本發(fā)明涉及利用離心力用于處理和移動(dòng)液體的流控裝置的領(lǐng)域，更具體地涉及在這樣的裝置中轉(zhuǎn)移珠的方法。優(yōu)選的使用領(lǐng)域在對(duì)樣品中存在的化合物進(jìn)行分析的分析方法中。當(dāng)其中發(fā)生流控或微流控處理的分析裝置(芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip))結(jié)合離心機(jī)(并且優(yōu)選提供用于相對(duì)于所施加的離心力方向來(lái)改變分析裝置取向的裝置的離心機(jī))使用時(shí)，有利地使用所述轉(zhuǎn)移方法。

背景技術(shù)：

在關(guān)于適用于流控或微流控芯片或盒(cartridge)的分析方法的研究中構(gòu)想了根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)移珠的方法。為了更好地理解本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，下面詳細(xì)描述這樣的分析方法。

某些物質(zhì)或分析物的常見(jiàn)分析方法涉及使用將與靶物質(zhì)或分析物選擇性結(jié)合的固相，所述靶物質(zhì)或分析物通常為生物標(biāo)志物。在一些測(cè)定中，固相可以在其表面攜帶和展示特異性捕獲分子(capturing molecule)，其將特異性地結(jié)合生物標(biāo)志物。為了檢測(cè)和定量所述生物標(biāo)志物，固相-生物標(biāo)志物復(fù)合體也可與附著于一種或更多種示蹤物質(zhì)的另一組生物標(biāo)志物特異性結(jié)合分子反應(yīng)，形成固相-生物標(biāo)志物-示蹤物復(fù)合體。在另一些測(cè)定(例如競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定)中，樣品中的生物標(biāo)志物將與確定量的攜帶示蹤物質(zhì)的生物標(biāo)志物競(jìng)爭(zhēng)與固相的結(jié)合。有多種方法來(lái)安排和使用所涉及的特異性黏合劑和靶分析物，包括多種類(lèi)型的固相材料和示蹤物質(zhì)。

在許多分析系統(tǒng)中，固相包含固定的實(shí)施方案，例如腔(微量滴定板孔或微通道或微腔)的壁，或固定的結(jié)構(gòu)，例如柱狀物或多孔膜，其上附著有與生物標(biāo)志物(例如，抗原)互補(bǔ)的捕獲分子(例如，抗體)。在其與靶生物標(biāo)志物結(jié)合時(shí)，含靶生物標(biāo)志物的樣品側(cè)向或橫向流過(guò)多孔膜是優(yōu)選的固相理念。這是因?yàn)樵谶@些膜中表面體積比非常大，允許大幅過(guò)量的捕獲分子(例如抗體)且因此非常高效地結(jié)合靶生物標(biāo)志物的事實(shí)。但是，這些膜難以清洗，特別是當(dāng)示蹤物是納米顆粒或其團(tuán)塊時(shí)。這種困難由示蹤物質(zhì)在膜內(nèi)的口袋樣結(jié)構(gòu)中非特異性結(jié)合或包埋(entrapment)引起。

在另一些分析系統(tǒng)中，固相可有利地為聚合物材料制備的球形納米級(jí)或微米級(jí)顆粒，其暴露大的表面積。

示蹤物是可以通過(guò)光學(xué)、化學(xué)、電學(xué)、磁性、放射性手段或其組合來(lái)檢測(cè)和測(cè)量的任何類(lèi)型的物質(zhì)。另外，示蹤物質(zhì)也可以配制成顆?；蚺c顆粒締合。通常通過(guò)光學(xué)手段使用和檢測(cè)的這樣的顆粒包括金屬膠體(金、銀、鐵等)，量子點(diǎn)，含有或攜帶染料或熒光染料(fluorochrome)的聚合物(乳膠)顆粒，攜帶信號(hào)產(chǎn)生分子(包括酶)的聚合物、二氧化硅(silica)或其他顆粒，或無(wú)機(jī)晶體，例如升頻轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticle，UCNP)。用作示蹤物質(zhì)或載體的顆粒通常在納米范圍內(nèi)，通常為2nm至200nm，但是在一些情況下也可使用高至100μm的更大顆粒。分別附著于固相和示蹤物質(zhì)的生物標(biāo)志物特異性分子可以是例如抗體，其將與靶生物標(biāo)志物特異性結(jié)合，后者然后稱(chēng)為抗原?？贵w的常用替代物包括核酸探針、親和素/鏈霉親和素、凝集素和適配體以及將識(shí)別和特異性結(jié)合于配體(即，分析物或分析物的一部分)的限定分子結(jié)構(gòu)的任何(生物)受體。事實(shí)上，自然界中所有蛋白質(zhì)中的大部分或多或少地與一些配體特異性相互作用，所述配體可以是大分子的限定結(jié)構(gòu)或小分子。通常來(lái)說(shuō)，結(jié)合的特異性和親和力越高，受體配體系統(tǒng)越適合于設(shè)計(jì)分析測(cè)定。為了定量固相-生物標(biāo)志物-示蹤物質(zhì)復(fù)合體(在下文中也稱(chēng)為可定量珠復(fù)合體)，示蹤物質(zhì)必須表現(xiàn)出某些允許鑒定和測(cè)量的特性。光學(xué)讀出系統(tǒng)通常特別方便，因?yàn)闄z測(cè)器可置于測(cè)定裝置外面。光學(xué)示蹤物質(zhì)的特性包括通過(guò)透射比或反射比測(cè)量的光吸收、光散射以及光衍射和發(fā)光現(xiàn)象，如化學(xué)發(fā)光、熒光、升頻轉(zhuǎn)換磷光(upconversion phosphorescence)等，包括其組合。在測(cè)量顏色、發(fā)光(例如熒光和磷光)、衍射、等離子體效應(yīng)等時(shí)，通常涉及這些現(xiàn)象。

在大部分異質(zhì)型分析測(cè)定中，首先允許靶生物標(biāo)志物與固相和過(guò)量的示蹤物質(zhì)反應(yīng)。然后，通過(guò)洗滌除去未與固相特異性結(jié)合的示蹤物質(zhì)。

為了使靶生物標(biāo)志物分別結(jié)合于固相和示蹤物質(zhì)，其將必須直接互相作用。利用高親和力黏合劑，反應(yīng)物(即，生物標(biāo)志物、固相和示蹤物質(zhì))相互作用或碰撞越頻繁，結(jié)合反應(yīng)越快。因此，為了獲得快速測(cè)定，應(yīng)建立具有高親和力和特異性結(jié)合物質(zhì)的非常高的局部濃度的反應(yīng)條件。為了建立這樣的條件，固相應(yīng)暴露擠滿(mǎn)特異性高親和力受體分子的大表面積。同樣地，攜帶第二組特異性和高親和力受體分子的示蹤物質(zhì)應(yīng)以高濃度存在。納米顆粒和微顆粒的懸液暴露大的表面積體積比，類(lèi)似于多孔結(jié)構(gòu)，例如多孔膜。應(yīng)當(dāng)應(yīng)用將進(jìn)一步促進(jìn)所涉及反應(yīng)物之間的碰撞的流控運(yùn)動(dòng)。這樣的運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)溫和加熱和攪拌來(lái)獲得，但是更優(yōu)選通過(guò)使樣品和試劑(在非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的情況下，包括示蹤物質(zhì))通過(guò)/流過(guò)固相來(lái)獲得。因此，在設(shè)計(jì)高效的結(jié)合測(cè)定中，流過(guò)固相材料如多孔膜、微通道、微柱結(jié)構(gòu)或堆疊顆粒的液體是優(yōu)選的。

與前段中的討論相同的考慮同樣好地適用于競(jìng)爭(zhēng)性異質(zhì)測(cè)定。在這樣的測(cè)定中，固相暴露擠滿(mǎn)結(jié)合和標(biāo)記的生物標(biāo)志物的大表面積。

由于若干原因，球形微顆粒和納米顆粒作為固相材料通常是優(yōu)選的：

·顆粒具有非常大的表面積體積比

·顆粒以批次高效官能化，因此可以混合形成均勻懸液。

·顆粒懸液可以以等分試樣分配，所述等分試樣可直接以液體形式使用，或者可以配制成干等分試樣，例如片劑或凍干球。

·顆?？梢载?fù)載有為顆粒添加獨(dú)特特征的材料，或者由所述材料制成。這包括獨(dú)特光學(xué)特征，例如光吸收、光散射、光發(fā)射度(發(fā)光)等，以及磁性、放射性、催化/酶特性、電化學(xué)特性和其他可測(cè)量特性。

