn)此目標，例如通過糖基化、PEG化、引入不可水解的鍵、與藥學上可接受的稀釋劑、輔劑或載體混合，等等。一方面，所述肽組合物含有至少一種選自以下的活性劑保濕劑、脫色劑 (de-pigmenting agent)、著色促進齊Ll (pro-pigmentingagent)、錄Ij 離齊[J (desquamating agent)、紫外線吸收劑、防曬活性劑、粘度調(diào)節(jié)劑、摩擦劑、pH調(diào)節(jié)劑、抗糖化劑、抗氧化齊U、 NO合酶抑制劑、刺激真皮和/或表皮大分子合成的物質(zhì)、防止真皮和/或表皮大分子降解的物質(zhì)、刺激膠原合成的物質(zhì)、防止膠原降解的物質(zhì)、刺激成纖維細胞和/或角質(zhì)形成細胞增殖或刺激角質(zhì)形成細胞分化的物質(zhì)、肌肉松弛劑、皮膚松弛劑、再生劑(rejuvenating agent)、抗污染劑(anti-pollution agent)和自由基清除劑、作用于毛細血管循環(huán)的物質(zhì)、 作用于細胞代謝的物質(zhì)、抗炎劑、止汗劑、抗微生物劑和抗真菌劑，以及輔助性的親水和親脂凝膠劑、活性劑、防腐劑、溶劑、芳香劑、填充劑、色素、氣味吸收劑。在另一個實施方案中，預期肽組合物中的一種或多種肽的濃度為組合物總重量的 0.00001%至10% (重量/重量)。一方面，一種或多種肽的濃度為約0.001至(重量 /重量)。在一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供單位劑量的肽，其優(yōu)選包含在容器中，該容器上貼有注明容器內(nèi)容物的標簽并附有對受試者給藥的說明書。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物為水包油乳劑。在一個相關(guān)實施方案中，組合物為油包水浸漬液。在又一個實施方案中，本發(fā)明的肽組合物配制用于局部應(yīng)用。本發(fā)明的肽可使用合成技術(shù)和重組DNA技術(shù)來制備。因此，本發(fā)明還提供純化的和分離的多核苷酸，其含有的核苷酸序列編碼本發(fā)明的肽；包含這些多核苷酸的載體(尤其是表達載體)；含有所述多核苷酸或載體的宿主細胞；以及使用所述多核苷酸、載體或宿主細胞制備肽的方法。例如，提供了一種轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法，該方法包括以下步驟將含有多核苷酸的載體導入所述宿主細胞中，所述宿主細胞表達多核苷酸，純化所獲肽。還提供通過以上方法轉(zhuǎn)化的宿主細胞。如果肽與配偶體(partner)作為融合體表達，則可能需要切割融合體，以獲得純化的肽。由本文描述顯而易見，本發(fā)明提供眾多涉及本發(fā)明組合物的方法和應(yīng)用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供抑制細胞的神經(jīng)遞質(zhì)分泌的方法，該方法包括使分泌神經(jīng)遞質(zhì)的細胞與本發(fā)明的組合物接觸，組合物的用量有效抑制細胞的神經(jīng)遞質(zhì)分泌。所考慮的已知表達神經(jīng)遞質(zhì)的靶細胞包括但不限于成人腦和神經(jīng)元細胞、肌肉細胞、上皮細胞和神經(jīng)上皮細胞、視網(wǎng)膜、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和皮膚中的梅克爾細胞(Merkel cell)。在一個優(yōu)選變化中，接觸步驟包括使細胞與含有所述肽和藥學上可接受的載體的組合物接觸。在一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供抑制哺乳動物受試者的肌肉收縮的方法，該方法包括給予哺乳動物受試者含有本發(fā)明的一種或多種肽的組合物，組合物的用量有效抑制肌肉收縮。在一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供誘導哺乳動物受試者的肌肉松弛的方法，該方法包括給予哺乳動物受試者含有本發(fā)明的一種或多種肽的組合物，組合物的用量有效誘導肌肉松弛。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供治療面部表情紋的方法，該方法包括給予表現(xiàn)出面部表情紋的哺乳動物受試者含有本發(fā)明的一種或多種肽的組合物，組合物的用量有效減小皺紋的深度或皺紋尺寸的增加。設(shè)想本文使用的面部表情紋是指由重復的面部表情所產(chǎn)生的皺紋，包括通常稱為魚尾紋、眼周皺紋、笑紋、眉溝紋、唇周皺紋、向下的口角紋、眉間皺紋(垂直皺眉線)和頸部皺紋在內(nèi)的皺紋。要認識到的是，皺紋尺寸等級的任何降低都指示成功治療。一方面，皺紋深度改善約10-100%。在一個相關(guān)方面，皺紋深度改善約10%、 約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%。在又一方面，皺紋減少或被完全根除。在一個變化中，本發(fā)明提供增強傷口愈合的方法，該方法包括給予需要傷口愈合的受試者有效量的組合物的步驟，所述組合物含有本發(fā)明的一種或多種肽。在另一個變化中，本發(fā)明提供通過阻斷纖維化過程增強傷口愈合的方法，該方法包括給予需要傷口愈合的受試者有效量的組合物的步驟，所述組合物含有本發(fā)明的一種或多種肽。在又一個變化中，本發(fā)明提供用于治療與神經(jīng)遞質(zhì)釋放和肌肉收縮相關(guān)的其它疾病的方法，所述疾病選自多汗癥、局灶性肌張力障礙、非肌張力障礙性疾病、炎癥和疼痛，所述方法包括給予有需要的受試者有效量的組合物的步驟，所述組合物含有本發(fā)明的一種或多種肽。有可能通過將額外的治療劑與本發(fā)明的肽一起遞送來增強所述肽的治療功效。在一個變化中，肽可與其它治療劑一起共同給予。這樣的治療劑包括但不限于神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑、止痛藥、血管收縮藥、凋亡抑制劑、抗炎藥。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的肽組合物，該肽組合物還含有一種或多種選自以下的神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑和肌肉松弛藥箭毒、α-銀環(huán)蛇毒素、芋螺毒素、阿庫銨、加拉明(gallamine)、泮庫銨、阿曲庫銨、維庫銨、哌侖西平AF-DX 116 pF-HHSiD、異丙托銨 (ipratroprium)、東莨菪堿和阿托品。本發(fā)明的肽組合物可抑制的神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿(ACh)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、5_羥色胺(5-HT)、組胺、腎上腺素、Y-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、緩激肽、內(nèi)啡肽、鈴蟾肽、降鈣素、縮膽囊素、腦啡肽、強啡肽、胰島素、胃泌素、P 物質(zhì)、神經(jīng)加壓素、胰高血糖素、分泌素、促生長素抑制素、促胃動素、血管加壓素、催產(chǎn)素、 催乳素、促甲狀腺素、血管緊張素II、睡眠肽(sle印ρ印tide)、甘丙肽、神經(jīng)肽Y、促甲狀腺素釋放激素、促性腺激素釋放激素(gonadotropnin-releasing hormone)、生長激素釋放激素、促黃體激素和血管活性腸肽。前述方法可在體外進行，或者可以通過將所述肽給予含靶細胞的生物而在體內(nèi)進行。一方面，接觸通過選自以下的途徑進行皮下、透皮、局部、真皮內(nèi)和真皮下。在又一個變化中，本發(fā)明涉及改善皮膚外觀的方法，該方法包括局部應(yīng)用化妝品， 所述化妝品含有本發(fā)明的組合物和化妝品可接受的溶媒。一方面，所述皮膚是衰老的、光老化的、干燥的、有條紋的或起皺紋的。化妝品可接受的溶媒可包括但不限于水、液體或固體潤膚劑、溶劑、保濕劑、增稠劑和底粉，它們在本文有進一步詳述。還提出了化妝品組合物還含有一種或多種下列成分雌二醇、孕酮、孕烷醇酮(pregnanalone)、輔酶 Q10、甲基磺酰甲烷(methylsolanomethane) (MSM)、銅肽(銅提取物)、浮游生物提取物(磷脂復合物(phytosome))、乙醇酸、曲酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、全反式視黃醇、杜鵑花酸、水楊酸、溴帕雌烯(broparoestrol)、雌酮、雄烯二酮 (adrostenedione)和雄烷二醇(androstanedione)。在一個相關(guān)方面，所述組合物還含有防曬劑。在一個變化中，所述化妝品可接受的溶媒為水包油乳劑或油包水乳劑。在第二個變化中，所述組合物選自乳劑、洗劑、噴霧劑、氣霧劑、粉劑、軟膏劑、乳膏劑和泡沫劑。附圖簡述