·當(dāng)懸浮時(shí)，顆粒可以在微流控系統(tǒng)中運(yùn)輸。

·顆?？梢耘c溶液中的樣品高效混合。

·可以通過(guò)重力、離心、過(guò)濾、磁力(磁性顆粒)或電力或其組合將懸液中的顆粒與溶液分離。

·根據(jù)顆粒相對(duì)于所述顆粒分散于其中的介質(zhì)的密度，顆粒可以沉積、保持懸浮或漂浮。

·顆?？梢灾苽涑蓡畏稚⒑屯耆蛐危銮蛐螢槎嗫椎幕蚓邿o(wú)孔的光滑固體表面。

·顆?？梢远逊e或堆疊在多種容器(包括柱)中。

·顆粒可以是不透明的(有色的)或基本上透明的，允許與多種基于光的測(cè)量系統(tǒng)相容并在其中使用。

·當(dāng)緊湊的單分散顆粒堆疊在過(guò)濾器上，如在柱中，其可以形成具有規(guī)則的和限定的間隔的多孔晶格結(jié)構(gòu)。液體可以以受控的和可再現(xiàn)的方式流過(guò)這樣的柱。

使分析物和任選的示蹤物質(zhì)(在非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的情況下)與附著在固相顆粒表面的固定的捕獲分子相互作用的最高效方式是將顆粒以柱的形式堆積在過(guò)濾器或狹縫上，并且允許含有分析物和/或試劑(如示蹤物質(zhì))的溶液通過(guò)顆粒的柱。這可以按順序并且在重復(fù)步驟中進(jìn)行，或者可以通過(guò)應(yīng)用分析物和示蹤物質(zhì)兩者的混合物并且使其在一個(gè)步驟中通過(guò)。

在反應(yīng)步驟或結(jié)合步驟之后，將溶液與固相分離并且洗滌固相以除去剩下的過(guò)量示蹤物質(zhì)、標(biāo)記的未結(jié)合分析物(在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中)等，以獲得一致和準(zhǔn)確的分析。

從使用微流控芯片的分析方法知道了使用珠柱以獲得珠與多種示蹤物質(zhì)和/或分析物之間的高效相互作用。

US 2009/0104077A1公開(kāi)了在微流控芯片中進(jìn)行ELISA測(cè)定(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)的方法。所公開(kāi)的微流控芯片具有流體回路，其包含填充有作為固相的珠的柱結(jié)構(gòu)。ELISA型反應(yīng)通過(guò)首先形成珠-生物標(biāo)志物-酶標(biāo)記抗體復(fù)合體來(lái)在柱結(jié)構(gòu)中的珠上進(jìn)行。然后通過(guò)施加離心力使洗滌液流過(guò)柱來(lái)除去過(guò)量的酶標(biāo)記抗體。所述方法的重要特征是使相同洗滌流體再循環(huán)通過(guò)所述柱多次以獲得改善的洗滌步驟的能力。在清潔或洗滌步驟之后，將生色物質(zhì)施加到酶標(biāo)記的復(fù)合體中，并且產(chǎn)生的顏色可以例如在柱結(jié)構(gòu)中測(cè)量。柱結(jié)構(gòu)的至少一端結(jié)束于受限通道，防止固相珠從柱中流出。

WO 2011/081530A1公開(kāi)了用于分析測(cè)試樣品(例如，生物樣品，如全血)的處理盒(processing cartridge)(即，流控或微流控芯片)。所述盒適用于離心分析儀器。所述盒可包含描述為捕集器(trap)的特定流體回路元件。這樣的元件用于形成固相顆粒(珠)的柱，其中在流體流過(guò)所述柱的同時(shí)顆?？梢员Ａ?。通過(guò)相對(duì)于盒適當(dāng)?shù)馗淖兪┘拥碾x心力的方向，含有與固相顆粒反應(yīng)的多種反應(yīng)物(例如生物標(biāo)志物和示蹤物質(zhì))的流體重復(fù)地通過(guò)柱。捕集器的設(shè)計(jì)避免了使用過(guò)濾器或狹窄流體路徑來(lái)獲得顆?；蛑榈闹Ｍㄟ^(guò)重復(fù)洗滌顆粒來(lái)獲得除去過(guò)量試劑。因此，通過(guò)引用并入了捕集器及其使用的描述，以及具有流體回路的微流控芯片的理念，其中包含分析物和多種任選試劑和溶劑的樣品通過(guò)所述回路的移動(dòng)可以通過(guò)使用離心力來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在另一些測(cè)定系統(tǒng)中，使用鐵磁性顆粒作為固相以有助于洗滌或分離步驟。然后臨時(shí)用磁鐵將顆粒拉到反應(yīng)容器的一個(gè)壁并且在其與液體分離時(shí)扣留它們。當(dāng)反應(yīng)容器遠(yuǎn)離磁鐵時(shí)，顆粒自由地重懸在溶液中。但是，磁性顆粒由于含有鐵磁性材料而是光學(xué)致密的，因此將顯著熄滅光學(xué)讀出。由于這個(gè)原因，鐵磁性顆粒不適合在測(cè)定中與結(jié)合于顆粒的示蹤物標(biāo)記組合使用。

在樣品分析的技術(shù)領(lǐng)域中，例如生物標(biāo)志物的分析中，在測(cè)定中固定固相和可移動(dòng)的固相兩者的使用均是已知的。本發(fā)明尤其涉及在具有流體回路的微流控芯片(即，處理盒)中使用這樣的測(cè)定，可使用離心力使包含分析物和多種任選試劑和溶劑的樣品通過(guò)所述回路。這樣的微流控芯片公開(kāi)在例如Schultz等.Clin.Chem.1985，31，1457、美國(guó)專(zhuān)利no.488763以及上述專(zhuān)利申請(qǐng)US 2009/0104077A1和WO 2011/081530A1中。

在異質(zhì)型分析測(cè)定中，過(guò)量未結(jié)合示蹤物質(zhì)與結(jié)合于固相的示蹤物質(zhì)的高效和可再現(xiàn)分離(洗滌)對(duì)于可靠的分析結(jié)果是必要的。在高靈敏度分析中，高效的洗滌特別重要。

與具有光滑表面的固相如在孔壁、微柱或球形顆粒上可得到的那些相比，具有多孔結(jié)構(gòu)的固相如多孔膜更難以高效地洗滌。但是，包含緊密堆積成柱的球形顆粒(例如，珠)的固相在高效和可再現(xiàn)洗滌方面具有與多孔膜中遇到的那些相同的一些困難。堆積的柱中珠的緊密相互作用提供了臨時(shí)多孔結(jié)構(gòu)(即，由于珠之間形成的空隙)，其中未結(jié)合的示蹤物質(zhì)(即，未結(jié)合至固相的示蹤物質(zhì))容易以非特異性方式捕獲在所述臨時(shí)多孔結(jié)構(gòu)中。在現(xiàn)有技術(shù)中，通過(guò)使洗滌液通過(guò)柱來(lái)洗滌這樣的柱。但是，即使將這樣的洗滌重復(fù)多次(參考US 2009/0104077A1的公開(kāi)內(nèi)容)，至少一些未結(jié)合的示蹤物質(zhì)將保持捕獲在多孔結(jié)構(gòu)中并隨后對(duì)測(cè)定的再現(xiàn)性和靈敏度具有不利影響。

在流控或微流控芯片中進(jìn)行的現(xiàn)有技術(shù)分析方法中，其中所施加的離心力任選地用于移動(dòng)珠或固相顆粒通過(guò)內(nèi)部流體回路，它們的共同特征是所述珠或固相顆粒在與離心力相同的方向移動(dòng)。該特征對(duì)內(nèi)部流體回路的可能設(shè)計(jì)具有限制和約束。

本發(fā)明涉及在包含內(nèi)部流體回路的流控或微流控芯片中轉(zhuǎn)移珠或固相顆粒的方法，其避免或減輕現(xiàn)有技術(shù)的至少一些缺點(diǎn)。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及在包含內(nèi)部流體回路的流控或微流控芯片中轉(zhuǎn)移珠或固相顆粒的方法，其避免或減輕現(xiàn)有技術(shù)的至少一些缺點(diǎn)。所述方法由所附權(quán)利要求和下文中限定：

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在包含內(nèi)部流體回路的流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法，其中多種反應(yīng)物通過(guò)所述內(nèi)部流體回路的移動(dòng)可以通過(guò)使用離心力來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中至少一種反應(yīng)物是珠，所述方法包括以下步驟：

-在包含至少第一出口的所述流體回路的節(jié)段中提供密度等于或小于m1的珠；

-向所述流體回路的所述節(jié)段中提供第一液體介質(zhì)，所述液體介質(zhì)的密度為d2，使得d2＞m1；以及

-施加離心力，使得所述珠在所述離心力的相反方向上移動(dòng)。

在流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述珠朝向所述第一出口移動(dòng)。

在流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：

-通過(guò)改變所述離心力的方向?qū)⑺鲋檗D(zhuǎn)移出所述節(jié)段，優(yōu)選地使得通過(guò)所述第一出口傾析所述珠。

在流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述流控芯片設(shè)置在能夠提供所述離心力的離心機(jī)中。