圖1提供的表給出了本發(fā)明設(shè)計的肽序列。圖 2 顯示了肽 MRP、L-Tat-MRP、3D-MRP 和 L-Tat_3D_MRP 對 PC12 細胞的神經(jīng)分泌的劑量依賴性抑制。圖3顯示了本發(fā)明的肽組合對PC12細胞的神經(jīng)分泌的抑制。圖4A顯示了弗林蛋白酶抑制劑在體外對弗林蛋白酶活性的作用。圖4B顯示了合成肽在體外對弗林蛋白酶活性的作用。圖5A圖示了不同濃度的9RaC/am肽對弗林蛋白酶活性的作用。圖5B圖示了不同濃度的L-Bell肽對弗林蛋白酶活性的作用。圖5C顯示了 L-9K對弗林蛋白酶活性的作用。圖6圖示了多種弗林蛋白酶抑制劑(圖6A，離子螯合劑；圖6B，弗林蛋白酶抑制劑 RVKR ；圖6C，肽D-Rac/am ；和圖6D，肽D-6R)在PC12-ES細胞中對弗林蛋白酶活性的作用。圖7顯示了用L-Bell處理后的PC12-ES細胞的染色情況。圖7A顯示了單獨的 L-Bel-I的染色情況，而圖7B顯示了 L-Bell和抗弗林蛋白酶抗體的染色情況。圖8 圖解了用 L-Bell (圖 8A)、D-9rac (圖 8B)或肽L-9K(圖 8C)處理后的 PC12-ES 細胞的形態(tài)。圖9圖示了在用肽D-9RaC/am處理之前(圖9A)和之后(圖9B)的成肌纖維細胞的圖像。圖10描述了肽L-Bel-1、D-Rac/am和L_9K對成肌纖維細胞介導的膠原收縮的作用。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及治療上有益的肽的鑒定和這些肽的應(yīng)用。本發(fā)明的肽。提出本發(fā)明的肽，例如在圖1中示例的那些肽，作為L氨基酸肽起作用或者作為D氨基酸肽起作用。L氨基酸是那些通常存在于天然合成的肽中的氨基酸。L 氨基酸是那些呈L構(gòu)象的氨基酸。D氨基酸是L氨基酸的對映體形式，通常不摻入到天然合成的肽中。提出本發(fā)明的肽作為D-對映體氨基酸肽起作用，即從氨基(NH2)端至羧基(COOH)端的序列相同，但每個氨基酸均為D-對映體。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽為不可水解的。為了提供這樣的肽，人們可以從不可水解的肽的文庫篩選出該肽，例如含有一個或多個D氨基酸的肽或者含有氨基酸通過一個或多個不可水解的肽鍵連接起來的肽。本發(fā)明還包括全D逆向逆型肽 (all-D-retro-inversopeptide)0術(shù)語“逆向逆型肽(retro-inverso ρ印tide) ”是指線性肽的異構(gòu)體，其中序列的方向是相反的，術(shù)語“D-逆向逆型異構(gòu)體(D-retro-inverso isomer) ”是指線性肽的異構(gòu)體，其中序列的方向是相反的，且每個氨基酸殘基的手性是反轉(zhuǎn)的。參見例如Jameson 等，Nature 368 :744-46,1994 ；Brady 等，Nature 368 :692-93,1994，Guichard 等，J. Med. Chem. 39 :2030_39，1996。逆向肽通過經(jīng)典的F-mock合成產(chǎn)生，再通過質(zhì)譜法作進一步分析。它們使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)通過HPLC純化。本發(fā)明的全D逆向逆型肽應(yīng)提供具有類似于天然肽的功能特性的肽，其中組成氨基酸的側(cè)基應(yīng)符合天然肽排列，但應(yīng)保留蛋白酶抗性骨架。舉例說明，如果天然TAT蛋白 (由L-氨基酸構(gòu)成)具有序列RKKRRQRRR(SEQ ID NO 3的氨基酸4_12)，則該肽的逆向逆型肽類似物(由D氨基酸構(gòu)成)應(yīng)具有序列RRRQRRKKR(SEQ ID NO 3的氨基酸4_12的反轉(zhuǎn))。D-氨基酸肽(正向序列或逆向逆型序列)可適用于其它肽，例如阿基瑞林(乙酰六肽)或 Pal-KTTKS (SEQ ID NO :26)。結(jié)合D-對映體和反向合成的最終結(jié)果是每個酰胺鍵中的羰基和氨基的位置發(fā)生交換，而由α碳伸出的側(cè)鏈基團的位置被保留下來。除非另有明確說明，否則假定本發(fā)明的任何給定L-氨基酸序列都可通過合成對應(yīng)天然L-氨基酸序列的反向序列而被制成 D-逆向逆型肽。在一個實施方案中，提出本發(fā)明的肽與本文描述的任一種肽的側(cè)鏈交聯(lián)。該方法用于使類似的肽或者本發(fā)明的肽彼此交聯(lián)，以產(chǎn)生分支肽。一方面，分支可位于N端或C端。 交聯(lián)還可以對內(nèi)部氨基酸進行，產(chǎn)生內(nèi)部分支，或者在N端或C端和內(nèi)部位置同時進行。本發(fā)明的肽可作為經(jīng)修飾的肽起作用。本發(fā)明提出的修飾包括但不限于PEG化 (PEG連接)、糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化，或者加入乙酰基、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸或酸性基團，產(chǎn)生酸加成鹽、酰胺、酯，尤其是本發(fā)明肽的C端酯和N-?；苌?。所述肽還可以通過與其它部分形成共價或非共價復合物而修飾，產(chǎn)生肽衍生物?？赏ㄟ^將化學部分與所述肽含有的氨基酸側(cè)鏈上的或在N端或C端的官能團連接而制備共價結(jié)合的復合物。本發(fā)明的肽可為線性的或環(huán)狀的，通過天然或合成方法產(chǎn)生。例如，半胱氨酸殘基之間的二硫鍵可以使肽序列環(huán)化。雙官能試劑可用于提供肽的兩個或更多個氨基酸之間的化學鍵。肽的其它環(huán)化方法也是本領(lǐng)域已知的，例如由Anwer等(Int. J Pep. Protein Res. 36 :392-399,1990)和 Rivera-Baeza 等(Neuropeptides 30 :327-333,1996)描述的那些方法。具體地說，提出本發(fā)明的肽可以與報告基團綴合，所述報告基團包括但不限于放射性標記、熒光標記、酶(例如催化顯色反應(yīng)或熒光反應(yīng)的酶)、底物、固體基質(zhì)或載體(例如生物素或抗生物素蛋白)。這些標記都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。有關(guān)標記參見例如美國專利第3，817，837號、美國專利第3，850，752號、美國專利第3，996，345號、美國專利第4，277，437號、美國專利第3，817，837號、美國專利第3，850，752號和美國專利第 3，939，350號。本發(fā)明的任何肽都可以含有任何這些標記的1種、2種或更多種。進一步提出本發(fā)明的肽可與抑制性基團(例如氟甲基酮或氯甲基酮)綴合，以封閉酶的活性。本發(fā)明的肽還可以用作天然底物的競爭劑。還包括本發(fā)明肽的類似物或變體。變體和類似物可與本文所述肽基本同源或基本相同。優(yōu)選的變體和類似物是與本發(fā)明肽具有相同特征的那些，所述特征例如為抑制神經(jīng)分泌或抑制肌肉收縮。肽類似物或變體是與在SEQ ID NO :1-23中所示的肽的氨基酸序列具有最小百分率的氨基酸同一性(例如優(yōu)選至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%的同一性)的那些肽變體。取代變體通常在蛋白中的一個或多個位點將肽序列的一個氨基酸換為另一個氨基酸，并可被設(shè)計用于調(diào)節(jié)多肽的一種或多種特性，例如抗蛋白酶剪切的穩(wěn)定性，而沒有失去其它功能或特性。該類取代優(yōu)選是保守的，即一個氨基酸被另一個如下所述的具有相似形狀和電荷的氨基酸所置換。