在流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述流控芯片是微流控芯片。

在流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于內(nèi)部流體回路所述離心力的方向可以在至少兩個(gè)不同的方向上變化。

在流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)物包含含有一種或更多種分析物的樣品。

在所有實(shí)施方案中，所述流控芯片可有利地為微流控芯片。但是，在一些情況下，預(yù)期體積在ml范圍中的流控芯片可以是優(yōu)選的。

第一液體介質(zhì)可以按原樣提供，或者可以通過(guò)將高密度或低密度液體添加到或?qū)⒏呙芏裙腆w溶解在已經(jīng)存在于該節(jié)段中的液體介質(zhì)中來(lái)獲得所需的密度。換句話(huà)說(shuō)，當(dāng)提供一定密度的液體介質(zhì)時(shí)，不一定需要向該節(jié)段添加液體介質(zhì)，而是可以通過(guò)改變已經(jīng)存在于該節(jié)段中的液體介質(zhì)的密度來(lái)提供。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“流控芯片”旨在涵蓋包含內(nèi)部流體回路的任何類(lèi)型的芯片或盒，其中包含珠和含有至少一種分析物之樣品的多種反應(yīng)物通過(guò)所述內(nèi)部流體回路的移動(dòng)可以通過(guò)使用離心力來(lái)實(shí)現(xiàn)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1a-1k是示出了在適用于本發(fā)明的分析方法中使用的步驟的示意圖。

圖1l-1p是示出了本發(fā)明(即用于在微流控回路中移動(dòng)珠的方法)的示意圖。本發(fā)明可有利地與本文中所述的分析方法組合。

圖2a-2b是示出了用于在流體回路中分離不同密度的珠的發(fā)明構(gòu)思的示意圖。

圖3是示出了適用于根據(jù)本發(fā)明的方法的微流控回路的進(jìn)一步細(xì)節(jié)的示意圖。

發(fā)明詳述

術(shù)語(yǔ)定義

本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“分析物”應(yīng)理解為包括可在根據(jù)本發(fā)明的方法中定量或定性地測(cè)定的任何化合物。特別地，術(shù)語(yǔ)“分析物”旨在包括可用作生物體(優(yōu)選人體)的特定疾病狀態(tài)或一些其他生理狀態(tài)的指示物(即，生物標(biāo)志物)的任何化合物。生物標(biāo)志物可例如是貧血的生物標(biāo)志物，例如紅細(xì)胞生成素(EPO)鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTrR)、葉酸(葉酸鹽)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白、維生素B12；骨疾病的生物標(biāo)志物，例如堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素、甲狀旁腺激素(PTH)、骨特異性堿性磷酸酶(BSAP)、1,25二羥基維生素D、C末端I型膠原蛋白端肽(CTx)、25羥基維生素D、N末端I型膠原蛋白端肽(NTx)；心臟病的生物標(biāo)志物，例如載脂蛋白E(Apo E)、腦鈉肽(BNP)、LDH、CK、CKMB、Pro-B型利尿鈉肽(Pro-BNP)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、CRPh(超靈敏)；糖尿病的生物標(biāo)志物，例如C肽、HbA1c、IA-2抗體、胰島素、果糖胺、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-1)、胰高血糖素、微量白蛋白、葡萄糖、前胰島素、抗體；與內(nèi)分泌學(xué)有關(guān)的生物標(biāo)志物，例如甲胎蛋白(Alpha-Foetoprotein)、生長(zhǎng)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、生長(zhǎng)釋放因子(GRF)、皮質(zhì)酮、催乳素、皮質(zhì)醇、睪酮、卵泡刺激素(FSH)；與胃腸病有關(guān)的生物標(biāo)志物，例如胃泌素、脂肪酶；與感染性疾病有關(guān)的生物標(biāo)志物，例如抗Borrelia、抗Rubella、抗HBs、抗HBc、抗Anti-HBe、抗HCV、抗HIV I/II以及感染原的其他抗體，以及作為感染原的一部分的特定抗原，例如HIV-p24、HBsAg等；與炎癥/免疫力有關(guān)的生物標(biāo)志物，例如免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM、IgE、IgD及其子類(lèi))、簇集素(載脂蛋白J)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、CRPh(超靈敏)、前降鈣素(PCT)、肝素結(jié)合蛋白(HPB)、鈣防衛(wèi)蛋白、人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運(yùn)載蛋白/中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(HNL/NGAL)、內(nèi)皮肽-1、纖維蛋白原、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)、IFNγ誘導(dǎo)的單核因子(MIG/CXCL9)、IFN-α、新蝶呤、IFNγ(IL-2、IL-4、IL-10)-4-plex、IL-10、IL-10(IL-2、IL-4、IFNγ)-4-plex、IL-1β、Rantes/CCL5、IL-2(IL-4、IL-10、IFNγ)-4-plex、IL-4(IL-2、IL-10、IFNγ)-4-plex、腫瘤生長(zhǎng)因子(TGF-β1)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNFα)、IL-8；與脂類(lèi)代謝有關(guān)的生物標(biāo)志物，例如載脂蛋白AI(Apo AI)、膽固醇、載脂蛋白AII(Apo AII)、HDL-膽固醇、載脂蛋白B-100(Apo B)、LDL-膽固醇、載脂蛋白B48(Apo B48)、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)、載脂蛋白CII(Apo CII)、對(duì)氧磷酶(PON1)、載脂蛋白CIII(Apo CIII)、磷脂酰肌醇聚糖F(PIGF)、載脂蛋白E(Apo E)、甘油三酯；與腎臟學(xué)有關(guān)的生物標(biāo)志物，例如α-GST、β-2-微球蛋白(血清)、微量白蛋白、β-2-微球蛋白(尿)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、肌酸酐；與腫瘤學(xué)有關(guān)的生物標(biāo)志物，例如糖類(lèi)抗原19-9(CA19-9)、前列腺特異性抗原(PSA)、致癌胚胎抗原(CEA)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFb)；以及與甲狀腺病癥有關(guān)的生物標(biāo)志物，例如抗甲狀腺過(guò)氧化物酶Ab(TPO)、促甲狀腺激素(TSH)、抗甲狀腺球蛋白Ab、總甲狀腺素(T4)、游離甲狀腺素(FT4)、總?cè)饧紫僭彼?T3)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、TSH受體Ab和甲狀腺球蛋白。

術(shù)語(yǔ)“示蹤物質(zhì)”旨在涵蓋能夠與目標(biāo)分析物(例如，生物標(biāo)志物)或珠(術(shù)語(yǔ)珠在下文中定義)結(jié)合，并且表現(xiàn)出使得其通過(guò)分析化學(xué)/生物學(xué)領(lǐng)域中常見(jiàn)的任何合適的技術(shù)可定量或可鑒定(即，其可以通過(guò)光學(xué)、磁性、電學(xué)或輻射檢測(cè))的特性的任何物質(zhì)。特別感興趣的特性是能夠光學(xué)檢測(cè)的那些，例如示蹤物質(zhì)可吸收和/或散射光，例如發(fā)色團(tuán)，或者表現(xiàn)出發(fā)光特性，例如熒光或磷光，或者示蹤物不是直接光學(xué)可檢測(cè)的，但是能夠與另外的物質(zhì)反應(yīng)以提供光學(xué)可檢測(cè)的反應(yīng)產(chǎn)物。適合與目標(biāo)分析物(例如，生物標(biāo)志物)或珠結(jié)合的示蹤物質(zhì)的結(jié)合部分包括例如蛋白質(zhì)、核酸、糖類(lèi)和螯合化合物。特異性結(jié)合部分包括抗體、抗原、核酸探針或其他生物特異性受體配體系統(tǒng)。

適合于本發(fā)明方法使用的示蹤物質(zhì)的實(shí)例包括含納米顆粒(優(yōu)選基于金屬的納米顆粒)和酶的那些。示蹤物質(zhì)納米顆粒的直徑通常為3至100nm。優(yōu)選的納米顆粒包括基于金屬的顆粒，例如金(ρ＝19.3g/cm³)、銀(ρ＝10.5g/cm³)或鐵(ρ＝7.9g/cm³)膠體，以及無(wú)機(jī)晶體，例如升頻轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNP，ρ通常為4至5g/cm³)。

使用基于金屬的納米顆粒作為示蹤物質(zhì)是公知的，對(duì)于金納米顆粒的綜述，參見(jiàn)例如S.Zeng等；″A review on functionalized gold nanoparticles for biosensing applications″.Plasmonics 6(3)：491-506。

對(duì)于適合于本發(fā)明方法使用的UCNP的綜述，參見(jiàn)例如Cheng等.Nanoscale，2013，5，23和Ang等.Nanomedicine，2011，6，1273。

使用熒光團(tuán)作為示蹤物質(zhì)綜合地參考例如Life Technologies^TM的The MolecularHandbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies。

其他本身非光學(xué)可檢測(cè)的物質(zhì)也可用作示蹤物質(zhì)。例如，當(dāng)本發(fā)明方法用于進(jìn)行ELISA型測(cè)定時(shí)，所得珠-分析物-示蹤物質(zhì)復(fù)合體的最終分析不依賴(lài)于示蹤物質(zhì)的直接光學(xué)檢測(cè)，而是依賴(lài)于示蹤物質(zhì)上的酶與合適的底物之間反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物(提供顏色或熒光或電化學(xué)信號(hào))。

合成合適的示蹤物質(zhì)的方法的實(shí)例全面公開(kāi)在現(xiàn)有技術(shù)中，獲得適合于本發(fā)明方法的示蹤物質(zhì)也是合成化學(xué)或生物化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。

術(shù)語(yǔ)“珠”旨在涵蓋任何類(lèi)型的固相顆粒或珠，優(yōu)選球形微米顆?；騺單⒚最w粒，直徑為0.1至50μm、0.5至50μm，優(yōu)選直徑為2μm至20μm。這些顆?？梢允嵌嗫椎幕蛘呔哂泄饣腆w表面。其可以是緊實(shí)的或具有包圍珠內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)中央核心材料的一個(gè)或更多個(gè)殼，所述中央核心材料可以是固體材料、液體或氣體。珠可以是不透明的或透明的。優(yōu)選地，珠是基本上透明的并且由體積質(zhì)量密度(ρ)稍微高于水密度(ρ＝1.0g/cm³)的聚合物制成。通常來(lái)說(shuō)，珠由聚苯乙烯(ρ＝1.05g/cm³)、聚甲基丙烯酸甲酯(ρ＝1.18g/cm³)或其他合適的材料制成。此外，珠包含能夠與目標(biāo)分析物結(jié)合的多個(gè)共價(jià)偶聯(lián)的分子結(jié)構(gòu)或?qū)嶓w。這樣的分子結(jié)構(gòu)或?qū)嶓w可以是例如抗體或其片段、核酸、適配體、螯合結(jié)構(gòu)等。在本公開(kāi)內(nèi)容中，在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的情況下珠也可以包含確定量的分析物-示蹤物質(zhì)單元(即，由結(jié)合于示蹤物質(zhì)的分析物組成的單元)。在這一點(diǎn)上，術(shù)語(yǔ)“確定量”意在表示珠被歸一化以提供已知的分析結(jié)果或信號(hào)。通過(guò)在與來(lái)自樣品的競(jìng)爭(zhēng)性分析物反應(yīng)之后分析珠(其最初具有確定量的分析物-示蹤物質(zhì)單元)并且將分析結(jié)果與所述已知分析結(jié)果相比較，可以測(cè)定/測(cè)量所述分析物。

本公開(kāi)內(nèi)容中的術(shù)語(yǔ)“可定量珠-分析物復(fù)合體”旨在意指通過(guò)珠與分析物之間的反應(yīng)形成的復(fù)合體。通常來(lái)說(shuō)，復(fù)合體包含珠、分析物和示蹤物質(zhì)。這樣的復(fù)合體的定性和/或定量分析將提供對(duì)來(lái)自樣品的待測(cè)定分析物的間接的定性和/或定量分析。根據(jù)進(jìn)行的測(cè)定的類(lèi)型，可定量珠-分析物復(fù)合體的具體結(jié)構(gòu)將不同。例如，在非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，復(fù)合體將理想地包含珠，其中珠僅結(jié)合于至少一個(gè)分析物-示蹤物質(zhì)單元，而在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，復(fù)合體可包含與分析物-示蹤物質(zhì)單元和來(lái)源于樣品的不具有示蹤物質(zhì)的分析物二者結(jié)合的珠。僅根據(jù)測(cè)定類(lèi)型，可定量珠-分析物復(fù)合體的另外的變體也是可能的。

本公開(kāi)內(nèi)容中的術(shù)語(yǔ)“夾心復(fù)合體”旨在意指包含珠、分析物和示蹤物質(zhì)的復(fù)合體?！皧A心復(fù)合體”通常是可定量珠復(fù)合體，但是該術(shù)語(yǔ)在與競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定相結(jié)合時(shí)也可表示包含上述確定量的分析物-示蹤物質(zhì)單元的珠。

術(shù)語(yǔ)d、d1、d2等旨在表示給定液體介質(zhì)以g/cm³為單位的體積質(zhì)量密度。

術(shù)語(yǔ)m、m1、m2等旨在表示給定固體材料以g/cm³為單位的體積質(zhì)量密度。

術(shù)語(yǔ)“液體介質(zhì)”旨在涵蓋適合用于進(jìn)行特定測(cè)定的任何液體。技術(shù)人員容易理解特定液體介質(zhì)在特定測(cè)定中的合適性。另外，任何液體的所需體積質(zhì)量密度可通過(guò)溶解在所述液體中或與所述液體混合的添加劑來(lái)改變。這適用于任何類(lèi)型的所涉及材料，例如多種物質(zhì)、鹽、液體或氣體，只要它們會(huì)適當(dāng)?shù)鼗旌虾腿芙饧纯伞Ｃ芏鹊母淖兣c所涉及物質(zhì)的濃度和相對(duì)密度有關(guān)。具有不同于溶劑的密度的所有可溶性化合物將影響溶液/液體的密度。通常來(lái)說(shuō)，海水具有比純凈淡水(1.00g/cm³)更高的密度(表面1.025g/cm³)。多種物質(zhì)用于改變水溶液的密度，特別是在密度梯度離心的領(lǐng)域。這些包括例如蔗糖、蔗糖聚合物、多種包被的膠體和氯化銫的物質(zhì)，以及多種含碘物質(zhì)，例如碘克沙醇、碘海醇、甲泛葡胺等易于以高濃度溶于水的物質(zhì)。

在本申請(qǐng)的情況中的術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)物”旨在作為分析方法中存在的組分的一般術(shù)語(yǔ)，例如分析物、示蹤物質(zhì)或珠上的結(jié)合分子實(shí)體。

術(shù)語(yǔ)“干燥制劑”是指可并入到用于運(yùn)行測(cè)定的裝置中的包含珠和納米顆粒的制備物的試劑。這些干燥制劑可通過(guò)真空干燥或通過(guò)冷凍干燥制備。冷凍干燥制劑制備成尺寸為小于1μL至200μL的均勻球形等份。這些可以成批生產(chǎn)然后逐個(gè)分配到分析裝置中。

適合與本發(fā)明組合使用的分析方法的一般原理

本發(fā)明涉及用于在流控或微流控芯片或盒的內(nèi)部流體回路中轉(zhuǎn)移或移動(dòng)珠或固相顆粒的新方法。本發(fā)明的方法可有利地與分析測(cè)定組合，例如下文中所述的分析測(cè)定。

在公開(kāi)的分析方法中，第一溶液中的反應(yīng)物與附著于固相顆粒表面的反應(yīng)物之間的非常高效的相互作用與通過(guò)使用第二溶液使其懸浮來(lái)對(duì)固相顆粒非常高效的洗滌相結(jié)合。

固相顆粒是微型珠(micro-sized bead)或球形顆粒。

溶液中的和附著于固相顆粒表面的反應(yīng)物將根據(jù)所進(jìn)行的測(cè)定的類(lèi)型而變化。

在夾心型非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定中，溶液中的反應(yīng)物將是分析物(例如存在于生物樣品中的一些類(lèi)型的生物標(biāo)志物)和示蹤物質(zhì)(例如對(duì)特定生物標(biāo)志物具有選擇性的標(biāo)記抗體)。所述反應(yīng)物可以在與固相顆粒相互作用之前混合，即同時(shí)施用或作為預(yù)先形成的分析物-示蹤物質(zhì)單元施用，或者依次施用(即，在施用示蹤物質(zhì)之前將分析物附著在固相顆粒上)。固相顆粒表面上的反應(yīng)物將是能夠結(jié)合分析物和/或分析物-示蹤物質(zhì)單元的分子結(jié)構(gòu)(例如抗體)。

在競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定中，溶液中的反應(yīng)物可以是樣品中存在的分析物與通過(guò)樣品分析物從珠替換的一定量的分析物-示蹤物質(zhì)單元的混合物。固相顆粒(即珠)表面上的反應(yīng)物將包含能夠結(jié)合樣品中存在的分析物的分子實(shí)體或結(jié)構(gòu)(例如抗體)，并且其中分子結(jié)構(gòu)最初與分析物-示蹤物質(zhì)單元鍵合。