本文使用的術(shù)語“保守取代”是指一個氨基酸殘基被另一個就疏水性、親水性、陽離子電荷、陰離子電荷、形狀、極性等而言在生物學上相似的殘基所置換。因此，應(yīng)當理解的是，在本發(fā)明背景下，保守取代在本領(lǐng)域視為一個氨基酸被另一個具有類似特性的氨基酸取代。保守取代的實例包括一個疏水殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸取代另一個疏水殘基， 或者一個極性殘基取代另一個極性殘基，例如精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或者谷氨酰胺取代天冬酰胺，等等?？杀舜巳〈闹行杂H水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、 絲氨酸和蘇氨酸。術(shù)語“保守取代”還包括取代的或修飾的氨基酸替代未取代的親本氨基酸的應(yīng)用，只要針對取代的多肽產(chǎn)生的抗體也與未取代的多肽有免疫反應(yīng)。本發(fā)明所述“取代的”或“修飾的”包括已由天然氨基酸改變或修飾的那些氨基酸。本發(fā)明還包括所述肽作為前肽(prop印tide)的應(yīng)用，所述前肽在宿主細胞內(nèi)部被切割，產(chǎn)生活性形式的目標肽。前肽的重組合成描述于例如mi等，Proc Natl Acad Sci USA. 94 :13654-60,1997。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽在不同肽的NH2端或COOH端融合，產(chǎn)生融合蛋白。 所述肽可與諸如以下的蛋白融合靶向蛋白、受體特異性配體、酶、抗體、易位結(jié)構(gòu)域，或者可將肽靶向特定組織或細胞類型以增強本發(fā)明肽的實用性的其它蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域。提出本發(fā)明的肽作為與其它活性肽融合的融合肽起作用，所述活性肽例如為阿基瑞林乙?；?AGGEEMQRR(SEQ ID NO :27)、F6L9Y10F14 (SAAEAFAKLYAEAFAKG) (SEQ ID NO: 28)、Pal-KTTKS (SEQ ID NO :26)、ESUP-A(NH2-SNKTRIDEANQRATKMLGSG_COOH(SEQ ID NO: 四)、肉毒桿菌毒素A或另外的肉毒桿菌毒素B、C、D、E、F和G(Montecucco等，Curr Opin Pharmacol. 5 :274-9,2005)。在一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明的肽與諸如DNA、單鏈或雙鏈RNA或RNAi的核酸融
口 O易位結(jié)構(gòu)域存在于除HIV Tat蛋白之外的許多不同蛋白中。易位肽的其它來源在本領(lǐng)域眾所周知。例如。HSV-I蛋白VP22(描述于例如WO 97/05265 ；Elliott和0' Hare, Cell 88 :223-233,1997))或非病毒蛋白(Jackson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10691-10695,1992)表現(xiàn)出易位特性。其它適宜的易位肽或運輸肽包括來源于黑腹果蠅觸角足蛋白(Drosophila melanogasterantennapedia) (Antp)同源異型基因轉(zhuǎn)錄因子的肽、 Kaposi成纖維細胞生長因子(MTS)信號序列的h區(qū)和乙型肝炎病毒(HBV)的ft~eS2蛋白 (Kelemen 等，J. Biol. Chem. 277 :8741-8748, 2002)?；蛘?，易位肽是陽離子大分子的多聚體或含有聚精氨酸重復序列的富精氨酸肽。 又一方面，所述肽與脂解肽GKH融合，脂解肽GKH也跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。本發(fā)明提出的其它蛋白易位結(jié)構(gòu)域包括但不限于pentratin-Ι、觸角足蛋白(antermapedia)易位結(jié)構(gòu)域、L-精氨酸寡聚物、D-精氨酸寡聚物、L-賴氨酸寡聚物、D-賴氨酸寡聚物、L-組氨酸寡聚物、D-組氨酸寡聚物、L-烏氨酸寡聚物、D-烏氨酸寡聚物、具有至少6個連續(xù)氨基酸殘基(即L-精氨酸、D-精氨酸、L-賴氨酸、D-賴氨酸、L-組氨酸、D-組氨酸、L-烏氨酸、D-烏氨酸、高精氨酸、N-甲基-賴氨酸、N，N- 二甲基-Lys、N, N, N-三甲基賴氨酸、任何非天然堿性氨基酸 (例如N-I-(2-吡唑啉基)-精氨酸或任何帶有胍基的非天然氨基酸或其組合)的肽；以及其肽類似物。
可通過以本領(lǐng)域已知的任何適宜方式化學偶聯(lián)來連接用于本發(fā)明的肽和易位或運輸序列。許多已知的化學交聯(lián)方法是非特異性的，即它們不將偶聯(lián)點導向轉(zhuǎn)運多肽上的任何特定位點。因此，非特異性交聯(lián)劑的使用可攻擊功能位點或在空間上阻斷活性位點，使得綴合蛋白在生物學上無活性。一種增加偶聯(lián)特異性的方法是通過將化學偶聯(lián)導向在要交聯(lián)的一個或兩個多肽中僅出現(xiàn)1次或幾次的官能團。例如，在許多蛋白中，唯一含有巰基的蛋白氨基酸半胱氨酸僅出現(xiàn)幾次。另外，例如，如果多肽不含賴氨酸殘基，則對伯胺特異性的交聯(lián)試劑對該多肽的氨基端將是選擇性的。使用該方法成功增加偶聯(lián)特異性需要多肽在可被改變而不失去分子的生物活性的分子區(qū)域中具有適當罕見且反應(yīng)性的殘基。fe的制各方法。本發(fā)明的肽可按照常規(guī)技術(shù)在溶液中或在固相支持體上合成。多種自動化合成儀是市售的，可按照已知方法使用。參見例如Mewart和^ung，Solid Phase Peptide Synthesis,第 2 版，Pierce Chemical Co. , (1984) ；Tam 等，J. Am. Chem. Soc. 105 6442，1983 ；Merrifield, Science 232 :341-347,1986 ；以及 Barany 和 Merrifield, The Peptides, Gross 禾口 Meienhofer 編輯，AcademicPress, New York, 1 284 ；Barany 等，Int. J. Peptide Protein Res. 30 :705-739,1987 ；和美國專利第 5，424，398 號，所述每個文獻都通過引用結(jié)合到本文中。固相肽合成方法使用含有0. 1-1. OmMol胺/g聚合物的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。這些用于肽合成的方法使用α -氨基的丁氧基羰基(t-B0C)或9-芴甲氧基羰基(FMOC) 保護。兩種方法都涉及分步合成，由此在每個步驟由肽的C端開始加入單個氨基酸(參見 Coligan 等，Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience，1991，第 9 單兀)。 在完成化學合成后，脫去肽的保護基，即通過用酸在降低的溫度處理(例如液態(tài)HF-10%苯甲醚，在0°C約0. 25至約1小時)肽而脫去t-B0C或FMOC氨基酸保護基，因此從聚合物上切下肽。在蒸發(fā)試劑后，用1 %乙酸溶液將肽由聚合物中萃取出來，然后凍干乙酸溶液，得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物一般可通過例如在kphadex G-15上使用5%乙酸作為乳劑進行凝膠過濾的技術(shù)來純化。凍干柱子的適宜流分將得到均一的肽或肽衍生物，然后其可通過諸如氨基酸分析、薄層層析、高效液相層析、紫外吸收分光光度法、摩爾旋光度、溶解性等標準技術(shù)來鑒定，并通過固相Edman降解定量。或者，可利用多種包含和表達本發(fā)明的肽的表達載體/宿主系統(tǒng)。這些表達載體/ 宿主系統(tǒng)包括但不限于微生物，例如用重組噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌； 用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV;煙草花葉病毒TMV)轉(zhuǎn)染的或用細菌表達載體 (例如Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)。用于表達重組蛋白的哺乳動物宿主系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。可根據(jù)加工所表達蛋白或產(chǎn)生將用于提供蛋白活性的某些翻譯后修飾的特定能力選擇宿主細胞菌株。多肽的這些修飾包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和?；?。不同的宿主細胞，例如CH0、HeLa、MDCK、293、W138等，對這些翻譯后活性具有特定的細胞機器和特征性機制，并可進行選擇，以確保所導入外源蛋白的正確修飾和加工?？捎糜谥亟M蛋白生產(chǎn)的哺乳動物細胞包括但不限于VERO細胞、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、COS細胞 (例如 COS 7)、W138、BHK、H印G2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562 和 293 細胞。下文描述了用于重組表達蛋白的示例性方案。