為了獲得高效的相互作用，固相顆粒緊密地堆積成結(jié)構(gòu)例如柱。這優(yōu)選通過(guò)使固相顆粒保持在測(cè)定裝置(例如流控或微流控芯片)中的流體回路的節(jié)段或腔中來(lái)實(shí)現(xiàn)。該節(jié)段或腔可以有利地是大致柱狀，但是其他形狀或形式也是合適的。固相顆粒優(yōu)選通過(guò)設(shè)置在流體回路的節(jié)段或腔中的顆粒保持元件(例如過(guò)濾元件)保留在腔中。WO2011/081530A1中公開(kāi)的捕集器是用于提供包含顆粒保持元件而不需要使用過(guò)濾元件的腔的替代解決方案。

過(guò)濾元件被設(shè)計(jì)或選擇為具有不允許固相顆粒從其通過(guò)的孔徑或狹縫尺寸。通過(guò)施加離心力將液體溶液從固相顆粒柱或顆粒懸液中除去，離心力從柱的與過(guò)濾元件相對(duì)的一側(cè)作用并朝向所述元件。以這種方式，迫使液體溶液通過(guò)固相顆粒柱和過(guò)濾器結(jié)構(gòu)。

可以使用控制通過(guò)過(guò)濾器的液體出口的閥來(lái)控制通過(guò)過(guò)濾器的液體流。當(dāng)液柱基本上平行于包含固相顆粒的柱狀腔浸入時(shí)，這可作為替代地通過(guò)控制施加到出口液體的反壓力來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后可以通過(guò)相對(duì)于離心力改變測(cè)定裝置(例如流控或微流控芯片)的取向從顆粒中除去液體。

為了獲得固相顆粒的高效洗滌，通過(guò)添加第二液體溶液使顆粒懸浮。第二液體溶液具有高于固相顆粒的體積密度的密度。當(dāng)暴露于離心力時(shí)，固相顆粒將在該液體中從其柱狀結(jié)構(gòu)開(kāi)始解體(unpacking)，并通過(guò)漂浮朝向最接近離心軸的高密度液體的表面移動(dòng)。通過(guò)這種方式，在溶液中的反應(yīng)物與固相相互作用期間，固相顆粒將在其朝向表面的路徑上分散在溶液中，并且還從任何未結(jié)合的示蹤劑試劑(例如未結(jié)合的示蹤物質(zhì)或未結(jié)合的分析物-示蹤物質(zhì)單元)和捕獲在堆積的固相顆粒的柱狀結(jié)構(gòu)中其他可溶性或可分散的組分中分離。當(dāng)通過(guò)過(guò)濾從柱狀腔排出第二液體溶液時(shí)，通過(guò)漂浮獲得的固相顆粒在第二液體溶液中的分散將由此允許這些顆粒的高效洗滌。

當(dāng)這些后者材料包含具有比第二液體更高的密度的顆粒時(shí)，可以進(jìn)一步促進(jìn)“低密度”固相顆粒和其他可分散材料之間的分離。這些顆?？梢允歉呙芏燃{米顆粒，例如具有比第二液體更高的密度的金屬膠體或聚合物微粒。在這種情況下，具有比第二液體高的密度的顆粒被從離心軸拉離，而低密度顆粒朝向旋轉(zhuǎn)軸移動(dòng)。分離程度將取決于涉及的組分和液體的密度的差異、顆粒的尺寸、施加的離心力和離心時(shí)間。

因此，通過(guò)改變圍繞顆粒的溶液的密度來(lái)使堆積的固相顆粒懸浮。當(dāng)該溶液(即第二液體溶液)的密度高于顆粒本身的密度時(shí)，所述顆粒將漂浮，即沿與施加的重力或離心力的方向相反的方向移動(dòng)。當(dāng)離心力作用在比圍繞它們的液體更低的密度的顆粒上時(shí)，其將逐漸移動(dòng)到最接近離心中心的溶液的表面，而比液體更高密度的組分將傾向于沉積，即移動(dòng)到溶液的離離心中心最遠(yuǎn)的體積。通過(guò)在進(jìn)行測(cè)定的結(jié)合步驟之后使固相顆粒懸浮獲得的主要優(yōu)點(diǎn)是，由于通過(guò)將固相顆粒堆積成柱獲得的多孔結(jié)構(gòu)而以非特異性方式截留或捕獲的任何過(guò)量的示蹤物質(zhì)被釋放，因此更容易除去。

通過(guò)這種方式，例如，比液體具有更高密度的示蹤物質(zhì)可以高效地從比液體更低密度的組分中分離。然后，包含分散在液體中的較高密度組分的液體可以通過(guò)濾器排出，而固相顆粒將在到達(dá)過(guò)濾器時(shí)停止。固相顆粒的重復(fù)洗滌步驟可以通過(guò)重復(fù)的再懸浮和排出步驟進(jìn)行。

具有高于固相顆粒的密度的示蹤物質(zhì)是有利的，但是當(dāng)示蹤物質(zhì)具有與固相顆粒相等或更低的體積密度時(shí)，堆積成柱的固相顆粒的再懸浮也將提供大大改進(jìn)的洗滌步驟。在后一種情況下，如上所討論的，示蹤物質(zhì)仍然從多孔結(jié)構(gòu)釋放，因此當(dāng)?shù)诙后w溶液通過(guò)過(guò)濾元件排出時(shí)，更容易從固相顆粒中除去。

該方案提供了用于洗掉過(guò)量的示蹤物質(zhì)的簡(jiǎn)單方式。

在芯片實(shí)驗(yàn)室裝置(即微流控芯片、處理盒等)中使用固相顆?；蛑榈牧硗獾膬?yōu)點(diǎn)是，在整個(gè)測(cè)定中，懸液中的珠可轉(zhuǎn)移到裝置中的不同位置/部位。這可以包括將顆粒流控轉(zhuǎn)移到流體回路的先前沒(méi)有被示蹤物質(zhì)污染的腔或節(jié)段和/或?qū)ｉT(mén)設(shè)計(jì)用于各步驟的優(yōu)化功能的腔中。這可以例如允許首先在優(yōu)化用于存儲(chǔ)的腔中具有珠，然后將珠轉(zhuǎn)移到優(yōu)化用于快速相互作用的腔(即，柱狀結(jié)構(gòu))中，然后將珠轉(zhuǎn)移到優(yōu)化用于洗滌的腔中，進(jìn)一步到優(yōu)化用于讀出的腔中，并且最終轉(zhuǎn)移到用于廢物存儲(chǔ)的腔中。

如所描述的，用于分析樣品的裝置可以是特別設(shè)計(jì)用于根據(jù)特定程序?qū)悠泛驮噭﹥烧哌M(jìn)行微流控處理的微流控芯片或盒。這些盒通常由通過(guò)泵、閥、離心力或其他物理裝置處理盒內(nèi)的流體的儀器運(yùn)作。特別地，本發(fā)明涉及通過(guò)離心力或重力在微流控芯片內(nèi)運(yùn)作的測(cè)定系統(tǒng)。

在一個(gè)發(fā)明構(gòu)思中，本申請(qǐng)還公開(kāi)了用于分離不同密度的珠或固相顆粒的高效方法。該構(gòu)思允許在同一時(shí)間分析多種分析物，隨后容易地分離不同的所得可定量珠復(fù)合體。下面進(jìn)一步描述該構(gòu)思。

本發(fā)明是例如適用于本文中公開(kāi)的分析方法的方法，通過(guò)該方法，珠或固相顆?？梢酝ㄟ^(guò)以下方式從一個(gè)腔或節(jié)段高效地轉(zhuǎn)移到另一個(gè)腔或節(jié)段：使用比珠更高密度的液體通過(guò)傾析，從而將漂浮在液體的上部分中的珠，即已經(jīng)在朝向產(chǎn)生離心力的旋轉(zhuǎn)軸線(xiàn)的方向上移動(dòng)(或漂浮)的珠，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)腔。下文中進(jìn)一步描述了本發(fā)明。

本發(fā)明和發(fā)明構(gòu)思二者可有利地與分析方法(如下文描述的)組合，但是不以任何方式限于這樣的使用。

適合與本發(fā)明的轉(zhuǎn)移方法一起使用的分析方法的詳述

在圖1a-k中示出了分析方法的示意圖。該方法旨在用于針對(duì)一種或更多種目標(biāo)分析物分析樣品。該方法適用于可以溶解在液體中的任何類(lèi)型的樣品，以及還用于檢測(cè)/定量所述樣品中的任何類(lèi)型的化合物或物質(zhì)，對(duì)于所述樣品可以提供用于進(jìn)行此類(lèi)分析的測(cè)定。

在下文中，假定樣品是生物樣品，并且目標(biāo)化合物或物質(zhì)優(yōu)選是生物標(biāo)志物，并且可以是蛋白質(zhì)(抗原、酶、抗體)、核酸、藥物、激素、營(yíng)養(yǎng)物、代謝物、微生物、細(xì)胞或可在包括一種或更多種選擇性結(jié)合劑的測(cè)定中測(cè)量的任何此類(lèi)分子或分子集合。該方法基于使生物標(biāo)志物與固相顆粒(即微型珠、球形顆粒等)反應(yīng)的公知原理，其中固相顆粒包含能夠與生物標(biāo)志物結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)或?qū)嶓w。如果生物標(biāo)志物是抗原的話(huà)，合適的分子實(shí)體是例如抗體。除了固相顆粒和生物標(biāo)志物之外，必須存在示蹤物質(zhì)。示蹤物質(zhì)的特征為能夠結(jié)合生物標(biāo)志物的分子實(shí)體。

固相顆?；蛑槿缟纤x。

示蹤物質(zhì)如上所定義。

典型的異質(zhì)免疫測(cè)定的第一步驟由使包含待定量或鑒定的生物標(biāo)志物的生物樣品與第一液體介質(zhì)中的珠和/或示蹤物質(zhì)相互作用、接觸、孵育、沖洗或混合，參見(jiàn)圖1a-e。在這種情況下建立了夾心型構(gòu)型，其中靶生物標(biāo)志物作為固相顆粒與示蹤物質(zhì)之間的連接體。這些相互作用可以以?xún)煞N順序依次進(jìn)行，或者將所有涉及的反應(yīng)物一起施加。優(yōu)選地，確定了在這些“夾心復(fù)合體”中生物標(biāo)志物與示蹤物質(zhì)之間的固定化學(xué)計(jì)量比為1∶1。在非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，珠和示蹤物質(zhì)兩者都能夠結(jié)合生物標(biāo)志物。示蹤物質(zhì)和固相顆粒可以攜帶多種生物標(biāo)志物特異性受體，因此可與多種生物標(biāo)志物分子結(jié)合。然而，通常來(lái)說(shuō)，將測(cè)定設(shè)計(jì)為相對(duì)于生物標(biāo)志物包含大量過(guò)量的示蹤物質(zhì)。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，每個(gè)生物標(biāo)志物分子將因此僅與一個(gè)示蹤物質(zhì)結(jié)合。然而，每個(gè)微球珠暴露非常大的表面，并且可以結(jié)合許多靶生物標(biāo)志物和隨后的示蹤物質(zhì)。

在用于原理說(shuō)明的所示的該具體簡(jiǎn)化實(shí)施方案中，在W形腔、流體回路或試管裝置1中進(jìn)行測(cè)定。腔1包含第一出口2和第二出口3、入口4以及第一過(guò)濾元件5和第二過(guò)濾元件6。第一過(guò)濾元件5設(shè)置在入口4與第一出口2之間。設(shè)置在入口與第一過(guò)濾元件之間的節(jié)段形成柱結(jié)構(gòu)7。所述節(jié)段或腔可以考慮包括出口16。箭頭G表示相對(duì)于腔或試管施加的離心力(或重力，盡管使用重力僅可提供顯著更慢的測(cè)定)的方向。腔1可以是流控或微流控芯片中的流體回路的一部分，例如在本公開(kāi)內(nèi)容的背景技術(shù)部分中描述的現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的微流控芯片。在這種情況下，腔可以被認(rèn)為設(shè)置在垂直于微流控芯片外部的旋轉(zhuǎn)軸線(xiàn)的平面中。因此，通過(guò)圍繞所述軸線(xiàn)旋轉(zhuǎn)微流控芯片獲得所需的離心力G，并且可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)微流控芯片本身來(lái)改變相對(duì)于微流控芯片中的腔的離心力的方向。

在圖1a-1p中，W形腔(或流體回路的節(jié)段)的多個(gè)部分被示出為在一個(gè)平面中，例如設(shè)置在流控芯片內(nèi)的相同水平面。然而，在許多情況下，W形腔的部分可以有利地設(shè)置在通過(guò)基本垂直定向的通道連接的不同水平面。如圖3所示，W形腔或流控回路的節(jié)段可以設(shè)置在兩個(gè)或更多個(gè)水平面，其中橫向通道17、18和19連接如L1和L2內(nèi)所示的側(cè)向通道。過(guò)濾器(5細(xì)節(jié)A)和/或包括顆粒捕集器的其他功能元件優(yōu)選地放置在一個(gè)或更多個(gè)這種橫向通道(6細(xì)節(jié)B)內(nèi)或基于一個(gè)或更多個(gè)這樣的橫向通道。

通過(guò)圖1a-e示出的特定測(cè)定是非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。在這樣的測(cè)定中，可以任意選擇其中測(cè)定的多個(gè)組分相互作用、接觸或混合的順序，因?yàn)橹?和示蹤物質(zhì)9(參見(jiàn)圖1d)都以大量過(guò)量提供，并且它們?cè)诓淮嬖谥虚g生物標(biāo)志物的情況下彼此不反應(yīng)。此外，混合、相互作用或接觸(即結(jié)合步驟)可有利地包括使上述第一液體介質(zhì)通過(guò)由珠8形成的塞或柱，以確保珠、示蹤物質(zhì)9和生物標(biāo)志物之間的反應(yīng)盡可能完全。通過(guò)使珠堆積在柱狀腔7或體積中來(lái)獲得塞或柱。柱狀腔7可以?xún)?yōu)選地是芯片實(shí)驗(yàn)室裝置中的流體回路(即，微流控芯片或處理盒中的流體回路)的一部分。

在圖1a和1b中，懸浮在液體介質(zhì)中的珠通過(guò)入口4引入。液體介質(zhì)的密度低于珠的密度。珠的密度表示為m1g/m³。由于離心力G，珠將堆積成由柱狀腔7和第一過(guò)濾元件5限定的柱狀結(jié)構(gòu)，參見(jiàn)圖1c。由于布置在所述腔的一端的第一過(guò)濾元件5，所述珠保留在柱狀腔中。過(guò)濾元件可以包含過(guò)濾器、格柵(grid)、篩、窄狹縫等，并且能夠防止珠從其通過(guò)。

在下一步驟中，參見(jiàn)圖1d，懸浮在包含生物標(biāo)志物的液體介質(zhì)中的示蹤物質(zhì)9通過(guò)入口4引入。在該具體實(shí)施方案中，包含生物標(biāo)志物的樣品在與珠相互作用之前已經(jīng)與示蹤物質(zhì)相互作用，樣品因此可形成其中懸浮示蹤物質(zhì)的液體介質(zhì)的一部分。從懸浮珠的液體介質(zhì)和懸浮示蹤物質(zhì)的液體介質(zhì)獲得的組合液體介質(zhì)具有低于珠的密度。組合液體介質(zhì)表示為第一液體介質(zhì)，并且所述液體介質(zhì)的密度表示為d1g/cm³。

使包含示蹤物質(zhì)和生物標(biāo)志物以及通過(guò)示蹤物質(zhì)與生物標(biāo)志物的相互作用形成的復(fù)合體的第一液體介質(zhì)通過(guò)堆積珠。當(dāng)使第一液體介質(zhì)通過(guò)堆積珠時(shí)，形成包含珠、生物標(biāo)志物和示蹤物質(zhì)的“夾心復(fù)合體”。過(guò)濾元件5使得示蹤物質(zhì)9和由示蹤物質(zhì)與生物標(biāo)志物的相互作用形成的復(fù)合體可以通過(guò)，參見(jiàn)圖1d。第一液體介質(zhì)通過(guò)柱，并通過(guò)改變施加的離心力G的方向從W形腔1或試管中引出，參見(jiàn)圖1f-h。在一些作為替代的實(shí)施例中，可以例如使用位于第一過(guò)濾元件下方的閥將第一液體介質(zhì)從腔引出。

珠8、示蹤物質(zhì)9和生物標(biāo)志物之間的相互作用的順序取決于在特定情況下哪種溶液是最合適的或合適的。因此，包含生物標(biāo)志物的樣品可以是其中懸浮有示蹤物質(zhì)9的液體介質(zhì)的一部分，或其中懸浮有珠8的液體介質(zhì)的一部分。

在第一液體介質(zhì)單次通過(guò)堆積珠的柱之后，珠、示蹤物質(zhì)和生物標(biāo)志物之間的相互作用可能不完全。有利地，通過(guò)再引入入口4使可包含未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)、生物標(biāo)志物和通過(guò)示蹤物質(zhì)與生物標(biāo)志物的相互作用形成的復(fù)合體(即分析物-示蹤物質(zhì)單元)的第一液體介質(zhì)重復(fù)通過(guò)堆積珠。這種再引入可以例如通過(guò)具有連接第一出口2與入口4的環(huán)結(jié)構(gòu)(例如，形成為環(huán)的流體回路)來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)W形腔是芯片實(shí)驗(yàn)室裝置中的流體回路的一部分時(shí)，后者的解決方案尤其有利。在再引入之后，可重復(fù)根據(jù)圖1e-h的步驟。