還可以使用市售表達系統(tǒng)，例如畢赤酵母表達系統(tǒng)anvitrogen，San Diego,CA), 按照生產(chǎn)商的說明在酵母中重組表達本發(fā)明的肽。該系統(tǒng)也依賴于前-原-α序列引導分泌，但插入片段的轉(zhuǎn)錄在通過甲醇誘導時由乙醇氧化酶(AOXl)啟動子驅(qū)動。通過例如用于由細菌和哺乳動物細胞上清液純化肽的方法，從酵母生長培養(yǎng)基純化所分泌的肽。或者，所述肽可以在昆蟲系統(tǒng)中表達。用于蛋白表達的昆蟲系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在一個這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)用作在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞和粉紋夜蛾 (Trichoplusia)幼蟲中表達外源基因的載體。將肽編碼序列克隆到病毒的非必需區(qū)如多角體蛋白基因中，并處于多角體蛋白啟動子控制之下。成功插入所述肽將使多角體蛋白基因失活，并產(chǎn)生沒有外殼蛋白包裹的重組病毒。然后使用重組病毒感染肽在其中表達的草地貪夜蛾(S. frugiperda)細胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia)幼蟲(Engelhard 等，Proc Nat Acad Sci 91 :3224-7,1994)。在另一個實例中，編碼所述肽的DNA序列通過PCR擴增，并克隆到適宜的載體如 PGEX-3X(Pharmacia, Piscataway, NJ)中。pGEX載體設(shè)計用于產(chǎn)生由載體編碼的含谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白，和由插入到載體的克隆位點中的DNA片段編碼的蛋白?？僧a(chǎn)生含有例如適宜的切割位點的PCR引物。在融合配偶體僅用于促進表達或不需要連接目標肽的情況下，則可從融合蛋白的 GST部分切下重組融合蛋白?；蛘?，編碼肽的DNA序列可克隆到含有所需啟動子和任選的前導序列的質(zhì)粒中 (參見例如Better等，Science, 240 1041-43，1988)。該構(gòu)建體的序列可通過自動化測序證實。然后使用標準方法如采用CaCl2溫育和細菌熱激處理的標準方法(Sambrook等，出處同上)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株MC1061中。讓轉(zhuǎn)化的細菌在補加羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長，表達蛋白的生產(chǎn)通過在適宜的培養(yǎng)基中生長而誘導。如果存在前導序列的話， 則前導序列將影響本發(fā)明肽的分泌，并在分泌過程中被切除。制劑與給藥涂徑。為了制備用于臨床應(yīng)用的本發(fā)明組合物，必須將本發(fā)明肽制成藥物組合物，即為適合于體內(nèi)應(yīng)用的形式。一般而言，用于臨床應(yīng)用的組合物劑型將必須制備基本無熱源以及基本無對人或動物可能有害的其它雜質(zhì)的組合物。關(guān)于藥物組合物的制備，參見 Remington' s Pharmaceutical Science,第 18 版，Mack Pub 1 ishingCompany, Easton, Pa. (1990)。人們一般需要使用合適的鹽和緩沖液，以使傳遞載體穩(wěn)定和允許被靶細胞吸收。 在將重組細胞給予患者時還將使用緩沖液。本發(fā)明的水性組合物含有對細胞有效量的肽或表達載體，其溶解或分散在藥學上可接受的載體或水性介質(zhì)中。這樣的組合物也被稱為接種物。術(shù)語“藥學上可接受的或藥理上可接受的”是指在給予動物或人時不產(chǎn)生不利的、變態(tài)的或其它不需要的反應(yīng)的分子實體和組合物。本文使用的“藥學上可接受的載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和輔劑在藥物活性劑中的應(yīng)用在本領(lǐng)域眾所周知。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或輔劑與本發(fā)明的載體或細胞不相容，否則包括其在治療組合物中的應(yīng)用。組合物中也可以摻入補充活性成分。本發(fā)明的活性組合物包括經(jīng)典的藥物制劑。本發(fā)明的這些組合物的給藥將經(jīng)由任何普通途徑，只要經(jīng)該途徑可到達靶組織。可通過任何常規(guī)方法將藥物組合物給予受試者， 例如通過靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼球后、口服、透皮或局部遞藥，或通過在特定部位手術(shù)植入。 治療可由單劑或一定時間段內(nèi)的多劑組成?；钚曰衔锟芍瞥膳c表面活性劑如羥丙基纖維素適宜混合的游離堿或藥理上可接受的鹽的水溶液劑。還可以制備在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中的分散液。在普通儲藏和使用條件下，這些制品含有防腐劑，以防止微生物生長。適于注射用的藥物形式包括無菌水性溶液劑或分散液和用于臨時配制無菌注射液或分散液的無菌粉針劑。在所有情況下，所述劑型必須是無菌的，流動性必須達到具有易注射能力的程度，在生產(chǎn)和儲藏條件下必須是穩(wěn)定的，必須針對微生物如細菌和真菌的污染作用進行防腐。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其適宜的混合物和植物油。適宜的流動性例如可通過使用包衣材料如卵磷脂、就分散劑而言通過維持需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑來維持。防止微生物的作用可通過多種抗細菌劑和抗真菌劑來實現(xiàn)，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中使用延長吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)。如下制備無菌注射液將需要量的活性化合物摻入具有以上列舉的多種其它成分的適宜溶劑中，在需要時后接過濾除菌。一般而言，如下制備分散液將多種無菌活性成分摻入無菌溶媒中，所述溶媒含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自以上列舉的所需的其它成分。對用于制備無菌注射液的無菌粉針劑而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)獲得粉末狀活性成分，加上來自其先前過濾除菌溶液的任何其它所需成分。對于口服給藥，本發(fā)明的多肽中可摻混賦形劑，并以不可攝入的漱口水和潔齒劑的形式使用?？蓪⑿枰康幕钚猿煞謸饺脒m宜溶劑如硼酸鈉溶液(Dobell溶液)中，制備漱口水?；蛘?，活性成分可摻入到含硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的無菌洗滌液中?；钚猿煞诌€可以分散在潔齒劑中，包括凝膠劑、糊劑、粉劑和料漿?；钚猿煞挚梢灾委熡行Я考尤氲胶隣顫嶟X劑中，所述潔齒劑可含有水、粘合劑、摩擦劑、調(diào)味劑、發(fā)泡劑和保濕劑。本發(fā)明的組合物可配制成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白的游離氨基形成)，其與無機酸如鹽酸或磷酸形成，或與諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有機酸形成。與游離羧基形成的鹽還可以衍生自無機堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)以及有機堿(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)。在配制時，溶液以和劑型相適的方式并以諸如治療有效的劑量給予。制劑容易以多種劑型給藥，例如注射液、釋藥膠囊劑等。對于以水性溶液劑的胃腸外給藥，例如，必要時溶液劑應(yīng)適宜地緩沖，首先用足量的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑變成等滲的。這些特定水性溶液劑尤其適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥?！皢挝粍┝俊北欢x為分散在適宜載體中的獨立量的治療組合物。胃腸外給藥可如下進行先推注，然后持續(xù)滴注，以保持藥品的治療循環(huán)水平。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易依據(jù)優(yōu)良藥物規(guī)范和個體患者的臨床病況所確定的來優(yōu)化有效劑量和給藥方案。對于局部給藥，提出組合物中含有濃度為約5%至約50%重量/體積的本發(fā)明的一種或多種肽。還提出用于局部給藥的組合物中可含有約10%、約15%、約20%、約25%、 約30%、約35%、約40%或約45%的本發(fā)明肽。還提供本發(fā)明組合物中含有的一種或多種肽的總濃度可為組合物總重量的約0.00001%至約10% (重量/重量)。本發(fā)明組合物中可含有總濃度為約0. 001 %至約5 %、約0. 001 %至約1 %、0. 01 %至約1 %重量/重量的一種或多種肽。給藥頻率取決于藥物的藥代動力學參數(shù)和給藥途徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)給藥途徑和所需劑量確定優(yōu)化的藥物制劑。參見例如Remington，s Pharmaceutical Sciences, 第 18 版(1990，Mack Publ. Co,Easton PA 18042)，第 1435-1712 頁，該文獻通過引用結(jié)合到本文中。這類制劑可影響身體狀況、所給予藥物的穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。 根據(jù)給藥途徑，按照體重、體表面積或器官大小可計算出合適的劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需過多的實驗，尤其是按照本文公開的劑量信息和測定以及在動物和人體臨床試驗中觀測的藥代動力學數(shù)據(jù)，就可以常規(guī)地進行確定適合治療劑量必需的進一步精密計算。通過使用相關(guān)的劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)可以確定合適的劑量。主治醫(yī)師通過考慮改變藥物作用的因素，例如藥物的比活、損傷的嚴重性和患者的反應(yīng)、年齡、身體狀況、體重、性別和飲食、任何感染的嚴重性、給藥時間和其它臨床因素，來確定最后的劑量方案。隨著研究進行，將得到關(guān)于具體疾病和病癥的適宜劑量水平和治療時程的進一步信息。本發(fā)明的這些組合物涉及用于離子電滲療法或電動藥物給藥(ElectroMotive Drug Administration) (EMDA)，該方法是一種利用電流將藥物遞送至受侵襲部位的有效方法，如遞送至關(guān)節(jié)或身體某一很小部位中。該方法是非侵入性的，無痛的，并消除了可在使用口服或注射遞送的藥物時出現(xiàn)的潛在副作用和有害反應(yīng)。透皮給藥可使用標準透皮貼劑、具有用于定期釋放組合物的微處理器的貼劑、具有超聲裝置或電子裝置的顯微針的貼劑進行。通過在有或沒有增強劑的情況下破壞患者皮膚的角質(zhì)層(化學的或非化學的、摩擦劑去除、膠粘劑去除、賽璐玢膠帶、超聲、電流)，也可以將肽組合物用于透皮給藥。與超氧化物歧化酶融合的Tat可穿過角質(zhì)層。還可以使用不同透皮給藥的組合如摩擦和超聲來遞送本發(fā)明組合物?；瘖y品形式。本發(fā)明包括的肽組合物可配制成用于局部應(yīng)用和用于化妝目的應(yīng)用的化妝品。本文使用的術(shù)語“化妝品”是指保護、恢復或增強組織或皮膚外觀的物質(zhì)或制品。 本發(fā)明的化合物和組合物還可以用作改變組織、尤其是改變皮膚的藥物。術(shù)語“改變”用于指本發(fā)明改變其要提供、應(yīng)用或給予的組織的外觀、形態(tài)、特征和/或物理性質(zhì)。形態(tài)的改變可由單獨的下列任一特征或下列各特征的組合反映出來皮膚外觀改善、皮膚柔軟性增加、皮膚飽滿感增加、皮膚紋理增加、皮膚彈性增加和皮膚皺紋形成降低。化妝品的實例包括潤膚乳、洗面乳、潤澤乳、潔面乳等乳液；潤膚霜、按摩霜、清潔霜、化妝霜等霜劑；諸如此類。按照使用者的年齡、性別、預期用途、皮膚受累部分的狀況等，每次應(yīng)用以適宜的劑量或者每天以適宜的頻率將這些化妝品應(yīng)用于皮膚(美國專利6，946，436)。其余的化妝品形式描述于國際化妝品成分辭典和手冊(International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook)第 4卷(第 9 版，2002)。國際化妝品成分辭典和手冊第4卷的公開內(nèi)容通過弓I用結(jié)合到本文中。在一個實施方案中，提出包含本發(fā)明的肽組合物的化妝品可任選地含有其它對皮膚有益的物質(zhì)。這些物質(zhì)包括但不限于雌二醇、孕酮、孕烷醇酮(pregnanalone)、輔酶Q10、甲基磺酰甲烷(methylsolanomethane) (MSM)、銅肽(銅提取物)、浮游生物提取物(磷脂復合物(phytosome))、乙醇酸、曲酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、全反式視黃醇、杜鵑花酸、水楊酸、溴中白雌煉(broparoestrol)、雌麗、雄;I；希二麗(adrostenedione)、雄燒二醇(androstanediol) 等。參見美國專利6，821，524。類固醇一般以低于組合物總重量約2%的濃度存在，而其它皮膚有益物質(zhì)可以較高水平存在，例如高達10%至15%?；瘖y品組合物還可以含有防曬劑，以降低皮膚對有害UV射線的暴露。防曬劑包括常用于阻斷紫外線的那些物質(zhì)。代表性的化合物是PABA衍生物、肉桂酸酯和水楊酸酯衍生物(非阿魏酰水楊酸酯)。例如，可使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮 (也稱為氧苯酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮是市售的，其商品名分別為Parsol MCX和Benzophenone-3。還可以使用Dermascreen。組合物中使用的防曬劑的精確量可隨需要防太陽紫外輻射的保護程度而改變。參見美國專利6，821，524。化妝品溶媒。本發(fā)明的肽還可以含有化妝品可接受的溶媒，作為肽的稀釋劑、分散劑或載體，以便在組合物施用于皮膚時有利于肽的分布。非水溶媒或者除了水之外的溶媒還可包括液體或固體潤膚劑、溶劑、保濕劑、增稠劑和底粉。化妝品可接受的溶媒可占組合物重量的5%至99.9%，并可以在沒有其它化妝品添加劑的情況下構(gòu)成組合物的余下部分?；瘖y品組合物可為以下形式水性溶液劑、水性/醇性溶液劑或油性溶液劑；洗液或血清類型的分散液；無水或親水凝膠劑；液體或半稠液體的乳液，其通過將脂肪相分散在水相中(OMI)或相反(W/0)而制備；或者平滑、半固體或固體稠度的乳劑或凝膠類型的混懸液或乳液。這些組合物可按照本領(lǐng)域眾所周知的通用技術(shù)配制。當本發(fā)明的組合物配制成乳液時，脂肪相的比例可在相對于組合物總重量的 5%-80% (重量)范圍內(nèi)。摻入到乳液形式的組合物中的油、乳化劑和輔助乳化劑選自常規(guī)用于化妝品領(lǐng)域或皮膚病學領(lǐng)域的那些物質(zhì)。乳化劑和輔助乳化劑在組合物中可以在相對于組合物總重量的0.3%至30% (重量)范圍內(nèi)的比例存在。當本發(fā)明的組合物配制成油性溶液劑或凝膠劑時，脂肪相可占組合物總重量的90%以上。本發(fā)明的組合物還可以包含化妝品、藥學或皮膚病學領(lǐng)域常用的添加劑和輔劑， 例如親水或親脂膠凝劑、親水或親脂活性劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、芳香劑、填充劑、殺菌劑、氣味吸收劑和染料或著色劑。這些不同的添加劑和輔劑的用量是在本領(lǐng)域常規(guī)使用的那些量，例如在組合物總重量的0. 01%至10%的范圍內(nèi)。根據(jù)這些添加劑和輔劑的性質(zhì)， 它們可加到脂肪相中，也可加到水相中。可按照本發(fā)明使用的示例性油狀物包括礦物油(液體石蠟)、植物油(燭果油的液體級分、葵花油)、動物油(全氫化角鯊烯)、合成油(辛酸十六/十八烷酯(purcellin oil))、硅油(環(huán)狀聚二甲基硅氧烷)和氟化油(全氟聚醚)。脂肪醇、脂肪酸(硬脂酸)和蠟(固體石臘、巴西棕櫚蠟和蜂蠟)也可以用作脂肪?？墒褂玫娜榛瘎┌ㄓ仓岣视王?、聚山梨醇酯60、PEG-6/PEG-32/硬脂酸甘油酯混合物等。可使用的溶劑包括低級醇，尤其是乙醇和異丙醇以及丙二醇。親水膠凝劑包括羧基乙烯基聚合物(卡波姆)、丙烯酸系共聚物如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酰胺、多糖如羥丙基纖維素、天然樹膠和粘土，作為親脂膠凝劑，代表性的是改性粘土例如膨潤土(bentone)，脂肪酸金屬鹽例如硬脂酸鋁和疏水性二氧化硅，或乙基纖維素和聚乙烯?？