取決于測(cè)定設(shè)計(jì)和樣品中生物標(biāo)志物的濃度，每個(gè)珠可以攜帶從無(wú)到數(shù)千的生物標(biāo)志物-示蹤物質(zhì)復(fù)合體。由于在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中每個(gè)珠的體積顯著大于生物標(biāo)志物-示蹤物質(zhì)復(fù)合體的體積，所以每個(gè)珠的許多生物標(biāo)志物-示蹤物質(zhì)復(fù)合體的結(jié)合將基本上不會(huì)影響珠的體積質(zhì)量密度。在一個(gè)典型的實(shí)例中，球形5μm(直徑)珠的體積接近于40nm示蹤物質(zhì)的體積的2百萬(wàn)倍。

珠、示蹤物質(zhì)和生物標(biāo)志物之間的相互作用提供了包含“夾心復(fù)合體”(即可定量的珠復(fù)合體)和未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)的堆積珠柱。“夾心復(fù)合體”的密度表示為m2g/cm³。在相互作用期間，由于堆積珠形成的多孔結(jié)構(gòu)，一些未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)9以非特異性方式被截留或捕獲。為了獲得靈敏且可再現(xiàn)的分析結(jié)果，盡可能多的未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)必須與珠和“夾心復(fù)合體”分離。在現(xiàn)有技術(shù)中，未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)的分離通過(guò)使洗滌液通過(guò)堆積珠柱而重復(fù)洗滌來(lái)進(jìn)行。然而，如上所討論的，這樣的洗滌不會(huì)除去所有截留的未反應(yīng)示蹤物質(zhì)，或需要過(guò)多和耗時(shí)的重復(fù)洗滌次數(shù)。

為了改善或甚至允許未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)與珠和“夾心復(fù)合體”的分離，將第二液體介質(zhì)添加到堆積珠中，參見(jiàn)圖1i。第二液體介質(zhì)的密度為d2g/cm³，其中d2＞m1和m2。應(yīng)當(dāng)注意，當(dāng)用于替代分析系統(tǒng)中時(shí)，其中通過(guò)傾析(即，不是通過(guò)使第一液體介質(zhì)通過(guò)過(guò)濾元件)除去第一液體介質(zhì)，第一液體介質(zhì)的小部分和第二液體介質(zhì)的組合的密度可以表示為d2′。然而，由于第二液體介質(zhì)與第一液體介質(zhì)的體積之間的高比值，d2′的數(shù)值將近似等于d2，即d2′＞m1和m2。

本方法的基本特征是第二液體介質(zhì)具有比珠和“夾心復(fù)合體”更高的密度。然后添加第二液體介質(zhì)將確保堆積珠柱崩解，使得珠之間的緊密相互作用被破壞。當(dāng)珠之間的緊密相互作用被破壞時(shí)，截留/捕獲的未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)被釋放到第二液體介質(zhì)中。由于其相對(duì)于第二液體介質(zhì)的密度較低的密度，珠和“夾心復(fù)合體”將逆著施加的離心力G的方向移動(dòng)遠(yuǎn)離第一過(guò)濾元件5，參見(jiàn)圖1j。為了除去先前在堆積珠之間截留/捕獲的未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)，通過(guò)改變施加的離心力G的方向，將第二液體介質(zhì)通過(guò)第一出口2從W形腔或試管中引出，參見(jiàn)圖1k。在一些作為替代的實(shí)施方案中，可例如通過(guò)使用位于第一過(guò)濾元件5下方的閥從腔引出第二液體介質(zhì)。

使用不同密度的第一和第二液體介質(zhì)獲得的最重要的效果是，珠將“沉積”在d1＜m1的第一液體介質(zhì)中，同時(shí)它們將“漂浮”在d2＞m1的第二液體介質(zhì)中。術(shù)語(yǔ)“沉積”和“漂浮”用于描述珠在液體介質(zhì)中相對(duì)于所施加的離心力G的位置，即當(dāng)珠“漂浮”時(shí)，它們沿與所施加的離心力G的方向相反的方向移動(dòng)，術(shù)語(yǔ)“沉積”相反。

如果在除去第二液體介質(zhì)之后未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)的剩余量太高，可以使用第二液體介質(zhì)的新鮮等分試樣將根據(jù)圖1i-k添加和去除第二液體介質(zhì)的步驟(即洗滌步驟)重復(fù)所需次數(shù)。

如在該具體分析方法中所示，示蹤物質(zhì)可以有利地具有n g/cm³的體積質(zhì)量密度，其中n＞m1、m2和d2。這樣的密度將確保當(dāng)將第二液體介質(zhì)供應(yīng)到珠時(shí)，過(guò)量的示蹤物質(zhì)將“沉積”，并且進(jìn)一步促進(jìn)示蹤物質(zhì)與珠和“夾心復(fù)合體”的分離。在一些作為替代的實(shí)施方案中，即具有根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移方法之特征的實(shí)施方案中，這可以是特別有利的，其中通過(guò)如上所述的傾析使珠移出柱狀腔。

然而，示蹤物質(zhì)不需要具有特定的密度。僅堆積珠柱崩解使得珠之間的緊密相互作用被破壞的事實(shí)將確保當(dāng)除去第二液體介質(zhì)時(shí)實(shí)現(xiàn)過(guò)量示蹤物質(zhì)的改善的去除。除了體積質(zhì)量密度之外，示蹤物質(zhì)的另一些性質(zhì)可決定其在第二液體介質(zhì)中的行為。例如，如果示蹤物質(zhì)締合或包含納米顆粒，則其將傾向于在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持懸浮在液體介質(zhì)中，即使它們的體積質(zhì)量密度低于第二液體介質(zhì)的密度。將影響示蹤物質(zhì)行為的其他性質(zhì)或特征包括它們?cè)谒婕暗囊后w介質(zhì)中的溶解性或任何可使它們與漂浮珠分離的施加力(即磁性、電)的存在。

如上所述，珠、示蹤物質(zhì)和“夾心復(fù)合體”在第二液體介質(zhì)中的混合物經(jīng)受具有第一方向的離心力。珠(包含“夾心復(fù)合體”(即可定量的珠復(fù)合體))具有小于第二液體(d2)的體積質(zhì)量密度(m1和m2)，并且將“漂浮”(即朝最接近離心系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)軸線(xiàn)的第二液體介質(zhì)液面移動(dòng))，而過(guò)量的未結(jié)合的示蹤物質(zhì)，如上所討論的，根據(jù)其性質(zhì)如密度n、尺寸、溶解度等，將“沉積”，即移動(dòng)遠(yuǎn)離產(chǎn)生離心力的旋轉(zhuǎn)軸線(xiàn)，或保持懸浮至少足以將第二液體介質(zhì)和因此懸浮的示蹤物質(zhì)與珠和“夾心復(fù)合體”分離的時(shí)間。

在除去未反應(yīng)的示蹤物質(zhì)之后，通過(guò)分析多個(gè)“夾心復(fù)合體”，可以原位(即在柱狀腔7中)定量或鑒定生物標(biāo)志物。

在一些作為替代的分析方法中，珠和“夾心復(fù)合體”被運(yùn)輸?shù)讲煌奈稽c(diǎn)或腔用于分析。當(dāng)本文中公開(kāi)的分析方法用于芯片實(shí)驗(yàn)室裝置，其包含具有內(nèi)部流體回路的微流控芯片，可使用離心力使包含珠和含有至少一種分析物之樣品的多種反應(yīng)物移動(dòng)通過(guò)所述內(nèi)部流體回路時(shí)，包含“夾心復(fù)合體”的珠可以例如被運(yùn)輸?shù)綄?zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于分析此類(lèi)珠的流體回路或腔。

在該具體分析方法中，使用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移方法將包括“夾心復(fù)合體”的珠從節(jié)段或腔7轉(zhuǎn)移到第二柱狀腔10。轉(zhuǎn)移通過(guò)將第二液體介質(zhì)或與第二液體介質(zhì)具有相同的或更高的密度的不同的液體介質(zhì)的另一等分試樣添加到珠中來(lái)實(shí)現(xiàn)，參見(jiàn)圖1l-m。等分試樣優(yōu)選大于圖1i-k的洗滌步驟中使用的量，使得珠可以更靠近腔7的入口4(或出口16，參見(jiàn)圖1l)移動(dòng)。將包含所有珠(包含“夾心復(fù)合體”)的最接近離心軸(或入口4或出口16)的第二液體介質(zhì)的級(jí)分通過(guò)傾析轉(zhuǎn)移到第二柱狀腔10，參見(jiàn)圖1o。傾析通過(guò)相對(duì)于第一柱狀腔稍微改變離心力G的方向的來(lái)實(shí)現(xiàn)。第二柱狀腔10被最佳地設(shè)計(jì)用于測(cè)定中的下一個(gè)優(yōu)選動(dòng)作，即第二腔可以被設(shè)計(jì)用于更廣泛的洗滌和/或用于定量“夾心復(fù)合體”。