纱嬖谟突蛴托晕镔|(zhì)以及潤膚劑，以提供油包水乳劑或水包油乳劑，這很大程度上取決于所用潤膚劑的平均親水-親油平衡值(HLB)。這些潤膚劑的水平以組合物總重量計可在約0. 5%至約50%的范圍內(nèi)。潤膚劑可根據(jù)這些一般化學類別分類為酯、脂肪酸以及醇、多元醇和烴。酯可為單酯或二酯。脂肪酸二酯的實例包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、二聚亞油酸二異丙酯(diisopropyl dimerate)和琥珀酸二辛酯?？山邮艿闹ф溨舅狨グㄈ舛罐⑺?-乙基-己基酯、硬脂酸異丙酯和棕櫚酸異十八烷基酯?？山邮艿娜狨グㄈ齺営退崛惐ズ蜋幟仕崛鹿鹚狨??？山邮艿闹辨溨舅狨グㄗ貦八嵩鹿鸹?、乳酸肉豆蔻基酯、芥酸油酯和油酸十八烷基酯。優(yōu)選的酯包括椰油醇辛酸酯/癸酸酯(椰油醇辛酸酯和椰油醇癸酸酯的混合物)、肉豆蔻基醚乙酸丙二醇酯、己二酸二異丙酯和辛酸鯨蠟酯。適宜的脂肪醇和脂肪酸包括具有10-20個碳原子的那些化合物，例如鯨蠟醇和鯨蠟酸、肉豆蔻醇和肉豆蔻酸、棕櫚醇和棕櫚酸以及硬脂醇和硬脂酸。多元醇中可用作潤膚劑的是直鏈和支鏈烷基多羥基化合物。例如，優(yōu)選丙二醇、山梨醇和甘油。還可以使用聚合多元醇，例如聚丙二醇和聚乙二醇。還尤其優(yōu)選丁二醇和丙二醇作為滲透增強劑?？捎米鳚櫮w劑的代表性烴為那些無論何處具有12-30個碳原子烴鏈的烴，例如礦物油、凡士林、角鯊烯和異構(gòu)烷烴。本發(fā)明的化妝品組合物中的另一類功能成分是增稠劑。增稠劑通常以組合物重量的0. 1% -20%中的任何量存在。代表性的增稠劑是根據(jù)商標卡波姆(Carbopol)可獲得的交聯(lián)聚丙烯酸酯物質(zhì)?？墒褂脴淠z，例如黃原膠、角叉菜膠、明膠、刺梧桐樹膠、果膠和刺槐豆膠。在某些情況下，增稠劑功能可由還用作硅酮或潤膚劑的物質(zhì)實現(xiàn)。例如，超過10厘斯(centistoke)的硅橡膠和諸如硬脂酸甘油酯的酯具有雙重官能性。本發(fā)明的化妝品組合物中可摻入底粉。這些底粉包括白堊粉、滑石粉、高嶺土、淀粉、蒙脫石粘土、化學改性的硅酸鎂鋁、有機改性的蒙脫石粘土、水合硅酸鋁、熱解硅石、辛烯基丁二酸鋁淀粉及其混合物。本發(fā)明的化妝品組合物中也可以摻入其它微量輔助成分。這些成分可包括著色劑、遮光劑和芳香劑。一方面，提出使用椰油脂肪酸的蔗糖酯在水性乙醇溶液中的混合物。諸如蔗糖椰油酸酯的混合物已廣泛用作化妝品和皮膚病用產(chǎn)品中的藥物賦形劑，在親水和親油值為15 的情況下，其具有作為皮膚潤膚劑和保濕劑的性能。使用特定肽的體內(nèi)試驗表明，在蔗糖椰油酸酯中最豐富的蔗糖酯——蔴糖單十二烷酸酯是肽類藥物吸收的有效增強劑(Ahsan等， Int. J. Pharm. 251 :95_203，2003)。這些化學品的特性使蔗糖椰油酸酯成為在本發(fā)明肽組合物的化妝品制劑中用作可能的吸收增強劑的有吸引力的候選物。提出將肽組合物配制成日用或夜用乳霜。應(yīng)用部位包括但不限于面部、前額、嘴周圍、眼睛周圍、眉間部位、頸部、頸至前胸部位、手。使用方法。本發(fā)明的組合物對需要治療的受試者具有廣泛治療用途。一方面，受試者是哺乳動物受試者。在一個相關(guān)方面，受試者是人。一方面，提出本發(fā)明的組合物抑制神經(jīng)遞質(zhì)分泌。組合物可通過阻斷小泡運輸而作用于神經(jīng)肌肉板(neuromuscular plate)，阻斷小泡運輸就阻斷了去甲腎上腺素、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)分泌。另一方面，提出本發(fā)明的組合物用于抑制肌肉收縮。在一個相關(guān)方面，組合物用于減少由肌肉收縮引起的面部皺紋。例如，組合物可作用于具有收縮特性的成纖維細胞和成肌纖維細胞，或用于抑制肌肉收縮過程中的肌動蛋白絲。這些肽可以抑制涉及收縮活性的肌球蛋白肌鈣蛋白復合物或激酶。提出將包含本發(fā)明的肽的組合物應(yīng)用于表現(xiàn)出皺紋或有出現(xiàn)皺紋傾向的面部區(qū)域，例如眼睛、鼻子和嘴巴周圍的區(qū)域，以減低這些部位的皺紋程度，防止形成其它皺紋或更深的皺紋，或者作為預防劑應(yīng)用，以防止在這些部位出現(xiàn)皺紋。另外，所述組合物可在手術(shù)中用作短期肌肉松弛藥，例如芋螺毒素肽。此外，所述肽可以通過影響肌肉絲相互作用和肌肉收縮而用作針對肌肉的肌肉松弛藥。在一個相關(guān)方面，組合物可用于抑制其它類型的肌肉收縮。例如，本發(fā)明的組合物可用于治療肌張力障礙或者運動疾病，其中持續(xù)的肌肉收縮引起扭傷和重復的運動或異常姿勢。不隨意和不時疼痛的動作可累及一塊肌肉、一組肌肉，例如在臂、腿或頸或全身的那些肌肉。肌張力障礙可以是局灶性或多灶性肌張力障礙，包括但不限于瞼痙攣(眼瞼的強迫性閉合)和頭顱肌張力障礙(累及頭、面部和頸的肌肉)。這些病癥的治療可包括給予本發(fā)明的肽和其它藥物，例如降低乙酰膽堿水平的藥物，包括鹽酸苯海索、鹽酸苯扎托品、鹽酸普羅吩胺和鹽酸丙環(huán)定?？墒褂谜{(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)GABA的藥物，包括地西泮、勞拉西泮、氯硝西泮和巴氯芬。其它可給予的藥物包括作用于多巴胺的那些藥物，包括左旋多巴/卡比多巴和溴隱亭、培高利特、普拉克索、羅匹尼羅(ropinerol)、丁苯那嗪和利血平。本發(fā)明提出的非肌張力失調(diào)病癥包括偏側(cè)面肌痙攣或震顫，例如與帕金森病相關(guān)的那些。本發(fā)明的肽可以同一些治療非肌張力失調(diào)病癥的藥物聯(lián)合用藥，這些藥物包括但不限于苯妥英、卡馬西平和氯硝西泮。本發(fā)明的組合物還可以用于治療全身肌肉痙攣或痙攣狀態(tài)，全身肌肉痙攣或痙攣狀態(tài)是指全身上運動神經(jīng)元障礙，以速度依賴性的肌緊張度增加為特征。痙攣狀態(tài)可由于多種病因而出現(xiàn)，包括中風、大腦性麻痹、外傷性腦損傷和多發(fā)性硬化。由痙攣狀態(tài)導致的失能包括疼痛、肌肉痙攣、活動度下降和功能性受損。用于痙攣狀態(tài)的藥物，例如巴氯芬、丹曲林和苯二氮類，可結(jié)合本發(fā)明的肽一起給予，以治療這些障礙或病癥。本發(fā)明的組合物可用于治療多汗癥或過度出汗的病癥，包括面部多汗、腋下多汗 (腋窩出汗)、手掌多汗(手出汗)、腳底多汗和軀干部位出汗。還提出本發(fā)明的組合物可用于增強傷口愈合。在傷口愈合時，組合物可降低傷口愈合過程中的皮膚修復期間產(chǎn)生的皮膚張力，并增加愈合速率和減少瘢痕量。還提出本發(fā)明的組合物可用于加速肌肉修復。一方面，本發(fā)明的肽通過干擾 TGF-β活性而干擾纖維化。纖維化受到首先被轉(zhuǎn)化酶原如弗林蛋白酶活化的TGF-β調(diào)節(jié)。本發(fā)明的組合物還可用于改善組織腫脹的方法，該方法包括使細胞與有效量的組合物接觸的步驟。在一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供改善皮膚外觀的方法，該方法包括局部應(yīng)用含有本發(fā)明的組合物和化妝品可接受的溶媒的化妝品。對于治療應(yīng)用，提出含有本發(fā)明的一種或多種肽的組合物還可以含有第二種藥物。提出這些藥物在同一制劑中同時給予。還提出將所述藥物在單獨的制劑中給予和同時給予，同時是指各藥物彼此在30分鐘內(nèi)給予。另一方面，第二種藥物在給予本發(fā)明的組合物之前給予。之前給予是指在用本發(fā)明的組合物治療之前1周至給予本發(fā)明組合物之前30分鐘的范圍內(nèi)給予第二種藥物。還提出第二種藥物在給予本發(fā)明的組合物之后給予。之后給予是指在給予本發(fā)明組合物之后 30分鐘至給予所述組合物之后1周進行給藥。例如，組合物可含有上下文中記載的有用的第二種藥物。例如，組合物可含有用于治療上述肌肉收縮疾病的第二種藥物。還提出組合物可含有作為神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑的第二種藥物，包括但不限于箭毒、α-銀環(huán)蛇毒素、芋螺毒素、阿庫銨、加拉明(gallamine)、泮庫銨、阿曲庫銨、維庫銨、哌侖西平AF-DX 116 pF-HHSiD、異丙托銨(ipratroprium)、東莨菪堿和阿托品。組合物可含有作為凋亡抑制劑的第二種藥物，包括但不限于氯甲基酮(CMK)、氟甲基酮(FMK) (Morwell Diagnostics, Zurich, Switzerland)、R(_)-丙炔苯丙胺鹽酸鹽、 (-)_石杉堿甲((_)-Huperzine A)、Necrostatin-Ι、抗ARC(具有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡阻抑物)半胱天冬酶1/ICE抑制劑Z-WEHD、半胱天冬酶-IOfmk抑制劑Z-AEVD、半胱天冬酶_13fmk抑制劑Z-LEED、半胱天冬酶_2fmk抑制劑Z-VDVAD、半胱天冬酶_3fmk抑制劑Z-DEVD、半胱天冬酶-4fmk抑制劑Z-YVAD、半胱天冬酶_6fmk抑制劑Z-VEID、半胱天冬酶-8fmk抑制劑Z-IETD、半胱天冬酶_9fmk抑制劑Z-LEHD、泛半胱天冬酶fmk抑制劑如 Z-VAD和Z-VKD以及泛半胱天冬酶抑制劑OPH Q-VD。本發(fā)明的組合物或肽可含有作為用于收縮血管的血管收縮藥的第二種藥物，包括但不限于烏氨加壓素、去甲腎上腺素、腎上腺素、去氧腎上腺素、萘甲唑啉、羥甲唑啉、安他唑啉、內(nèi)皮縮血管肽、血栓烷和α -腎上腺素能激動劑。本發(fā)明的組合物或肽可包含作為止痛藥的第二種藥物，包括但不限于利多卡因和衍生物、普魯卡因、美西律、妥卡尼和氟卡尼、丁卡因、苯佐卡因、辣椒辣素、capzasin-P, menthacin和辣椒辣素乳膏(zostrix)。本發(fā)明的組合物或肽可包含作為抗炎藥的第二種藥物，包括但不限于鎮(zhèn)痛藥，包括NSAID和留族化合物。提出用于本發(fā)明的示例性NSAID選自布洛芬、萘普生、Cox-I抑制劑、Cox-2抑制劑和水楊酸鹽(酯)。提出的示例性留族化合物包括但不限于雄激素、雌激素、孕激素、21-氨基類固醇藥物、糖皮質(zhì)類固醇、留族神經(jīng)遞質(zhì)(神經(jīng)活性類固醇)和本領(lǐng)域已知的其它甾族激素。本發(fā)明還包括一種篩選方法，該方法包括可用于評價本發(fā)明肽對神經(jīng)分泌的作用以及鑒定其它神經(jīng)遞質(zhì)釋放抑制劑的神經(jīng)分泌測定。篩選測定還可以用于評價本發(fā)明組合物的潛在副作用。一方面，用于篩選細胞的神經(jīng)遞質(zhì)分泌抑制劑的方法包括使含有神經(jīng)遞質(zhì)的細胞與候選抑制劑接觸；然后在有和沒有所述抑制劑的情況下，通過測定釋放的神經(jīng)遞質(zhì)量來檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放，其中在存在所述候選抑制劑時的神經(jīng)遞質(zhì)釋放與其不存在時的神經(jīng)遞質(zhì)釋放相比下降，將候選物鑒定為神經(jīng)遞質(zhì)釋放抑制劑。本發(fā)明的肽可用作測定的陽性或陰性對照，由此確定所述候選抑制劑是否類似地作用于本發(fā)明的肽。試劑盒和包裝。作為又一方面，本發(fā)明包括試劑盒，其含有本發(fā)明的一種或多種肽或組合物，這些肽或組合物的包裝方式有利于它們用于實施本發(fā)明的方法。在一個實施方案中，這類試劑盒包含本文描述的化合物或組合物(例如含有單獨的或與第二種藥物、緩沖劑或治療化合物組合的一種或多種本發(fā)明肽的組合物)，它們包裝在諸如密封瓶或密封管的容器中，容器上貼有或包裝內(nèi)附有說明如何應(yīng)用本發(fā)明化合物或組合物實施本發(fā)明方法的標簽。優(yōu)選地，化合物或組合物以單位劑量形式包裝。試劑盒還可以含有適于按照特定給藥途徑給予組合物或?qū)嵤┖Y選測定的裝置。優(yōu)選地，試劑盒含有說明如何應(yīng)用本發(fā)明組合物的標簽。另一方面，將少量的本發(fā)明化妝品組合物，例如1-lOOml，從適宜的容器或涂藥器取出后應(yīng)用于皮膚的裸露部位，必要時，可用手或手指或適宜裝置將其涂抹在皮膚上和/ 或擦在皮膚上。產(chǎn)品可為用作手部或面部治療而專門配制。本發(fā)明的化妝品組合物可配制成洗液、霜劑或凝膠劑。組合物可包裝在合適的容器中，以適合其粘度和預期用途。例如，洗液或霜劑可包裝在瓶子或推進劑驅(qū)動的氣溶膠裝置或配有泵并適于手指操作的容器中。當組合物是霜劑時，其可簡單地儲存在不會變形的瓶子或擠壓容器如管或有蓋的瓶子中。因此，本發(fā)明還提供裝有本文定義的化妝品可接受的組合物的密封容器。提供以下的實施例是為了說明本發(fā)明，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。 實施例實施例1. L-肽和D-肽的合成制備合成肽序列并如下表征。在合成過程中使用的所有氨基酸都是如圖1所示的 L-氨基酸或 D-氨基酸(Calbiochem-Novabiochem AG)。肽的合成。圖1所示的肽(SEQ ID NO 1_23)是通過標準固相Fmoc化學法、在 Applied Biosystems 431A肽合成儀上化學合成的。所述肽使用對烷氧基芐基醇樹脂 (Wang，Bachem, Switzerland)制備，合成中使用了 5倍過量的Fmoc氨基酸衍生物、DCCI和 HOBt作為活化劑和60分鐘偶聯(lián)時間。側(cè)鏈保護基包括三苯基甲基，用于天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和組氨酸(AsruGlruCys和His)；五甲基-色滿-磺?；?，用于精氨酸(Arg)； 叔丁氧羰基，用于賴氨酸和色氨酸(Lys和Trp)；叔丁基，用于天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸和酪氨酸(Asp、Glu, Ser, Thr和Tyr)。肽脫保護后從樹脂上切下來，其方法是肽用 2. 5% H20、5%三乙基硅烷的TFA溶液于室溫處理2小時。在通過過濾去除樹脂后，用叔丁基甲基醚使肽沉淀出來，然后離心，將沉淀重懸浮在50%乙酸中，再凍干。然后對凍干的物質(zhì)實施分析型HPLC和MALDI-TOF MS分析。肽的純化。粗肽用Iml 50%乙酸的H2O溶液重配，低分子量雜質(zhì)通過在kphadex G-25上進行凝膠過濾去除。凍干以空體積洗脫的物質(zhì)，用Iml 50%乙酸的H2O溶液重配，在Vydac柱 (250 X 22讓，10-15 μ m)上進行RP-HPLC。以9ml/分鐘的流速通過0. TFA/乙腈至0. 1% TFA/H20的線性梯度洗脫柱子，在60分鐘內(nèi)從10%到100%流洗。于220nm或280nm監(jiān)測洗脫液的光密度。收集流分，通過MALDI-T0F分析。合并含有預期分子量的肽的流分并凍干。然后對純化的物質(zhì)進行MALDI-TOF MS和在C18 nucleosil柱O50X4mm，5ym)中進行分析型HPLC。該柱以Iml/分鐘通過乙腈至0. 1 % TFA/H20的線性梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)從0%到60%流洗。使用Waters 991光電二極管陣列檢測器于220nm或^Onm進行檢測。
質(zhì)譜。α-氰基-4-羥基肉桂酸購自 Sigma(Sigma Chemical Co. , St. Louis, Mo，USA)。高效液相層析(HPLC)級三氟乙酸購自 Fluka(Buchs, Switzerland), HPLC 級 H2O 得自 Romil Ltd (Amman TechnikSA, Kol liken, Switzerland),乙腈購自 Biosolve Ltd(ChemieBrunschwig, Basel)。所有其它化學品都為最高純度，無需進一步純化即可使用。MS分析使用以延時引出和線性模式操作的Pers印tiveBiosystems MALDI-TOF Voyager DE-RP 質(zhì)譜儀(Framingham, MA, USA)進行。實施例2 逆向逆型異構(gòu)體的合成本發(fā)明的肽可為反向合成的全D氨基酸肽，以防止天然蛋白酶解(即全D逆向逆型肽)(參見美國專利公開號20050106695)。本發(fā)明的全D逆向逆型肽提供了具有類似于天然肽的功能特性的肽。用于合成D氨基酸鏈以形成逆向逆型肽的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如 Jameson 等，Nature 368 :744-46,1994 ；Brady 等，Nature368,692-93,1994 ；Guichard 等， J. Med. Chem. 39 2030-39，1996。具體地說，逆向肽通過經(jīng)典的F_moc合成產(chǎn)生，通過如上所述的質(zhì)譜進一步分析。它們通過HPLC純化。示例性的逆向逆型肽使用Rnoc化學合成，9R-D肽(GYGRRRRRRRRRG) (SEQ ID NO 13)被 9Rrev-D 肽(GRRRRRRRRRGYG) (SEQ ID NO 14)取代。實施例3 神經(jīng)遞質(zhì)分泌的評價 分化和神經(jīng)遞質(zhì)分泌測定。為了評價本發(fā)明的肽對神經(jīng)遞質(zhì)分泌的效力，首先建立了研究小泡神經(jīng)遞質(zhì)釋放的功能性實驗模型。