在該具體分析方法中，其中堆積有珠的腔7被示出和描述為柱狀。然而，在另一些分析方法中，腔可以具有任何形狀或形式，只要其提供允許反應(yīng)物之間的緊密相互作用的珠的堆積結(jié)構(gòu)，隨后將堆積結(jié)構(gòu)分散在液體介質(zhì)中即可。

用于在流體回路中分離不同密度的珠的發(fā)明構(gòu)思的詳細(xì)描述

在圖1a-k所描述的分析方法中，所述方法顯示為一次分析一種分析物。然而，該方法不限于一次僅分析一種分析物。

通過(guò)使用不同密度的多種類(lèi)型的珠，每種類(lèi)型對(duì)不同的分析物以及與包含多種類(lèi)型的分析物的樣品相互作用的各自的互補(bǔ)示蹤物質(zhì)具有選擇性，可以在同一時(shí)間獲得對(duì)應(yīng)于多種類(lèi)型的分析物的多種類(lèi)型的“夾心復(fù)合體”。多種類(lèi)型的“夾心復(fù)合體”可以同時(shí)或依次分析。在如上所述的結(jié)合或相互作用步驟之后，堆積珠的柱將包含多種類(lèi)型的珠和代表待分析的多種分析物的相應(yīng)的“夾心復(fù)合體”。在一些情況下，可以在不彼此分離的情況下分析多種類(lèi)型的“夾心復(fù)合體”。然而，為了獲得期望水平的靈敏度和再現(xiàn)性，可能需要分離多種類(lèi)型的“夾心復(fù)合體”。

本公開(kāi)提供了用于實(shí)現(xiàn)多種類(lèi)型的珠/固相材料的分離的發(fā)明構(gòu)思，包括如整個(gè)說(shuō)明書(shū)中所描述的“夾心復(fù)合體”。該構(gòu)思不依賴(lài)于上述聚體分析方法，也不是其基本部分。該構(gòu)思尤其有利于在芯片實(shí)驗(yàn)室設(shè)備中使用，例如包含內(nèi)部流體回路的微流控芯片，其中包含珠和含有至少一種分析物之樣品的多種反應(yīng)物通過(guò)所述內(nèi)部流體回路的移動(dòng)可以通過(guò)使用離心力來(lái)實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明構(gòu)思的一個(gè)實(shí)施方案在圖2a和2b中示出。適于分離具有不同密度的珠的腔15在圖2a和2b中示出。腔包括入口12、第一出口13和第二出口14。在該特定情況下，向腔提供密度為m1的第一組珠8a和密度為m2的第二組珠8b。然后密度為d3(m1＜d3＜m2)的液體介質(zhì)11添加到腔中的珠中。離心力G使得第一組珠8a在第一出口13的方向上移動(dòng)(或漂浮)，而第二組珠8b朝向第二出口14移動(dòng)(或沉積)。通過(guò)改變離心力的方向，即腔相對(duì)于離心力的取向，第一組珠8a和液體介質(zhì)11的一部分通過(guò)第一出口13轉(zhuǎn)移，而第二組珠8b和液體介質(zhì)11的一部分通過(guò)第二出口14轉(zhuǎn)移。

發(fā)明構(gòu)思也適用于其他腔設(shè)計(jì)，例如圖1a中已經(jīng)示出的腔設(shè)計(jì)。在如圖1a所示的腔中，密度為d3的液體介質(zhì)(如結(jié)合圖2a和2b所述)可以首先用于分離兩組珠(類(lèi)似于圖2a中的動(dòng)作)。在兩組珠分離之后，通過(guò)改變所施加的離心力G的方向，可以使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移方法從柱狀腔7傾析出第一組珠(類(lèi)似于圖1o中的珠的傾析)。因此可以將第一與第二組珠分離。通過(guò)向柱狀腔7中添加密度為d4(d4＞m2)的另外的液體介質(zhì)，可以隨后以與用于第一組珠的相同的方式從所述腔中傾析出第二組珠，即，通過(guò)進(jìn)一步使用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移方法。

分離不同密度的珠的發(fā)明構(gòu)思不限于僅具有不同密度的兩組珠，而是可用于分離任何數(shù)量組的珠，只要其具有不同的密度，允許通過(guò)應(yīng)用適當(dāng)密度的液體介質(zhì)分離即可。例如，在如圖1a所示的腔的情況下，可以按順序如下分離密度分別為m1、m2、m3和m4的四組珠：首先添加密度為d3(m4＜d3＜m3、m2、m1)的液體介質(zhì)，傾析密度為m4的珠(類(lèi)似于圖1o中的珠)，過(guò)濾掉密度為d3的剩余液體介質(zhì)，并添加密度為d4(m3＜d4＜m2、m1)的另外的液體介質(zhì)(或者，不過(guò)濾掉密度為d3的剩余液體介質(zhì)，但是通過(guò)添加密度提高添加劑如另外的高密度液體將其密度提高到d4)，傾析密度為m3的珠等。

另一選擇是將珠分離成兩個(gè)組合組的珠，其中第一組合組包含密度m1和m2的珠，而另一組合組包含密度m3和m4的珠。這可以通過(guò)首先添加密度為d4(m4、m3＜d4＜m2、m1)的液體介質(zhì)并傾析密度為m4和m3的珠來(lái)獲得。然后，將每個(gè)組合組的珠可以例如轉(zhuǎn)移到如圖2a中所示的腔中用于進(jìn)一步分離。當(dāng)在分析方法(例如上述方法)中使用第一構(gòu)思時(shí)，珠的組還可以包含待分析的“夾心復(fù)合體”。

可如下限定發(fā)明構(gòu)思：

一種在內(nèi)部流體回路的微流控芯片中分離珠的方法，其中包含珠和含有至少一種分析物之樣品的多種反應(yīng)物通過(guò)所述內(nèi)部流體回路的移動(dòng)可以通過(guò)使用離心力來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方法包括以下步驟：

-在所述流體回路的腔中提供至少密度為m1的第一組珠和密度為m2的第二組珠，所述腔至少包含第一出口；

-向所述腔提供第一液體介質(zhì)，所述液體介質(zhì)的密度為d3，使得m1＜d3＜m2；以及

-施加離心力，使得所述第一組珠和所述第二組珠在所述腔內(nèi)沿相反方向移動(dòng)。

在分離微流控芯片中的珠的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第一組珠移向第一出口。

在分離微流控芯片中的珠的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：

-通過(guò)改變離心力的方向?qū)⒌谝唤M珠轉(zhuǎn)移到腔外，而第二組珠保留在所述腔中，優(yōu)選地使得第一組珠通過(guò)第一出口傾析。

在分離微流控芯片中的珠的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述腔包含第二出口，所述方法包括以下步驟：

-改變離心力的方向，使得第一組珠通過(guò)第一出口轉(zhuǎn)移，并且第二組珠通過(guò)第二出口轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的詳述；在流體回路中轉(zhuǎn)移珠的方法

關(guān)于珠的運(yùn)輸，本公開(kāi)內(nèi)容描述了不依賴(lài)于上述分析方法，也不是其基本部分的發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施方案在圖1l-p中公開(kāi)。本發(fā)明解決了尤其與芯片實(shí)驗(yàn)室裝置(例如微流控芯片)相關(guān)的問(wèn)題，其中使用離心力運(yùn)輸珠通過(guò)流體回路。在現(xiàn)有技術(shù)中，珠的運(yùn)輸總是在與離心力相同的方向上進(jìn)行，因此限制了可用于流體回路的設(shè)計(jì)的選擇。本發(fā)明允許通過(guò)將密度為d2的液體介質(zhì)添加到密度等于或小于m1的珠中而沿與施加的離心力相反的方向運(yùn)輸珠，其中d2＞m1。

雖然通過(guò)參照?qǐng)D1l-1p的柱狀腔7示出了本發(fā)明，但是本發(fā)明同樣適用于具有很多種形狀和形式的腔。圖2a和2b中示出了合適的腔15的另一實(shí)例。如在上述發(fā)明構(gòu)思的描述中所公開(kāi)的，使第一組珠8a在第一出口13的方向上移動(dòng)(或漂浮)，該方向與施加的離心力G的方向相反。