大鼠嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞系，來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤[Greene等，Proc Natl Acad Sci USA，73 :2424_8，1976]，常常用作神經(jīng)分泌細胞和神經(jīng)元細胞的體外模型(Greene 等，Proc Natl AcadSci USA, 73 :2424-8,1976 ；Tischler 等，Lab Invest. 39 77-89，1978)。因為PC12細胞在刺激時顯示出小泡兒茶酚胺釋放(Chen等，AmJ Physiol, 266 :C784-93,1994)，并使用在突觸神經(jīng)傳遞中有功能的相同保守機器(Burgoyne等，Arm N Y Acad Sci，710 :333-46,1994 ；Burgoyne 等，Trends Neurosci,18 191-6，1995 ；Burgoyne 等，Bioessays, 20 =328-35,1998)，所以選擇該細胞作為神經(jīng)分泌測定的模型系統(tǒng)。P12細胞的增殖和培養(yǎng)。可獲得大量截然不同的PC12細胞系。其中許多表現(xiàn)出聚集傾向性，并表現(xiàn)出較差的細胞培養(yǎng)特性，包括高度可變的乙酰膽堿合成和培養(yǎng)物之間的極端異質(zhì)性，有關(guān)綜述參見Martin等，Methods Cell Biol. 71 :267_86，2003。因此，對P12 細胞系(PC12 ES)需要的特性進行了詳細表征。如下所述，獲得了適用于該細胞系的生長條件。PC12細胞系的分化使用PC12-ES細胞作為對照，對神經(jīng)突增生進行了分析。對于兩種細胞系，在存在神經(jīng)生長因子(NGF，50ng/ml)或蛋白激酶抑制劑星孢菌素(STSP， IOOnM)的情況下進行分化(Hashimoto 等，Exp Cell Res. 184 :351-9,1989 ；Hashimoto 等， JNeurochem. 53 1675-85，1989)。在完全 Dulbecco 培養(yǎng)基(DMEM-CM)和僅補加馬血清的DMEM高葡萄糖(DMEM-DM)中測定PCl2-ES細胞的分化。為在NGF或STSP存在下檢驗PC12細胞系的分化形態(tài)，通過相差顯微鏡監(jiān)測細胞， 并在加入分化誘導物后以不同的間隔(1-7天)獲取圖片。PC12-ES細胞在用STSP誘導后有效分化。細胞在DMEM-CM培養(yǎng)基中于M小時內(nèi)長出神經(jīng)突，或者在DMEM-DM中于48小時內(nèi)長出神經(jīng)突。在加入神經(jīng)生長因子(NGF) 24小時后還觀察到PC12-ES終末分化，但僅在DMEM-DM中才觀察到。PC12-ES細胞系在無血清培養(yǎng)基中響應(yīng)NGF而分化完成天)。 不過，NGF對細胞的作用在復雜培養(yǎng)基中較慢天)。在未加入NGF或STSP的對照樣品中，未觀察到神經(jīng)突增生。這些結(jié)果表明，未處理的PC12細胞有助于分裂但不分化，保持圓形形態(tài)，沒有神經(jīng)突延伸。PC12-ES的神經(jīng)遞質(zhì)分泌。PC12細胞為研究受調(diào)節(jié)的分泌提供了眾多優(yōu)勢。在這些細胞中，致密核心大泡(LDCV)的胞吐作用易于根據(jù)預先標記的細胞的放射性去甲腎上腺素([3HjNE)釋放來測定[Greene 等，Brain Res, 129 :247-63,1977 ；Greene 等，J Neurochem, 30 :579-86,1978 ；Greene 等，J Neurochem. 30 :549-55,1978 ；Greene 等，Brain Res. 138 :521-8 ；1977 ；Greene 等，Nature 268 :349-51，1977]。通過用 PC12-ES 細胞檢測 [3HJNE激發(fā)的分泌，進行了神經(jīng)分泌測定。測試了不同的分泌緩沖液(例如鈣分泌緩沖液 CaSB和CaSB-葡萄糖)和促分泌素(80mM鉀、0. ImM煙堿或ImM卡巴膽堿(Carbachol)；參見表1)，促分泌素定義為引起或刺激分泌的物質(zhì)。用未分化的PC12細胞以及NGF或STSP 分化細胞，測定了 [3H]NE激發(fā)的分泌。PC12-ES細胞未經(jīng)處理、用STSP(IOOnM)處理48小時，或者用NGF(50ng/ml)處理 48小時，然后加載[3H]NE，并為釋放檢測做準備。然后用鉀(80mM)、煙堿(0. ImM)或卡巴膽堿(ImM)刺激細胞15分鐘。收集培養(yǎng)基，通過液體閃爍計數(shù)測定釋放的[3H]NE以及總細胞含量。用不含促分泌素的鈣分泌緩沖液(CaSB)或補加IlmM葡萄糖的CaSB (CaSB-葡萄糖)測量基礎(chǔ)分泌。數(shù)據(jù)在表1中表示為分泌百分率[釋放量/(釋放量+細胞裂解物中的量)]X 100。凈分泌是促分泌素刺激的釋放減去基礎(chǔ)釋放。存在相當大的[3H]NE誘發(fā)釋放(表1)，這些結(jié)果與文獻報告的結(jié)果(Avila等，Mol Pharmacol. 64 =974-86,2003)相一致。在所有測試條件下，[3H]NE的釋放百分率都是可檢測的。未分化的細胞表現(xiàn)出的[3H]NE載荷低于分化細胞，但主要缺點的是，這些細胞對天然神經(jīng)遞質(zhì)分泌抑制劑如肉毒桿菌神經(jīng)毒素無反應(yīng)。因此，以后的試驗都用分化的PC12-ES 細胞進行。表 1
促分泌素未分化細胞NGF分化細胞STSP分化細胞CaSB9. 5%14%21. 7%CaSB-高 K+42%24%44. 3%CaSB-煙堿40. 3%21%47. 8%CaSB-卡巴膽堿44. 7%27%46. 5%CaSB-葡萄糖21. 3%12%18. 5%CaSB-葡萄糖高K+46. 5%15. 9%48. 5%
權(quán)利要求
1.一種合成肽，含有與SEQ ID NO :13有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的合成肽，其中所述氨基酸序列如SEQID NO :11或15所示被乙?；?br> 3.權(quán)利要求1的合成肽，其中所述氨基酸序列包含 i)所需氨基酸的L-對映體；或 )所需氨基酸的D-對映體；或iii)所需氨基酸的L-對映體或D-對映體的混合物。
4.權(quán)利要求1-3任一項的合成肽，其中所述氨基酸序列是肽SEQIDN0:ll、13或15的逆向逆型異構(gòu)體。
5.權(quán)利要求1-4任一項的合成肽，其中所述合成肽是融合肽。
6.權(quán)利要求1-5任一項的合成肽，其中所述氨基酸序列與蛋白、核酸或脂解肽GKH融I=I O
7.權(quán)利要求1-6任一項的合成肽在制備用于治療疾病的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1-6任一項的合成肽在制備用于治療多汗癥、肌張力障礙、局灶性肌張力障礙、非肌張力障礙性疾病、側(cè)面肌痙攣或震顫、與帕金森病相關(guān)的側(cè)面肌痙攣或震顫、炎癥和疼痛的藥物中的用途。
9.一種純化和分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求1-6任一項的合成肽的核苷酸序列。
10.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求9的多核苷酸。
11.一種分離的宿主細胞，所述宿主細胞由權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化。
12.—種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-6任一項的合成肽，為水包油乳劑或油包水浸漬液。
13.權(quán)利要求12的組合物在制備用于改善皮膚外觀的藥物中的用途。
14.權(quán)利要求13的組合物的用途，其中所述組合物還包含化妝品可接受的溶媒。
15.權(quán)利要求14的組合物的用途，其中所述組合物還包含防曬劑。
16.權(quán)利要求13-15的組合物的用途，其中所述皮膚是衰老的、光老化的、干燥的、有條紋的或起皺紋的皮膚。
17.權(quán)利要求1-6任一項的合成肽在制備用于肌肉松弛的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了涉及阻斷神經(jīng)遞質(zhì)分泌并誘導肌肉松弛的合成肽的材料和方法，以及所述肽作為神經(jīng)遞質(zhì)分泌和肌肉收縮的抑制劑和作為肌肉松弛誘導物的用途。
文檔編號C07K7/08GK102408470SQ20111036214
公開日2012年4月11日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日
發(fā)明者A·庫恩迪希, N·費塞爾 申請人:洛桑大學